Transport von HIV-1 durch epitheliale Zellen
Identifizierung einer neuen funktionalen Domäne auf gp120

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Dipl. Ing. (FH) Maren Helwig
geb. Kracht
13.11.1971, Wuppertal

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Ph. D. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Georg Pauli
3. Prof. Dr. Lutz Gürtler

Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2006

Zusammenfassung

Als ein Grund für die vertikale Transmission von HIV von der Mutter auf das Kind während der Schwangerschaft bzw. der Geburt wird der Transport von HIV durch die Eihaut diskutiert. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um einen rezeptorvermittelten Transport, der auf einer Interaktion zwischen einer Lektin-bindenden Domäne auf dem viralen Oberflächenglykoprotein gp120 und einem Rezeptor auf der epithelialen Oberfläche beruht. In der vorliegenden Arbeit konnte die in den Transport von zellfreien HIV-1 durch epitheliale Zellen beteiligte Domäne auf gp120 erstmals näher charakterisiert werden. Überlappende Oligopeptide –basierend auf der Aminosäurensequenz von gp120– wurden zur Hemmung der Transzytose von HIV-1 durch humane Amnionzellen verwendet. Vier dieser Oligopeptide inhibierten die Transzytose von HIV-1 signifikant. Ein synthetisches Peptid (Env362-420) mit einer Länge von 59 Aminosäuren, welches die Sequenz der inhibierenden Oligopeptide darstellt, reduzierte die Menge an transportierten Viren ebenfalls, unabhängig vom HIV-1 Subtyp. Im Weiteren konnte der Transport von HIV-1 durch polyklonale Antikörper in Seren HIV-Infizierter, die mit Env362-420 reagierten, und durch Seren, die durch eine Immunisierung von Kaninchen mit Env362-420 gewonnen wurden, inhibiert werden. Antikörper gegen die in den Transport involvierte Domäne konnte in Seren HIV-Infizierter zu jedem Stadium der Infektion nachgewiesen werden. Bei einer Expression der Antikörper in der frühen Infektionsphase wäre ein positiver Einfluss auf die Prognose der Krankheit vorstellbar. Ob ein Zusammenhang zwischen einer Antikörperexpression gegen Env362-420 in HIV-infizierten Schwangeren und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-Transmission auf das Kind besteht, muss noch geklärt werden. Env362-420 kann zur Identifizierung des Rezeptors auf der epithelialen Oberfläche, welcher in die Transzytose von HIV involviert ist, und zur Entwicklung von Inhibitoren der Mutter–Kind-Übertragung von HIV herangezogen werden.

Eigene Schlagworte: HIV, Mutter–Kind-Übertragung, Transzytose, gp120, Inhibierung

Abstract

The transport of HIV through the fetal membranes is discussed as one possible reason for the vertical transmission of HIV from mother to child during pregnancy or labor. HIV can penetrate epithelial barriers by a receptor-mediated transport mechanism involving interaction of a lectin-like domain on the viral glycoprotein gp120 and a receptor on the epithelial surface. In this study the domain on gp120 involved in transcytosis of cell-free HIV-1 through epithelial cells was characterized in more detail. Overlapping oligopeptides of gp120 were used to inhibit transcytosis of HIV1 through an amnion cell monolayer. Four oligopeptides significantly inhibited transcytosis of HIV1. A synthetic oligopeptide (Env362-420) with a length of 59 amino acids representing the sequence of the four inhibiting oligopeptides significantly reduced the transport of HIV, independent of the HIV1 subtype. Furthermore, human HIV-positive sera with antibodies reacting with the domain Env362-420 and rabbit sera raised against the oligopeptide Env362-420 also inhibited the transport of HIV-1. Antibodies directed against the transcytosis domain could be detected in sera from every stage of infection. The development of these antibodies in the early stage of infection might play a role in the outcome of the HIV disease.It has to be investigated whether HIV1-infected women who developed these antibodies show a lower rate of HIV transmission to their offspring than those without such antibodies. Env362–420 can also be used as a tool to identify the receptor involved in transcytosis on the epithelial cell surface and to develop inhibitors that could help prevent mother-to-child transmission of HIV during pregnancy or labor.

