Ergebnisse

Bevorzugte Assoziation des DRB4B-Promotors und der DRB4-Spleißvariante mit dem Haplotyp DR7

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst der mit der RA assoziierte Haplotyp DR4 mit den DR7 und DR9-Haplotypen, die nicht mit der RA assoziert sind, hinsichtlich struktureller Unterschiede miteinander verglichen. Für die Untersuchung wurden 35 RA-Patienten und 28 Kontrollen ausgewählt, die entweder auf einem oder auf beiden Chromosomen DR4-, DR7- oder DR9-positiv waren. Unter den 63 RA-Patienten und Kontrollen gab es insgesamt 36 DR4-, 49 DR7- und 5 DR9-Haplotypen. Für die Bestimmung der Assoziation der drei Haplotypen mit den beiden unterschiedlichen DRB4-Promotoren und mit der DRB4-Spleißvariante wurden 76 DRB4-Promotoren sowie 86 Intron 1/Exon 2-Grenzen amplifiziert und sequenziert (siehe 2.2.1-2.2.3 und 2.2.8). Die Auswertung der Sequenzen ist für die Patienten in Tabelle 6 und für die Kontrollen in Tabelle 7 dargestellt. Zusätzlich sind die von Listing et al. bestimmten CRP-Konzentrationen zu Beginn der Erkrankung mit der RA aufgeführt. Die Sequenzen wurden anschließend - wo es möglich war - mit den drei Haplotypen korreliert. Eine Zuordnung war in den Fällen, die DR4/DR7-heterozygot waren und nur eine DRB4-Spleißvariante und/oder zwei unterschiedliche DRB4-Promotoren besaßen, nicht möglich.

Patienten-Nr.

HLA-DRB1-Allel-
Kombination

CRP zu Beginn
[mg/l]*

DRB4-
Spleißvariante

DRB4-
Promotor

02126

4/4

21,5

-/-

A/B

06019

4/4

3,0

-/-

A/A

06022

4/4

3,0

-/-

A/A

10016

4/4

14,5

-/-

A/A

10041

4/4

23,0

-/-

A/A

10052

4/4

24,4

-/-

A/B

10086

4/4

5,0

+/-

A/A

20044

4/4

20,0

-/-

A/B

02112

1/7

12,1

+

A

06092

1/7

n.b.

+

A

10044

1/7

8,0

+

A

20029

1/7

28,3

-

A

06007

2/7

76,0

-

B

10021

2/7

5,0

-

A

10050

2/7

0,5

-

B

10087

2/7

27,7

-

B

20069

2/7

n.b.

-

B

10015

3/7

5,0

-

A

10076

3/7

5,0

+

A

02104

4/7

19,7

-/-

n.b.

02109

4/7

83,4

-/-

n.b.

06011

4/7

2,8

-/-

n.b.

20021

4/7

10,0

+/-

n.b.

20072

4/7

5,0

-/-

n.b.

34004

4/7

n.b.

+/-

n.b.

10039

5/7

5,0

-

B

10079

5/7

7,3

-

A

02102

6/7

25,9

-

B

02003

7/7

34,8

+/-

A/A

10027

7/7

5,0

+/+

A/A

08022

7/8

16,0

-

B

02002

1/9

25,9

-

A

06005

2/9

24,0

-

A

10059

6/9

5,0

-

A

10126

6/9

10,0

-

A

einzelne Allele sind durch einen Schrägstrich getrennt, n.b.: nicht bestimmt, * siehe Listing et al., 2000

Tabelle 6: Daten von Patienten

Kontrollen-Nr.

