Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek
In den humanen Leukozyten-Antigenen (HLA) wird die wichtigste genetische Ursache von rheumatoider Arthritis gesehen. Es wurden bisher mehrere Mechanismen beschrieben, wie diese HLA-Moleküle die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen in unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen als möglicher Mechanismus untersucht. Dabei wurden strukturelle Unterschiede zwischen den Promotoren des krankheitsassoziierten HLA-DR4-Haplotyps und den neutralen Haplotypen DR7 und DR9 eingehender betrachtet. Allen drei Haplotypen ist gemein, daß sie das DRB4-Gen als zweites funktionelles DRB-Gen tragen, wobei das DRB4-Gen entweder den DRB4A oder den –B-Promotor besitzt. Um den Einfluß einzelner Promotorelemente auf die mit dem Luziferase-Assay bestimmten Transkriptionsaktivitäten näher zu untersuchen, wurde mit Hilfe der surface plasmon resonance die Bindung der Transkriptionsfaktoren aus den Zellkernlysaten von der humanen Monozytenzellinie THP-1 und von der humanen B-Lymphom-Zellinie BJAB an die unterschiedlichen S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen analysiert. Es konnte gezeigt werden, daß die unterschiedliche Expression von DRB4A und DRB4B durch die ubiquitäre TATA-Box vermittelt wird. Dagegen wurde die INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression von THP-1- aber auch von BJAB-Zellen durch die für die HLA-DR-Promotoren spezifische X-Box vermittelt. Bei der Analyse von DR4-, DR7- und DR9-positiven Patienten einer bereits gut charakterisierten RA-Kohorte stellte sich heraus, daß der DRB4B-Promotor, welcher im Vergleich zu DRB4A eine höhere transkriptionelle Aktivität besitzt, mit einem schweren Krankheitsverlauf assoziiert ist, so daß eine erhöhte HLA-DR-Expression den Krankheitsverlauf negativ zu beeinflussen scheint.
Disease associated human leukocyte antigen (HLA) genes have been identified in humans where they are assumed to promote the susceptibility and/or progression of rheumatoid arthritis. Several mechanisms have been described how these HLA haplotypes impact on the disease. Among them the differential expression of HLA-DRB molecules in different types of antigen-presenting cells, which was investigated here in detail. The promoters of the disease associated HLA-DR4 to the neutral DR7 and DR9 haplotypes were analyzed for sequence polymorphisms resulting in functional differences. All three haplotypes carry as a second functional DRB gene the DRB4 gene, which is regulated by the DRB4A or –B promoter. To determine the impact of the promoter elements on the transcriptional activities measured by luciferase assay the surface plasmon resonance technology was employed. To this end, nuclear extracts from the monocytic cell line THP-1 and from the B lymphoma cell line BJAB were used to analyze their binding to the various S-, X-, Y-, CCAAT-, and TATA boxes. It could be demonstrated that the differential expression of DRB4A and –B was regulated via the ubiquitous TATA box. By contrast, the INF-γ stimulation of HLA expression in THP-1 and BJAB was mediated via the unique X box. Analyzing the DR4, DR7 and DR9 positive patients of an RA cohort, the DRB4B promoter, which has a higher transcriptional activity than the DRB4A promoter, is associated with radiographic progression of RA. This data is thus indicative of an impact of elevated HLA-DR expression on the progression of the disease.
Für Hans
Das Immunsystem der Wirbeltiere dient dazu, den Organismus vor Krankheitserregern (Bakterien, Pilze, Viren sowie Parasiten) zu schützen und damit das Überleben des Individuums zu sichern. Das Immunsystem ist dabei in die angeborene und in die erworbene Immunabwehr zu unterteilen. Die erworbene Immunabwehr ist spezifisch und durch ihre Fähigkeit zum Gedächtnis und zur Toleranz charakterisiert. Einige Zellen erwerben nach dem ersten Antigenkontakt ein Gedächtnis, um bei erneutem Antigenkontakt schneller und effektiver antworten zu können. Gleichzeitig muß das Immunsystem tolerant gegenüber körpereigenen Antigenen sein, damit die Immunantwort sich nicht gegen den eigenen Organismus richtet [1].
Die spezifische Immunabwehr wird durch die B- und T-Lymphozyten (B- und T-Zellen) vermittelt. Diese Zellen besitzen spezifische Rezeptoren, die in der Lage sind, Antigene spezifisch zu erkennen. Die Antigen-Rezeptoren der B-Zellen heißen Antikörper oder Immunglobuline (Ig), die der T-Zellen T-Zellrezeptoren (TCR). Die B-Zellen bekämpfen die Antigene extrazellulär, indem sie Antikörper freisetzen, die spezifisch Oberflächenmoleküle der Erreger erkennen können (humorale Immunantwort). Die T-Zellen hingegen benötigen für die Erkennung des Antigens dessen Präsentation über die Haupt-Histokompatibilitäts-Antigene (MHC) der Klasse I oder II. Die MHC-Moleküle der Klasse I (MHC-I) werden auf allen Körperzellen exprimiert, die MHC-Moleküle der Klasse II (MHC-II) indessen nur auf spezialisierten Zellen des Immunsystems, den Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Zu den APC gehören B-Lymphozyten, Makrophagen/Monozyten und dendritische Zellen (DC). Die zytotoxischen (CD8-positiven) T-Zellen erkennen an MHC-I-Molekülen gebundene 8 – 11 Aminosäure lange Peptide, welche in der Regel von intrazellulären Erregern stammen. Daraufhin bekämpfen die zytotoxischen T-Zellen die von den Erregern infizierten Zellen (zelluläre Immunantwort). Die T-Helferzellen (Th) hingegen sind CD4-positiv und werden durch MHC-II-Moleküle aktiviert, welche 12 – 25 Aminosäure lange Peptide präsentieren. Diese Peptide gehen auf Proteine zurück, die von der Zelle aufgenommen und fragmentiert wurden [2].
Aufgrund ihrer unterschiedlichen Ausschüttung von Zytokinen (Botenstoffen) werden die Th-Zellen in die Th1- und Th2-Zellen unterteilt. Die Th1-Zellen, die als wichtigstes Zytokin Interferon-γ (INF-γ) ausschütten, aktivieren nach der Präsentation durch das MHC-II-Molekül vor allem die Makrophagen und vermitteln damit die zelluläre Immunantwort.
Sowohl die T- als auch die B-Zellen durchlaufen eine zentrale und eine periphere Toleranzentwicklung. Durch negative Selektion soll ausgeschlossen werden, daß die T-oder B-Zellen, die körpereigene Antigene erkennen, in die Peripherie gelangen. Die zentrale Toleranzentwicklung der T-Zellen findet im Thymus statt. Bei der zentralen Toleranzentwicklung der B-Zellen geht man davon aus, daß sie größtenteils noch im Knochenmark stattfindet. Gelangen dennoch autoreaktive B- oder T-Zellen in die Peripherie, so werden sie im gesunden Menschen im Rahmen der peripheren Toleranzentwicklung durch klonale Deletion eliminiert oder in Anergie versetzt. Ein Versagen der peripheren Toleranz kann zu Autoimmunerkrankungen führen, bei der sich die fehlgesteuerte Immunantwort gegen körpereigene Strukturen richtet [4].
Die Autoimmunerkrankungen können in organspezifische und systemische (nicht-organspezifische) Erkrankungen unterteilt werden. Beim Diabetis mellitus richtet sich beispielsweise die fehlgesteuerte Immunantwort gegen ein einzelnes Organ, beim systemischen Lupus erythematodes (SLE) oder bei der rheumatoiden Arthritis (RA) gegen den gesamten Organismus [5].
Gemeinsam ist allen Autoimmunerkrankungen eine Assoziation mit bestimmten MHC-Genen der Klasse I oder II. Beim Menschen werden die MHC-Gene auch humane Leukozyten-Antigene (HLA) genannt. Tabelle 1 zeigt für mehrere Autoimmunerkrankungen, mit welchen HLA-Haplotypen die jeweilige Erkrankung assoziiert ist. Diese Assoziationen sind unterschiedlich stark und können sowohl positiv als auch negativ sein. Beispielsweise bezeichnet man den HLA-B27-Haplotypen als positiv mit der ankylosierenden Spondylitis und der reaktiven Arthritis assoziiert, da die Häufigkeit dieses Haplotyps unter den Patienten höher ist als unter den Kontrollen. Dagegen ist der Haplotyp HLA-DRB1*02 negativ mit dem Diabetis mellitus assoziiert, weil hier innerhalb der Kontrollgruppe mehr Träger dieses Haplotyps zu finden sind als unter den Patienten. Im Falle der RA ist vor allem der HLA-Haplotyp DRB1*04 positiv mit der Erkrankung assoziiert, da 69% der Patienten diesen Haplotypen tragen, aber nur 34% der Kontrollen (siehe Tabelle 1).
Darüber hinaus wurden für die RA die DRB1*01- und DRB1*10-Haplotypen in einigen Studien als krankheitsassoziiert beschrieben, während die Haplotypen DRB1*07 und DRB1*02 eher als protektiv gelten, da sie negativ mit der Krankheit assoziiert sind [6, 7].
Abbildung 1 zeigt die unterschiedlich starken Assoziationen der zehn HLA-DRB1-Haplotypen mit der RA. Es wurden dabei 139 RA-Patienten und 73 Kontrollen betrachtet. Die RA-Patienten gehörten zu einer Inzeptionskohorte, welche die von dem American College of Rheumatology (ACR) festgelegten Kriterien für RA erfüllten (siehe 1.2.1). Zu Beginn der Studie betrug deren Krankheitsdauer weniger als zwei Jahre, und es bestand eine Erstmedikation mit Disease modifying antirheumatic drugs (DMARD). Weiterhin wurde die Konzentration des C-reaktiven Proteins (CRP) zu Beginn der RA gemessen, da eine erhöhte Konzentration im Serum ein hohes Risiko für einen schweren Krankheitsverlauf darstellt [8]. Die von der RA befallenen Gelenke wurden zu Beginn und während der Studie radiologisch untersucht, um das Fortschreiten der RA anhand des Röntgenscores zu bewerten. Bei dieser frühen Kohorte gab es eine deutliche Assoziation mit dem HLA-DRB1*04-Haplotypen, nicht aber mit dem HLA-DRB1*01-Haplotypen. Für die anderen Haplotypen war keine signifikante Assoziation mit der RA zu verzeichnen, es gab lediglich leichte positive (z.B. HLA-DRB1*10) bzw. negative (z.B. HLA-DRB1*02 oder -*07) Tendenzen.
Die rheumatoide Arthritis (RA), die auch chronische Polyarthritis genannt wird, ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung, die prinzipiell alle Gelenke und selten auch innere Organe, Haut und Augen treffen kann. Meist befällt die RA jedoch die kleinen Gelenke, hauptsächlich die der Hände und Füße. Mit einer Häufigkeit von etwa 1% unter der Bevölkerung ist sie die häufigste rheumatische Erkrankung bzw. die zweithäufigste Autoimmunerkrankung. Die RA tritt vorwiegend zwischen dem 30. und 40. Lebensjahr auf, Frauen erkranken etwa dreimal häufiger als Männer [9].
