Heinze, Susanne: Triptorelinazetat 2,1 mg versus Triptorelinazetat 4,12 mg zur ovariellen Suppression im Rahmen der In-vitro-Fertilisation. Eine prospektive randomisierte Dosisfindungsstudie

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Kapitel 2. Material und Methode

2.1 Studiendesign

Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine prospektive und randomisierte Studie.

Dabei wurden 200 IvF- und IvF/ICSI-Behandlungszyklen der Jahre 1997 und 1998 ausgewertet.

Es wurden 200 Patientinnen aus der Kinderwunschsprechstunde der DRK-Frauenklinik randomisiert, die im Rahmen des üblichen Prozedere (siehe Kapitel 2.3) vor geplanter künstlicher Befruchtung im sog. langen Protokoll downreguliert wurden: 100 Patientinnen erhielten 4,12 mg Triptorelinazetat entsprechend der Standarddosis (1 Ampulle Decapeptyl® Gyn, i.m., im Folgenden Gruppe B genannt), weitere 100 Patientinnen erhielten die halbierte Dosis, also 2,1 mg Triptorelinazetat (1/2 Ampulle Decapeptyl® Gyn, i.m., Gruppe A genannt), jeweils zur Downregulation.

Bei dem verwendeten GnRH-Agonisten handelt es sich um das Depot-Präparat Decapeptyl® Gyn der Firma Ferring Arzneimittel, welches jeweils einmalig intramuskulär appliziert wurde: am 22. Zyklustag (mittlere Lutealphase) des der Stimulations- und IvF-Behandlung vorausgegangenen Zyklus.

Mögliche Komedikationen waren L-Thyroxin, Bromocriptin, Prednisolon, um die jeweilige Patientin bei entsprechender Indikation in einen hormonell normalen Zustand zu versetzen. Da es sich in dieser Studie um normogonadotrope Patientinnen handelt, haben die o.g. Komedikationen nach aktuellem Wissensstand keinen Einfluss auf die Studienergebnisse.

Einschlusskriterien:

Zwischen 18- und 38-jährige regelmäßig menstruierende, sekundär oder primär sterile Patientinnen mit einem ovulatorischen Zyklus, bei denen eine IvF- oder IvF/ICSI-Therapie geplant war.

Ausschlusskriterien:

Nicht eingeschlossen wurden Patientinnen, die eine GnRH-Analoga-Medikation in den vergangenen 8 Wochen erhalten hatten; des Weiteren bei anamnestischem Hinweis auf oder Nachweis von “low-responder“.

Die Ethikkommission wurde nicht angerufen, da die angewendeten Medikationen zu den Indikationen zugelassen sind und vor Beginn der Behandlung ein "informed consent" hergestellt wurde.


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2.2 Patientinnen

Zusammensetzung der Gruppen:

In Gruppe A erhielten n = 100 Patientinnen 2,1 mg Triptorelinazetat (=halbierte Standarddosis),in Gruppe B erhielten n = 100 Patientinnen 4,12 mg Triptorelinazetat (=Standarddosis), jeweils zur Downregulation im sog. langen Protokoll.

Die Altersverteilung war in beiden Studienarmen gleich:

In der Gruppe der Patientinnen, die 2,1 mg Triptorelinazetat erhielten (Gruppe A) betrug das Alter 22-38 Jahre, im Median 32 Jahre. In der Gruppe der Patientinnen, die 4,12 mg Triptorelinazetat erhielten (Gruppe B) lag das Alter bei 20-38 Jahren, im Median bei 32 Jahren.

Die Verteilung bezüglich der Sterilitätsursachen sah folgendermaßen aus:

In Gruppe A lag bei 21% der Patientinnen eine tubare Ursache der Sterilität zu Grunde. Eine männlich bedingte Sterilität lag bei 63% der Patientinnen vor. Gemischte Sterilität mit männlicher und tubarer Indikation bestand in 16% der Fälle.

In der Gruppe B waren 25% der Patientinnen von tubarer Sterilität betroffen, 60% von männlich bedingter Sterilität. In 15% der Fälle lag eine gemischte Sterilitätsursache vor.