Keywords: HIV, mother-to-child-transmission, transcytosis, gp120, inhibition

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  HIV
    • 1.1.1  Morphologie
    • 1.1.2 Genomstruktur
    • 1.1.3 Replikation von HIV-1
    • 1.1.4 Krankheitsverlauf
    • 1.1.5 Pathogenese
    • 1.1.6 Epidemiologie der HIV-Infektion
    • 1.1.7 Übertragungswege
  • 1.2 Mutter-Kind-Transmission
    • 1.2.1  Aufbau der menschlichen Eihaut
    • 1.2.2 Transportmechanismen
    • 1.2.3 Stand der Forschung
  • 1.3 Aufgabenstellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Material
  • 2.2 Molekularbiologische Methoden
    • 2.2.1  Expression von gp120
      • 2.2.1.1  PCR-Reaktion: (Amplifizierung des env-Fragments)
      • 2.2.1.2 Restriktionsverdau und Dephosphorylierung
      • 2.2.1.3 Ligation
      • 2.2.1.4 Herstellung Z-kompetenter E.coli XL1
      • 2.2.1.5 Transformation Z-kompetenter E. coli XL1
      • 2.2.1.6 Kolonie-PCR
      • 2.2.1.7 Restriktionsanalyse
      • 2.2.1.8 Sequenzierung der Klone
      • 2.2.1.9 Umklonierung: StrepTag^®-Kassette aus pASK-IBA-7 mit env-Sequenz in pFast His und pTriEx-3
      • 2.2.1.10 Proteinexpression in E. coli
      • 2.2.1.11 Aufreinigung über Nickel-NTA
      • 2.2.1.12 Aufreinigung über Strep-Tactin^®
      • 2.2.1.13 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese
      • 2.2.1.14 Western Blot
      • 2.2.1.15 Bestimmung der Proteinkonzentration
      • 2.2.1.16 Kopplung an Beads
      • 2.2.1.17 Proteinexpression im Baculovirus-System
      • 2.2.1.18 Proteinexpression in Säugerzellen
    • 2.2.2 Plasmid-Präparation
    • 2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese
    • 2.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration
    • 2.2.5 RNA-Extraktion
    • 2.2.6 RT-PCR: Synthese von cDNA aus RNA
    • 2.2.7 DNA-Extraktion
    • 2.2.8 Quantitative Real-time PCR (TaqMan™)
    • 2.2.9 Standards für TaqMan™-PCR
  • 2.3 Zellbiologische Methoden
    • 2.3.1  Zellkultivierung
    • 2.3.2 Virusanzucht
    • 2.3.3 Durchführung der Transzytoseversuche
    • 2.3.4 Gewinnung und Präparation von menschlicher Eihaut
    • 2.3.5 CV-Test: Testung auf Dichtigkeit der FL-Filter
    • 2.3.6 Bestimmung des Virustiters über Endstufentitration
    • 2.3.7 Aufnahme und Abgabe von HIV-1
    • 2.3.8 Synzythien-Inhibierungsassay (SIA)
    • 2.3.9 Deglykosylierung der humanen, monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12
    • 2.3.10 Einfluss von Env362-420 auf Infektiösität
    • 2.3.11 Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen
    • 2.3.12 Alkalische-Phosphatase-anti alkalische-Phosphatase Technik (APAAP)
  • 2.4 Serologische Methoden
    • 2.4.1  Peptid-ELISA
  • 2.5 Untersuchungen an mit Env362-420 immunisierten Kaninchen
    • 2.5.1  Immunisierung und Boostern der Kaninchen
    • 2.5.2 Charakterisierung der Immunseren
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Etablierung der TaqMan™-PCR-Systeme
  • 3.2 Etablierung des Modellsystems zur Messung des Transports von infektiösen und physikalischen HIV-Partikeln
  • 3.3 Werden auch nicht-infektiöse Partikel von der Epithelzelle transportiert?
  • 3.4 Sind die verwendeten Epithelzellen mit HIV-1 infizierbar?
  • 3.5 Hemmung der Transzytose durch humane monoklonale Antikörper
  • 3.6 Bestimmung der minimalen Wirkkonzentration
    • 3.6.1  Transzytose in Anwesenheit humaner monoklonaler Antikörper
  • 3.7 Einfluss humaner Seren auf den Transport von Viren
    • 3.7.1  Transzytose in Anwesenheit humaner Seren
    • 3.7.2 Untersuchung der Seren und Plasmen auf neutralisierende Antikörper
  • 3.8 Expression von gp120 in unterschiedlichen Expressionssystemen
    • 3.8.1  Expression von gp120 in E. coli
    • 3.8.2 Expression von gp120 im Baculovirussystem
    • 3.8.3 Expression von gp120 in Säugerzellen