Die Krankheitsursache ist weitgehend ungeklärt. Neben Umweltfaktoren (Nahrung, Medikamente, Toxine aber auch Infektionen) werden aufgrund des häufigeren Auftretens bei Frauen auch endokrine (hormonelle) Faktoren diskutiert. Genetische Anlagen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle, da man anhand von Zwillingsstudien festgestellt hat, daß der monozygote Zwilling in 32% der Fälle auch unter der Erkrankung leidet. Die genetische Ursache für die Erkrankung an der RA wird vor allem – wie eben beschrieben - in den HLA-Genen gesehen.
Das Hauptsymptom der RA ist eine chronische Gelenkentzündung, wobei das Knorpel- und Knochengewebe als Folge des Einwachsens der Synovialmembran (Gelenkhaut) in den Gelenkspalt zerstört wird. Im betroffenen Gelenk lassen sich Infiltrationen von T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen nachweisen [10]. Es ist bisher
Die typischen Symptome, die bei der RA auftreten, sind durch die folgenden Kriterien des American College of Rheumatology (ACR) zusammengestellt worden:
Morgensteifigkeit der Gelenke über mehr als sechs Wochen von mindestens 1h Dauer
Arthritis von mehr als drei Gelenkregionen über mehr als sechs Wochen
Arthritis an Hand- oder Fingergelenken über mehr als sechs Wochen
Symmetrische Arthritis über mehr als sechs Wochen
Subkutane Rheumaknoten
Rheumafaktornachweis im Blut
Für RA typische radiologische Veränderungen an den Händen
Von diesen sieben Kriterien müssen mindestens vier für die Diagnose einer RA erfüllt sein.
Die RA verläuft meistens allmählich fortschreitend, wobei die Gelenkzerstörungen fast immer nach einigen Jahren im Röntgenbild zu sehen sind. Mit der medikamentösen Behandlung kann man zwar bei der Mehrzahl der Patienten den Verlauf bremsen und häufig die Entzündung und die Schmerzen über lange Zeit gut kontrollieren, trotzdem besteht ein hohes Risiko für eine dauerhafte Invalidität.
Ein für die RA charakteristisches wenngleich nicht spezifisches Phänomen ist der Nachweis von Rheumafaktoren (RF). RF sind Immunglobuline (Ig), die an den konstanten Teil von IgG-Molekülen binden. Bei 70 – 90% aller RA-Patienten sind die RF im Blut nachweisbar, allerdings können diese auch bei einigen anderen Erkrankungen und sogar bei Gesunden vorhanden sein. Als weitere Parameter, die ebenfalls bei anderen Erkrankungen auftreten können, dienen die erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit sowie die vermehrte Bildung des CRP im Serum. Es zeigt sich, daß RF-positive Patienten einen ungünstigeren Krankheitsverlauf zeigen als RF-negative Patienten [12].
Damit möglichst viele verschiedene Antigene vom Immunsystem erkannt werden können, hat der Mensch im Laufe der Evolution eine Vielfalt von HLA-Molekülen entwickelt. Die HLA-Gene werden als polygen bezeichnet, da es mehrere Gene gibt, die für die entsprechenden Moleküle kodieren. Strukturell stellen sich die HLA-Moleküle als hochgradig polymorphe, an der Zelloberfläche exprimierte Heterodimere dar. Der HLA-Komplex ist größtenteils auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 6 lokalisiert und umschließt einen Genabschnitt von etwa 3500kbp. Innerhalb dieses Komplexes sind die HLA-Gene in drei Klassen organisiert: HLA-Klasse-I, -II und -III. Die HLA-Klasse-I-Gene kodieren für die Oberflächenmoleküle HLA-A, -B und –C, die HLA-Klasse-III-Gene hingegen für einige Proteine des Komplementsystems. Die HLA-Klasse-II-Genregion beherbergt die an der Zelloberfläche exprimierten HLA-DR, -DQ- und –DP-Gene. Während in der HLA-DQ- und –DP-Region je ein α- und β-Kettengen exprimiert wird, finden sich im Bereich der HLA-DR-Region ein wenig polymorphes α-Kettengen (DRA) und mehrere exprimierte β-Kettengene (DRB1, DRB3, DRB4 und DRB5) sowie die nicht exprimierten Pseudogene DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 und DRB9. Ein besonderes Charakteristikum der HLA-DR-Region ist, daß die Zahl der DRB-Gene auf einem Chromosom vom jeweiligen Haplotyp abhängig ist [9]. Für das HLA-DR-Molekül gibt es fünf verschiedene allelische Linien, die in Abbildung 2 dargestellt sind.
Die HLA-DR-Gene gehören zu den polymorphsten Genen überhaupt. Es sind bis heute 273 DRB1-Allele, 30 DRB3-Allele, 10 DRB4-Allele, 15 DRB5 und 2 DRA-Allele bekannt [13]. Alle HLA-DR-Moleküle besitzen die gleiche Sekundärstruktur, sie sind Glykoproteine, die aus einer 35kDa schweren α- und einer 28kDa schweren β-Kette zusammengesetzt sind. Beide Ketten weisen je zwei extrazelluläre Domänen (α1 und α2 bzw. β1 und β2), eine transmembrane Region und einen intrazellulären C-terminalen Abschnitt auf. Die Variation für diesen Bereich betrifft dabei ausschließlich die β-Kette, da sie die Antigenbindungsstelle (die peptidbindende Grube des HLA-DR-Moleküls) formt. Die einzig bekannte Variation der α-Kette liegt somit außerhalb der Antigenbindungsstelle. In der β-Kette gibt es drei Regionen mit einer erhöhten Variabilität, die hypervariablen Regionen (HVR) 1, 2 und 3, die ausschließlich vom Exon 2 kodiert werden. Die HVR, die in Abbildung 3 dargestellt sind, umfassen die Aminosäuresequenzen 9 – 13 (HVR1), 26 – 38 (HVR2) und 68 – 77 (HVR3).
Neben dem Polymorphismus der kodierenden Sequenzen, welcher der Erkennung möglichst vieler Erreger dient, gibt es einen Polymorphismus der regulierenden Sequenzen – der Promotoren. Die Promotoren sind die Regulationseinheiten der Gene und beinhalten mehrere spezifische DNA-Sequenzen (Boxen), die als Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren dienen. Die Promotoren der HLA-DRB-Gene sind durch die folgenden fünf Boxen charakterisiert: S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Box [14, 15]. Die Y-Box ist eine invertierte CCAAT-Box, und die X-Box besteht aus den X1- und X2-Motiven. Die S-Box (auch W-, H- bzw. Z-Box genannt) wird als Duplikation der X-Box beschrieben [16]. Das X1-Motiv als Bestandteil der X-Box ist spezifisch für die Promotoren der HLA-II-Gene. Das X2-Motiv sowie die Y-, CCAAT- und TATA-Boxen hingegen sind auch für die Regulation anderer Gene bekannt.
Den zwei verschiedenen DRB4-Promotoren stehen zehn unterschiedliche DRB4-Allele gegenüber. In Tabelle 2 werden die einzelnen DRB4-Allele aufgeführt und mit dem DRB4*0101101-Allel verglichen. Die DRB4*0103101- und -*0103102N-Allele sind mit dem DRB4A-Promotor assoziiert, während das DRB4*0101101-Allel mit dem DRB4B-Promotor assoziiert ist [22, 23]. Für die anderen sieben Allele ist nicht bekannt, ob sie auch einen dieser beiden Promotoren tragen oder gänzlich andere. Von den zehn DRB4-Allelen werden lediglich sieben auch exprimiert. Die Variationen dieser Allele liegen für DRB4*0102 und -*0104 innerhalb der HVR3, für die anderen Allele außerhalb einer der drei HVR.
Zudem gibt es eine geringere Variation innerhalb der Boxen der Promotoren als außerhalb, wenn man verschiedene Spezies miteinander vergleicht. Im Gegensatz dazu gibt es eine höhere Variation innerhalb der Boxen als außerhalb, vergleicht man verschiedene Allele einer Spezies miteinander [24]. Der Polymorphismus innerhalb der Boxen bedeutet für eine Spezies, wenn man unterstellt, daß dadurch unterschiedliche Promotoraktivitäten und somit unterschiedliche Expressionen an der Oberfläche resultieren, neben der Heterozygotie ein zusätzliches Maß an Flexibilität bei der Immunantwort. Kürzlich wurde ein Modell der Ko-Evolution der kodierenden und regulierenden Sequenzen beschrieben. Darin wird postuliert, daß sich der Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen parallel zum Polymorphismus der kodierenden Gensequenzen entwickelt hat. Entsprechend sollten MHC-II-Sequenzen, die eine Th2-Differenzierung begünstigen, mit MHC-Molekülen, die in der Lage sind, Epitope eines parasitären Wurms zu präsentieren, assoziiert sein. Dagegen müßten Promotoren, welche die Th1-Antwort begünstigen, mit MHC-Molekülen assoziiert sein, die virale Epitope präsentieren [25].
Die Mechanismen, mit denen die HLA-Allele Empfänglichkeit gegenüber bzw. Schutz vor Autoimmunerkrankungen vermitteln, sind noch weitgehend unbekannt. Es werden mehrere mögliche Mechanismen dafür diskutiert, z.B. die Deletion von Teilen des T-Zell-Repertoires durch ein endogenes Superantigen oder das Binden des Class II invariant chain peptide (CLIP) bzw. des CD4 an HLA-II-Moleküle [26].
Darüber hinaus gibt es als weiteres Modell die anschauliche „shared epitope-Hypothese“. Danach wird angenommen, daß bestimmte MHC-II-Moleküle in der Lage sind, krankheitsinduzierende Peptide zu binden sowie den T-Zellen zu präsentieren und damit Autoimmunerkrankungen zu ermöglichen [27]. Für die RA-assoziierten HLA-
In dieser Arbeit wird ein anderer Wirkungsmechanismus verfolgt, der möglicherweise für die Erkrankung ursächlich ist: die differentielle Expression der HLA-II-Allele. Dieser Wirkungsmechanismus beinhaltet sowohl eine unterschiedliche Expression der HLA-II-Allele auf den verschiedenen APC als auch eine unterschiedlich starke Expression von verschiedenen HLA-II-Allelen. Eine unterschiedliche Expression auf den APC bewirkt demnach quantitative Unterschiede bei der jeweiligen Interaktion zwischen APC (B-Lypmphozyten, Makrophagen/Monozyten und dendritische Zellen) und T-Zellen. Die T-Zellen können entweder zu Th1- oder zu Th2-Effektorzellen polarisiert werden, je nach Zytokinproduktion der APC. Beispielsweise drängt das von den Makrophagen und DC ausgeschüttete IL-12 die T-Zellen zur Th1-Antwort, die B-Lymphozyten hingegen vermitteln bevorzugt Th2-Antworten. Eine starke HLA-II-Expression auf Makrophagen polarisiert dabei die Immunantwort in Richtung Th1, eine starke HLA-II-Expression auf B-Lypmphozyten eher in Richtung Th2. Durch die Polarisierung der Immunreaktion in Richtung Th1 könnten dadurch Th1-vermittelte Erkrankungen beschleunigt sowie Th2-vermittelte Erkrankungen unterbunden werden. Beispielsweise gibt es bei der RA ein Ungleichgewicht zugunsten der Th1-Zellen [29].
