2  Material und Methoden

2.1.1  DNA-Proben von RA-Patienten und Kontrollen

In dieser Arbeit wurde die DNA von 35 RA-Patienten und 28 gesunden Kontrollen untersucht. Die RA-Patienten gehörten zu einer frühen Inzeptionskohorte, welche die Kriterien des American College of Rheumatology erfüllten (siehe 1.2.1), und zu Beginn der Studie eine Krankheitsdauer von weniger als zwei Jahren hatten [8]. Aus dieser Kohorte wurden RA-Patienten ausgewählt, die entweder auf einem oder beiden Allelen DR4-, DR7- oder DR9 positiv waren. Unter ihnen waren acht Patienten DR4-homozygot, sechs DR4-DR7-heterozygot, fünfzehn DR7-heterozygot, zwei DR7-homozygot und vier DR9-heterozygot. Von den 35 RA-Patienten hatten fünfzehn eine CRP-Konzentration ≥15mg/l und siebzehn einen CRP-Konzentration <15mg/l im Serum zu Beginn der Studie, für die verbleibenden drei Patienten gab es keine Angaben.

Zu den 28 Kontrollen gehörten sechs DR4-homozygote, zwei DR4-DR7-heterozygote, sechzehn DR7-heterozygote, drei DR7-homozygote und ein DR9-heterozygoter Spender. Das Alter der Kontrollen lag zwischen 23 und 60 Jahren, das Durchschnittsalter betrug 37 Jahre. Die Kontrollen bestanden zur Hälfte aus Männern und Frauen.

Die Isolierung der genomischen DNA aus dem Blut erfolgte nach der Methode von Sykes [36]. Die HLA-DRB-Allele von RA-Patienten und Kontrollen wurden anhand einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der genomischen DNA und biotinylierten, sequenzspezifischen Oligonukleotid (SSO)-Proben [37] typisiert.

	Abbildung 6: Expressionsvektoren pGL3-Basic und pCMVβ

2.1.4  Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden von der Firma TIB Molbiol aus Berlin synthetisiert.

Für die Bestimmung der DRB4-Speißvarianten wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

Nachstehende Oligonukleotide wurden für die Charakterisierung der HLA-DRB-Promotoren genutzt, dabei besaßen die 5´-Oligonukleotide eine Nhe I-Schnittstelle und das 3´-Oligonukleotid ein Bgl II-Schnittstelle:

Für die Sequenzierung der DRB4-Speißvarianten bzw. der DRB4-Promotoren wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

Für die Versuche zum Bindungsverhalten wurden doppelsträngige, biotinylierte Oligonukleotide genutzt. Im folgenden sind jeweils nur die biotinylierten Einzelstränge aufgeführt, der korrespondierende Gegenstrang war ohne Biotin:

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Die Chemikalien wurden – soweit nicht anders angegeben – in analysenreiner Qualität von den Firmen Merck, Sigma und Roth bezogen.

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2.2.1  Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um die enzymatische Vervielfältigung eines DNA-Fragments zwischen zwei flankierenden Oligonukeotid-Primern (siehe 2.1.4). Der Ablauf der PCR gliedert sich in drei Stufen:

1. Thermische Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Matritze
2. Anlagerung der Primer an die Zielsequenz (Annealing)
3. Verlängerung der Primer durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Extension)

Für die Sequenzierung und die Gewinnung von Inserts für Klonierungen wurde neben der Taq-DNA-Polymerase zusätzlich die Pfu-DNA-Polymerase eingesetzt, die proof-reading-Funktion besitzt. Die Amplifikation der gewünschten DNA-Sequenz erfolgte im folgenden 50µl-Ansatz:

• 5µl 10x PCR-Puffer
• 2,5µl MgCl₂ (25mM)
• 0,5µl dNTPs (25mM)
• 1µl 5´-Primer (50µM)
• 1µl 3´-Primer (50µM)
• 2µl genomische DNA (ca. 200µg/ml)
• 2,5U Taq-DNA-Polymerase
• 0,3U Pfu-DNA-Polymerase
• ad 50µl H₂O

Dieser Ansatz wurde mit dem in Tabelle 3 aufgeführten Programm im Thermocycler vervielfältigt.

