4  Diskussion

Bei der Untersuchung der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen im Rahmen dieser Arbeit wurden bekannte Polymorphismen in den Promotorregionen dahingehend analysiert, ob sie von funktioneller Bedeutung sein könnten. Dabei waren die Promotorbereiche des DR53-Locus Gegenstand der Analyse, da sowohl der mit der RA assoziierte Haplotyp DR4 als auch die neutralen Haplotypen DR7 und DR9 von diesem Locus kodiert werden.

4.1  Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in der THP-1- und in der BJAB-Zellinie

In Kapitel 3.3 wurde gezeigt, daß Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und DRB4B-Promotoren in den beiden Zellinien zu verzeichnen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß in der B-Lymphom-Zellinie BJAB die DR4-Promotoraktivität am höchsten ist, danach folgen die von DRB4B, DR9 und DR7, die transkriptionelle Aktivität von DRB4A ist am geringsten.

Louis et al. hatten für die B-EBV-Zellinie BM92 bereits angedeutet, daß die mittels Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)-Assay ermittelten Promotoraktivitäten von DR4 und DRB4B etwa doppelt so hoch sind wie die von DR7 und DR9 [39]. In einer Studie von Leen und Gorski wurden lediglich die Promotoraktivitäten von DR7 und DRB4A miteinander verglichen [40]. Sie haben mit Hilfe eines CAT-Assays gezeigt, daß die beiden Promotoraktivitäten in der B-Lymphom-Zellinie RAJI miteinander vergleichbar sind.

Damit entsprechen die Ergebnisse dieser beiden Studien zumindest qualitativ den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Die transkriptionellen Aktivitäten von DR4 und DRB4B sind in BJAB höher als die von DR7, DR9 und DRB4A, wenngleich die Unterschiede in meiner Arbeit nicht so groß sind. Aufgrund der unterschiedlichen Zellinien, anders gewählten Promotorabschnitten und unterschiedlichen Methoden ist ein Vergleich der Analysen allerdings nur begrenzt möglich.

In der Monozytenzellinie THP-1 ist die Promotoraktivität von DRB4B am höchsten, darauf folgen die von DR9, DRB4A und DR9, am geringsten ist die Promotoraktivität von DR4. Es gibt dazu keine vergleichbaren Werte in der Literatur. In einer Studie von Leen und Gorski deuteten die Ergebnisse mit mononukleären Zellen des peripheren Blut (PBMC) darauf hin, daß die Aktivität des DRB4B-Promotors höher ist als die des DRB4A-Promotors [22]. In einem RNase-Protection-Assay haben sie gezeigt, daß die prä-mRNA-Konzentration dreifach und die mRNA-Konzentration von DRB4B fünffach [Seite 59↓]höher sind als die jeweiligen Konzentrationen von DRB4A. Insgesamt variierten die Promotoraktivitäten in der monozytären Zellinie mehr als in der B-Lymphom-Zellinie.

In Kapitel 3.4 wurde mit Hilfe der SPR untersucht, ob die unterschiedlichen Promotoraktivitäten (siehe 3.3) und die unterschiedlichen HLA-DR-Oberflächenexpressionen (siehe 3.2) auf das Bindungsverhalten der Zellkernlysate der zwei Zellinien an die einzelnen Boxen zurückzuführen ist. Dabei wurde angenommen, daß die spezifische Bindung der Transkriptionsfaktoren an die einzelnen Promotorsequenzen in linearer Beziehung zur transkriptionellen Aktivität steht. Ferner wurde davon ausgegangen, daß sich die Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten auf die jeweiligen HLA-DR-Expressionen auswirken und daß die α-Kette nicht limitierend für die Oberflächenexpression ist.

Die Unterschiede zwischen den einzelnen Bindungen wären möglicherweise größer, wenn man nicht Zellkernextrakte sondern rekombinante Transkriptionsfaktoren als Analyten bei den Bindungsstudien verwendet hätte. Andere Bestandteile des Zellkernextraktes kompetieren um die Bindung an den Liganden (das Promotor-Oligonukleotid), so daß bei den Bindungsstudien nie eine Sättigung – auch nicht in höheren Konzentrationen – erreicht wurde (Daten nicht gezeigt).