Für die Maus wurde bereits beschrieben, daß ein Basenpaaraustausch in einem MHC-II-Promotor zu einer erhöhten Transkription in einer Makrophagen-Zellinie führt, nicht aber in einer dendritischen Zellinie [30]. Das Mausmodell für die RA, die Collagen-induced arthritis (CIA), zeigt ebenfalls wie die RA eine deutliche Assoziation mit MHC-II-Genen. Baumgart et al. haben beschrieben, daß zwei als protektiv im Zusammenhang mit der CIA geltende MHC-II-Allele im Vergleich zu einem krankheitsassoziierten MHC-Allel auf aktivierten Makrophagen bis zu 100fach stärker
Im Hinblick auf die differentielle Expression beim Menschen wurde die HLA-DR-Expression auf mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) untersucht. Dabei zeigte sich, daß sowohl die DR4- als auch die DRB4-Gene auf kultivierten menschlichen B-Lymphozyten innerhalb von zwei Tagen gleichmäßig exprimiert wurden. Bei den Monozyten hingegen konnte in dieser Zeit ein Anstieg der DRB4-Expression, nicht aber der DR4-Expression verzeichnet werden [32]. Darüber hinaus wurde dargelegt, daß es bei RA-Patienten zu einer Überexpression von HLA-DR-Molekülen sowohl im Synovium als auch auf den B-Lymphozyten des peripheren Bluts kommt [33, 34]. Insbesondere werden die mit der RA assoziierten HLA-DR4-Moleküle auf den B-Lymphozyten des peripheren Bluts von RA-Patienten stärker exprimiert als von Kontrollen [35].
Im Rahmen der Dissertation soll die differentielle Expression von krankheitsassoziierten und nicht-krankheitsassoziierten HLA-DRB-Allelen eingehender untersucht werden. Dabei sind die Gene des DR53-Locus Gegenstand der Analyse, da dieser Locussowohl für den krankheitsassozierten Haplotypen DR4 als auch für die neutralen Haplotypen DR7 und DR9 kodiert. Zunächst soll eine genaue Analyse der strukturellen Unterschiede der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und DRB4B-Promotoren klären, ob sie unterschiedlich unter den RA-Patienten und den Kontrollen verteilt sind. Im weiteren Verlauf werden die Transkriptionsaktivitäten der fünf Promotoren über die Aktivitätsbestimung der Luziferase ermittelt. Dabei sollen die Promotoraktivitäten in zwei unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen bestimmt und miteinander verglichen werden, wofür die Monozytenzellinie THP-1 sowie die B-Lymphom-Zellinie BJAB gewählt werden.
Damit der Einfluß der einzelnen Promotorelemente auf die unterschiedlichen Promotoraktivitäten näher charakterisiert werden kann, soll mit Hilfe der surface plasmon resonance (SPR) das Bindungsverhalten der Transkriptionsfaktoren aus den Zellkernextrakten von THP-1 und BJAB an die unterschiedlichen S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen analysiert werden. Mittels SPR kann man die Interaktion von Zellkernextrakten der beiden Zellinien mit den jeweiligen Promotorelementen auf einer Chipoberfläche durch optische Biosensoren untersuchen. Die Interaktion mehrerer Moleküle auf der Chipoberfläche bewirkt eine Massenänderung, was eine meßbare Änderung des Brechungsindex an der Oberfläche zur Folge hat.
Weiterhin soll darauf eingegangen werden, ob die strukturellen Unterschiede der Promotoren des DR53-Locus mit der Empfänglichkeit gegenüber der RA oder mit dessen Krankheitsverlauf korrelieren, wofür auf eine bereits zuvor beschriebene RA-Kohorte zurückgegriffen wird.
In dieser Arbeit wurde die DNA von 35 RA-Patienten und 28 gesunden Kontrollen untersucht. Die RA-Patienten gehörten zu einer frühen Inzeptionskohorte, welche die Kriterien des American College of Rheumatology erfüllten (siehe 1.2.1), und zu Beginn der Studie eine Krankheitsdauer von weniger als zwei Jahren hatten [8]. Aus dieser Kohorte wurden RA-Patienten ausgewählt, die entweder auf einem oder beiden Allelen DR4-, DR7- oder DR9 positiv waren. Unter ihnen waren acht Patienten DR4-homozygot, sechs DR4-DR7-heterozygot, fünfzehn DR7-heterozygot, zwei DR7-homozygot und vier DR9-heterozygot. Von den 35 RA-Patienten hatten fünfzehn eine CRP-Konzentration ≥15mg/l und siebzehn einen CRP-Konzentration <15mg/l im Serum zu Beginn der Studie, für die verbleibenden drei Patienten gab es keine Angaben.
Zu den 28 Kontrollen gehörten sechs DR4-homozygote, zwei DR4-DR7-heterozygote, sechzehn DR7-heterozygote, drei DR7-homozygote und ein DR9-heterozygoter Spender. Das Alter der Kontrollen lag zwischen 23 und 60 Jahren, das Durchschnittsalter betrug 37 Jahre. Die Kontrollen bestanden zur Hälfte aus Männern und Frauen.
Die Isolierung der genomischen DNA aus dem Blut erfolgte nach der Methode von Sykes [36]. Die HLA-DRB-Allele von RA-Patienten und Kontrollen wurden anhand einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der genomischen DNA und biotinylierten, sequenzspezifischen Oligonukleotid (SSO)-Proben [37] typisiert.
Alle Oligonukleotide wurden von der Firma TIB Molbiol aus Berlin synthetisiert.
Für die Bestimmung der DRB4-Speißvarianten wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
Nachstehende Oligonukleotide wurden für die Charakterisierung der HLA-DRB-Promotoren genutzt, dabei besaßen die 5´-Oligonukleotide eine Nhe I-Schnittstelle und das 3´-Oligonukleotid ein Bgl II-Schnittstelle:
Für die Sequenzierung der DRB4-Speißvarianten bzw. der DRB4-Promotoren wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
Für die Versuche zum Bindungsverhalten wurden doppelsträngige, biotinylierte Oligonukleotide genutzt. Im folgenden sind jeweils nur die biotinylierten Einzelstränge aufgeführt, der korrespondierende Gegenstrang war ohne Biotin:
Die Chemikalien wurden – soweit nicht anders angegeben – in analysenreiner Qualität von den Firmen Merck, Sigma und Roth bezogen.
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um die enzymatische Vervielfältigung eines DNA-Fragments zwischen zwei flankierenden Oligonukeotid-Primern (siehe 2.1.4). Der Ablauf der PCR gliedert sich in drei Stufen:
Thermische Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Matritze
Anlagerung der Primer an die Zielsequenz (Annealing)
Verlängerung der Primer durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Extension)
Für die Sequenzierung und die Gewinnung von Inserts für Klonierungen wurde neben der Taq-DNA-Polymerase zusätzlich die Pfu-DNA-Polymerase eingesetzt, die proof-reading-Funktion besitzt. Die Amplifikation der gewünschten DNA-Sequenz erfolgte im folgenden 50µl-Ansatz:
5µl 10x PCR-Puffer
2,5µl MgCl2 (25mM)
0,5µl dNTPs (25mM)
1µl 5´-Primer (50µM)
1µl 3´-Primer (50µM)
2µl genomische DNA (ca. 200µg/ml)
2,5U Taq-DNA-Polymerase
0,3U Pfu-DNA-Polymerase
ad 50µl H2O
Dieser Ansatz wurde mit dem in Tabelle 3 aufgeführten Programm im Thermocycler vervielfältigt.
Die Auftrennung der DNA-Fragmente nach Größe erfolgte durch eine DNA-Gelelektrophorese. Dazu wurde ein 1,4%iges Agarosegel, welches 5µl 1%ige Ethidiumbromid-Lösung enthält, in eine horizontale Apparatur gegossen. Die Proben wurden mit 3µl DNA-Ladepuffer versetzt und auf dem Agarosegel für ca. 1h bei 130V in TAE-Puffer aufgetrennt. Mit Hilfe von UV-Durchlicht konnten die DNA-Banden sichtbar gemacht und fotografiert werden. Anhand des DNA-Molekulargewichtsmarkers konnte die Größe der DNA-Fragmente bestimmt werden.
Für die Isolierung von DNA-Fragmenten aus der vorangegangenen Gelelektrophorese wurde das Gelextraktionskit der Firma Genomed verwendet. Hierzu wurde die gewünschte Bande aus dem Agarosegel ausgeschnitten und für 15min bei 50°C in 300µl Puffer A1 (Hochsalzpuffer) zuzüglich 10µl Jetsorb-Supension gelöst. Anschließend wurde die Lösung kurz zentrifugiert und das Pellet einmal mit Puffer A1 und zweimal mit Puffer A2 (Niedrigsalzpuffer) gewaschen. Zum Schluß wurde das Pellet 5min bei 50°C getrocknet und in 20µl TE-Puffer aufgenommen.
Die PCR-Produkte sowie die Vektoren wurden mit Restriktions-Endonukleasen Nhe I und Bgl II in 30µl-Ansätzen folgender Zusammensetzung gespalten:
10U Nhe I
10U Bgl II
3µl 10x Restriktionspuffer
3-10µl DNA (je nach Stärke der Banden)
ad 30µl H2O
Die einstündige Restriktion erfolgte bei 37°C im Heizblock. Falls die Vektor-DNA für eine Klonierung benötigt wurde, wurde diese zusätzlich mit der alkalischen Phosphatase (AP) behandelt. Mit diesem Enzym wurde das 5´-Ende des Vektors dephosphoryliert, so daß eine Rezirkulierung einmalgeschnittener Vektoren bei der Ligationsreaktion vermieden wurde. Dazu wurde dem 30µl-Ansatz der Restriktion 5U AP und 4µl 10x AP-Puffer zugesetzt und für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung der AP für 10min bei 65°C.
Vor der Ligation wurden die Restriktionsprodukte durch eine Mikrodialyse mit einer Nitrozellulosemembran von störenden Salzen befreit. Im folgenden 10µl-Ansatz wurden dann über Nacht bei 16°C die jeweiligen Inserts mit dem Vektor pGL3 an den Nhe I- und Bgl II-Schnittstellen ligiert:
7µl Insert
1µl pGL3-Vektor
1U T4-DNA-Ligase
1µl 10x Ligationspuffer
Für die Transformtion durch Elektroporation wurden 40µl elektrokompetente E. coli-Zellen und 10µl vorweg dialysierter Ligationsansatz in eine eisgekühlte 2mm-Elektroporationsküvette gegeben. Nach dem Elektoschock mit dem Transformationsgerät wurden die Zellen mit 600µl SOC-Medium versetzt. Danach wurde der Transformationsansatz auf antibiotikahaltige L-Broth-Nährböden gegeben und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die Bakterien, die ein oder mehrere Plasmide aufgenommen haben, bildeten aufgrund ihrer Antibiotikaresistenz Kolonien auf den Nährböden. Positive Klone wurden mit Hilfe der Plasmidpräparation dahingehend geprüft, ob die Plasmide das gewünschte DNA-Fragment insertiert hatten.
Die Isolierung verschiedener Mengen an hochgereinigter Plasmid-DNA erfolgte nach den Protokollen der Firma Qiagen für Plasmid Mini- bzw. Maxi-Präparation, die für DNA-Mengen bis zu 20µg (Mini) bzw. bis zu 500µg (Maxi) vorgesehen sind. Von einer Übernachtkultur plasmidhaltiger Zellen wurden maximal 3 (250) ml abzentrifugiert (5000rpm). Das Pellet wurde in jeweils 250µl (10ml) P1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250µl (10ml) P2-Puffer wurde die nun stark viskose Suspension 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 350µl (10ml) N3- (P3-) Puffer zugegeben und vorsichtig gemischt. Im folgenden unterscheiden sich die Protokolle für die Mini- und Maxi-Präparation, so daß sie hier getrennt beschrieben werden.
