Damit möglichst viele verschiedene Antigene vom Immunsystem erkannt werden können, hat der Mensch im Laufe der Evolution eine Vielfalt von HLA-Molekülen entwickelt. Die HLA-Gene werden als polygen bezeichnet, da es mehrere Gene gibt, die für die entsprechenden Moleküle kodieren. Strukturell stellen sich die HLA-Moleküle als hochgradig polymorphe, an der Zelloberfläche exprimierte Heterodimere dar. Der HLA-Komplex ist größtenteils auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 6 lokalisiert und umschließt einen Genabschnitt von etwa 3500kbp. Innerhalb dieses Komplexes sind die HLA-Gene in drei Klassen organisiert: HLA-Klasse-I, -II und -III. Die HLA-Klasse-I-Gene kodieren für die Oberflächenmoleküle HLA-A, -B und –C, die HLA-Klasse-III-Gene hingegen für einige Proteine des Komplementsystems. Die HLA-Klasse-II-Genregion beherbergt die an der Zelloberfläche exprimierten HLA-DR, -DQ- und –DP-Gene. Während in der HLA-DQ- und –DP-Region je ein α- und β-Kettengen exprimiert wird, finden sich im Bereich der HLA-DR-Region ein wenig polymorphes α-Kettengen (DRA) und mehrere exprimierte β-Kettengene (DRB1, DRB3, DRB4 und DRB5) sowie die nicht exprimierten Pseudogene DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 und DRB9. Ein besonderes Charakteristikum der HLA-DR-Region ist, daß die Zahl der DRB-Gene auf einem Chromosom vom jeweiligen Haplotyp abhängig ist [9]. Für das HLA-DR-Molekül gibt es fünf verschiedene allelische Linien, die in Abbildung 2 dargestellt sind.

Abbildung 2: Der HLA-Locus besteht aus den Klassen I, II und III. Die HLA-Klasse-II besteht aus den Regionen DP, DQ und DR. Unten sind für HLA-DR die fünf allelischen Linien gezeigt.

Farbig hinterlegte Rechtecke repräsentieren funktionelle Gene, wobei die grün hinterlegten Gegenstand der dieser Arbeit sind, weiße Rechtecke stellen Pseugogene dar.

Diese verschiedenen allelischen Linien tragen alle das gleiche DRA-Gen aber ein oder zwei verschiedene funktionelle DRB-Gene und führen deshalb zur Ausprägung von ein oder zwei unterschiedlichen HLA-DR-Molekülen pro Chromosom. Die DRB1-Gene werden in die zehn Hauptgruppen HLA-DRB1*01 (DR1) – HLA-DRB1*10 (DR10) unterteilt. Die DR1-, DR8- und DR10-Loci enthalten jeweils nur ein funktionelles DRB-Gen und ein DRA-Gen. Die DR51-, DR52- und DR53-Loci beinhalten jeweils zwei funktionelle DRB-Gene und ein DRA-Gen.

Die HLA-DR-Gene gehören zu den polymorphsten Genen überhaupt. Es sind bis heute 273 DRB1-Allele, 30 DRB3-Allele, 10 DRB4-Allele, 15 DRB5 und 2 DRA-Allele bekannt [13]. Alle HLA-DR-Moleküle besitzen die gleiche Sekundärstruktur, sie sind Glykoproteine, die aus einer 35kDa schweren α- und einer 28kDa schweren β-Kette zusammengesetzt sind. Beide Ketten weisen je zwei extrazelluläre Domänen (α1 und α2 bzw. β1 und β2), eine transmembrane Region und einen intrazellulären C-terminalen Abschnitt auf. Die Variation für diesen Bereich betrifft dabei ausschließlich die β-Kette, da sie die Antigenbindungsstelle (die peptidbindende Grube des HLA-DR-Moleküls) formt. Die einzig bekannte Variation der α-Kette liegt somit außerhalb der Antigenbindungsstelle. In der β-Kette gibt es drei Regionen mit einer erhöhten Variabilität, die hypervariablen Regionen (HVR) 1, 2 und 3, die ausschließlich vom Exon 2 kodiert werden. Die HVR, die in Abbildung 3 dargestellt sind, umfassen die Aminosäuresequenzen 9 – 13 (HVR1), 26 – 38 (HVR2) und 68 – 77 (HVR3).