Die Polymorphismen, die hier betrachtet wurden, sind je nach Box unterschiedlich. Es gibt Boxen, die stark konserviert sind, Boxen, innerhalb derer es Substitutionen gibt, aber auch Boxen, bei denen es nur in den flankierenden Bereichen Unterschiede zwischen den Allelen gibt.

Das Modell der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen betrachtet nicht nur den Polymorphismus der kodierenden Gensequenzen sondern darüber hinaus auch den Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen, der Promotorsequenzen. Der Polymorphismus ist durch die Polygenie dieses Genortes verstärkt, wobei die Entwicklung eines zweiten funktionellen DRB-Gens in Form von unterschiedlichen allelischen Linien bisher für keinen anderen Locus bekannt ist. Um das Überleben der Art zu gewährleisten, sind vermutlich im Laufe der Evolution unterschiedliche MHC-Moleküle entstanden, die möglichst viele Erreger bei der Immunabwehr erkennen. Indessen könnten unterschiedliche Promotoren durch unterschiedliche Promotoraktivitäten eine differentielle Expression bewirken. Die differentielle Expression könnte man als zusätzliche Flexibilität bei der Immunabwehr verschiedener Erreger betrachten. Damit wird dem in der Evolution entwickelten Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen neben dem Polymorphismus der kodierenden [Seite 60↓]Gensequenzen eine Bedeutung zugeschrieben. Dies trifft möglicherweise auch für andere Gene zu. Erst kürzlich wurde gezeigt, daß eine hirnspezifische differentielle Genexpression möglicherweise den Entwicklungsunterschied zwischen Menschen und Schimpansen ausmacht [41].

Es stellt sich die Frage, ob und wie man die Ergebnisse der Bindungsstudien auf die jeweiligen Promotoraktivitäten beziehen kann. Sobald sich die einzelnen Sequenzen an mehreren Positionen unterscheiden und daraus unterschiedliche Stärken der Bindungen resultieren, ist nicht eindeutig, welche Bindungsaffinitäten zu welchem Anteil in die transkriptionelle Aktivität eingehen. Für die Maus wurde unlängst gezeigt, daß ein einzelner Basenpaaraustausch von A zu G innerhalb der X-Box die Promotoraktivität eines MHC-II-Gens in einer Makrophagenzellinie senkt [30]. Die Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten werden möglicherweise noch verstärkt, wenn man in Betracht zieht, daß die Unterschiede zwischen den mRNA-Konzentrationen von zwei Promotoren höher sind als die entsprechenden prä-mRNA-Konzentrationen [22]. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß die transkriptionellen Aktivitäten von zwei murinen MHC-II-Allelen, die durch die Aktivitätsbestimmung der Luziferase ermittelt wurden, um einen geringeren Faktor differieren als die entsprechenden Oberflächenexpressionen der MHC-II-Moleküle [30, 31].

Der auffälligste Unterschied zwischen den transkriptionellen Aktivitäten in den beiden Zellinien ist die achtfach höhere Promotoraktivität von DRB4B im Vergleich zu DRB4A für THP-1, aber nur eine zweifach höhere für BJAB. Der einzige Sequenzunterschied zwischen den beiden DRB4-Promotoren, der das Bindungsverhalten beeinflußt, liegt 3´ der TATA-Box. Das mit Hilfe der SPR ermittelte Bindungsverhalten hinsichtlich der beiden verschiedenen TATA-Boxen kann die unterschiedlichen Verhältnisse der Promotoraktivitäten von DRB4B zu –A nicht erklären, da in beiden Fällen die Verhältnisse der Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate von THP-1 und BJAB zueinander gleich waren. Daher gibt es vermutlich noch andere, außerhalb des hier betrachteten Promotorbereiches liegende, regulierende Elemente, welche die Transkriptionsrate in beiden Zellinien unterschiedlich beeinflussen.

Interessanterweise wurden in dieser Arbeit keine großen Unterschiede zwischen den Bindungsaffinitäten der HLA-DRB1-Allele gemessen. Sowohl für die S-Box als auch für die CCAAT-, TATA- und X-Boxen wurden keine deutlichen Unterschiede zwischen den Bindungen an die Zellkernextrakte der beiden Zellinien detektiert. Die mit dem Luziferase-Assay ermittelten transkriptionellen Aktivitäten von DR4, DR7 und DR9 variieren ebenfalls nicht sehr stark (lediglich die DR4-Promotoraktivität ist in der THP-1-Zellinie etwa zweifach niedriger als Promotoraktivitäten von der DR7 und DR9). Unterschiedliche Transkriptionsaktivitäten sind auch nicht erwartet worden, da sich die Promotorsequenzen der DRB1-Allele nur geringfügig voneinander unterscheiden.