Bei der Mini-Präparation wurde die Suspension für 10min zentrifugiert (13000rpm) und der Überstand auf die QIAprep-Säule gegeben. Nach einer kurzen Zentrifugation wurde die Säule mit 500µl PB-Puffer und danach mit 750µl PE-Puffer gewaschen. Zum Schluß wurde die DNA mit 50µl EB-Puffer eluiert.
Bei der Maxi-Präparation hingegen wurde die Suspension in die QIAfilter-Patrone gegeben und für 10min inkubiert. Anschließend wurde die Lösung mit dem Stempel durch den Filter der Patrone gepreßt und auf die vorher mit QBT-Puffer equilibrierte
Die DNA-Konzentration aus der Mini- bzw. Maxi-Präparation wurde durch Messung der Absorption (A) bei 260nm im Photometer bestimmt (1A260=50µg DNA/ml).
Bei der Sequenzierungsreaktion wurden fluoreszenzmarkierte ddNTPs verwendet, die beim Einbau neben den dNTPs zum Kettenabbruch der Elongation führen. Als Matritze diente entweder die Plasmid-DNA oder aber das PCR-Produkt, welches vorher durch die DNA-Gelelektrophorese gereinigt und anschließend aus dem Agarosegel extrahiert wurde.
Die Sequenzierungsreaktion wurde mit dem Sequencing reaktion kit (Big Dye) der Firma Perkin Elmer, der Taq-DNA-Polymerase, F1, dNTPs, ddNTPs, MgCl2 und Puffer enthält, in folgenden 10µl-Ansätzen durchgeführt:
0,5µl Plasmid-DNA oder 2µl PCR-Produkt
2µl Big Dye
1µl Primer (5µM) (siehe 2.1.4)
ad 10µl H2O
Das Programm in Tabelle 4 wurde für die Sequenzierungsreaktion im Thermocycler verwendet.
Anschließend wurden die Proben durch Zugabe von
90µl H2O
10µl 3M Na-Acetat, pH5
250µl 100%-Ethanol
gefällt. Danach wurden die Ansätze für 15min zentrifugiert (13000rpm) und die DNA-Pellets nach dem Waschen mit 250µl 70%-Ethanol erneut zentrifugiert. Die für 10min bei 50°C getrocknete DNA wurde in 25µl H2O aufgenommen und schließlich im Sequenziergerät ABI PRISM 310 sequenziert und ausgewertet.
Die Kultivierung der beiden verwendeten Zellinien BJAB und THP-1 erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2-Begasung. Zur Stimulierung der Zellinien wurden unterschiedliche Stimuli verwendet, wobei die Konzentrationen der einzelnen Stimuli in Tabelle 5 aufgeführt sind. Die Dauer der Stimulation betrug jeweils 48h.
Mittels Durchflußzytometrie läßt sich feststellen, inwiefern die Stimulation Einfluß auf die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen hat. Der mit dem Fluoreszenzfarbstoff R-Phycoerythrin (PE) gekoppelte Antikörper L243 bindet dabei spezifisch an diese Moleküle und emittiert bei einer Wellenlänge von 575nm. Als Kontrolle für eine spezifische Bindung des L243-Antikörpers an die HLA-DR-Moleküle wurde ein Antikörper gleichen Isotyps gewählt, damit eine Bindung der Antikörper an die Fc-Rezeptoren der Zellen ausgeschlossen wird.
Das FACS-Gerät kann die Fluoreszenzintensität dieser Wellenlänge auf den Zellen in vivo detektieren. Dazu wurden ca. 105 Zellen pro Ansatz mit PBS/BSA/Azid-Puffer gewaschen und 15min bei 4°C mit humanen IgG, welches die Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche blockieren soll, in einer Verdünnung von 1:10 inkubiert. Der L243-Antikörper wurde unter gleichen Bedingungen in einer 1:20 Verdünnung hinzugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit PBS/BSA/Azid-Puffer gewaschen und in 500µl PBS/BSA/Azid-Puffer resuspendiert. Für die Isotypkontrolle (anti-CD3, PE-konjugiert) wurde analog verfahren. Mit Hilfe des Programms CellQuest wurden die Messungen am FACS-Gerät ausgewertet.
Die Zellen, die durch Elektroporation transient transfiziert werden sollten, wurden während der logarithmischen Wachsstumsphase geerntet. Nachdem die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wurden, wurden pro Transfektionsansatz 5x 106 Zellen in serumfreies Zellkulturmedium gegeben. Zusätzlich wurden pro Ansatz 20µg Plasmid-DNA (pGL3-Vektor mit oder als Kontrolle ohne Promotor) sowie 5µg pCMVβ-Vektor (zur Ko-Transfektion) hinzugefügt. Der gesamte Transfektionsansatz wurde nun in eine 4mm-Elektroporationsküvette gefüllt und für 10min bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich die Plasmid-DNA an die Zellmembran anlagern kann. Die Elektroporation erfolgte bei 250V, 960µF und 0Ω, wobei die Zeitkonstante bei ca. 20ms-1 liegen sollte. Schließlich wurde die Probe gut gespült in 1,5ml vorgewärmtes Zellkulturmedium einer 12-well-Platte gegeben.
Die Luziferase wandelt das Substrat Luziferin in Gegenwart von molekularem O2, ATP und Mg2+ in Oxyluziferin und CO2 um. Bei dieser Reaktion wird Licht einer Wellenlänge von 562nm emittiert, das in einem Luminometer gemessen werden kann.
Zur Bestimmung der Luziferaseaktivität wurden die transfizierten THP-1-Zellen nach 6h und die BJAB-Zellen nach 22h zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 200µl Reporter-Lysis-Puffer aus dem Luziferase-Kit der Firma Promega lysiert. Nach einer 10minütigen Inkubation wurden die Lysate für 3min zentrifugiert (13000rpm) und der Überstand abgenommen. Zur Messung der Luziferaseaktivität wurde pro Ansatz 20µl Überstand in ein FACS-Röhrchen gegeben und im Luminometer unter Zusatz von je 100µl Substrat die Lichtemission detektiert. Dabei wurden die ermittelten Luziferasesaktivitäten der einzelnen Promotorkonstrukte in Relation zur Aktivität des pGL3-Vektors ohne Promotor gesetzt.
Die β-Galaktosidase katalysiert die Hydrolyse des Substrats o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG). Das Produkt o-Nitrophenol dieser Reaktion kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 405nm nachgewiesen werden.
Für die Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität wurden die Zelllysate vom Luziferase-Assay verwendet. Je 50µl Zelllysat wurde mit 50µl 2x Assaypuffer aus dem β-Galaktosidase-Kit der Firma Promega in einer Mikrotiterplatte (96-well) gemischt. Nach einer Inkubationszeit (1h, 37°C) konnte die Umsetzung des Substrats bei 405nm im ELISA-Reader gemessen werden. Schließlich wurden die Luziferase-Werte durch die β-Galaktosidase-Werte dividiert, um die relative Luziferaseaktivität zu erhalten.
Zur Ermittlung der Bindungsaffinität der jeweiligen Transkriptionsfaktoren an die unterschiedlichen Boxen der HLA-DR-Promotoren wurden die Zellkernlysate von den Zellinien THP-1 und BJAB extrahiert.
Für die Zellkernextraktion wurden 5x 107 Zellen pro Ansatz genommen und zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde nun in 500µl Kernextraktionsuffer A resuspendiert und 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Hinzufügen von NP-40 in einer Endkonzentration von 0,5% wurde die Suspension 10s gevortext und 20s bei 6500rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 150µl Kernextraktionsuffer C aufgenommen und 30min mit dem Magnetrührer auf Eis gerührt. Zum Schluß wurde nach der 10minütigen Zentrifugation (13000rpm) der Überstand abgenommen und 10µl zur Proteinbestimmung des Zellkernextraktes abgenommen.
Mit dem BCA-Proteinassay lassen sich insbesondere Peptidbindungen detektieren. Cu2+-Ionen werden dabei im alkalischen Milieu zu Cu1+-Ionen reduziert. Diese komplexieren mit 2 Molekülen BCA (Bichinolin-4-Carbonsäure) und ergeben einen violetten Farbstoff mit einer Absorption bei 562nm.
Um den genauen Proteingehalt der Zellkernextrakte zu ermitteln, wurde mit Hilfe von BSA eine Eichreihe von 0 – 2mg BSA/ml erstellt. Die Lösungen A und B des BCA-Assays werden dabei im Verhältnis 50:1 gemischt. Je 2ml des Gemisches wurden nun entweder mit 100µl Standard oder Zellkernextrakt (1:10 verdünnt) versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Anhand der im Photometer gemessenen Aborption bei 562nm ließ sich über die Eichgerade der Proteingehalt der unbekannten Proben ermitteln.
Das optische Phänomen der surface plasmon resonance (SPR) wurde zur Analyse der Interaktion von Zellkernextrakten mit Promotor-Oligonukleotiden verwendet. In Biacore-Instrumenten wird einer der Reaktionspartner, der Ligand, auf einen Sensorchip immobilisiert, während der andere Reaktionspartner, der Analyt, in kontinuierlichen Fluß über die Sensorchip-Oberfläche geleitet wird. Die Detektion der Bindung basiert darauf, daß eine Massenänderung auf der Chipoberfläche, hervorgerufen durch die Interaktion von Ligand und Analyt, eine Änderung des Brechungsindex an der Chipoberfläche bewirkt. Die Bindung wird in Form eines SPR-Signals, ausgedrückt in Resonance Units (RU), gemessen. Durch kontinuierliche Aufzeichnung des Signals kann die Bindungskinetik in Echtzeit verfolgt werden.
Alle Messungen erfolgten bei einer Temperatur von 25°C und einer Flußrate von 30µl/ml in Biacore-Laufpuffer mit einer Zellkernlysat-Konzentration von 100µg/ml. Es wurden jeweils 250µl Probe injiziert und nach Beendigung der Assoziationszeit zur Aufnahme der Dissoziationskinetik für 300s durch konstanten Pufferfluß ersetzt. Nach jedem Zyklus wurde der Chip durch zwei kurze Pulse von 0,05% SDS in TES-Puffer regeneriert. Die Interaktion der Zellkernlysate mit der DNA wurde für jeden Zyklus durch kontinuierliche Messung der RU festgehalten. Die Datenanalyse erfolgte mit der BIAevaluation-Software, Version 3.0. Das Bindungsverhalten wurde ermittelt durch den RU-Wert am Ende der Assoziationsphase abzüglich des RU-Wertes vor der Injektion der Zellkernproteine. Von den spezifischen Bindungsaffinitäten wurde dann der RU-Wert der Referenzzelle ohne DNA subtrahiert und auf die unspezifische DNA (Random) bezogen (im Falle der X-Box-Oligonukleotide aufgrund der längeren Sequenz auf Random2).