Neben dem Polymorphismus der kodierenden Sequenzen, welcher der Erkennung möglichst vieler Erreger dient, gibt es einen Polymorphismus der regulierenden Sequenzen – der Promotoren. Die Promotoren sind die Regulationseinheiten der Gene und beinhalten mehrere spezifische DNA-Sequenzen (Boxen), die als Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren dienen. Die Promotoren der HLA-DRB-Gene sind durch die folgenden fünf Boxen charakterisiert: S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Box [14, 15]. Die Y-Box ist eine invertierte CCAAT-Box, und die X-Box besteht aus den X1- und X2-Motiven. Die S-Box (auch W-, H- bzw. Z-Box genannt) wird als Duplikation der X-Box beschrieben [16]. Das X1-Motiv als Bestandteil der X-Box ist spezifisch für die Promotoren der HLA-II-Gene. Das X2-Motiv sowie die Y-, CCAAT- und TATA-Boxen hingegen sind auch für die Regulation anderer Gene bekannt.

Abbildung 3: Variabilität innerhalb des HLA-II-Moleküls, modifiziert nach Janeway, Travers et al., Seite 142.

In den oberen beiden Bildern wird die auf die β-Kette (gelb) beschränkte Variabilität verwiesen. Die hypervariablen Regionen, die in der β1–Domäne liegen, sind rot hervorgehoben. Im unteren Bild wird die Variabilität der einzelnen Positionen der Aminosäure für die β-Kette gezeigt, dabei sind die kodierenden Exons sowie die HVR angezeigt. TM = Transmembran-Domäne.

Die HLA-II-Promotoraktivität hängt von der Bildung spezifischer Komplexe ab, die aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren sowie Transaktivator-Proteinen bestehen. Der Regulatory factor X (RFX)-Komplex, bestehend aus RFX5, RFXAP und RFXANK, bindet an die X1-Box und ist absolut erforderlich für die Expression von HLA-II-Genen [14]. An die X2-Box, die auch als cAMP responsive element (CRE)- oder TPA responsive element (TRE)-Box bekannt ist, bindet das X2 binding protein (X2BP) oder analog das CRE binding protein (CREB) bzw. TRE binding protein (TREB). Die nuclear factors (NF)-YA, -YB und –YC binden gemeinsam sowohl an die Y- als auch an die CCAAT-Box. Aufgrund der Ähnlichkeit von der S- und X-Box wird davon ausgegangen, daß der RFX-Komplex auch an die S-Box bindet [17]. An die TATA-Box bindet der Transcription factor IID (TFIID), der zu einem Komplex mehrerer Transkriptionsfaktoren gehört, die mit der RNA-Polymerase II interagieren [18, 19]. Der Klasse II-Transaktivator (CIITA), welcher differentiell in den APC exprimiert wird, bindet dann an die Transkriptionsfaktoren der X-Box (siehe Abbildung 4) [14]. Es ist umstritten, ob der CIITA noch mit den anderen Transkriptionsfaktoren interagiert. Durch die Protein-Protein-Wechselwirkungen wird die Transkriptionsrate der RNA-Polymerase II beeinflußt und damit die Expression der HLA-DR-Moleküle.

Abbildung 4: Koordinierte Bindung von Transkriptionsfaktoren und CIITA an den HLA-II-Promotor.

Der RFX-Komplex bindet sowohl an die S- als auch an die X1-Box, X2BP bindet an die X2-Box. NF-Y bindet sowohl an die Y- als auch an die CCAAT-Box und TFIID an die TATA-Box. Der CIITA interagiert mit den Transkriptionsfaktoren der X-Box.

Im Gegensatz zur kodierenden Region ist der Polymorphismus der Promotoren nicht so stark ausgeprägt. Für jeden Haplotyp (DR1 - DR10) sowie für die beiden DRB3- und DRB5-Gene ist jeweils nur ein Promotor bekannt, lediglich für das DRB4-Gen sind zwei verschiedene Promotoren beschrieben [20]. Abbildung 5 zeigt die 257bp umfassenden Promotorsequenzen des DR53-Locus, die im Rahmen der Dissertation näher untersucht werden sollen. Die DRB4A- und –B-Promotoren unterscheiden sich an zwei Positionen im proximalen Promotorbereich sowie an drei Positionen nach dem Transkriptionsstart. Ferner gibt es eine DRB4-Spleißvariante, die eine Mutation von G nach A an der Spleißerkennungssequenz an der Grenze vom Intron 1 zum Exon 2 aufweist, welche die Expression eines funktionellen Proteins verhindert [21].

