Differentielle Expression von HLA-DRB-GenenChristian Heldt191.1101.21112567#3541.2.1131.314566#3041516565#76017642#18518617#304191.3.1201.3.2211.4222232.12.1.12.1.22.1.324761#2662.1.425262.1.52.1.627282.1.72.2292.2.12.2.2302.2.32.2.42.2.5312.2.62.2.7322.2.82.2.9332.2.10342.2.112.2.122.2.13352.2.142.2.15362.2.1637383393.1404142618#2423.243678#279443.34546564#2593.4473.4.148564#3723.4.249564#360503.4.351564#3783.4.452564#3475354552#482552#2523.4.555564#390563.5574584.1594.260614.2.14.2.262634.36465566 6 Literaturverzeichnis6768697071 Abkürzungsverzeichnis78Danksagung Lebenslauf73 Publikationsliste74 Eidesstattliche Erklärung75deInhaltsverzeichnisHilfeDifferentielle Expression von HLA-DRB-GenenDissertationzur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologieeingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlinvon

Diplom-Biochemiker Dipl.- Oec. Christian Heldt 28.06.1970 in Bremen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek


Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. B. Ronacher Prof. Dr. W. Lockau PD Dr. B. Müller Prof. Dr. A. Radbruch eingereicht: 17.04.2002Datum der Promotion: 17.07.2002 Abstract

In den humanen Leukozyten-Antigenen (HLA) wird die wichtigste genetische Ursache von rheumatoider Arthritis gesehen. Es wurden bisher mehrere Mechanismen beschrieben, wie diese HLA-Moleküle die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen in unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen als möglicher Mechanismus untersucht. Dabei wurden strukturelle Unterschiede zwischen den Promotoren des krankheitsassoziierten HLA-DR4-Haplotyps und den neutralen Haplotypen DR7 und DR9 eingehender betrachtet. Allen drei Haplotypen ist gemein, daß sie das DRB4-Gen als zweites funktionelles DRB-Gen tragen, wobei das DRB4-Gen entweder den DRB4A oder den –B-Promotor besitzt. Um den Einfluß einzelner Promotorelemente auf die mit dem Luziferase-Assay bestimmten Transkriptionsaktivitäten näher zu untersuchen, wurde mit Hilfe der surface plasmon resonance die Bindung der Transkriptionsfaktoren aus den Zellkernlysaten von der humanen Monozytenzellinie THP-1 und von der humanen B-Lymphom-Zellinie BJAB an die unterschiedlichen S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen analysiert. Es konnte gezeigt werden, daß die unterschiedliche Expression von DRB4A und DRB4B durch die ubiquitäre TATA-Box vermittelt wird. Dagegen wurde die INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression von THP-1- aber auch von BJAB-Zellen durch die für die HLA-DR-Promotoren spezifische X-Box vermittelt. Bei der Analyse von DR4-, DR7- und DR9-positiven Patienten einer bereits gut charakterisierten RA-Kohorte stellte sich heraus, daß der DRB4B-Promotor, welcher im Vergleich zu DRB4A eine höhere transkriptionelle Aktivität besitzt, mit einem schweren Krankheitsverlauf assoziiert ist, so daß eine erhöhte HLA-DR-Expression den Krankheitsverlauf negativ zu beeinflussen scheint.

 Differentielle Expression HLA MHC Humane Leukozyten-Antigene Haupthistokompatibiblitäts-Antigene Rheumatoide Arthritis Abstract

Disease associated human leukocyte antigen (HLA) genes have been identified in humans where they are assumed to promote the susceptibility and/or progression of rheumatoid arthritis. Several mechanisms have been described how these HLA haplotypes impact on the disease. Among them the differential expression of HLA-DRB molecules in different types of antigen-presenting cells, which was investigated here in detail. The promoters of the disease associated HLA-DR4 to the neutral DR7 and DR9 haplotypes were analyzed for sequence polymorphisms resulting in functional differences. All three haplotypes carry as a second functional DRB gene the DRB4 gene, which is regulated by the DRB4A or –B promoter. To determine the impact of the promoter elements on the transcriptional activities measured by luciferase assay the surface plasmon resonance technology was employed. To this end, nuclear extracts from the monocytic cell line THP-1 and from the B lymphoma cell line BJAB were used to analyze their binding to the various S-, X-, Y-, CCAAT-, and TATA boxes. It could be demonstrated that the differential expression of DRB4A and –B was regulated via the ubiquitous TATA box. By contrast, the INF-γ stimulation of HLA expression in THP-1 and BJAB was mediated via the unique X box. Analyzing the DR4, DR7 and DR9 positive patients of an RA cohort, the DRB4B promoter, which has a higher transcriptional activity than the DRB4A promoter, is associated with radiographic progression of RA. This data is thus indicative of an impact of elevated HLA-DR expression on the progression of the disease.