Der Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ist eine Alternative zur Bestimmung der Bindungsaffinität mittels Biacore-Technologie. Hierbei werden die einzelnen radioaktivmarkierten Promotorabschnitte mit den Zellkernlysaten gemischt und anschließend durch ein natives Polyacrylamidgel (PA-Gel) elektrophoretisch getrennt. Um die Bindungsstärke der Proteine des Zellkernextraktes an zwei verschiedenen Zielsequenzen zu vergleichen, werden die beiden radioaktivmarkierten Promotorabschnitte zusätzlich mit unmarkierter Promotor-DNA derselben Sequenz kompetiert.
Für den EMSA wurde zunächst der sense-Strang (siehe 2.1.4) der Zielsequenz radioaktiv markiert, indem er durch die T4-Kinase vom Labeling-Kit der Firma Promega am 3´-Ende mit γ-32P-ATP phosphoryliert wurde. Diese Reaktion erfolgte im folgenden Ansatz:
2µl Oligonukleotid (10µM)
2µl 10x Label-Puffer
2µl T4-Kinase
5µl γ-32P-ATP
9µl H2O
Die Probe wurde 1h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion unter Zugabe von 2µl 500mM EDTA gestoppt. Anschließend wurde die Probe mit H2O auf 50µl aufgefüllt und durch Auftragen auf eine Probequant G-50-Säule vom überschüssigen γ-32P-ATP befreit. Dazu wurde die Säule in ein 1,5ml-Gefäß gegeben und 2min bei 1000rpm zentrifugiert. Das gereinigte Eluat wurde nun mit dem komplementären Oligonukleotid (siehe 2.1.4) hybridisiert, dieser Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
50µl 32P-Oligonukleotid (0,2µM)
5µl komplementäres Oligonukleotid (100µM)
5µl 10x NE2-Puffer
40µl H2O
Nach dem zweiminütigen Erhitzen der Probe auf 95°C wurde sie langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die anschließende 15minütige Bindungsreaktion der doppelsträngigen Promotorabschnitte an die Zellkernextrakte erfolgte im folgenden 20µl-Ansatz:
10µl 2x Bindepuffer (inkl. Protease-Inhibitor-Cocktail)
1µl doppelsträngiges Oligonukleotid (0,1µM)
2µl Kernextrakt (2mg/ml)
2µl poly dI/dC (0,5mg/ml)
ad 20µl H2O
Danach wurden die Proben durch eine native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Dazu wurde vorerst ein unteres, etwa 2cm breites 10%iges PA-Gel in die Elektrophoresekammer gegossen, es beinhaltete:
2,7ml 30% Acrylamid
0,8ml 5x TBE-Puffer
14µl 20% APS
9µl TEMED
4,5ml H2O
Nach dem Auspolymerisieren des Gels wurde ein weiteres, etwa 13cm breites PA-Gel in die Apparatur gegossen, das 5%ige PA-Gel setzte sich folgendermaßen zusammen:
5,35ml 30% Acrylamid
4ml 5x TBE
70µl 20% APS
45µl TEMED
20,65ml H2O
Nach Beendigung des einstündigen Vorlaufs in 0,5x TBE-Puffer bei 200V, 20mA und 4°C wurden die Proben mit 3µl DNA-Lade-Puffer versetzt und für ca. 3h unter gleichen Bedingungen elektrophoretisch getrennt. Schließlich wurde das Gel für ca. 1h bei 70°C getrocknet und über Nacht auf einem Röntgenfilm exponiert. Zur Quantifizierung der einzelnen Banden des PA-Gels wurden sie auf dem Phosphoimager mit dem Programm Image Quant ausgewertet. Dazu wurde die Intensität der einzelnen Banden auf die jeweilige Gesamtintensität der Spur bezogen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst der mit der RA assoziierte Haplotyp DR4 mit den DR7 und DR9-Haplotypen, die nicht mit der RA assoziert sind, hinsichtlich struktureller Unterschiede miteinander verglichen. Für die Untersuchung wurden 35 RA-Patienten und 28 Kontrollen ausgewählt, die entweder auf einem oder auf beiden Chromosomen DR4-, DR7- oder DR9-positiv waren. Unter den 63 RA-Patienten und Kontrollen gab es insgesamt 36 DR4-, 49 DR7- und 5 DR9-Haplotypen. Für die Bestimmung der Assoziation der drei Haplotypen mit den beiden unterschiedlichen DRB4-Promotoren und mit der DRB4-Spleißvariante wurden 76 DRB4-Promotoren sowie 86 Intron 1/Exon 2-Grenzen amplifiziert und sequenziert (siehe 2.2.1-2.2.3 und 2.2.8). Die Auswertung der Sequenzen ist für die Patienten in Tabelle 6 und für die Kontrollen in Tabelle 7 dargestellt. Zusätzlich sind die von Listing et al. bestimmten CRP-Konzentrationen zu Beginn der Erkrankung mit der RA aufgeführt. Die Sequenzen wurden anschließend - wo es möglich war - mit den drei Haplotypen korreliert. Eine Zuordnung war in den Fällen, die DR4/DR7-heterozygot waren und nur eine DRB4-Spleißvariante und/oder zwei unterschiedliche DRB4-Promotoren besaßen, nicht möglich.
Die strukturellen Unterschiede der fünf verschiedenen Promotoren des DR53-Locus sollen nun auf molekularer Ebene in zwei unterschiedlichen APC weiter analysiert werden. Dazu wurden stellvertretend zwei verschiedene Zellinien ausgewählt, zum einen die monozytäre Zellinie THP-1 und zum anderen die B-Lymphom-Zellinie BJAB. Endogen kodieren die beiden Zellinien für unterschiedliche Haplotypen: THP-1 wurde positiv für DR1 und DR2 typisiert, während BJAB positiv für DR8 und DR5 (oder DR6) war. Die Allele DR5 und DR6 konnten dabei nicht eindeutig differenziert werden.
Zur weiteren Analyse wurde die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen der beiden Zellinien durch FACS-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper L243 bestimmt (siehe 2.2.9) und miteinander verglichen. Weiterhin wurden die zwei Zelltypen mit unterschiedlichen Substanzen stimuliert (siehe Tabelle 5), um deren Einfluß auf die HLA-DR-Expression zu ermitteln. Abbildung 8 zeigt, daß nur wenige der unstimulierten THP-1-Zellen positiv für HLA-DR sind. Durch die 48stündige Stimulation mit 1000U/ml INF-γ wurde in allen THP-1-Zellen die HLA-DR-Expression induziert, was an der Verschiebung der Population in Richtung einer höheren Fluoreszenzintensität zu erkennen ist.
Eine Stimulation mit TGF-β1, cAMP, LPS, IL-1β, Vitamin D3, TPA, TNF-α, GM-CSF oder IL-4 induziert die THP-1-Zellen dagegen nicht bzw. unwesentlich (siehe Tabelle 8). Im Unterschied dazu waren die BJAB-Zellen ohne oder mit INF-γ-Stimulation zu 100% HLA-DR-positiv. Durch die Stimulation mit INF-γ wurde lediglich die mittlere Fluoreszenzintensität (mFI) von 153,4 auf 208,0 erhöht. Diese Verschiebung konnte weder durch anti-CD40/anti-IgM noch durch cAMP, TGF-β1, Vitamin D3 oder LPS erreicht werden. IL-4, TPA oder IL-1β hingegen erhöhten die mFI leicht (siehe Tabelle 9).
Im nächsten Schritt wurde betrachtet, ob die Sequenzunterschiede in der Promotorregion der drei Haplotypen mit ihren insgesamt fünf funktionellen DRB-Genen zu unterschiedlichen transkriptionellen Aktivitäten in der monozytären Zellinie THP-1 und in der B-Lymphom-Zellinie BJAB führen. Dazu wurden die Promotoraktivitäten der folgenden Gene bestimmt: DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B. Die je 257bp umfassenden Promotorsequenzen, welche die S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen einschließen (siehe Abbildung 5), wurden zunächst amplifiziert (siehe 2.2.1 und 2.2.3). Dazu wurde auf die DNA der Individuen zurückgegriffen, deren Sequenzanalyse in Kapitel 3.1 ergeben hatte, daß sie für den jeweiligen Promotor homozygot positiv waren. Die PCR-Produkte wurden anschließend in den Reportervektor pGL3, der das Luziferasegen als Reportergen besitzt, eingefügt (siehe 2.2.4 und 2.2.5). Im Anschluß daran wurden die unterschiedlichen pGL3-Vektoren und der pCMVβ-Vektor, der als Transfektionskontrolle dient, in E. coli-Zellen transformiert (siehe 2.2.6). Mit den erfolgreich transformierten Zellen wurde danach durch die Plasmidpräparation genügend DNA für die folgende Transfektion hergestellt (siehe 2.2.7). Die pGL3-Vektoren mit den fünf unterschiedlichen Promotorkonstrukten sowie der pGL3-Vektor ohne Promotor als Standard wurden transient mit dem pCMVβ-Vektor, der für die β-Galaktosidase kodiert, in die beiden Zellinien THP-1 und BJAB transfiziert (siehe 2.2.10). Die Bestimmung der transkriptionellen Aktivitäten der fünf verschiedenen Promotorkonstrukte wurde über die Aktivitätsbestimmung der Luziferase und der β-Galaktosidase ermittelt (siehe 2.2.11 und 2.2.12).
Die einzelnen Promotoraktivitäten in der monozytären Zellinie THP-1 und in der B-Lymphom-Zellinie BJAB sind in Abbildung 9 wiedergegeben. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis einer Messung. Weitere Messungen unterschieden sich lediglich im Vergleich zum Standard (pGL3-Vektor ohne Promotor), wohingegen die Verhältnisse der spezifischen Promotoraktivitäten untereinander gleich waren. Für die THP-1-Zellen zeigte sich, daß der DR4-Promotor mit dem Wert 12 für die relative Luziferaseaktivität die geringste transkriptionelle Aktivität besaß. Die Werte für die Promotoraktivitäten von DR7, DR9 und DRB4A sind mit den Werten 26, 29 und 27 vergleichbar und damit 2,2- bis 2,4fach höher als der Wert vom DR4-Promotor. Der DRB4B-Promotor besitzt mit dem Wert 97 die höchste Aktivität in der THP-1-Zellinie und ist damit achtfach höher als der Wert vom DR4-Promotor.
In diesem Kapitel soll das Bindungsverhalten der Zellkernlysate der monozytären Zellinie THP-1 und der B-Lymphom-Zellinie BJAB an die einzelnen Boxen der unterschiedlichen Promotoren des DR53-Locus untersucht werden. Möglicherweise lassen sich damit Rückschlüsse auf die gemessenen Promotoraktivitäten bzw. die HLA-DR-Oberflächenexpression ziehen. Dazu wurden die Promotorsequenzen von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B miteinander verglichen und doppelsträngige Oligonukleotide gewählt, die jeweils die S-, X-, Y-, CCAAT- oder TATA-Box abdecken. Die beiden Zellinien wurden für diese Versuche mit mehreren Substanzen stimuliert (siehe Tabelle 5), von denen bekannt ist, daß sie die HLA-DR-Expression über die Konzentration der Transkriptionsfaktoren beeinflussen [38]. Danach wurden von diesen Zellen Zellkernlysate hergestellt und deren Proteingehalt bestimmt (siehe 2.2.13 und 2.2.14). Die Interaktion der unterschiedlichen Promotor-Oligonukleotide mit den Zellkernlysaten wurde mit Hilfe der SPR charakterisiert (siehe 2.2.15), bzw. durch einen kompetitiven EMSA bestätigt (siehe 2.2.16).