Tabelle 3: Programm für die PCR

Die Auftrennung der DNA-Fragmente nach Größe erfolgte durch eine DNA-Gelelektrophorese. Dazu wurde ein 1,4%iges Agarosegel, welches 5µl 1%ige Ethidiumbromid-Lösung enthält, in eine horizontale Apparatur gegossen. Die Proben wurden mit 3µl DNA-Ladepuffer versetzt und auf dem Agarosegel für ca. 1h bei 130V in TAE-Puffer aufgetrennt. Mit Hilfe von UV-Durchlicht konnten die DNA-Banden sichtbar gemacht und fotografiert werden. Anhand des DNA-Molekulargewichtsmarkers konnte die Größe der DNA-Fragmente bestimmt werden.

2.2.3  DNA-Extraktion

Für die Isolierung von DNA-Fragmenten aus der vorangegangenen Gelelektrophorese wurde das Gelextraktionskit der Firma Genomed verwendet. Hierzu wurde die gewünschte Bande aus dem Agarosegel ausgeschnitten und für 15min bei 50°C in 300µl Puffer A1 (Hochsalzpuffer) zuzüglich 10µl Jetsorb-Supension gelöst. Anschließend wurde die Lösung kurz zentrifugiert und das Pellet einmal mit Puffer A1 und zweimal mit Puffer A2 (Niedrigsalzpuffer) gewaschen. Zum Schluß wurde das Pellet 5min bei 50°C getrocknet und in 20µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.4  Spaltung von DNA mit Restriktions-Endonukleasen

Die PCR-Produkte sowie die Vektoren wurden mit Restriktions-Endonukleasen Nhe I und Bgl II in 30µl-Ansätzen folgender Zusammensetzung gespalten:

• 10U Nhe I
• 10U Bgl II
• 3µl 10x Restriktionspuffer
• 3-10µl DNA (je nach Stärke der Banden)
• ad 30µl H₂O

Die einstündige Restriktion erfolgte bei 37°C im Heizblock. Falls die Vektor-DNA für eine Klonierung benötigt wurde, wurde diese zusätzlich mit der alkalischen Phosphatase (AP) behandelt. Mit diesem Enzym wurde das 5´-Ende des Vektors dephosphoryliert, so daß eine Rezirkulierung einmalgeschnittener Vektoren bei der Ligationsreaktion vermieden wurde. Dazu wurde dem 30µl-Ansatz der Restriktion 5U AP und 4µl 10x AP-Puffer zugesetzt und für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung der AP für 10min bei 65°C.

2.2.5  Ligation von DNA-Fragmenten

Vor der Ligation wurden die Restriktionsprodukte durch eine Mikrodialyse mit einer Nitrozellulosemembran von störenden Salzen befreit. Im folgenden 10µl-Ansatz wurden dann über Nacht bei 16°C die jeweiligen Inserts mit dem Vektor pGL3 an den Nhe I- und Bgl II-Schnittstellen ligiert:

• 7µl Insert
• 1µl pGL3-Vektor
• 1U T4-DNA-Ligase
• 1µl 10x Ligationspuffer

2.2.6  Transformation von E. coli-Zellen

Für die Transformtion durch Elektroporation wurden 40µl elektrokompetente E. coli-Zellen und 10µl vorweg dialysierter Ligationsansatz in eine eisgekühlte 2mm-Elektroporationsküvette gegeben. Nach dem Elektoschock mit dem Transformationsgerät wurden die Zellen mit 600µl SOC-Medium versetzt. Danach wurde der Transformationsansatz auf antibiotikahaltige L-Broth-Nährböden gegeben und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die Bakterien, die ein oder mehrere Plasmide aufgenommen haben, bildeten aufgrund ihrer Antibiotikaresistenz Kolonien auf den Nährböden. Positive Klone wurden mit Hilfe der Plasmidpräparation dahingehend geprüft, ob die Plasmide das gewünschte DNA-Fragment insertiert hatten.

2.2.7  Plasmidpräparation

Die Isolierung verschiedener Mengen an hochgereinigter Plasmid-DNA erfolgte nach den Protokollen der Firma Qiagen für Plasmid Mini- bzw. Maxi-Präparation, die für DNA-Mengen bis zu 20µg (Mini) bzw. bis zu 500µg (Maxi) vorgesehen sind. Von einer Übernachtkultur plasmidhaltiger Zellen wurden maximal 3 (250) ml abzentrifugiert (5000rpm). Das Pellet wurde in jeweils 250µl (10ml) P1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250µl (10ml) P2-Puffer wurde die nun stark viskose Suspension 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 350µl (10ml) N3- (P3-) Puffer zugegeben und vorsichtig gemischt. Im folgenden unterscheiden sich die Protokolle für die Mini- und Maxi-Präparation, so daß sie hier getrennt beschrieben werden.