Die relative Verteilung der Sterilitätsursachen ist anteilig in beiden Studienarmen ohne signifikanten Unterschied, sodass auch diesbezüglich statistisch eine Vergleichbarkeit gegeben ist.

Den Indikationen entsprechend wurden IvF- bzw. IvF/ICSI-Behandlungen durchgeführt:

In Gruppe A wurde bei 92 von 100 Patientinnen die Follikelpunktion durchgeführt; IvF wurde 22 mal (24 %) und IvF/ICSI 70 mal (76%) durchgeführt (bei 8 Patientinnen erfolgte keine Punktion).

In Gruppe B wurden 97 der 100 Patientinnen punktiert; hier wurde IvF 29 mal (30%) und IvF/ICSI 68 mal (70%) durchgeführt (3 Patientinnen wurden nicht punktiert).

Beide Gruppen sind auch bezüglich der durchgeführten Methode der assistierten Reproduktion in ihrer Zusammensetzung ohne signifikanten Unterschied.

Von den erhobenen Patientinnen waren in Gruppe A 69% Patientinnen primär, 31% sekundär steril. In Gruppe B lag eine primäre Sterilität bei 54% der Patientinnen und eine sekundäre Sterilität bei 46% der Patientinnen vor. Diese Unterschiede sind statistisch signifikant (p = 0,042); es wurde jedoch bei der Randomisierung auf die Unterscheidung von primärer und sekundärer Sterilität verzichtet, da dies ohne Einfluss auf die Ergebnisse bezüglich der Fragestellung dieser Studie (ovarielle Antwort auf Downregulation mit halbierter Dosis und Schwangerschaftsraten pro Embryotransfer) ist, denn bei


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dem Studienkollektiv handelt es sich in beiden Studienarmen um normovulatorische Sterilitätspatientinnen mit annähernd gleicher Gruppenzusammensetzung bezüglich der Sterilitätsfaktoren .

Insgesamt besteht eine statistische Vergleichbarkeit der beiden Studienarme bei annähernd gleicher Verteilung bezüglich der Kriterien, die zur Beantwortung der Fragestellung der vorliegenden Studie relevant sind.

2.3 Ablauf der Behandlung

Das Prozedere der im Rahmen der Studie durchgeführten Behandlungen entspricht den Behandlungsstandards, wie sie in der Kinderwunschsprechstunde des Hauses etabliert sind und im Folgenden ausgeführt werden(Kentenich 1989, Kentenich et al. 1996).

In-vitro-Fertilisation werden an der DRK-Frauenklinik, Westend (vormals Pulsstraße, Frauenklinik der FU-Berlin) seit 1984 durchgeführt. 1998 erfolgten 949 IvF- Zyklen, davon 69,5% IvF/ICSI-Zyklen, in der Regel im so genannten langen Protokoll.

Indikationen für die in-vitro-Fertilisation sind

als Indikationen für die intracytoplasmatische Spermieninjektion (IvF/ICSI) gilt

Vor Beginn der Therapie erfolgen eine ausführliche Anamnese, die Bestimmung der hormonellen Basisparameter, die Abklärung der tubaren Situation, ein HIV-Test beider Partner, eine Hepatitis-Serologie sowie ein zweimaliges Spermiogramm.

2.3.1 Downregulation/ovarielle Suppression im langen Protokoll

Die Behandlung beginnt mit der Applikation des Depot-GnRH-Agonisten Triptorelinazetat (Standarddosis: 4,12 mg Triptorelinazetat, siehe auch Kapitel 2.1). Diese Downregulation erfolgt am 22. Zyklustag des Vorzyklus.

Die Überprüfung der ovariellen Suppression erfolgt durch Bestimmung der Hormonspiegel von Östradiol, LH und Progesteron, 14 Tage nach Downregulation bzw. bei entsprechenden klinischen Symptomen.

Eine ovarielle Suppression wird definiert mit Östradiolwerten unter 50 pg/ml, LH unter 4 U/l und Progesteron unter 2 ng/ml. In diesem Falle beginnt die Stimulationsbehandlung.