HLA-DRB1-
Allel-Kombination

DRB4-
Spleißvariante

DRB4-
Promotor

KG044

4/4

+/-

A/A

KG050

4/4

-/-

A/B

KG064

4/4

-/-

A/B

KG113

4/4

-/-

A/A

KG122

4/4

+/-

A/A

KG128

4/4

-/-

A/B

KG014

1/7

-

B

KG077

1/7

-

B

KG016

2/7

+

A

KG017

2/7

-

B

KG063

2/7

-

A

KG089

2/7

+

A

KG101

2/7

-

B

KG110

2/7

-

B

KG008

3/7

-

A

KG111

4/7

-/-

A/A

KG134

4/7

-/-

A/B

KG009

5/7

+

A

KG060

5/7

+

A

KG073

5/7

-

B

KG124

5/7

+

A

KG129

5/7

-

A

KG071

6/7

-

A

KG059

7/7

+/-

A/B

KG108

7/7

-/-

A/A

KG127

7/7

-/-

B/B

KG114

7/8

-

A

KG007

2/9

-

A

einzelne Allele sind durch einen Schrägstrich getrennt

Tabelle 7: Daten von Kontrollen

Abbildung 7 zeigt, daß sowohl der DRB4B-Promotor als auch die DRB4-Spleißvariante bevorzugt mit dem Haplotypen DR7 assoziiert ist. Hinsichtlich der Assoziation mit dem DRB4B-Promotor besaßen 38% der DR7-positiven Allele einen solchen Promotor, aber nur 21% der DR4-positiven Allele. Kein DRB4B-Promotor war unter den DR9-positiven Allelen zu finden (siehe Abbildung 7A). Für die Assoziation der DRB4-Spleißvariante wurden ausschließlich die DRB4A-positiven Allele betrachtet, da nur sie eine Spleißvariante tragen können. Insgesamt trugen 50% der DR7-positiven Allele eine DRB4-Spleißvariante, wohingegen lediglich 13% der DR4-positiven Allele eine solche Spleißvariante trugen. Unter den fünf DR9-positiven Allelen wurde keine Spleißvariante gefunden (siehe Abbildung 7B). Darüber hinaus gab es keine Unterschiede zwischen den Häufigkeiten der Assoziation unter den RA-Patienten und unter den Kontrollen (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 7: Differentielle Assoziation von HLA-DRB1*04, -*07 und -*09 mit dem DRB4B-Promotor (A) und der DRB4-Spleißvariante (B). Die Analyse erfolgte mittels Amplifikation und Sequenzierung der jeweiligen Gensequenz. Die Balken repräsentieren die einzelnen Häufigkeiten für die DR4-, DR7- und DR9-Haplotypen, die mit dem DRB4B-Promotor (A) oder der DRB4-Spleißvariante (B) assoziiert sind.

Unterschiedliche HLA-DR-Oberflächenexpression auf einer monozytären und einer B-Lymphom-Zellinie

Die strukturellen Unterschiede der fünf verschiedenen Promotoren des DR53-Locus sollen nun auf molekularer Ebene in zwei unterschiedlichen APC weiter analysiert werden. Dazu wurden stellvertretend zwei verschiedene Zellinien ausgewählt, zum einen die monozytäre Zellinie THP-1 und zum anderen die B-Lymphom-Zellinie BJAB. Endogen kodieren die beiden Zellinien für unterschiedliche Haplotypen: THP-1 wurde positiv für DR1 und DR2 typisiert, während BJAB positiv für DR8 und DR5 (oder DR6) war. Die Allele DR5 und DR6 konnten dabei nicht eindeutig differenziert werden.

Zur weiteren Analyse wurde die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen der beiden Zellinien durch FACS-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper L243 bestimmt (siehe 2.2.9) und miteinander verglichen. Weiterhin wurden die zwei Zelltypen mit unterschiedlichen Substanzen stimuliert (siehe Tabelle 5), um deren Einfluß auf die HLA-DR-Expression zu ermitteln. Abbildung 8 zeigt, daß nur wenige der unstimulierten THP-1-Zellen positiv für HLA-DR sind. Durch die 48stündige Stimulation mit 1000U/ml INF-γ wurde in allen THP-1-Zellen die HLA-DR-Expression induziert, was an der Verschiebung der Population in Richtung einer höheren Fluoreszenzintensität zu erkennen ist.

Abbildung 8: Unterschiedliche Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen auf einer monozytären und einer B-Lymphom-Zellinie. Die Histogramme zeigen die FASC-Analyse der unstimulierten oder mit INF-γ stimulierten THP-1- und BJAB-Zellen. Die Zellen wurden sowohl mit einer Isotypkontrolle als auch mit dem monoklonalen Antikörper L243 gefärbt. Die Stimulation der Zellen erfolgte für 48h mit INF-γ.

Stimuli

Konzentration

HLA-DR-positive Zellen [%]

MFI

ohne

-

15,8

42,0

TGF-β1

20ng/ml

17,5

27,0

cAMP

100µM

14,5

34,9

LPS

10µg/ml

15,5

39,8

IL-1β

5ng/ml

16,2

41,2

Vitamin D₃

250ng/ml

15,6

42,1

TPA

1nM

15,7

44,9

TNF-α

1000U/ml

16,3

45,1

GM-CSF

1000U/ml

18,1

47,8

IL-4

20U/ml

17,6

48,5

INF-γ

1000U/ml

96,9

131,6

Tabelle 8: Anteil HLA-DR-positiver und mittlere Fluoreszenzintensitäten unterschiedlich stimulierter THP-1-Zellen