Bei der Mini-Präparation wurde die Suspension für 10min zentrifugiert (13000rpm) und der Überstand auf die QIAprep-Säule gegeben. Nach einer kurzen Zentrifugation wurde die Säule mit 500µl PB-Puffer und danach mit 750µl PE-Puffer gewaschen. Zum Schluß wurde die DNA mit 50µl EB-Puffer eluiert.

Bei der Maxi-Präparation hingegen wurde die Suspension in die QIAfilter-Patrone gegeben und für 10min inkubiert. Anschließend wurde die Lösung mit dem Stempel durch den Filter der Patrone gepreßt und auf die vorher mit QBT-Puffer equilibrierte [Seite 32↓]Säule gegeben. Nach dem Durchlaufen der Suspension wurde die Säule zweimal mit 30ml QC-Puffer gewaschen und mit 15ml QF-Puffer eluiert. Das Eluat wurde nun mit 10,5ml 2-Propanol präzipitiert und für 30min bei 4°C zentrifugiert (11000rpm). Zum Schluß wurde das DNA-Pellet mit 70%-Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in einem geeigneten Volumen an TE-Puffer aufgenommen.

Die DNA-Konzentration aus der Mini- bzw. Maxi-Präparation wurde durch Messung der Absorption (A) bei 260nm im Photometer bestimmt (1A₂₆₀=50µg DNA/ml).

2.2.8  DNA-Sequenzierung

Bei der Sequenzierungsreaktion wurden fluoreszenzmarkierte ddNTPs verwendet, die beim Einbau neben den dNTPs zum Kettenabbruch der Elongation führen. Als Matritze diente entweder die Plasmid-DNA oder aber das PCR-Produkt, welches vorher durch die DNA-Gelelektrophorese gereinigt und anschließend aus dem Agarosegel extrahiert wurde.

Die Sequenzierungsreaktion wurde mit dem Sequencing reaktion kit (Big Dye) der Firma Perkin Elmer, der Taq-DNA-Polymerase, F1, dNTPs, ddNTPs, MgCl₂ und Puffer enthält, in folgenden 10µl-Ansätzen durchgeführt:

• 0,5µl Plasmid-DNA oder 2µl PCR-Produkt
• 2µl Big Dye
• 1µl Primer (5µM) (siehe 2.1.4)
• ad 10µl H₂O

Das Programm in Tabelle 4 wurde für die Sequenzierungsreaktion im Thermocycler verwendet.

Tabelle 4: Programm für die Sequenzierungsreaktion

Anschließend wurden die Proben durch Zugabe von

• 90µl H₂O
• 10µl 3M Na-Acetat, pH5
• 250µl 100%-Ethanol

gefällt. Danach wurden die Ansätze für 15min zentrifugiert (13000rpm) und die DNA-Pellets nach dem Waschen mit 250µl 70%-Ethanol erneut zentrifugiert. Die für 10min bei 50°C getrocknete DNA wurde in 25µl H₂O aufgenommen und schließlich im Sequenziergerät ABI PRISM 310 sequenziert und ausgewertet.

2.2.9  Kultivierung und Stimulierung von Zellen

Die Kultivierung der beiden verwendeten Zellinien BJAB und THP-1 erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂-Begasung. Zur Stimulierung der Zellinien wurden unterschiedliche Stimuli verwendet, wobei die Konzentrationen der einzelnen Stimuli in Tabelle 5 aufgeführt sind. Die Dauer der Stimulation betrug jeweils 48h.

Tabelle 5: Konzentrationen der einzelnen Stimuli

Mittels Durchflußzytometrie läßt sich feststellen, inwiefern die Stimulation Einfluß auf die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen hat. Der mit dem Fluoreszenzfarbstoff R-Phycoerythrin (PE) gekoppelte Antikörper L243 bindet dabei spezifisch an diese Moleküle und emittiert bei einer Wellenlänge von 575nm. Als Kontrolle für eine spezifische Bindung des L243-Antikörpers an die HLA-DR-Moleküle wurde ein Antikörper gleichen Isotyps gewählt, damit eine Bindung der Antikörper an die Fc-Rezeptoren der Zellen ausgeschlossen wird.