Dadurch, daß die mit der SPR ermittelten Bindungsaffinitäten der CCAAT- und S-Boxen kaum variieren, scheinen die beiden Boxen keinen Einfluß auf die unterschiedlichen Promotoraktivitäten bzw. die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen zu haben.

Bei der Y-Box wurden dagegen deutliche Unterschiede zwischen den Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die Promotor-Oligonukleotide von DRB1 und DRB4 beobachtet (siehe 3.4.3). Diese Unterschiede sind auf zwei Substitutionen innerhalb der Y-Box zurückzuführen. Interessanterweise besitzen die DRB4-Promotorsequenzen der Y-Box eine Substitution, welche die Affinität zum NF-Y und anderer redoxabhängiger Transkriptionsfaktoren senkt [42]. Auf der anderen Seite scheint die Substitution 5´ der Y-Box, die einen der zwei Unterschiede zwischen DRB4A und –B darstellt, für das Bindungsverhalten der THP-1- und BJAB-Zellkernlysate unerheblich zu sein, da die gemessenen relativen Bindungsaffinitäten nur geringfügig voneinander abweichen. In der Literatur wird die Region 5´ der Y-Box für DRA als B-Cell factor-1 (BCF-1)-Element beschrieben [43]. Unterschiede in diesem Element scheinen hier jedoch das Bindungsverhalten an die Y-Box nicht zu beeinflussen. Daher beruhen die gemessenen Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten von DRB4A und –B vermutlich nicht auf der Y-Box.

Besonders hervorzuheben ist das Bindungsverhalten der Zellkernextrakte beider Zellinien an die ubiquitäre TATA-Box. Hier zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den DRB4A- und –B-Promotoren. Einerseits war die gemessene Differenz in beiden Zellinien die höchste Differenz, die überhaupt für die DRB-Promotoren aller Boxen zu verzeichnen war. Andererseits scheint dieser etwa zweifache Unterschied - relativ gesehen - gering zu sein. Durch die Kompetitionsanalyse mittels EMSA wurde die höhere Bindungsaffinität zur TATA-Box von DRB4B allerdings mit einer anderen Methode bestätigt. Die stärkere Bindung der Zellkernextrakte an das DRB4B-Oligonukleotid der TATA-Box scheint damit ursächlich im Basenpaaraustausch 3´ der TATA-Box zu liegen. Dieser Basenpaaraustausch ist neben dem 5´ der Y-Box (siehe 3.4.4) der einzige, der die Promotorsequenzen von DRB4A und –B unterscheidet. Somit ist es höchstwahrscheinlich, daß die höhere transkriptionelle Aktivität des DRB4B-Promotors, die in Kapitel 3.3 bestimmt wurde, auf diesen einzelnen Basenpaaraustausch zurückzuführen ist. Die differentielle Expression von DRB4A und –B wird damit vermutlich über die ubiquitäre TATA-Box und nicht über die HLA-II-spezifische X-Box und CIITA reguliert.

Die Untersuchung des Bindungsverhaltens der für die HLA-II-Promotoren spezifischen X-Box ergab, daß sowohl die Zellkernextrakte der Monozyten-Zellinie als auch die der B-Lymphom-Zellinie deutlich besser an die Promotor-Oligonukleotide von DRA binden als an die von DRB. Darüber hinaus lassen sich alle Bindungsaffinitäten durch die Stimulation mit INF-γ im Falle von THP-1 deutlich und im Falle von BJAB nur etwas steigern.

In bezug auf den Vergleich von DRA mit DRB wurde bereits von Louis et al. angedeutet, daß die durch einen CAT-Assay bestimmte Promotoraktivität von DRA vierfach höher ist als die von DR4, bzw. achtfach höher als die von DR7 und DR9 [39]. Eine Kompetitionsanalyse mittels EMSA von Louis-Plence et al. hatte ergeben, daß die Transkriptionsfaktoren, die an die X-Box binden, die höchste relative Bindungsaffinität zu der X-Box von DRA haben. Die relative Bindungsaffinität zur X-Box von DRB war hingegen am geringsten, geringer sogar als die zur X-Box von DPA, DQB, DQA oder DPB [44]. Somit entsprechen die in dieser Dissertation gemessenen Daten der Auffassung, daß die HLA-II-Expression über die Locus-spezifische X-Box, die mit dem RFX-Kompex und dem CIITA interagiert, reguliert wird [14]. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, daß die DRA-Expression der reglementierende Schritt bei der HLA-DR-Oberflächenexpression ist [39], da sich die Bindungsaffinität der THP-1-Zellkernextrakte an die X-Box-Sequenz von DRA durch die Stimulation am stärksten steigern ließ.