Stimuli

Konzentration

mFI

ohne

-

153,4

anti-CD40/anti-IgM

je 5µg/ml

105,5

cAMP

100µM

129,8

TGF-β1

20ng/ml

131,2

Vitamin D₃

250ng/ml

138,9

LPS

10µg/ml

142,3

IL-4

20U/ml

175,6

TPA

1nM

177,0

IL-1β

5ng/ml

181,2

INF-γ

1000U/ml

208,0

Tabelle 9: Mittlere Fluoreszenzintensitäten unterschiedlich stimulierter BJAB-Zellen

Eine Stimulation mit TGF-β1, cAMP, LPS, IL-1β, Vitamin D₃, TPA, TNF-α, GM-CSF oder IL-4 induziert die THP-1-Zellen dagegen nicht bzw. unwesentlich (siehe Tabelle 8). Im Unterschied dazu waren die BJAB-Zellen ohne oder mit INF-γ-Stimulation zu 100% HLA-DR-positiv. Durch die Stimulation mit INF-γ wurde lediglich die mittlere Fluoreszenzintensität (mFI) von 153,4 auf 208,0 erhöht. Diese Verschiebung konnte weder durch anti-CD40/anti-IgM noch durch cAMP, TGF-β1, Vitamin D₃ oder LPS erreicht werden. IL-4, TPA oder IL-1β hingegen erhöhten die mFI leicht (siehe Tabelle 9).

Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in den Zellinien THP-1 und BJAB

Im nächsten Schritt wurde betrachtet, ob die Sequenzunterschiede in der Promotorregion der drei Haplotypen mit ihren insgesamt fünf funktionellen DRB-Genen zu unterschiedlichen transkriptionellen Aktivitäten in der monozytären Zellinie THP-1 und in der B-Lymphom-Zellinie BJAB führen. Dazu wurden die Promotoraktivitäten der folgenden Gene bestimmt: DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B. Die je 257bp umfassenden Promotorsequenzen, welche die S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen einschließen (siehe Abbildung 5), wurden zunächst amplifiziert (siehe 2.2.1 und 2.2.3). Dazu wurde auf die DNA der Individuen zurückgegriffen, deren Sequenzanalyse in Kapitel 3.1 ergeben hatte, daß sie für den jeweiligen Promotor homozygot positiv waren. Die PCR-Produkte wurden anschließend in den Reportervektor pGL3, der das Luziferasegen als Reportergen besitzt, eingefügt (siehe 2.2.4 und 2.2.5). Im Anschluß daran wurden die unterschiedlichen pGL3-Vektoren und der pCMVβ-Vektor, der als Transfektionskontrolle dient, in E. coli-Zellen transformiert (siehe 2.2.6). Mit den erfolgreich transformierten Zellen wurde danach durch die Plasmidpräparation genügend DNA für die folgende Transfektion hergestellt (siehe 2.2.7). Die pGL3-Vektoren mit den fünf unterschiedlichen Promotorkonstrukten sowie der pGL3-Vektor ohne Promotor als Standard wurden transient mit dem pCMVβ-Vektor, der für die β-Galaktosidase kodiert, in die beiden Zellinien THP-1 und BJAB transfiziert (siehe 2.2.10). Die Bestimmung der transkriptionellen Aktivitäten der fünf verschiedenen Promotorkonstrukte wurde über die Aktivitätsbestimmung der Luziferase und der β-Galaktosidase ermittelt (siehe 2.2.11 und 2.2.12).

Die einzelnen Promotoraktivitäten in der monozytären Zellinie THP-1 und in der B-Lymphom-Zellinie BJAB sind in Abbildung 9 wiedergegeben. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis einer Messung. Weitere Messungen unterschieden sich lediglich im Vergleich zum Standard (pGL3-Vektor ohne Promotor), wohingegen die Verhältnisse der spezifischen Promotoraktivitäten untereinander gleich waren. Für die THP-1-Zellen zeigte sich, daß der DR4-Promotor mit dem Wert 12 für die relative Luziferaseaktivität die geringste transkriptionelle Aktivität besaß. Die Werte für die Promotoraktivitäten von DR7, DR9 und DRB4A sind mit den Werten 26, 29 und 27 vergleichbar und damit 2,2- bis 2,4fach höher als der Wert vom DR4-Promotor. Der DRB4B-Promotor besitzt mit dem Wert 97 die höchste Aktivität in der THP-1-Zellinie und ist damit achtfach höher als der Wert vom DR4-Promotor.

Dagegen variierten die Werte für die Promotoraktivitäten in der BJAB-Zellinie lediglich zwischen 15 und 28. Hier besaß der DR4-Promotor mit dem Wert 28 die höchste transkriptionelle Aktivität, während der DRB4A-Promotor mit dem Wert 15 die geringste Aktivität aufwies und damit etwa die Hälfte des DR4-Promotors. Die Promotoraktivitäten von DR7, DR9 und DRB4B lagen mit den Werten 18, 20 und 25 dazwischen.