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2.3.2 Ovarielle Stimulation

Etwa 14 Tage nach Gabe des Depot-GnRH-Agonisten ist die ovarielle Suppression erfolgt. Nun beginnt die ovarielle Stimulationsbehandlung mit Gonadotropinen. Diese hat zum Ziel, unter kontrollierter Kodominanz mehrere Follikel (8-10) zur präovulatorischen Reife zu bringen. Die übliche Anfangsdosierung sind 3 Ampullen (225 IE) FSH oder HMG (humanes Menopausengonadotropin) täglich (Wildt et al. 1986). Die Stimulation wird individuell unter hormoneller und vaginal-sonografischer Kontrolle mit täglich 2-3 Ampullen HMG fortgesetzt, bis zu einer Follikelgröße von durchschnittlich 20 mm Durchmesser und einem Östradiolwert von 200 pg/ml/reifem Follikel (Casper et al. 1987, Neulen 1997). Dies sind die Voraussetzungen zur Ovulationsinduktion mittels HCG.

Zum hormonellen Zyklusmonitoring werden die Östradiol-, LH- und Progesteronbestimmungen am Tag 1 und am Tag 7 der Stimulationsbehandlung, 2 Tage vor HCG-Gabe, 1 Tag vor HCG-Gabe, am Tag der HCG-Gabe morgens um 8.00 Uhr und abends um 22.00 Uhr und am Tage nach der HCG-Gabe durchgeführt.

2.3.3 Ovulationsinduktion

Sind die oben genannten Kriterien der präovulatorischen Follikelreife erfüllt, erfolgt am Abend des Kontrolltages um 22.00 Uhr in Absprache mit der Patientin bzw. dem Paar die Injektion von 10.000 IE Chorion Gonadotropin (HCG) intramusculär oder subcutan.

2.3.4 Oozytengewinnung

36 Stunden nach HCG-Gabe erfolgt die Follikelpunktion zur Oozytengewinnung transvaginal unter sonografischer Kontrolle (Michelmann et al. 1987, Gembruch et al. 1988). Die Patientin erhält dazu wahlweise entweder eine leichte Sedierung oder eine Allgemeinnarkose. Der Eingriff erfolgt unter Monitoring der Vitalparameter durch das anästhesiologische Team. Zur Vorbereitung wird die Scheide mit Alkohol und Kochsalzlösung gespült. Auf dem zuvor desinfizierten Vaginalschallkopf (7,5 MHz) ist eine Führungshülse arretiert, durch die die 2-lumige Punktionskanüle in einer vorausberechneten Linie im Ultraschallbild bewegt wird. Die Follikel eines Ovars werden möglichst mit einmaligem Durchstechen der Vaginalwand nacheinander punktiert und mittels steuerbarem Unterdruck (ca. 100-140 mmHg) abgesaugt. Die in einer so genannten Eifalle (Reagenzglas) aufgefangene Follikelflüssigkeit wird direkt im Operationssaal durch den Biologen unter sterilen Kautelen mit Hilfe eines Stereomikroskops beurteilt. Bei Punktaten ohne auffindbare Eizelle erfolgt die Spülung des Follikels (Lehmann et al. 1984). Es werden alle Follikel punktiert, da auch kleinere Follikel reife Eizellen enthalten können (Kentenich et al. 1988).


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Nach Beendigung des Eingriffs erfolgt für ca. 4 Stunden eine Beobachtung der ruhenden Patientin unter regelmäßiger Kontrolle der Kreislaufparameter, bei Wohlbefinden anschließend die Entlassung nach Hause. Nur in Einzelfällen ist die laparoskopische Punktion der Follikel notwendig, z.B. wenn die Ovarien transvaginal nicht zu punktieren sind.

Parallel zur Follikelpunktion werden nach Masturbation aus dem Ejakulat des Partners die Spermatozoen gewonnen, im Falle der Azoospermie durch eine testikuläre Spermienextraktion mittels Hodenbiopsie.