  • 3.9 Identifizierung der in den Transport von HIV-1_IIIB durch FL-Zellen involvierten Domäne auf gp120
    • 3.9.1  Überlappende Oligopeptide von HIV-1
    • 3.9.2 Transzytose in Anwesenheit der Oligopeptide ARP740
    • 3.9.3 Transzytose in Anwesenheit des Peptids Env362-420
    • 3.9.4 Transzytose durch CaCo-2 Zellen in Anwesenheit des Peptids Env362-420
    • 3.9.5 Einfluss des Peptids Env362-420 auf die Infektiösität
    • 3.9.6 Inhibition der Transzytose von anderen HIV-1 Subtypen
    • 3.9.7 ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen Env362-420 in humanen Seren/ Plasmen
      • 3.9.7.1  Untersuchung der verwendeten Seren auf Antikörper gegen das Peptid Env362-420
      • 3.9.7.2 Untersuchung von Verlaufsseren auf Antikörpern gegen das Peptid Env362-420
      • 3.9.7.3 Untersuchung von dokumentierten Serokonversionen auf Antikörpern gegen das Peptid Env362-420
    • 3.9.8 Immunisierung von Kaninchen
    • 3.9.9 Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen
    • 3.9.10 Untersuchung der Transzytose von HIV-1_IIIB im Eihautmodell
• 4 Diskussion
  • 4.1  Inhibition des Transportes durch mono- und polyklonale Antikörper
  • 4.2 Identifizierung der in den Transport involvierten Domäne auf gp120
  • 4.3 Etablierung eines Peptid-ELISAs zur Untersuchung von Seren auf Antikörper gegen Env362-420
  • 4.4 Entwicklung von Immunseren gegen Env362-420
  • 4.5 Transzytose von HIV-1_IIIB durch menschliche Eihaut
  • 4.6 Zusammenfassung und Ausblick
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Lebenslauf
• Publikationen und Präsentationen
• Eidestaatliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Sezernierte Zytokine der Dezidua, des Amnions und des Chorions während des 3. Trimesters und kurz vor der Geburt einer normalen Schwangerschaft und deren Einfluss auf die Replikation von HIV.
• Tab. 2: Verwendete Expressionssysteme
• Tab. 3: Zur Amplifizierung des env-Fragmentes verwendete Primer.
• Tab. 4: Primer zur Kolonie-PCR
• Tab. 5: Bedingungen zur Kolonie-PCR
• Tab. 6: Restriktionsenzyme und -muster zur Restriktionsanalyse der Klone
• Tab. 7: Sequenzierungsansatz
• Tab. 8: PCR-Programm Sequenzierung
• Tab. 9: Sequenzierungsprimer
• Tab. 10: Verwendete Systeme zur Identifizierung der gp120-Bande im Western Blot
• Tab.11: Ansatz zur cDNA-Synthese
• Tab. 12: Zyklerbedingungen RT-PCR
• Tab. 13: Verwendete Primer und Sonde für HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR.
• Tab. 14: Verwendete Primer und Sonde für HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR.
• Tab. 15: env-TaqMan™-PCR-Ansatz.
• Tab. 16: env-TaqMan™-PCR-Bedingungen
• Tab. 17: präparative PCR-Bedingungen
• Tab. 18: präparative PCR-Ansatz
• Tab. 19: Optimierung des Peptid-ELISAs.
• Tab. 20: Western Blot, ELISA-Daten und Viruslast der Serokonversion (Plasmen A bis E) bzw. Langzeitinfizierten (LTNP).
• Tab. 21: Einteilung der Oligopeptide ARP740 in die verschiedenen Pools.
• Tab. 22: Ergebnisse der Transzytosen von HIV-1IIIB in Anwesenheit der Oligopeptidpools 7 und 8 aus ARP740.
• Tab. 23: Charakterisierung der Immunseren.
• Tab. 24: Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen.
• Tab. 25: Korrektur der ermittelten Extinktionen in den einzelnen Studienkollektiven.
• Tab. 26: Tabellarische Darstellung der Laborphasen einer primären HIV-Infektion (zu Abb. 44, Fiebig et al. 2003)
• Tab. 27: Einteilung der Seren der dokumentierten Serokonversionen in die Laborphasen der primären HIV-Infektion und Zuordnung der ELISA-Ergebnisse,
• Tab. 28: Aminosäuresequenzen der Peptide ARP740
• Tab. 29: Ergebnisse der Transzytoseversuche mit unterschiedlichen Subtypen der HIV-1 Gruppe M und HIV-1 Gruppe O in Anwesenheit von Env362-420.
• Tab. 30: Abkürzungsverzeichnis der Aminosäuren
• Tab. 31: Studienkollektiv Verlaufsseren.
• Tab. 32: Studienkollektiv dokumentierte Serokonversionen.