Abbildung 9: Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in THP-1 (A) und BJAB (B). Die transkriptionellen Aktivitäten wurden durch die Aktivitätsbestimmung der Luziferase und der β-Galaktosidase ermittelt. Die Aktivitäten wurden 6h (THP-1) bzw. 22h (BJAB) nach der Transfektion im Luminometer bzw. im ELISA-Reader bestimmt. Gezeigt werden Mittelwerte aus je zwei Messungen mit den jeweiligen Standardabweichungen.

Unterschiedliches Bindungsverhalten von Zellkernlysaten an die einzelnen Promotorabschnitte des DR53-Locus

In diesem Kapitel soll das Bindungsverhalten der Zellkernlysate der monozytären Zellinie THP-1 und der B-Lymphom-Zellinie BJAB an die einzelnen Boxen der unterschiedlichen Promotoren des DR53-Locus untersucht werden. Möglicherweise lassen sich damit Rückschlüsse auf die gemessenen Promotoraktivitäten bzw. die HLA-DR-Oberflächenexpression ziehen. Dazu wurden die Promotorsequenzen von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B miteinander verglichen und doppelsträngige Oligonukleotide gewählt, die jeweils die S-, X-, Y-, CCAAT- oder TATA-Box abdecken. Die beiden Zellinien wurden für diese Versuche mit mehreren Substanzen stimuliert (siehe Tabelle 5), von denen bekannt ist, daß sie die HLA-DR-Expression über die Konzentration der Transkriptionsfaktoren beeinflussen [38]. Danach wurden von diesen Zellen Zellkernlysate hergestellt und deren Proteingehalt bestimmt (siehe 2.2.13 und 2.2.14). Die Interaktion der unterschiedlichen Promotor-Oligonukleotide mit den Zellkernlysaten wurde mit Hilfe der SPR charakterisiert (siehe 2.2.15), bzw. durch einen kompetitiven EMSA bestätigt (siehe 2.2.16).

Vergleichbares Bindungsverhalten der Zellkernextrakte an die unterschiedlichen CCAAT-Boxen des DR53-Locus

Abbildung 10A stellt die 26bp umfassende CCAAT-Box-Sequenzen der Promotoren von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B dar. Die Box selbst ist hochgradig konserviert, lediglich an den flankierenden Positionen gibt es Unterschiede. Die Sequenzen von DR7 und DR9 sind identisch und unterscheiden sich von DR4 nur durch ein Basenpaar. DRB4A und –B sind ebenfalls identisch, unterscheiden sich aber an drei Positionen von DR4. Die Abbildung 10B zeigt auf der linken Seite spezifische wenn auch schwache Bindungen der THP-1-Zellkernlysate an die drei unterschiedlichen Sequenzen der CCAAT-Box. Die relativen Bindungsaffinitäten, die in % Resonance Units (%RU) angegeben sind, sind mit 104 bis 110%RU vergleichbar. Die Bindung der BJAB-Zellkernlysate an die drei Sequenzen sind mit je 101%RU noch schwächer (siehe Abbildung 10B, rechte Seite). Die beiden Zellinien wurden ferner noch mit INF-γ, TGF-β1, Vitamin D₃ oder IL-1β stimuliert, jedoch konnte keine Erhöhung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren erzielt werden (siehe Tabelle 10).

INF-γ

Vitamin D₃

IL-1β

TGF-β1

THP-1

Random

100

100

100

100

DR4

107,2 ± 0,5

106,9 ± 0,8

104,9 ± 1,4

102,3 ± 0,3

DR7/DR9

106,2 ± 0,6

105,7 ± 0,8

103,4 ± 1,3

101,5 ± 0,1

DRB4

104,0 ± 0,5

101,0 ± 0,5

101,0 ± 0,5

101,0 ± 0,5

BJAB

Random

100

100

100

100

DR4

101,1 ± 0,1

100,5 ± 0,1

100,6 ± 0,1

100,2 ± 0,1

DR7/DR9

100,2 ± 0,1

100,4 ± 0,1

100,0 ± 0,0

99,4 ± 0,0

DRB4

101,0 ± 0,1

101,3 ± 0,1

101,3 ± 0,1

100,8 ± 0,1

aufgeführt sind Mittelwerte mit ihren jeweiligen Standardabweichungen

Tabelle 10: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen CCAAT-Box-Oligonukleotide

Abbildung 10: Vergleichbare Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die einzelnen Promotoren der CCAAT-Boxen. A zeigt die Promotorsequenzen der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und –B-Allele, dabei sind die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren grau unterlegt, die Unterschiede zwischen den Sequenzen sind angezeigt. B: Die Balken repräsentieren die jeweiligen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB-Zellkernlysaten an die Promotorregionen der CCAAT-Boxen von DR4, DR7/DR9 und DRB4. Das Bindungsverhalten wurde durch SPR bestimmt und auf die unspezifische DNA (Random) bezogen. Die Balken zeigen Mittelwerte aus je zwei Messungen mit ihren jeweiligen Standardabweichungen.