Durch die Gabe von INF-γ wurde die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen in den monozytären Zellen deutlich verstärkt (siehe 3.2). Dies spiegelte sich auch bei der Bindungsaffinitäten der Zellkernextrakte an die X-Box wider, die durch die Stimulation mit INF-γ ebenfalls erhöht wurden. Eine Stimulation mit den anderen Substanzen führte weder zu einer Erhöhung der HLA-DR-Oberflächenexpression noch zu einem deutlichen Anstieg der Bindungsaffinitäten. Die INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression wird nach den Ergebnissen dieser Arbeit vermutlich über die X-Box vermittelt. Gleiches gilt für die HLA-DR-Oberflächenexpression in der Zellinie BJAB, bei der lediglich die mittlere Fluoreszenzintensität der zu 100% HLA-DR-positiven Zellen etwas zunimmt. Entsprechend wurden hier die insgesamt höheren Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernextrakte an die einzelnen Promotor-Oligonukleotide durch die Stimulation mit INF-γ nur im geringen Ausmaße erhöht. Darüber hinaus zeigte sich auch für die BJAB-Zellinie, daß eine Stimulation mit weiteren Substanzen weder die HLA-DR-Oberflächenexpression noch das Bindungsverhalten der Zellkernlysate wesentlich beeinflußt.

Das Unvermögen der BJAB-Zellinie zur deutlichen Erhöhung der HLA-DR-Oberflächenexpression stimmt mit den Ergebnissen von Czerwony et al. überein, bei denen sich humane B-Lymphozyten des peripheren Bluts nicht mit LPS/PMA stimulieren ließen [32]. Die B-Zellen als ein Vertreter der APC scheinen daher unempfänglich für eine differentielle Expression von HLA-DRB-Genen zu sein. Dagegen kommt vermutlich den Monozyten – den Ergebnissen mit der THP-1-Zellinie nach zu urteilen – eine weit wichtigere Rolle bei der differentiellen Expression zu. Sie reagieren auf eine Stimulation mit einer unterschiedlichen HLA-DR-Expression, die sich möglicherweise auch auf das Th1/Th2-Gleichgewicht auswirkt.

Für das murine System wurde bereits gezeigt, daß eine differentielle Expression von MHC-II-Genen auf die Makrophagen beschränkt ist und sich auch auf die Zytokinproduktion der T-Zellen auswirkt [31]. Eine hohe MHC-II-Expression der Makrophagen regte die T-Zellen in deren Gegenwart zur Ausschüttung von Zytokinen an, die eine Th1-Antwort begünstigen. Im Gegensatz dazu führte eine geringere MHC-II-Expression der Makrophagen zu einer vermehrten Produktion Th2-spezifischer Zytokine der T-Zellen. Die Verschiebung des Th1/Th2-Gleichgewichtes durch die differentielle Expression der Monozyten könnte sich somit auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA auswirken.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde beschrieben, daß der DR7-Haplotyp bevorzugt sowohl mit dem DRB4B-Promotor als auch mit der DRB4-Spleißvariante assoziiert ist (siehe 3.1). Zu den Häufigkeiten der DRB4-Spleißvariante unter DRB4-positiven Individuen gab es bisher keine Zahlen, wohl aber zur Verteilung des DRB4B-Promotors. In einer japanischen Studie wurde für eine japanische Population beschrieben, daß 2 von 86 DR4-positiven Allelen (2%) bzw. 1 von 42 DR9-positiven Allelen (3%) mit dem DRB4-Gen assoziiert waren [45]. Hingegen waren 2 von 5 DR7-positiven Allelen (40%) mit dem DRB4B-Promotor assoziiert. Es ist bemerkenswert, daß in der japanischen Population im Gegensatz zu der hier betrachteten Population kaukasischen Ursprungs der DR9-Haplotyp aufgrund des anderen ethnischen Hintergrunds wesentlich häufiger auftritt als der DR7-Haplotyp. Nichtsdestotrotz bestätigt sich, daß der DRB4B-Promotor bevorzugt mit dem DR7-Haplotypen assoziiert ist, wenngleich die Anzahl der betrachteten Allele mit 5 sehr niedrig ist.