Abbildung 10A stellt die 26bp umfassende CCAAT-Box-Sequenzen der Promotoren von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B dar. Die Box selbst ist hochgradig konserviert, lediglich an den flankierenden Positionen gibt es Unterschiede. Die Sequenzen von DR7 und DR9 sind identisch und unterscheiden sich von DR4 nur durch ein Basenpaar. DRB4A und –B sind ebenfalls identisch, unterscheiden sich aber an drei Positionen von DR4. Die Abbildung 10B zeigt auf der linken Seite spezifische wenn auch schwache Bindungen der THP-1-Zellkernlysate an die drei unterschiedlichen Sequenzen der CCAAT-Box. Die relativen Bindungsaffinitäten, die in % Resonance Units (%RU) angegeben sind, sind mit 104 bis 110%RU vergleichbar. Die Bindung der BJAB-Zellkernlysate an die drei Sequenzen sind mit je 101%RU noch schwächer (siehe Abbildung 10B, rechte Seite). Die beiden Zellinien wurden ferner noch mit INF-γ, TGF-β1, Vitamin D3 oder IL-1β stimuliert, jedoch konnte keine Erhöhung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren erzielt werden (siehe Tabelle 10).
Die S-Box-Sequenzen für die einzelnen Promotoren des DR53-Locus sind in Abbildung 11A gezeigt. Der Polymorphismus der S-Box besteht nur in der Box selbst, nicht in den flankierenden Bereichen. Die Sequenzen von DR7 und DR9 unterscheiden sich von der DR4-Sequenz durch ein Basenpaar. Die beiden DRB4-Promotoren zeigen keine Unterschiede in der S-Box, sie unterscheiden sich von der DR7- und DR9-Sequenz durch ein weiteres Basenpaar. Die relativen Bindungsaffinitäten der THP-1- und BJAB-Zellkernextrakte zu den drei verschiedenen Promotorsequenzen werden durch die Balken in Abbildung 11 B verdeutlicht. Es zeigt sich wiederum, daß das Bindungsverhalten an die S-Box nur geringfügig variiert, die Werte für THP-1 liegen zwischen 119 und 124%RU, die für BJAB zwischen 114 und 120%RU. Durch die Stimulation mit INF-γ, TPA, und cAMP wurden die Bindungsaffinitäten bzw. die Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich verändert (siehe Tabelle 11).
Der Polymorphismus im Promotorbereich der Y-Box ist für die fünf Promotoren des DR53-Locus in Abbildung 12A gezeigt. Die Sequenzen von DR4, DR7 und DR9 sind für diesen Bereich gleich. Zu den beiden DRB4-Promotorsequenzen gibt es zwei Unterschiede, die innerhalb der Y-Box liegen. Darüber hinaus unterscheiden sich die Sequenzen von DRB4A und –B an einer Position 3´ der Y-Box. Die relativen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB-Zellkernlysaten zum DRB1-Oligonukleotid sind mit 168 bzw. 169%RU am stärksten (siehe Abbildung 12B). Im Gegensatz dazu betragen die relativen Bindungsaffinitäten zu den DRB4-Oligonukleotiden lediglich 122% (DRB4A) und 136%RU (DRB4B) für THP-1 bzw. 114%RU (DRB4A und -B) für BJAB. Auch hier konnte durch die Stimulation mit INF-γ, TGF-β1, Vitamin D3 oder IL-1β in den beiden Zellinien im allgemeinen keine Erhöhung der spezifischen Bindung bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren erreicht werden (siehe Tabelle 12).
Der Vergleich der unterschiedlichen TATA-Box-Sequenzen ist in Abbildung 13A wiedergegeben. Während die TATA-Box selbst komplett konserviert ist, gibt es sowohl 5´ als auch 3´ der Box Unterschiede. Die Promotorsequenzen von DR4 und DR7 sind identisch, wobei sie sich im Vergleich zu DR9 in einem Basenpaar unterscheiden. Den gleichen Unterschied sieht man auch bei der DRB4B-Sequenz. Zusätzlich besitzen die beiden DRB4-Sequenzen 5´ zwei Substitutionen, die sie von den DRB1-Sequenzen unterscheiden. Die relativen Bindungsaffinitäten sind sowohl für die THP-1- als auch die BJAB-Zellkernextrakte zum DRB4B-Promotor am höchsten (203 bzw. 183%RU) und zum DRB4A-Promotor am geringsten (126 bzw. 106%RU). Die Bindungen der Zellkernextrakte an die beiden DRB1-Oligonukleotide liegen für THP-1 zwischen 174 und 179%RU und für BJAB zwischen 155 und 168%RU. Durch die Stimulation mit 1000U/ml INF-γ wurden die Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernlysate zu den DRB4-Oligonukleotiden um 5% (DRB4A) bis 10% (DRB4B) sowie zu den DRB1-Oligonukleotiden um 29% (DR9) bis 37% (DR4/DR7) erhöht.
Für die Zellinie THP-1 konnte weder durch die Stimulation mit INF-γ noch mit cAMP eine Veränderung des Bindungsverhaltens erzielt werden, durch 1nM TPA war hingegen eine minimale Erhöhung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren zu verzeichnen (siehe Tabelle 13). Eine geringfügige Erhöhung der Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernlysate konnte ebenfalls durch 1nM TPA beobachtet werden, wohingegen cAMP keinen Effekt auf die Bindungen der BJAB-Zellkernextrakte hatte (siehe Tabelle 13).
Die Ergebnisse hinsichtlich des unterschiedlichen Bindungsverhaltens der BJAB-Zellkernlysate an die TATA-Box-Sequenzen von DRB4A und –B konnte durch eine Kompetitionsanalyse mittels EMSA bestätigt werden. Dazu kompetierten die beiden mit 32P-markierten DRB4-Sequenzen jeweils mit unmarkierten DRB4A- und DRB4B-Oligonukleotiden um die Bindung an die Zellkernlysate (siehe 2.2.16). Das Polyacrylamidgel des EMSAs zeigt eine schnellere Abnahme der Signalstärke für die obere Bande, wenn die radioaktivmarkierte TATA-DRB4B-Sequenz mit unmarkiertem TATA-DRB4B-Oligonukleotiden verdrängt wurde (siehe Abbildung 14). Die Abbildung 15 zeigt den gleichen Versuch mit 32P-markiertem TATA-DRB4A. Hier wurden die oberen Banden durch den Phosphoimager quantifiziert und deren Signalstärke aufgetragen. Hier war ebenfalls eine schnellere Abnahme der Signalstärke zu erkennen, wenn das radioaktivmarkierte Oligonukleotid durch das unmarkierte TATA-DRB4B-Oligonukleotid verdrängt wurde.
Abbildung 16A zeigt die X-Box-Sequenzen der Promotoren von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B. Die DR4-Sequenz unterscheidet sich von den DR7- und DR9-Sequenzen durch eine Substitution 3´ der X2-Box. Die Sequenzen der DRB4-Promotoren sind identisch, unterscheiden sich aber im Vergleich zu DR4 durch eine Substitution innerhalb der X1-Box und zwei Substitutionen 3´ der X2-Box. Die Sequenz von DRA hingegen weicht sehr stark von den Sequenzen der DRB-Promotoren ab. Die Bindungen der Zellkernlysate von THP-1 und BJAB sind zum X-Box-DRA-Oligonukleotid am stärksten (132 bzw. 191%RU). Die relativen Bindungsaffinitäten zu den DRB-Oligonukleotiden liegen für THP-1 zwischen 106 und 109%RU und für BJAB zwischen 117 und 126%RU (siehe Abbildung 16B). Durch die Stimulation mit INF-γ wurden alle Bindungsaffinitäten der THP-1-Zellkernextrakte zu den Oligonukleotiden erhöht, zu DR7 und DR9 auf 126, zu DRB4 auf 139, zu DR4 auf 149 und zu DRA auf 215%RU.
Für die BJAB-Zellkernlysate war die Zunahme der Bindungsaffinitäten durch die INF-γ-Stimulation nicht ganz so stark, der Effekt war aber wiederum bei DRA am stärksten. Die Stimulation mit cAMP erbrachte für beide Zellinien keine Zunahme der Bindungsaffinitäten, durch die Stimulation mit 1nM TPA konnte nur das Bindungsverhalten zu den THP-1-Zellkernextrakten leicht verbessert werden, durch TGF-β1 konnte hingegen nur bei den BJAB-Zellkernlysaten eine leichte Steigerung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren verzeichnet werden (siehe Tabelle 14).
Im letzten Schritt wurde untersucht, ob die gefundenen strukturellen und funktionellen Unterschiede zwischen den Promotoren mit dem Krankheitsverlauf der RA korrelieren. Dazu wurden die DNA-Proben der 32 RA-Patienten, bei denen die Konzentration vom C-reaktiven Protein (CRP) im Serum zu Beginn der Erkrankung gemessen wurde, dahingehend analysiert, ob sie mit dem DRB4B-Promotor oder mit der DRB4-Spleißvariante assoziiert waren (siehe Tabelle 6). Ein hohe CRP-Konzentration (≥15mg/l) stellt dabei ein hohes Risiko für einen schweren Krankheitsverlauf der RA dar [8]. Nach der Aufteilung der RA-Patienten in je eine Gruppe mit einer höheren und einer niedrigeren CRP-Konzentration zu Beginn der RA wurden ihre Assoziationen mit dem DRB4B-Promotor und der DRB4-Spleißvariante betrachtet. Dabei waren die Häufigkeiten der DR4-, DR7- und DR9-Allele ähnlich über die beiden Patientengruppen verteilt, lediglich die Häufigkeit des DR4-Allels war in der Patientengruppe mit einer höheren CRP-Konzentration leicht erhöht (siehe Tabelle 15).
Die Assoziation mit dem DRB4B-Promotor in der Gruppe mit einer höheren CRP-Konzentration ist mit 41% deutlich höher als in der Gruppe mit einer niedrigeren CRP-Konzentration (10%). Die Differenz über 31% ist mit Sicherheitsintervallen von 0,5 – 71% statistisch signifikant. Ferner war die DRB4-Spleißvariante bei 6 von 18 DRB4A-Allelen (33%) unter der Patientengruppe mit einer CRP-Konzentration ≥15mg/l zu finden. Dagegen befand sich nur 1 von 10 DRB4A-Allelen (10%) in der Gruppe der RA-Patienten mit einer CRP-Konzentration <15mg/l. Die Differenz beträgt 21%, sie ist aber aufgrund der geringen Anzahl der DRB4A-Allele unter den RA-Patienten mit einer hohen CRP-Konzentration mit Sicherheitsintervallen von –33 – 85 statistisch nicht signifikant.
Bei der Untersuchung der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen im Rahmen dieser Arbeit wurden bekannte Polymorphismen in den Promotorregionen dahingehend analysiert, ob sie von funktioneller Bedeutung sein könnten. Dabei waren die Promotorbereiche des DR53-Locus Gegenstand der Analyse, da sowohl der mit der RA assoziierte Haplotyp DR4 als auch die neutralen Haplotypen DR7 und DR9 von diesem Locus kodiert werden.