Ähnliches Bindungsverhalten der Zellkernlysate an die verschiedenen vom DR53-Locus kodierten S-Boxen

Die S-Box-Sequenzen für die einzelnen Promotoren des DR53-Locus sind in Abbildung 11A gezeigt. Der Polymorphismus der S-Box besteht nur in der Box selbst, nicht in den flankierenden Bereichen. Die Sequenzen von DR7 und DR9 unterscheiden sich von der DR4-Sequenz durch ein Basenpaar. Die beiden DRB4-Promotoren zeigen keine Unterschiede in der S-Box, sie unterscheiden sich von der DR7- und DR9-Sequenz durch ein weiteres Basenpaar. Die relativen Bindungsaffinitäten der THP-1- und BJAB-Zellkernextrakte zu den drei verschiedenen Promotorsequenzen werden durch die Balken in Abbildung 11 B verdeutlicht. Es zeigt sich wiederum, daß das Bindungsverhalten an die S-Box nur geringfügig variiert, die Werte für THP-1 liegen zwischen 119 und 124%RU, die für BJAB zwischen 114 und 120%RU. Durch die Stimulation mit INF-γ, TPA, und cAMP wurden die Bindungsaffinitäten bzw. die Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich verändert (siehe Tabelle 11).

Abbildung 11: Vergleichbare Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die einzelnen Promotoren der S- Boxen. A zeigt die Promotorsequenzen der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und –B-Allele, dabei sind die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren grau unterlegt, die Unterschiede zwischen den Sequenzen sind angezeigt. B: Die Balken repräsentieren die jeweiligen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB- Zellkernlysaten an die Promotorregionen der S-Boxen von DR4, DR7/DR9 und DRB4. Das Bindungsverhalten wurde gemäß der Legende von Abbildung 10 bestimmt.

INF-γ

CAMP

TPA

THP-1

Random

100

100

100

DR4

123,0 ± 0,8

110,9 ± 0,5

107,8 ± 1,0

DR7/DR9

116,7 ± 1,1

108,4 ± 1,0

106,7 ± 1,0

DRB4

119,8 ± 0,8

108,8 ± 1,5

106,4 ± 1,0

BJAB

Random

100

100

100

DR4

118,1 ± 1,4

109,5 ± 1,6

110,7 ± 1,1

DR7/DR9

113,3 ± 1,8

108,0 ± 1,3

108,9 ± 1,2

DRB4

114,6 ± 1,7

112,3 ± 4,2

107,8 ± 0,0

aufgeführt sind Mittelwerte mit ihren jeweiligen Standardabweichungen

Tabelle 11: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen S-Box-Oligonukleotide

Unterschiedliche Bindungen der Zellkernextrakte an die Y-Boxen von DRB1 und DRB4

Der Polymorphismus im Promotorbereich der Y-Box ist für die fünf Promotoren des DR53-Locus in Abbildung 12A gezeigt. Die Sequenzen von DR4, DR7 und DR9 sind für diesen Bereich gleich. Zu den beiden DRB4-Promotorsequenzen gibt es zwei Unterschiede, die innerhalb der Y-Box liegen. Darüber hinaus unterscheiden sich die Sequenzen von DRB4A und –B an einer Position 3´ der Y-Box. Die relativen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB-Zellkernlysaten zum DRB1-Oligonukleotid sind mit 168 bzw. 169%RU am stärksten (siehe Abbildung 12B). Im Gegensatz dazu betragen die relativen Bindungsaffinitäten zu den DRB4-Oligonukleotiden lediglich 122% (DRB4A) und 136%RU (DRB4B) für THP-1 bzw. 114%RU (DRB4A und -B) für BJAB. Auch hier konnte durch die Stimulation mit INF-γ, TGF-β1, Vitamin D₃ oder IL-1β in den beiden Zellinien im allgemeinen keine Erhöhung der spezifischen Bindung bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren erreicht werden (siehe Tabelle 12).