Das FACS-Gerät kann die Fluoreszenzintensität dieser Wellenlänge auf den Zellen in vivo detektieren. Dazu wurden ca. 10⁵ Zellen pro Ansatz mit PBS/BSA/Azid-Puffer gewaschen und 15min bei 4°C mit humanen IgG, welches die Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche blockieren soll, in einer Verdünnung von 1:10 inkubiert. Der L243-Antikörper wurde unter gleichen Bedingungen in einer 1:20 Verdünnung hinzugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit PBS/BSA/Azid-Puffer gewaschen und in 500µl PBS/BSA/Azid-Puffer resuspendiert. Für die Isotypkontrolle (anti-CD3, PE-konjugiert) wurde analog verfahren. Mit Hilfe des Programms CellQuest wurden die Messungen am FACS-Gerät ausgewertet.

2.2.10  Transfektion eukariotischer Zellen

Die Zellen, die durch Elektroporation transient transfiziert werden sollten, wurden während der logarithmischen Wachsstumsphase geerntet. Nachdem die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wurden, wurden pro Transfektionsansatz 5x 10⁶ Zellen in serumfreies Zellkulturmedium gegeben. Zusätzlich wurden pro Ansatz 20µg Plasmid-DNA (pGL3-Vektor mit oder als Kontrolle ohne Promotor) sowie 5µg pCMVβ-Vektor (zur Ko-Transfektion) hinzugefügt. Der gesamte Transfektionsansatz wurde nun in eine 4mm-Elektroporationsküvette gefüllt und für 10min bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich die Plasmid-DNA an die Zellmembran anlagern kann. Die Elektroporation erfolgte bei 250V, 960µF und 0Ω, wobei die Zeitkonstante bei ca. 20ms^-1 liegen sollte. Schließlich wurde die Probe gut gespült in 1,5ml vorgewärmtes Zellkulturmedium einer 12-well-Platte gegeben.

2.2.11  Aktivitätsbestimmung der Luziferase

Die Luziferase wandelt das Substrat Luziferin in Gegenwart von molekularem O₂, ATP und Mg²⁺ in Oxyluziferin und CO₂ um. Bei dieser Reaktion wird Licht einer Wellenlänge von 562nm emittiert, das in einem Luminometer gemessen werden kann.

Zur Bestimmung der Luziferaseaktivität wurden die transfizierten THP-1-Zellen nach 6h und die BJAB-Zellen nach 22h zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 200µl Reporter-Lysis-Puffer aus dem Luziferase-Kit der Firma Promega lysiert. Nach einer 10minütigen Inkubation wurden die Lysate für 3min zentrifugiert (13000rpm) und der Überstand abgenommen. Zur Messung der Luziferaseaktivität wurde pro Ansatz 20µl Überstand in ein FACS-Röhrchen gegeben und im Luminometer unter Zusatz von je 100µl Substrat die Lichtemission detektiert. Dabei wurden die ermittelten Luziferasesaktivitäten der einzelnen Promotorkonstrukte in Relation zur Aktivität des pGL3-Vektors ohne Promotor gesetzt.

2.2.12  Aktivitätsbestimmung der β-Galaktosidase

Die β-Galaktosidase katalysiert die Hydrolyse des Substrats o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG). Das Produkt o-Nitrophenol dieser Reaktion kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 405nm nachgewiesen werden.

Für die Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität wurden die Zelllysate vom Luziferase-Assay verwendet. Je 50µl Zelllysat wurde mit 50µl 2x Assaypuffer aus dem β-Galaktosidase-Kit der Firma Promega in einer Mikrotiterplatte (96-well) gemischt. Nach einer Inkubationszeit (1h, 37°C) konnte die Umsetzung des Substrats bei 405nm im ELISA-Reader gemessen werden. Schließlich wurden die Luziferase-Werte durch die β-Galaktosidase-Werte dividiert, um die relative Luziferaseaktivität zu erhalten.

2.2.13  Zellkernextraktion

Zur Ermittlung der Bindungsaffinität der jeweiligen Transkriptionsfaktoren an die unterschiedlichen Boxen der HLA-DR-Promotoren wurden die Zellkernlysate von den Zellinien THP-1 und BJAB extrahiert.

Für die Zellkernextraktion wurden 5x 10⁷ Zellen pro Ansatz genommen und zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde nun in 500µl Kernextraktionsuffer A resuspendiert und 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Hinzufügen von NP-40 in einer Endkonzentration von 0,5% wurde die Suspension 10s gevortext und 20s bei 6500rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 150µl Kernextraktionsuffer C aufgenommen und 30min mit dem Magnetrührer auf Eis gerührt. Zum Schluß wurde nach der 10minütigen Zentrifugation (13000rpm) der Überstand abgenommen und 10µl zur Proteinbestimmung des Zellkernextraktes abgenommen.