In Kapitel 3.3 wurde gezeigt, daß Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und DRB4B-Promotoren in den beiden Zellinien zu verzeichnen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß in der B-Lymphom-Zellinie BJAB die DR4-Promotoraktivität am höchsten ist, danach folgen die von DRB4B, DR9 und DR7, die transkriptionelle Aktivität von DRB4A ist am geringsten.
Louis et al. hatten für die B-EBV-Zellinie BM92 bereits angedeutet, daß die mittels Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)-Assay ermittelten Promotoraktivitäten von DR4 und DRB4B etwa doppelt so hoch sind wie die von DR7 und DR9 [39]. In einer Studie von Leen und Gorski wurden lediglich die Promotoraktivitäten von DR7 und DRB4A miteinander verglichen [40]. Sie haben mit Hilfe eines CAT-Assays gezeigt, daß die beiden Promotoraktivitäten in der B-Lymphom-Zellinie RAJI miteinander vergleichbar sind.
Damit entsprechen die Ergebnisse dieser beiden Studien zumindest qualitativ den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Die transkriptionellen Aktivitäten von DR4 und DRB4B sind in BJAB höher als die von DR7, DR9 und DRB4A, wenngleich die Unterschiede in meiner Arbeit nicht so groß sind. Aufgrund der unterschiedlichen Zellinien, anders gewählten Promotorabschnitten und unterschiedlichen Methoden ist ein Vergleich der Analysen allerdings nur begrenzt möglich.
In der Monozytenzellinie THP-1 ist die Promotoraktivität von DRB4B am höchsten, darauf folgen die von DR9, DRB4A und DR9, am geringsten ist die Promotoraktivität von DR4. Es gibt dazu keine vergleichbaren Werte in der Literatur. In einer Studie von Leen und Gorski deuteten die Ergebnisse mit mononukleären Zellen des peripheren Blut (PBMC) darauf hin, daß die Aktivität des DRB4B-Promotors höher ist als die des DRB4A-Promotors [22]. In einem RNase-Protection-Assay haben sie gezeigt, daß die prä-mRNA-Konzentration dreifach und die mRNA-Konzentration von DRB4B fünffach
In Kapitel 3.4 wurde mit Hilfe der SPR untersucht, ob die unterschiedlichen Promotoraktivitäten (siehe 3.3) und die unterschiedlichen HLA-DR-Oberflächenexpressionen (siehe 3.2) auf das Bindungsverhalten der Zellkernlysate der zwei Zellinien an die einzelnen Boxen zurückzuführen ist. Dabei wurde angenommen, daß die spezifische Bindung der Transkriptionsfaktoren an die einzelnen Promotorsequenzen in linearer Beziehung zur transkriptionellen Aktivität steht. Ferner wurde davon ausgegangen, daß sich die Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten auf die jeweiligen HLA-DR-Expressionen auswirken und daß die α-Kette nicht limitierend für die Oberflächenexpression ist.
Die Unterschiede zwischen den einzelnen Bindungen wären möglicherweise größer, wenn man nicht Zellkernextrakte sondern rekombinante Transkriptionsfaktoren als Analyten bei den Bindungsstudien verwendet hätte. Andere Bestandteile des Zellkernextraktes kompetieren um die Bindung an den Liganden (das Promotor-Oligonukleotid), so daß bei den Bindungsstudien nie eine Sättigung – auch nicht in höheren Konzentrationen – erreicht wurde (Daten nicht gezeigt).
Die Polymorphismen, die hier betrachtet wurden, sind je nach Box unterschiedlich. Es gibt Boxen, die stark konserviert sind, Boxen, innerhalb derer es Substitutionen gibt, aber auch Boxen, bei denen es nur in den flankierenden Bereichen Unterschiede zwischen den Allelen gibt.
Das Modell der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen betrachtet nicht nur den Polymorphismus der kodierenden Gensequenzen sondern darüber hinaus auch den Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen, der Promotorsequenzen. Der Polymorphismus ist durch die Polygenie dieses Genortes verstärkt, wobei die Entwicklung eines zweiten funktionellen DRB-Gens in Form von unterschiedlichen allelischen Linien bisher für keinen anderen Locus bekannt ist. Um das Überleben der Art zu gewährleisten, sind vermutlich im Laufe der Evolution unterschiedliche MHC-Moleküle entstanden, die möglichst viele Erreger bei der Immunabwehr erkennen. Indessen könnten unterschiedliche Promotoren durch unterschiedliche Promotoraktivitäten eine differentielle Expression bewirken. Die differentielle Expression könnte man als zusätzliche Flexibilität bei der Immunabwehr verschiedener Erreger betrachten. Damit wird dem in der Evolution entwickelten Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen neben dem Polymorphismus der kodierenden
Es stellt sich die Frage, ob und wie man die Ergebnisse der Bindungsstudien auf die jeweiligen Promotoraktivitäten beziehen kann. Sobald sich die einzelnen Sequenzen an mehreren Positionen unterscheiden und daraus unterschiedliche Stärken der Bindungen resultieren, ist nicht eindeutig, welche Bindungsaffinitäten zu welchem Anteil in die transkriptionelle Aktivität eingehen. Für die Maus wurde unlängst gezeigt, daß ein einzelner Basenpaaraustausch von A zu G innerhalb der X-Box die Promotoraktivität eines MHC-II-Gens in einer Makrophagenzellinie senkt [30]. Die Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten werden möglicherweise noch verstärkt, wenn man in Betracht zieht, daß die Unterschiede zwischen den mRNA-Konzentrationen von zwei Promotoren höher sind als die entsprechenden prä-mRNA-Konzentrationen [22]. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß die transkriptionellen Aktivitäten von zwei murinen MHC-II-Allelen, die durch die Aktivitätsbestimmung der Luziferase ermittelt wurden, um einen geringeren Faktor differieren als die entsprechenden Oberflächenexpressionen der MHC-II-Moleküle [30, 31].
Der auffälligste Unterschied zwischen den transkriptionellen Aktivitäten in den beiden Zellinien ist die achtfach höhere Promotoraktivität von DRB4B im Vergleich zu DRB4A für THP-1, aber nur eine zweifach höhere für BJAB. Der einzige Sequenzunterschied zwischen den beiden DRB4-Promotoren, der das Bindungsverhalten beeinflußt, liegt 3´ der TATA-Box. Das mit Hilfe der SPR ermittelte Bindungsverhalten hinsichtlich der beiden verschiedenen TATA-Boxen kann die unterschiedlichen Verhältnisse der Promotoraktivitäten von DRB4B zu –A nicht erklären, da in beiden Fällen die Verhältnisse der Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate von THP-1 und BJAB zueinander gleich waren. Daher gibt es vermutlich noch andere, außerhalb des hier betrachteten Promotorbereiches liegende, regulierende Elemente, welche die Transkriptionsrate in beiden Zellinien unterschiedlich beeinflussen.
Interessanterweise wurden in dieser Arbeit keine großen Unterschiede zwischen den Bindungsaffinitäten der HLA-DRB1-Allele gemessen. Sowohl für die S-Box als auch für die CCAAT-, TATA- und X-Boxen wurden keine deutlichen Unterschiede zwischen den Bindungen an die Zellkernextrakte der beiden Zellinien detektiert. Die mit dem Luziferase-Assay ermittelten transkriptionellen Aktivitäten von DR4, DR7 und DR9 variieren ebenfalls nicht sehr stark (lediglich die DR4-Promotoraktivität ist in der THP-1-Zellinie etwa zweifach niedriger als Promotoraktivitäten von der DR7 und DR9). Unterschiedliche Transkriptionsaktivitäten sind auch nicht erwartet worden, da sich die Promotorsequenzen der DRB1-Allele nur geringfügig voneinander unterscheiden.
Bei der Y-Box wurden dagegen deutliche Unterschiede zwischen den Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die Promotor-Oligonukleotide von DRB1 und DRB4 beobachtet (siehe 3.4.3). Diese Unterschiede sind auf zwei Substitutionen innerhalb der Y-Box zurückzuführen. Interessanterweise besitzen die DRB4-Promotorsequenzen der Y-Box eine Substitution, welche die Affinität zum NF-Y und anderer redoxabhängiger Transkriptionsfaktoren senkt [42]. Auf der anderen Seite scheint die Substitution 5´ der Y-Box, die einen der zwei Unterschiede zwischen DRB4A und –B darstellt, für das Bindungsverhalten der THP-1- und BJAB-Zellkernlysate unerheblich zu sein, da die gemessenen relativen Bindungsaffinitäten nur geringfügig voneinander abweichen. In der Literatur wird die Region 5´ der Y-Box für DRA als B-Cell factor-1 (BCF-1)-Element beschrieben [43]. Unterschiede in diesem Element scheinen hier jedoch das Bindungsverhalten an die Y-Box nicht zu beeinflussen. Daher beruhen die gemessenen Unterschiede zwischen den Promotoraktivitäten von DRB4A und –B vermutlich nicht auf der Y-Box.
Besonders hervorzuheben ist das Bindungsverhalten der Zellkernextrakte beider Zellinien an die ubiquitäre TATA-Box. Hier zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den DRB4A- und –B-Promotoren. Einerseits war die gemessene Differenz in beiden Zellinien die höchste Differenz, die überhaupt für die DRB-Promotoren aller Boxen zu verzeichnen war. Andererseits scheint dieser etwa zweifache Unterschied - relativ gesehen - gering zu sein. Durch die Kompetitionsanalyse mittels EMSA wurde die höhere Bindungsaffinität zur TATA-Box von DRB4B allerdings mit einer anderen Methode bestätigt. Die stärkere Bindung der Zellkernextrakte an das DRB4B-Oligonukleotid der TATA-Box scheint damit ursächlich im Basenpaaraustausch 3´ der TATA-Box zu liegen. Dieser Basenpaaraustausch ist neben dem 5´ der Y-Box (siehe 3.4.4) der einzige, der die Promotorsequenzen von DRB4A und –B unterscheidet. Somit ist es höchstwahrscheinlich, daß die höhere transkriptionelle Aktivität des DRB4B-Promotors, die in Kapitel 3.3 bestimmt wurde, auf diesen einzelnen Basenpaaraustausch zurückzuführen ist. Die differentielle Expression von DRB4A und –B wird damit vermutlich über die ubiquitäre TATA-Box und nicht über die HLA-II-spezifische X-Box und CIITA reguliert.
Die Untersuchung des Bindungsverhaltens der für die HLA-II-Promotoren spezifischen X-Box ergab, daß sowohl die Zellkernextrakte der Monozyten-Zellinie als auch die der B-Lymphom-Zellinie deutlich besser an die Promotor-Oligonukleotide von DRA binden als an die von DRB. Darüber hinaus lassen sich alle Bindungsaffinitäten durch die Stimulation mit INF-γ im Falle von THP-1 deutlich und im Falle von BJAB nur etwas steigern.
In bezug auf den Vergleich von DRA mit DRB wurde bereits von Louis et al. angedeutet, daß die durch einen CAT-Assay bestimmte Promotoraktivität von DRA vierfach höher ist als die von DR4, bzw. achtfach höher als die von DR7 und DR9 [39]. Eine Kompetitionsanalyse mittels EMSA von Louis-Plence et al. hatte ergeben, daß die Transkriptionsfaktoren, die an die X-Box binden, die höchste relative Bindungsaffinität zu der X-Box von DRA haben. Die relative Bindungsaffinität zur X-Box von DRB war hingegen am geringsten, geringer sogar als die zur X-Box von DPA, DQB, DQA oder DPB [44]. Somit entsprechen die in dieser Dissertation gemessenen Daten der Auffassung, daß die HLA-II-Expression über die Locus-spezifische X-Box, die mit dem RFX-Kompex und dem CIITA interagiert, reguliert wird [14]. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, daß die DRA-Expression der reglementierende Schritt bei der HLA-DR-Oberflächenexpression ist [39], da sich die Bindungsaffinität der THP-1-Zellkernextrakte an die X-Box-Sequenz von DRA durch die Stimulation am stärksten steigern ließ.