Abbildung 5: Vergleich der Promotorsequenzen der HLA-DRB-Allele des DR53-Locus.

Für die fünf Sequenzen sind die S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen sowie Transkriptions- und Translationsstart hervorgehoben. Die Unterschiede zwischen den Sequenzen sowie einzelne Positionen der Basenpaare sind angezeigt.

Den zwei verschiedenen DRB4-Promotoren stehen zehn unterschiedliche DRB4-Allele gegenüber. In Tabelle 2 werden die einzelnen DRB4-Allele aufgeführt und mit dem DRB4*0101101-Allel verglichen. Die DRB4*0103101- und -*0103102N-Allele sind mit dem DRB4A-Promotor assoziiert, während das DRB4*0101101-Allel mit dem DRB4B-Promotor assoziiert ist [22, 23]. Für die anderen sieben Allele ist nicht bekannt, ob sie auch einen dieser beiden Promotoren tragen oder gänzlich andere. Von den zehn DRB4-Allelen werden lediglich sieben auch exprimiert. Die Variationen dieser Allele liegen für DRB4*0102 und -*0104 innerhalb der HVR3, für die anderen Allele außerhalb einer der drei HVR.

DRB4-Allel

Variation

DRB4*0101101

-

DRB4*0102

Mutation im Kondon 76

DRB4*0103101

Mutation im Kodon 135

DRB4*0103102N

trägt die DRB4-Spleißvariante

DRB4*01032

Mutation im Kodon 188

DRB4*01033

stille Mutation im Kodon 78

DRB4*0104

Mutation im Kodon 77

DRB4*0105

Mutation im Kodon 81

DRB4*0201N

11bp Deletion im Exon 2

DRB4*0301N

fehlendes Exon 2

N: Nullallel

Tabelle 2: Variation in der kodierenden Region der DRB4-Allele

Zudem gibt es eine geringere Variation innerhalb der Boxen der Promotoren als außerhalb, wenn man verschiedene Spezies miteinander vergleicht. Im Gegensatz dazu gibt es eine höhere Variation innerhalb der Boxen als außerhalb, vergleicht man verschiedene Allele einer Spezies miteinander [24]. Der Polymorphismus innerhalb der Boxen bedeutet für eine Spezies, wenn man unterstellt, daß dadurch unterschiedliche Promotoraktivitäten und somit unterschiedliche Expressionen an der Oberfläche resultieren, neben der Heterozygotie ein zusätzliches Maß an Flexibilität bei der Immunantwort. Kürzlich wurde ein Modell der Ko-Evolution der kodierenden und regulierenden Sequenzen beschrieben. Darin wird postuliert, daß sich der Polymorphismus der regulierenden Gensequenzen parallel zum Polymorphismus der kodierenden Gensequenzen entwickelt hat. Entsprechend sollten MHC-II-Sequenzen, die eine Th2-Differenzierung begünstigen, mit MHC-Molekülen, die in der Lage sind, Epitope eines parasitären Wurms zu präsentieren, assoziiert sein. Dagegen müßten Promotoren, welche die Th1-Antwort begünstigen, mit MHC-Molekülen assoziiert sein, die virale Epitope präsentieren [25].

Im Rahmen der Dissertation soll die differentielle Expression von krankheitsassoziierten und nicht-krankheitsassoziierten HLA-DRB-Allelen eingehender untersucht werden. Dabei sind die Gene des DR53-Locus Gegenstand der Analyse, da dieser Locussowohl für den krankheitsassozierten Haplotypen DR4 als auch für die neutralen Haplotypen DR7 und DR9 kodiert. Zunächst soll eine genaue Analyse der strukturellen Unterschiede der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und DRB4B-Promotoren klären, ob sie unterschiedlich unter den RA-Patienten und den Kontrollen verteilt sind. Im weiteren Verlauf werden die Transkriptionsaktivitäten der fünf Promotoren über die Aktivitätsbestimung der Luziferase ermittelt. Dabei sollen die Promotoraktivitäten in zwei unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen bestimmt und miteinander verglichen werden, wofür die Monozytenzellinie THP-1 sowie die B-Lymphom-Zellinie BJAB gewählt werden.