INF-γ

Vitamin D₃

IL-1β

TGF-β1

THP-1

Random

100

100

100

100

DR4/DR7/DR9

163,1 ± 4,2

161,1 ± 0,8

150,3 ± 1,4

146,2 ± 2,8

DRB4A

120,9 ± 1,7

110,1 ± 0,8

112,8 ± 1,4

112,4 ± 0,0

DRB4B

132,6 ± 1,1

134,1 ± 6,5

129,0 ± 2,2

123,5 ± 1,9

BJAB

Random

100

100

100

100

DR4/DR7/DR9

145,2 ± 6,2

148,4 ± 3,7

149,6 ± 0,0

140,3 ± 5,5

DRB4A

114,1 ± 0,5

110,9 ± 1,4

99,83 ± 1,1

109,5 ± 0,5

DRB4B

110,2 ± 1,2

118,1 ± 2,6

102,2 ± 1,7

98,9 ± 3,5

aufgeführt sind Mittelwerte mit ihren jeweiligen Standardabweichungen

Tabelle 12: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen Y-Box-Oligonukleotide

Abbildung 12: Unterschiedliches Bindungsverhalten der Zellkernlysate an die Y-Boxen von DRB1 und DRB4. A zeigt die Promotorsequenzen der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und –B-Allele, dabei sind die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren grau unterlegt, Unterschiede zwischen den Sequenzen sind angezeigt. B: Die Balken repräsentieren die jeweiligen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB- Zellkernlysaten an die Promotorregionen der Y-Boxen von DR4/DR7/DR9, DRB4A und DRB4B. Das Bindungsverhalten wurde gemäß der Legende von Abbildung 10 bestimmt.

Vermittlung der differentiellen Expression von DRB4A und DRB4B durch die TATA-Box

Der Vergleich der unterschiedlichen TATA-Box-Sequenzen ist in Abbildung 13A wiedergegeben. Während die TATA-Box selbst komplett konserviert ist, gibt es sowohl 5´ als auch 3´ der Box Unterschiede. Die Promotorsequenzen von DR4 und DR7 sind identisch, wobei sie sich im Vergleich zu DR9 in einem Basenpaar unterscheiden. Den gleichen Unterschied sieht man auch bei der DRB4B-Sequenz. Zusätzlich besitzen die beiden DRB4-Sequenzen 5´ zwei Substitutionen, die sie von den DRB1-Sequenzen unterscheiden. Die relativen Bindungsaffinitäten sind sowohl für die THP-1- als auch die BJAB-Zellkernextrakte zum DRB4B-Promotor am höchsten (203 bzw. 183%RU) und zum DRB4A-Promotor am geringsten (126 bzw. 106%RU). Die Bindungen der Zellkernextrakte an die beiden DRB1-Oligonukleotide liegen für THP-1 zwischen 174 und 179%RU und für BJAB zwischen 155 und 168%RU. Durch die Stimulation mit 1000U/ml INF-γ wurden die Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernlysate zu den DRB4-Oligonukleotiden um 5% (DRB4A) bis 10% (DRB4B) sowie zu den DRB1-Oligonukleotiden um 29% (DR9) bis 37% (DR4/DR7) erhöht.

Abbildung 13: Vermittlung der differentiellen Expression von DRB4A und –B durch die TATA-Box. A zeigt die Promotorsequenzen der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A- und –B-Allele, dabei sind die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren grau unterlegt, Unterschiede zwischen den Sequenzen sind angezeigt. B: Die Balken repräsentieren die jeweiligen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB Zellkernlysaten an die Promotorregionen der TATA-Boxen von DR4/DR7, DR9, DRB4A und DRB4B. Das Bindungsverhalten wurde gemäß der Legende von Abbildung 10 bestimmt. Die hellen Balken zeigen die unstimulierten Zellen, die dunklen Balken die für 48h mit 1000U/ml INF-γ stimulierten Zellen.

cAMP

TPA

THP-1

Random

100

100

DR4/DR7

166,2 ± 2,4

188,3 ± 1,9

DR9

183,0 ± 1,5

190,5 ± 0,4

DRB4A

119,5 + 4,9

123,1 + 0,5

DRB4B

193,6 + 6,0

216,7 ± 0,5

BJAB

Random

100

100

DR4/DR7

168,2 ± 2,0

184,4 ± 4,2

DR9

165,4 ± 0,9

185,9 ± 4,7

DRB4A

106,1 ± 1,1

101,0 ± 2,4

DRB4B

176,2 + 1,0

186,0 ± 3,4

aufgeführt sind Mittelwerte mit ihren jeweiligen Standardabweichungen

Tabelle 13: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen TATA-Box-Oligonukleotide

Für die Zellinie THP-1 konnte weder durch die Stimulation mit INF-γ noch mit cAMP eine Veränderung des Bindungsverhaltens erzielt werden, durch 1nM TPA war hingegen eine minimale Erhöhung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren zu verzeichnen (siehe Tabelle 13). Eine geringfügige Erhöhung der Bindungsaffinitäten der BJAB-Zellkernlysate konnte ebenfalls durch 1nM TPA beobachtet werden, wohingegen cAMP keinen Effekt auf die Bindungen der BJAB-Zellkernextrakte hatte (siehe Tabelle 13).