Durch die Gabe von INF-γ wurde die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen in den monozytären Zellen deutlich verstärkt (siehe 3.2). Dies spiegelte sich auch bei der Bindungsaffinitäten der Zellkernextrakte an die X-Box wider, die durch die Stimulation mit INF-γ ebenfalls erhöht wurden. Eine Stimulation mit den anderen Substanzen führte weder zu einer Erhöhung der HLA-DR-Oberflächenexpression noch zu einem deutlichen Anstieg der Bindungsaffinitäten. Die INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression wird nach den Ergebnissen dieser Arbeit vermutlich über die X-Box vermittelt. Gleiches gilt für die HLA-DR-Oberflächenexpression in der Zellinie BJAB, bei der lediglich die mittlere Fluoreszenzintensität der zu 100% HLA-DR-positiven Zellen etwas zunimmt. Entsprechend wurden hier die insgesamt höheren Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernextrakte an die einzelnen Promotor-Oligonukleotide durch die Stimulation mit INF-γ nur im geringen Ausmaße erhöht. Darüber hinaus zeigte sich auch für die BJAB-Zellinie, daß eine Stimulation mit weiteren Substanzen weder die HLA-DR-Oberflächenexpression noch das Bindungsverhalten der Zellkernlysate wesentlich beeinflußt.
Für das murine System wurde bereits gezeigt, daß eine differentielle Expression von MHC-II-Genen auf die Makrophagen beschränkt ist und sich auch auf die Zytokinproduktion der T-Zellen auswirkt [31]. Eine hohe MHC-II-Expression der Makrophagen regte die T-Zellen in deren Gegenwart zur Ausschüttung von Zytokinen an, die eine Th1-Antwort begünstigen. Im Gegensatz dazu führte eine geringere MHC-II-Expression der Makrophagen zu einer vermehrten Produktion Th2-spezifischer Zytokine der T-Zellen. Die Verschiebung des Th1/Th2-Gleichgewichtes durch die differentielle Expression der Monozyten könnte sich somit auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA auswirken.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde beschrieben, daß der DR7-Haplotyp bevorzugt sowohl mit dem DRB4B-Promotor als auch mit der DRB4-Spleißvariante assoziiert ist (siehe 3.1). Zu den Häufigkeiten der DRB4-Spleißvariante unter DRB4-positiven Individuen gab es bisher keine Zahlen, wohl aber zur Verteilung des DRB4B-Promotors. In einer japanischen Studie wurde für eine japanische Population beschrieben, daß 2 von 86 DR4-positiven Allelen (2%) bzw. 1 von 42 DR9-positiven Allelen (3%) mit dem DRB4-Gen assoziiert waren [45]. Hingegen waren 2 von 5 DR7-positiven Allelen (40%) mit dem DRB4B-Promotor assoziiert. Es ist bemerkenswert, daß in der japanischen Population im Gegensatz zu der hier betrachteten Population kaukasischen Ursprungs der DR9-Haplotyp aufgrund des anderen ethnischen Hintergrunds wesentlich häufiger auftritt als der DR7-Haplotyp. Nichtsdestotrotz bestätigt sich, daß der DRB4B-Promotor bevorzugt mit dem DR7-Haplotypen assoziiert ist, wenngleich die Anzahl der betrachteten Allele mit 5 sehr niedrig ist.
Das gehäufte Auftreten des DRB4B-Promotors und der DRB4-Spleißvariante unter DR7-positiven Individuen hat für die HLA-DR-Expression zwei gegensätzliche Konsequenzen zur Folge. Zum einen bedeutet das Tragen der DRB4-Spleißvariante, daß es durch die Mutation an der Spleißerkennungssequenz zu keiner DRB4-Expression
Jedoch deuten die Ergebnisse in Kapitel 3.5 darauf hin, daß eine erhöhte HLA-DR-Expression mit der Schwere des Krankheitsverlaufes der RA korreliert. Unter den RA-Patienten mit einer höheren CRP-Konzentration im Serum war die Häufigkeit des DRB4B-Promotors, der eine höhere transkriptionelle Aktivität als der DRB4A-Promotor besitzt, statistisch signifikant erhöht. Weiterhin war das Auftreten der DRB4-Spleißvariante, welche eine DRB4-Expression verhindert, unter den RA-Patienten mit einer höheren CRP-Konzentration geringer. Dennoch war dieses zweite Ergebnis aufgrund der geringen Anzahl der betrachteten Allele statistisch nicht signifikant.
Interessanterweise gab es keinen deutlichen Unterschied zwischen den Häufigkeiten der HLA-DRB1*04-, -*07- und -*09-Allele in den beiden Patientengruppen. Da die hier untersuchte RA-Kohorte jedoch eine statistisch signifikante Assoziation mit dem Haplotyp HLA-DRB1*04 zeigt, scheint das gemeinsame Epitop („shared epitope“) keinen Einfluß auf die Schwere des Krankheitsverlaufes zu haben. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen des DR53-Locus keinen Einfluß auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA hat, wohl aber einen Einfluß auf den Krankheitsverlauf der RA.
In dieser Arbeit wurde für die Untersuchung der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen in zwei verschiedenen APC die monozytäre Zellinie THP-1 und die B-Lymphom-Zellinie BJAB gewählt. Es bleibt zu klären, inwiefern auch andere Zelltypen eine differentielle Expression aufweisen. Zum einen wären die dendritischen Zellen als dritter Vertreter der APC interessant. Zum anderen findet man auch HLA-DR-positive Zellen in der Gelenkhaut (Synoviozyten) bei RA-Patienten (siehe 1.3.2). Eine
Die wichtigste genetische Ursache von rheumatoider Arthritis (RA) wird in den humanen Leukozyten-Antigenen (HLA) gesehen. Die RA ist vor allem mit dem Haplotypen HLA-DRB1*04 (DR4) assoziiert. Es wurden bisher mehrere Mechanismen beschrieben, wie diese HLA-DR-Moleküle die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen in unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen als möglicher Mechanismus untersucht. Dabei wurden strukturelle Unterschiede zwischen den Promotoren des krankheitsassoziierten DR4-Haplotyps und den neutralen Haplotypen DR7 und DR9 eingehender betrachtet. Allen drei Haplotypen ist gemein, daß sie das DRB4-Gen als zweites funktionelles, gering-polymorphes DRB-Gen tragen, wobei das DRB4-Gen entweder den DRB4A oder den –B-Promotor besitzt. Über die Bestimmung der Luziferaseaktivität wurden die transkriptionellen Aktivitäten der fünf verschiedenen Promotoren DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B in der humanen Monozytenzellinie THP-1 und in der humanen B-Lymphom-Zellinie BJAB ermittelt. Es zeigte sich, daß in beiden Zellinien die Promotoraktivität von DRB4B höher war als die von DRB4A. Um den Einfluß der einzelnen Promotorelemente auf die unterschiedlichen Transkriptionsaktivitäten näher zu untersuchen, wurde mit Hilfe der surface plasmon resonance (SPR) die Bindung der Transkriptionsfaktoren aus den Zellkernlysaten von THP-1 und BJAB an die unterschiedlichen S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen analysiert. Als unerwartetes Ergebnis konnte gezeigt werden, daß die unterschiedliche Expression von DRB4A und DRB4B durch die ubiquitäre TATA-Box vermittelt wird. Erwartungsgemäß hingegen wurde die INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression von THP-1- aber auch von BJAB-Zellen durch die für die HLA-II-Promotoren spezifische X-Box vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß der Haplotyp DR7 bevorzugt mit dem DRB4B-Promotor, der eine höhere transkriptionelle Aktivität als der DRB4A-Promotor besitzt, und mit der DRB4-Spleißvariante, die eine DRB4-Expression verhindert, assoziiert ist. Da die beiden Häufigkeiten unter den RA-Patienten und den Kontrollen gleich waren, kann ein Einfluß der HLA-DR-Expression auf die Empfänglichkeit gegenüber der RA ausgeschlossen werden. Bei der Analyse einer bereits gut charakterisierten RA-Kohorte stellte sich allerdings heraus, daß der DRB4B-Promotor mit einem schweren und die DRB4-Spleißvariante mit einem milden Krankheitsverlauf assoziiert ist, so daß eine erhöhte HLA-DR-Expression den Krankheitsverlauf negativ zu beeinflussen scheint. Möglicherweise spielt der Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen neben dem Polymorphismus der kodierenden Gensequenzen auch für andere Gene eine wichtigere Rolle als bisher angenommen.
An dieser Stelle möchte ich mich bei PD Dr. Brigitte Müller und Prof. Dr. Andreas Radbruch bedanken, die es mir ermöglicht haben, am DRFZ diese Dissertation anzufertigen. Darüber hinaus bin ich Prof. Dr. Wolfgang Lockau für die bereitwillige Übernahme der Begutachtung außerordentlich dankbar.
Weiterhin möchte ich allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des DRFZ danken, die zur angenehmen Arbeitsatmosphäre beigetragen haben, darunter vor allem der Müller-Gruppe, bestehend aus Bianka, Rainer, Kai, Jill, Miro, Katrin, Sandra sowie Katharina und Verena, aber auch der Lauster-Gruppe, insbesondere Roland, Mark und Luzie. Selbstverständlich danke ich auch Osman und Franca, die mir die Bindungsexperimente näher gebracht haben.
Mein persönlicher Dank gilt Bernhard, meiner Mutter und meinem Vater – aber auch Hans, der das Ende der Promotion leider nicht mehr erleben durfte – und Maria sowie meinen Freunden, insbesondere Peter und Martin, die mich alle unterstützt und ermutigt haben.
Wissenschaftliche Publikation:
Heldt C, Müller B: Differential Expression of HLA II Genes Associated with Disease Progression in Rheumatoid Arthritis. In Vorbereitung
Poster und Vorträge:
2nd Joint Meeting Signal Transduction in Langen, 19.11. – 21.11.1998
Antisense CD11b integrin inhibits the development of a differentiated monocytic phenotype in myeloid cells (Christian Heldt / Ralf Hass, Berlin)
Institut für Zellbiologie und Immunologie (IZI) an der Universität Stuttgart, 04.03.1999
Antisense CD11b integrin inhibits the development of a differentiated monocytic phenotype in myeloid cells (Christian Heldt / Ralf Hass, Berlin)
23. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie in Rostock, 14.03. – 18.03.1999
Phorbol ester-induced differentiation of human myeloid leukemia cells is inhibited by antisense CD11b integrin expression (Christian Heldt / Ralf Hass, Berlin)
Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, 13.03. – 16.03.2002
Differential expression of DRB genes (Christian Heldt / Brigitte Müller-Hilke, Berlin)
Hiermit versichere ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne Verwendung anderer Hilfsmittel und Hilfen als die in der Arbeit angegebenen verfaßt habe.
Christian Heldt