2.3.5 Labortechnische Aufbereitung zur IvF

Aus der Follikelflüssigkeit werden die präovulatorischen Eizellen mit einer Glaspipette durch geringen Sog in das Nährmedium (Ham‘s F 10 Medium, versetzt mit 10% Patientinnenserum) überführt, wo in tubenähnlichem Milieu je nach Reife der Eizellen eine unterschiedlich lange Präinkubation (ca. 2-6 Stunden) bei 37° Celsius im CO2-Inkubator erfolgt. Die reife Eizelle trägt ein Polkörperchen als Zeichen der abgeschlossenen ersten Reifeteilung, das Zytoplasma ist homogen und farblos.

Parallel dazu erfolgt die Spermaaufbereitung, wodurch die Spermatozoen in vitro den zur Erlangung der Befruchtungsfähigkeit notwendigen Reifungsprozess (Kapazitation und akrosomale Reaktion) durchmachen (Diedrich et al. 1996): Nach Verflüssigung des Ejakulats werden die Spermien zweimal mit jeweils 2 ml Kulturmedium (Ham‘s F 10 Medium und 10% Serum) gewaschen und für 10 Minuten mit 200 g zentrifugiert. Die vom Prostatasekret befreiten beweglichen Samenzellen werden mit Hilfe der Swim Up, Fall-Down and Glaswoll-Filtrationstechnik (van der Ven 1987) konzentriert.

2.3.6 Insemination/ICSI

a) Insemination

Es werden pro reife Eizelle 200.000 bis 300.000 motile Spermien in das Medium gegeben, nach dem Oozyten und Sperma, wie zuvor beschrieben, aufbereitet wurden.

b) ICSI

Alternativ wird bei männlich bedingter Sterilität die intracytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) durchgeführt. ICSI ist eine Zusatzmaßnahme im Rahmen der IvF: durch eine assistierte Fertilisation mittels Mikroinjektion eines Spermiums in die Eizelle wird der natürliche Vorgang der Imprägnation (Vereinigung von Ei- und Samenzelle) nachgeahmt.

Dazu wird die Eizelle von den umgebenden Granulosazellen befreit: 2 Stunden nach Punktion werden die Eizellen für 2-5 Minuten einer Hyaluronidaselösung (enthält 60 U/ml aktives Enzym, gelöst in Ham‘s F 10 Medium) ausgesetzt. Die nach der Digestion verbliebenen Granulosazellschichten werden mit dünnen Glaskapillaren (150 &I;m Innendurchmesser) abgetrennt, bis das Polkörperchen der Eizelle


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klar zu erkennen ist. Anschließend werden die Eizellen mehrfach in Ham‘s F 10 Medium mit 10% Patientinnenserum gewaschen und 2 Stunden inkubiert.

Die Spermien werden durch das Swim Up-Verfahren in Ham‘s F 10 Medium mit 1% Humanalbumin aufbereitet. Ist die Anzahl motiler Spermien zu gering, wird das Zentrifugatpellet mehrfach gewaschen. Nach der Spermienreinigung wird der Überstand mit den motilen Spermien im Verhältnis 1:2 mit einer 10% Polyvinylpyrolidonlösung vermischt, um die Motilität der Spermien zu bremsen. Zur Vorbereitung der Injektion werden Petrischalen mit zuvor über 24 Stunden äquilibriertem Mineralöl gefüllt. Im Zentrum werden 2 Tropfen von je 10 µl Ham‘s F 10 Medium mit 10% Patientinnenserum und 10 &I;l der Spermienaufbereitung eingebracht.

Zur Spermieninjektion wird die Eizelle an einer Haltepipette so arretiert, dass das Polkörperchen entweder bei 12.00 Uhr oder bei 6.00 Uhr sichtbar ist. Somit wird bei der Injektion der intrazelluläre Spindelapparat mit den daran fixierten Chromosomen in unmittelbarer Nähe des Polkörperchens nicht verletzt. In die Injektionspipette (ca. 5 &I;m Durchmesser, mit angeschliffenem Winkel von 20-30°) wird ein Spermium mit der Geißel voran aufgenommen, nachdem es zuvor durch einen Schlag mit der Pipette auf den Schwanzteil immobilisiert wurde. Die Injektionspipette wird exakt gegenüber der Haltepipette durch die Zona pellucida in die Eizelle eingestochen und das Spermium komplett und mit möglichst geringem zusätzlichen Volumen im Zytoplasma der Eizelle deponiert (Al-Hasani 1995, Neulen 1997).