 Differential expression HLA MHC Human leukocyte antigen Major histocompatibility complex Rheumatoid arthritis

 

Für Hans

 

Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1 Das Immunsystem

    • 1.2 Genetische Ursache von Autoimmunerkrankungen

      • 1.2.1  Rheumatoide Arthritis

    • 1.3  Humane Leukozyten-Antigene (HLA)

      • 1.3.1 „Shared epitope-Hypothese“

      • 1.3.2  Differentielle Expression von HLA-DRB-Genen

    • 1.4  Aufgabenstellung

  • 2  Material und Methoden

    • 2.1 Material

      • 2.1.1  DNA-Proben von RA-Patienten und Kontrollen

      • 2.1.2 Zellinien und Bakterienstamm

      • 2.1.3  Vektoren

      • 2.1.4  Oligonukleotide

      • 2.1.5 Enzyme, Antikörper und Zytokine

      • 2.1.6  Chemikalien, Puffer und Medien

      • 2.1.7 Sonstiges Material

    • 2.2  Methoden

      • 2.2.1  Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

      • 2.2.2  DNA-Gelelektrophorese

      • 2.2.3  DNA-Extraktion

      • 2.2.4  Spaltung von DNA mit Restriktions-Endonukleasen

      • 2.2.5  Ligation von DNA-Fragmenten

      • 2.2.6  Transformation von E. coli-Zellen

      • 2.2.7  Plasmidpräparation

      • 2.2.8  DNA-Sequenzierung

      • 2.2.9  Kultivierung und Stimulierung von Zellen

      • 2.2.10  Transfektion eukariotischer Zellen

      • 2.2.11  Aktivitätsbestimmung der Luziferase

      • 2.2.12  Aktivitätsbestimmung der β-Galaktosidase

      • 2.2.13  Zellkernextraktion

      • 2.2.14  Proteinbestimmung

      • 2.2.15  Bindungsstudien mit Hilfe von surface plasmon resonance (SPR)

      • 2.2.16  Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

  • 3  Ergebnisse

    • 3.1  Bevorzugte Assoziation des DRB4B-Promotors und der DRB4-Spleißvariante mit dem Haplotyp DR7

    • 3.2  Unterschiedliche HLA-DR-Oberflächenexpression auf einer monozytären und einer B-Lymphom-Zellinie

    • 3.3  Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in den Zellinien THP-1 und BJAB

    • 3.4  Unterschiedliches Bindungsverhalten von Zellkernlysaten an die einzelnen Promotorabschnitte des DR53-Locus

      • 3.4.1  Vergleichbares Bindungsverhalten der Zellkernextrakte an die unterschiedlichen CCAAT-Boxen des DR53-Locus

      • 3.4.2  Ähnliches Bindungsverhalten der Zellkernlysate an die verschiedenen vom DR53-Locus kodierten S-Boxen

      • 3.4.3  Unterschiedliche Bindungen der Zellkernextrakte an die Y-Boxen von DRB1 und DRB4

      • 3.4.4  Vermittlung der differentiellen Expression von DRB4A und DRB4B durch die TATA-Box

      • 3.4.5  INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression wird in den Monozyten durch die X-Box vermittelt

    • 3.5  Assoziation des DRB4B-Promotors mit einem schweren Krankheitsverlauf der RA

  • 4  Diskussion

    • 4.1  Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in der THP-1- und in der BJAB-Zellinie

    • 4.2 Unterschiedlicher Beitrag der einzelnen Boxen der Promotoren des DR53-Locus an der HLA-DR-Expression