Das gehäufte Auftreten des DRB4B-Promotors und der DRB4-Spleißvariante unter DR7-positiven Individuen hat für die HLA-DR-Expression zwei gegensätzliche Konsequenzen zur Folge. Zum einen bedeutet das Tragen der DRB4-Spleißvariante, daß es durch die Mutation an der Spleißerkennungssequenz zu keiner DRB4-Expression [Seite 64↓]kommt. Daraus folgt, daß die gesamte HLA-DR-Expression eines Chromosoms nur auf das DRB1-Gen zurückzuführen ist. Das häufigere Auftreten des DRB4B-Promotors im Vergleich zum DRB4A-Promotor bedeutet zum anderen, daß die DRB4-Expression bei DR7-positiven Individuen höher ist, wenn man unterstellt, daß sich die transkriptionellen Aktivitäten auch auf die entsprechenden HLA-DR-Expressionen auswirken. Es wurde in dieser Arbeit beschrieben, daß die transkriptionellen Aktivitäten des DRB4B-Promotors sowohl in der Monozytenzellinie THP-1 als auch in der B-Lymphom-Zellinie BJAB höher sind als die des DRB4A-Promotors (siehe 3.3). Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sich DR7-positive Individuen sowohl durch eine erhöhte DRB4-Expression (DRB4B-Promotor) als auch durch eine geringere DRB4-Expression auszeichnen (DRB4-Spleißvariante). Die Häufigkeiten der Assoziation mit dem DRB4B-Promotor und mit der DRB4-Spleißvariante sind aber sowohl in der Gruppe der RA-Patienten als auch in der der Kontrollen gleich verteilt (siehe 3.1). Daraus kann man schließen, daß die unterschiedliche Expression des DRB4-Gens zumindest nach dieser Studie keinen Einfluß auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA hat.

Jedoch deuten die Ergebnisse in Kapitel 3.5 darauf hin, daß eine erhöhte HLA-DR-Expression mit der Schwere des Krankheitsverlaufes der RA korreliert. Unter den RA-Patienten mit einer höheren CRP-Konzentration im Serum war die Häufigkeit des DRB4B-Promotors, der eine höhere transkriptionelle Aktivität als der DRB4A-Promotor besitzt, statistisch signifikant erhöht. Weiterhin war das Auftreten der DRB4-Spleißvariante, welche eine DRB4-Expression verhindert, unter den RA-Patienten mit einer höheren CRP-Konzentration geringer. Dennoch war dieses zweite Ergebnis aufgrund der geringen Anzahl der betrachteten Allele statistisch nicht signifikant.

Interessanterweise gab es keinen deutlichen Unterschied zwischen den Häufigkeiten der HLA-DRB1*04-, -*07- und -*09-Allele in den beiden Patientengruppen. Da die hier untersuchte RA-Kohorte jedoch eine statistisch signifikante Assoziation mit dem Haplotyp HLA-DRB1*04 zeigt, scheint das gemeinsame Epitop („shared epitope“) keinen Einfluß auf die Schwere des Krankheitsverlaufes zu haben. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen des DR53-Locus keinen Einfluß auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA hat, wohl aber einen Einfluß auf den Krankheitsverlauf der RA.

In dieser Arbeit wurde für die Untersuchung der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen in zwei verschiedenen APC die monozytäre Zellinie THP-1 und die B-Lymphom-Zellinie BJAB gewählt. Es bleibt zu klären, inwiefern auch andere Zelltypen eine differentielle Expression aufweisen. Zum einen wären die dendritischen Zellen als dritter Vertreter der APC interessant. Zum anderen findet man auch HLA-DR-positive Zellen in der Gelenkhaut (Synoviozyten) bei RA-Patienten (siehe 1.3.2). Eine [Seite 65↓]differentielle HLA-DR-Expression dieser Zellen könnte sich möglicherweise auf die Immunantwort (und deren Polarisierung) auswirken und Hinweise für die Empfänglichkeit gegenüber der RA oder für den Verlauf der Erkrankung geben.