2.2.14  Proteinbestimmung

Mit dem BCA-Proteinassay lassen sich insbesondere Peptidbindungen detektieren. Cu²⁺-Ionen werden dabei im alkalischen Milieu zu Cu¹⁺-Ionen reduziert. Diese komplexieren mit 2 Molekülen BCA (Bichinolin-4-Carbonsäure) und ergeben einen violetten Farbstoff mit einer Absorption bei 562nm.

Um den genauen Proteingehalt der Zellkernextrakte zu ermitteln, wurde mit Hilfe von BSA eine Eichreihe von 0 – 2mg BSA/ml erstellt. Die Lösungen A und B des BCA-Assays werden dabei im Verhältnis 50:1 gemischt. Je 2ml des Gemisches wurden nun entweder mit 100µl Standard oder Zellkernextrakt (1:10 verdünnt) versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Anhand der im Photometer gemessenen Aborption bei 562nm ließ sich über die Eichgerade der Proteingehalt der unbekannten Proben ermitteln.

2.2.15  Bindungsstudien mit Hilfe von surface plasmon resonance (SPR)

Das optische Phänomen der surface plasmon resonance (SPR) wurde zur Analyse der Interaktion von Zellkernextrakten mit Promotor-Oligonukleotiden verwendet. In Biacore-Instrumenten wird einer der Reaktionspartner, der Ligand, auf einen Sensorchip immobilisiert, während der andere Reaktionspartner, der Analyt, in kontinuierlichen Fluß über die Sensorchip-Oberfläche geleitet wird. Die Detektion der Bindung basiert darauf, daß eine Massenänderung auf der Chipoberfläche, hervorgerufen durch die Interaktion von Ligand und Analyt, eine Änderung des Brechungsindex an der Chipoberfläche bewirkt. Die Bindung wird in Form eines SPR-Signals, ausgedrückt in Resonance Units (RU), gemessen. Durch kontinuierliche Aufzeichnung des Signals kann die Bindungskinetik in Echtzeit verfolgt werden.

Zur Messung der Interaktion von Zellkernlysaten mit spezifischen Promotor-Oligonukleotiden wurde wie folgt verfahren: Zuerst wurde der Streptavidin (SA)-Sensorchip nach Angaben des Herstellers vorbehandelt, um lose Verbindungen der Chipoberfläche zu entfernen. Dies geschah durch drei kurze Pulse mit 15µl 1M NaCl/50mM NaOH und fünf kurze Pulse mit 5µl 0,05% SDS in TES-Puffer. Als nächstes wurden doppelsträngige Oligonukleotide, welche die einzelnen Boxen der unterschiedlichen Promotoren repräsentieren, hergestellt, indem jeweils die beiden komplementären Stränge des Promotorbereichs hybridisiert wurden. Dazu wurde der biotinylierte Strang mit dem unmarkierten Gegenstrang (siehe 2.1.4) im Verhältnis 1:2 gemischt und für 3min auf 95°C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Jedes biotinylierte doppelsträngige Oligonukleotid wurde in TES-Puffer bis zu einer Endkonzentration von 100nM verdünnt und mit einer Flußrate von 5µl/ml mit TES-Puffer als Laufpuffer in eine der vier Flußzellen des Sensorchips injiziert. Die Bindung des Oligonukleotids wurde vom Instrument aufgezeichnet, und die Injektion nach Immobilisierung von 400RU DNA manuell beendet. Die Chipoberfläche wurde mit TES-Puffer gespült und anschließend mit Biotin abgesättigt. Dazu wurde 1min lang eine Biotinlösung (2mg/ml in 10mM NaOH) mit einer Flußrate von 5µl/ml und TES-Puffer als Laufpuffer injiziert. Der Chip wurde anschließend nochmals mit TES-Puffer gespült.

Alle Messungen erfolgten bei einer Temperatur von 25°C und einer Flußrate von 30µl/ml in Biacore-Laufpuffer mit einer Zellkernlysat-Konzentration von 100µg/ml. Es wurden jeweils 250µl Probe injiziert und nach Beendigung der Assoziationszeit zur Aufnahme der Dissoziationskinetik für 300s durch konstanten Pufferfluß ersetzt. Nach jedem Zyklus wurde der Chip durch zwei kurze Pulse von 0,05% SDS in TES-Puffer regeneriert. Die Interaktion der Zellkernlysate mit der DNA wurde für jeden Zyklus durch kontinuierliche Messung der RU festgehalten. Die Datenanalyse erfolgte mit der BIAevaluation-Software, Version 3.0. Das Bindungsverhalten wurde ermittelt durch den RU-Wert am Ende der Assoziationsphase abzüglich des RU-Wertes vor der Injektion der Zellkernproteine. Von den spezifischen Bindungsaffinitäten wurde dann der RU-Wert der Referenzzelle ohne DNA subtrahiert und auf die unspezifische DNA (Random) bezogen (im Falle der X-Box-Oligonukleotide aufgrund der längeren Sequenz auf Random2).