Die entweder spontan oder durch ICSI imprägnierten Eizellen werden anschließend in frische Kulturmedien gebracht und für weitere 24 Stunden kultiviert. Die Kontrolle der Fertilisation erfolgt am darauf folgenden Tag unter Beobachtung der Vorkernstadien. Werden mehr Vorkernstadien beobachtet als Embryonen transferiert werden können, so kann eine Kryokonservierung der imprägnierten Eizellen erfolgen.

2.3.7 Embryotransfer

Nach einer weiteren Inkubation von 24 Stunden erfolgt am Tag 2 oder3 nach der Eizellentnahme der Transfer von maximal 3 Embryonen, die sich in der Regel im Vier- bis Achtzellstadium befinden.

Dazu wird die Patientin ggf. nach leichter Sedierung im Bett in das IvF-Labor gefahren und in Steinschnittlage gelagert. Mit Hilfe eines Entenschnabel-Spekulums wird die Zervix eingestellt und mit einem Tupfer gereinigt. Nur selten ist das Anhaken der Portio zum Einführen des Transferkatheters notwendig. Die zu transferierenden fertilisierten Oozyten werden in ein Transfermedium (Ham‘s F 10 Medium mit 90% Patientinnenserum) überführt und in den Embryonentransferkatheter (Wallace-


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Katheter) geladen. Mit Hilfe einer Mikroliter-Spritze werden 1-3 Embryonen via Katheter transzervikal in das Uteruskavum eingespült. Nach einigen Sekunden in situ wird der Katheter langsam retrahiert und mit Nährmedium ausgespült. Falls verbliebene Embryonen gefunden werden, wird der Vorgang des Transfers wiederholt. Im Anschluss an den Transfer ruht die Patientin für etwa 1 Stunde, bevor sie nach einem ärztlichen Gespräch über ihren Behandlungsverlauf nach Hause entlassen wird (Kentenich 1989, Diedrich 1990).

2.3.8 Unterstützung der Lutealphase

Die Unterstützung der Lutealphase erfolgt mit 5.000 Einheiten HCG am Tage des Embryotransfers mit anschließender Wiederholung vier Tage nach Embryotransfer. Bei starker ovarieller Antwort (viele Eizellen) und erhöhtem Risiko für ein Überstimulationssyndrom (OHSS) erfolgt die Gabe von mikronisierten Progesteronkapseln intravaginal 600 mg täglich (Utrogest® 100 mg, 3 x 2 Kapseln/die). Die Progesterontherapie erfolgt für mindestens 2 Wochen, bei positivem Schwangerschaftstest wird sie fortgeführt (Kentenich 1989, Diedrich 1996).

Der Behandlungserfolg wird gemessen anhand von ß-HCG-Werten aus dem Serum 12 Tage nach Embryotransfer. Der Schwangerschaftstest wird als positiv bewertet bei mindestens zweimaligen ß-HCG-Werten über 50 U/l in mindestens zweitägigen Abständen. Klinische Schwangerschaften werden mittels transvaginaler Sonografie unter dem Nachweis fetaler Herzaktion kontrolliert.

2.4 Behandlungsparameter

2.4.1 Hormonelle Parameter

Durch Bestimmung der Hormonspiegel von Östradiol, LH und Progesteron wurde 14 Tage nach Downregulation und vor Beginn der Stimulationsbehandlung die ovarielle Suppression kontrolliert. Diese wurde definiert mit Östradiolwerten unter 50 pg/ml, LH unter 4 U/l und Progesteron unter 2 ng/ml.