      • 4.2.1 Feinregulation der DRB4A- und DRB4B-Expression durch die TATA-Box

      • 4.2.2  Differentielle Expression in den Monozyten wird durch die X-Box vermittelt

    • 4.3 Einfluß der differentiellen Expression von HLA-DRB-Genen auf die Schwere des Krankheitsverlaufes der RA

  • 5  Zusammenfassung

  • 6 Literaturverzeichnis

  • Abkürzungsverzeichnis

  • Danksagung

  • Lebenslauf

  • Publikationsliste

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1: Assoziationen zwischen Autoimmunerkrankungen und HLA-Haplotypen

  • Tabelle 2: Variation in der kodierenden Region der DRB4-Allele

  • Tabelle 3: Programm für die PCR

  • Tabelle 4: Programm für die Sequenzierungsreaktion

  • Tabelle 5: Konzentrationen der einzelnen Stimuli

  • Tabelle 6: Daten von Patienten

  • Tabelle 7: Daten von Kontrollen

  • Tabelle 8: Anteil HLA-DR-positiver und mittlere Fluoreszenzintensitäten unterschiedlich stimulierter THP-1-Zellen

  • Tabelle 9: Mittlere Fluoreszenzintensitäten unterschiedlich stimulierter BJAB-Zellen

  • Tabelle 10: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen CCAAT-Box-Oligonukleotide

  • Tabelle 11: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen S-Box-Oligonukleotide

  • Tabelle 12: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen Y-Box-Oligonukleotide

  • Tabelle 13: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen TATA-Box-Oligonukleotide

  • Tabelle 14: Relative Bindungsaffinitäten unterschiedlich stimulierter THP-1- und BJAB-Zellkernlysate an die einzelnen X-Box-Oligonukleotide

  • Tabelle 15: Eine erhöhte DRB4-Expression ist mit einem schweren Krankheitsverlauf der RA verbunden

Bilder

  • Abbildung 1: Assoziation von HLA-DRB1*04 mit der RA bei einer Kohorte früher Patienten.

  • Abbildung 2: Der HLA-Locus besteht aus den Klassen I, II und III. Die HLA-Klasse-II besteht aus den Regionen DP, DQ und DR. Unten sind für HLA-DR die fünf allelischen Linien gezeigt.

  • Abbildung 3: Variabilität innerhalb des HLA-II-Moleküls, modifiziert nach Janeway, Travers et al., Seite 142.

  • Abbildung 4: Koordinierte Bindung von Transkriptionsfaktoren und CIITA an den HLA-II-Promotor.

  • Abbildung 5: Vergleich der Promotorsequenzen der HLA-DRB-Allele des DR53-Locus.

  • Abbildung 6: Expressionsvektoren pGL3-Basic und pCMVβ

  • Abbildung 7: Differentielle Assoziation von HLA-DRB1*04, -*07 und -*09 mit dem DRB4B-Promotor (A) und der DRB4-Spleißvariante (B).

  • Abbildung 8: Unterschiedliche Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen auf einer monozytären und einer B-Lymphom-Zellinie.

  • Abbildung 9: Unterschiedliche transkriptionelle Aktivitäten der Promotoren des DR53-Locus in THP-1 (A) und BJAB (B).

  • Abbildung 10: Vergleichbare Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die einzelnen Promotoren der CCAAT-Boxen.

  • Abbildung 11: Vergleichbare Bindungsaffinitäten der Zellkernlysate an die einzelnen Promotoren der S- Boxen.

  • Abbildung 12: Unterschiedliches Bindungsverhalten der Zellkernlysate an die Y-Boxen von DRB1 und DRB4.

  • Abbildung 13: Vermittlung der differentiellen Expression von DRB4A und –B durch die TATA-Box.

  • Abbildung 14: Kompetitionsanalyse mittels EMSA für das Bindungsverhalten von BJAB-Zellkernlysaten an die TATA-Box von DRB4B.

  • Abbildung 15: Kompetitionsanalyse mittels EMSA für das Bindungsverhalten von BJAB-Zellkernlysaten an die TATA-Box von DRB4A.

  • Abbildung 16: Vermittlung der INF-γ-Stimulation der HLA-DR-Expression der Monozyten durch die X- Box.