2.2.16  Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

Der Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ist eine Alternative zur Bestimmung der Bindungsaffinität mittels Biacore-Technologie. Hierbei werden die einzelnen radioaktivmarkierten Promotorabschnitte mit den Zellkernlysaten gemischt und anschließend durch ein natives Polyacrylamidgel (PA-Gel) elektrophoretisch getrennt. Um die Bindungsstärke der Proteine des Zellkernextraktes an zwei verschiedenen Zielsequenzen zu vergleichen, werden die beiden radioaktivmarkierten Promotor­abschnitte zusätzlich mit unmarkierter Promotor-DNA derselben Sequenz kompetiert.

Für den EMSA wurde zunächst der sense-Strang (siehe 2.1.4) der Zielsequenz radioaktiv markiert, indem er durch die T4-Kinase vom Labeling-Kit der Firma Promega am 3´-Ende mit γ-³²P-ATP phosphoryliert wurde. Diese Reaktion erfolgte im folgenden Ansatz:

• 2µl Oligonukleotid (10µM)
• 2µl 10x Label-Puffer
• 2µl T4-Kinase
• 5µl γ-³²P-ATP
• 9µl H₂O

Die Probe wurde 1h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion unter Zugabe von 2µl 500mM EDTA gestoppt. Anschließend wurde die Probe mit H₂O auf 50µl aufgefüllt und durch Auftragen auf eine Probequant G-50-Säule vom überschüssigen γ-³²P-ATP befreit. Dazu wurde die Säule in ein 1,5ml-Gefäß gegeben und 2min bei 1000rpm zentrifugiert. Das gereinigte Eluat wurde nun mit dem komplementären Oligonukleotid (siehe 2.1.4) hybridisiert, dieser Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:

• 50µl ³²P-Oligonukleotid (0,2µM)
• 5µl komplementäres Oligonukleotid (100µM)
• 5µl 10x NE2-Puffer
• 40µl H₂O

Nach dem zweiminütigen Erhitzen der Probe auf 95°C wurde sie langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die anschließende 15minütige Bindungsreaktion der doppelsträngigen Promotorabschnitte an die Zellkernextrakte erfolgte im folgenden 20µl-Ansatz:

• 10µl 2x Bindepuffer (inkl. Protease-Inhibitor-Cocktail)
• 1µl doppelsträngiges Oligonukleotid (0,1µM)
• 2µl Kernextrakt (2mg/ml)
• 2µl poly dI/dC (0,5mg/ml)[Seite 38↓]
• Kompetitoren in unterschiedlichen Konzentrationen (0-10µM)
• ad 20µl H₂O

Danach wurden die Proben durch eine native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Dazu wurde vorerst ein unteres, etwa 2cm breites 10%iges PA-Gel in die Elektrophoresekammer gegossen, es beinhaltete:

• 2,7ml 30% Acrylamid
• 0,8ml 5x TBE-Puffer
• 14µl 20% APS
• 9µl TEMED
• 4,5ml H₂O

Nach dem Auspolymerisieren des Gels wurde ein weiteres, etwa 13cm breites PA-Gel in die Apparatur gegossen, das 5%ige PA-Gel setzte sich folgendermaßen zusammen:

• 5,35ml 30% Acrylamid
• 4ml 5x TBE
• 70µl 20% APS
• 45µl TEMED
• 20,65ml H₂O

Nach Beendigung des einstündigen Vorlaufs in 0,5x TBE-Puffer bei 200V, 20mA und 4°C wurden die Proben mit 3µl DNA-Lade-Puffer versetzt und für ca. 3h unter gleichen Bedingungen elektrophoretisch getrennt. Schließlich wurde das Gel für ca. 1h bei 70°C getrocknet und über Nacht auf einem Röntgenfilm exponiert. Zur Quantifizierung der einzelnen Banden des PA-Gels wurden sie auf dem Phosphoimager mit dem Programm Image Quant ausgewertet. Dazu wurde die Intensität der einzelnen Banden auf die jeweilige Gesamtintensität der Spur bezogen.