Die Ergebnisse hinsichtlich des unterschiedlichen Bindungsverhaltens der BJAB-Zellkernlysate an die TATA-Box-Sequenzen von DRB4A und –B konnte durch eine Kompetitionsanalyse mittels EMSA bestätigt werden. Dazu kompetierten die beiden mit ³²P-markierten DRB4-Sequenzen jeweils mit unmarkierten DRB4A- und DRB4B-Oligonukleotiden um die Bindung an die Zellkernlysate (siehe 2.2.16). Das Polyacrylamidgel des EMSAs zeigt eine schnellere Abnahme der Signalstärke für die obere Bande, wenn die radioaktivmarkierte TATA-DRB4B-Sequenz mit unmarkiertem TATA-DRB4B-Oligonukleotiden verdrängt wurde (siehe Abbildung 14). Die Abbildung 15 zeigt den gleichen Versuch mit ³²P-markiertem TATA-DRB4A. Hier wurden die oberen Banden durch den Phosphoimager quantifiziert und deren Signalstärke aufgetragen. Hier war ebenfalls eine schnellere Abnahme der Signalstärke zu erkennen, wenn das radioaktivmarkierte Oligonukleotid durch das unmarkierte TATA-DRB4B-Oligonukleotid verdrängt wurde.

Abbildung 14: Kompetitionsanalyse mittels EMSA für das Bindungsverhalten von BJAB-Zellkernlysaten an die TATA-Box von DRB4B. Das Polyacrylamid-Gel zeigt die Kompetition von markiertem TATA- Box-DRB4B mit steigenden Konzentrationen von unmarkiertem TATA-Box-DRB4A und –B.

Abbildung 15: Kompetitionsanalyse mittels EMSA für das Bindungsverhalten von BJAB-Zellkernlysaten an die TATA-Box von DRB4A. Mittels Phosphoimager wurde die Intensität der oberen Bande des Polyacrylamid-Gels bestimmt und auf die jeweilige Gesamtintensität der Spur bezogen. Die Kurve zeigt die Abnahme der Signalstärke von der Kompetition zwischen markierter TATA-Box-DRB4A und unmarkierten DRB4-Oligonukleotiden an die BJAB-Zellkernlysate. Die Signalstärke der Bindung ohne Kompetition wurde 1 gesetzt, alle anderen Werte wurden in Verhältnis dazu gesetzt.

INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression wird in den Monozyten durch die X-Box vermittelt

Abbildung 16A zeigt die X-Box-Sequenzen der Promotoren von DR4, DR7, DR9, DRB4A und DRB4B. Die DR4-Sequenz unterscheidet sich von den DR7- und DR9-Sequenzen durch eine Substitution 3´ der X2-Box. Die Sequenzen der DRB4-Promotoren sind identisch, unterscheiden sich aber im Vergleich zu DR4 durch eine Substitution innerhalb der X1-Box und zwei Substitutionen 3´ der X2-Box. Die Sequenz von DRA hingegen weicht sehr stark von den Sequenzen der DRB-Promotoren ab. Die Bindungen der Zellkernlysate von THP-1 und BJAB sind zum X-Box-DRA-Oligonukleotid am stärksten (132 bzw. 191%RU). Die relativen Bindungsaffinitäten zu den DRB-Oligonukleotiden liegen für THP-1 zwischen 106 und 109%RU und für BJAB zwischen 117 und 126%RU (siehe Abbildung 16B). Durch die Stimulation mit INF-γ wurden alle Bindungsaffinitäten der THP-1-Zellkernextrakte zu den Oligonukleotiden erhöht, zu DR7 und DR9 auf 126, zu DRB4 auf 139, zu DR4 auf 149 und zu DRA auf 215%RU.

Abbildung 16: Vermittlung der INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression der Monozyten durch die X- Box. A zeigt die Promotorsequenzen der DR4-, DR7-, DR9-, DRB4A-, DRB4B- und DRA-Allele, dabei sind die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren grau unterlegt, die Unterschiede zwischen den Sequenzen sind angezeigt. B: Die Balken repräsentieren die jeweiligen Bindungsaffinitäten von THP-1- und BJAB-Zellkernlysaten an die Promotorregionen der X-Boxen von DR4, DR7/DR9, DRB4 und DRA. Das Bindungsverhalten wurde gemäß der Legende von Abbildung 10 bestimmt. Die hellen Balken zeigen die unstimulierten Zellen, die dunklen Balken die für 48h mit 1000U/ml INF-γ stimulierten Zellen.