Zum hormonellen Zyklusmonitoring wurden die Östradiol-, LH- und Progesteronbestimmungen am Tag 1 und am Tag 7 der Stimulationsbehandlung, 2 Tage vor HCG-Gabe, 1 Tag vor HCG-Gabe, am Tag der HCG-Gabe morgens um 8.00 Uhr und abends um 22.00 Uhr und am Tage nach der HCG-Gabe durchgeführt.


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Die Messungen wurden am Tag der Blutentnahme im Labor der DRK-Kliniken Mark-Brandenburg, Drontheimer Straße (Leiter: Dr.Ostapovic) mit einem Enzym-Immuno-Essay-Verfahren (Gerät: ACE der Firma Ciba-Corning) durchgeführt.

2.4.2 Fertilitätsparameter

Die Fertilitätsergebnisse wurden kontrolliert mittels der Anzahl der gewonnenen Oozyten (unabhängig vom Reifegrad), der Anzahl der fertilisierten Oozyten, der Anzahl der transferierten Embryonen und der eingetretenen Schwangerschaften.

Schwangerschaft wurde nach dem Deutschen IvF-Register definiert als ß-HCG über 50 IE/ml und/oder einer positiven embryonalen Herzaktion. Somit gehen in diese Untersuchung auch sog. nicht klinische ß-HCG-Schwangerschaften ein (Deutsches IvF Register 1996, 1997 und 1998).

2.4.3 Behandlungsabbrüche

Die abgebrochenen IvF-Zyklen wurden in Einzelfallanalysen ausgewertet.

Im Falle einer vorzeitigen Luteinisierung wurde der Body mass index (BMI = kg/m2) bestimmt: Dieses trat nur in einem Fall auf. Die 1,61 m große Frau mit einem Körpergewicht von 50 kg hatte einen normalen BMI von 19,3. Auf eine Bestimmung des BMI aller Studienpatientinnen wurde verzichtet, da nach intramuskulärer Applikation von Depot-GnRH-Agonisten die erzielten Wirkstoff-Serumspiegel unabhängig sind von unterschiedlicher Größe, Gewicht und BMI der Patientinnen (Runnebaum 1992, Karck 1996).

2.5 Datenauswertung und Statistik

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm SPSS 10.0.

Die Signifikanzprüfungen erfolgten unter Mitarbeit von Herrn Dipl. Physiker J. Pachaly, Bereich Dokumentation und Statistik der Universitätsfrauenklinik der Charité, Campus Virchow-Klinikum.

Die Arbeitshypothese lautete: 2,1 mg Triptorelinacetat (Depot) sind für die LH-Suppression im Stimulationszyklus vor IvF bzw. IvF/ICSI ausreichend.

Vor diesem Hintergrund wurden folgende biometrische Prüfverfahren angewandt:

Mit Fisher‘s-Exact-Test wurden in 4-Feldertafeln zweiseitig Unterschiede in den beiden Studiengruppen geprüft.


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Bei Variablen mit Rangcharakter wurden Unterschiede zweiseitig mit dem U-Test nach Mann-Whitney geprüft.

Sämtliche Verteilungen der Hormonkonzentrationen zu den einzelnen Zeitpunkten im Verlauf der Behandlung wurden mittels Mann-Whitney-U-Test geprüft.

Es wurde ein multivariater Gruppenvergleich mittels logistischer Regression auf statistisch signifikante Zusammenhänge bezüglich möglicher Einflussgrößen (Alter, Sterilitätsfaktoren) zwischen Decapeptylgabe und Behandlungsergebnissen durchgeführt.

Auf eine Power-Analyse wurde verzichtet, da das Studiendesign die Prüfung der Effizienz der halbierten Dosis eines Depot-GnRH-Agonisten bezüglich der LH-Suppression unter Berücksichtigung der Fertilisations- und Schwangerschaftsraten zum Gegenstand hat und nicht die Untersuchung der Differenz der beiden Studiengruppen A und B (Yuzpe et al. 1995).

Statistische Signifikanz wurde bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 angenommen, die jeweiligen Irrtumswahrscheinlichkeiten selbst wurden angegeben.


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