cAMP

TPA

TGF-β1

THP-1

Random

100

100

100

DR4

100,0 ± 0,0

139,1 ± 0,4

125,0 ± 0,0

DR7/DR9

104,0 ± 0,3

117,0 ± 0,9

118,0 + 1,3

DRB4

114,8 ± 1,9

139,5 ± 0,5

115,0 ± 0,0

DRA

128,9 ± 3,1

141,9 ± 3,6

144,0 ± 0,7

BJAB

Random

100

100

100

DR4

120,3 ± 0,0

121,2 ± 0,4

132,0 ± 0,0

DR7/DR9

104,0 ± 0,3

122,0 ± 0,9

118,0 ± 1,3

DRB4

120,6 ± 1,9

122,2 ± 0,5

125,0 ± 0,0

DRA

142,9 ± 3,1

173,7 ± 3,6

177,0 ± 0,7

aufgeführt sind Mittelwerte mit ihren jeweiligen Standardabweichungen

Tabelle 14: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen X-Box-Oligonukleotide

Für die BJAB-Zellkernlysate war die Zunahme der Bindungsaffinitäten durch die INF-γ-Stimulation nicht ganz so stark, der Effekt war aber wiederum bei DRA am stärksten. Die Stimulation mit cAMP erbrachte für beide Zellinien keine Zunahme der Bindungsaffinitäten, durch die Stimulation mit 1nM TPA konnte nur das Bindungsverhalten zu den THP-1-Zellkernextrakten leicht verbessert werden, durch TGF-β1 konnte hingegen nur bei den BJAB-Zellkernlysaten eine leichte Steigerung der Bindungsaffinitäten bzw. der Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren verzeichnet werden (siehe Tabelle 14).

Assoziation des DRB4B-Promotors mit einem schweren Krankheitsverlauf der RA

Im letzten Schritt wurde untersucht, ob die gefundenen strukturellen und funktionellen Unterschiede zwischen den Promotoren mit dem Krankheitsverlauf der RA korrelieren. Dazu wurden die DNA-Proben der 32 RA-Patienten, bei denen die Konzentration vom C-reaktiven Protein (CRP) im Serum zu Beginn der Erkrankung gemessen wurde, dahingehend analysiert, ob sie mit dem DRB4B-Promotor oder mit der DRB4-Spleißvariante assoziiert waren (siehe Tabelle 6). Ein hohe CRP-Konzentration (≥15mg/l) stellt dabei ein hohes Risiko für einen schweren Krankheitsverlauf der RA dar [8]. Nach der Aufteilung der RA-Patienten in je eine Gruppe mit einer höheren und einer niedrigeren CRP-Konzentration zu Beginn der RA wurden ihre Assoziationen mit dem DRB4B-Promotor und der DRB4-Spleißvariante betrachtet. Dabei waren die Häufigkeiten der DR4-, DR7- und DR9-Allele ähnlich über die beiden Patientengruppen verteilt, lediglich die Häufigkeit des DR4-Allels war in der Patientengruppe mit einer höheren CRP-Konzentration leicht erhöht (siehe Tabelle 15).

Patienten

Häufigkeiten
der HLA-Allele

CRP zu Beginn

Assoziation der HLA-Allele
DR4, DR7 und DR9 mit DRB4B

Assoziation des HLA-DRB4A-Allels
mit der DRB4-Spleißvariante

n=15

DR4: 37%
DR7: 33%
DR9: 7%

≥15mg/l

41%*

10%

n=17

DR4: 29%
DR7: 35%
DR9: 6%

<15mg/l

10%*

33%

* die Differenz über 31% ist mit Sicherheitsintervallen von 0,7-71% statistisch signifikant

Tabelle 15: Eine erhöhte DRB4-Expression ist mit einem schweren Krankheitsverlauf der RA verbunden

Die Assoziation mit dem DRB4B-Promotor in der Gruppe mit einer höheren CRP-Konzentration ist mit 41% deutlich höher als in der Gruppe mit einer niedrigeren CRP-Konzentration (10%). Die Differenz über 31% ist mit Sicherheitsintervallen von 0,5 – 71% statistisch signifikant. Ferner war die DRB4-Spleißvariante bei 6 von 18 DRB4A-Allelen (33%) unter der Patientengruppe mit einer CRP-Konzentration ≥15mg/l zu finden. Dagegen befand sich nur 1 von 10 DRB4A-Allelen (10%) in der Gruppe der RA-Patienten mit einer CRP-Konzentration <15mg/l. Die Differenz beträgt 21%, sie ist aber aufgrund der geringen Anzahl der DRB4A-Allele unter den RA-Patienten mit einer hohen CRP-Konzentration mit Sicherheitsintervallen von –33 – 85 statistisch nicht signifikant.