Bilder

• Abb. 1: Schematischer Aufbau von HIV-1: SU = Oberflächen-(surface) Protein, RT = Reverse Transkriptase, TM = Transmembranprotein, IN = Integrase, CA = Kapsidprotein, MA = Matrixprotein, PR = Protease, NC = Nukleokapsidprotein, LI = Verbindungsprotein (link), CEL = Core-envelope linker, MHC = Major histocompatibility complex; Teil der Membran der Zelle, in der sich das Virus vermehrte, Modell: Gelderblom 1991.
• Abb. 2: Aufbau des proviralen HIV-1 Genoms: Das provirale Genom wird von den LTR-Elementen flankiert. Die offenen Leseraster (ORF; open reading frame) sind in Form von Kästchen dargestellt und exprimieren folgende Genprodukte: Strukturgene gag (group specific antigen) und env (envelope), Enzyme der pol (polymerase)-Region, akzessorische Proteine vif (virion infectivity factor), vpr (viral protein R), vpu (viral protein U) und nef (negative factor) sowie die regulatorischen Proteine rev (regulator of expression) und tat (transactivator of transcription)
• Abb. 3: Schematische Darstellung des gp120 (von HIV-1 IIIb) (nachBack 1993, Leonard et al. 1990): Die römischen Ziffern markieren die fünf durch Disulfid-Brücken begrenzten Domänen. Die fünf hypervariablen bzw. konservierten Regionen nach Modrow[Modrow et al. 1987] sind mit V₁ bis V₅ bzw. C₁ bis C₅ bezeichnet. Die den hypervariablen Regionen zugehörigen Aminosäuren sind zusätzlich in Kästen gesetzt. Die an der Bildung der CD4-Bindungsstelle beteiligten Aminosäuren sind vergrößert (schwarzer Kreis) dargestellt. Die verzweigten Fortsätze am Aminosäure-Strang repräsentieren Glykosylierungsstellen.
• Abb. 4: Lebenszyklus von HIV innerhalb einer CD4⁺ T-Zelle: Darstellung der Vorgänge, die bei der HIV-Infektion einer CD4⁺ T-Zelle ablaufen. Zunächst gelangt das Virus nach Bindung an den CD4- und den Chemokin-Rezeptor in das Zytoplasma der Zelle. Nach Freisetzung des RNA-Genoms wird dieses durch die Reverse Transkriptase (RT) in doppelsträngige DNA umgeschrieben. Im Zellkern vermittelt die virale Integrase (IT) die Integration der Virus-DNA in das Zellgenom. Die Provirus-DNA wird im Zellkern durch die zelluläre RNA-Polymerase II transkribiert und die Proteine im Zytoplasma translatiert. Tat, rev und nef führen nach Rücktransport in den Zellkern zu einer verstärkten Transkription. Es kommt zu einer Zusammenlagerung der Virusbausteine und des viralen RNA-Genoms mit anschließender Freisetzung unreifer Viruspartikel, die nach einer Reifung zu infektiösen Partikeln werden.
• Abb. 5: Aufbau der menschlichen Eihaut (aus Pschyrembel Klinisches Wörterbuch Version 2002, Copyright ©2001 Walter de Gruyter GmbH & Co. KG), die Eihaut setzt am Rand der Plazenta an und besteht aus zwei fetalen Schichten (Amnion und Chorion) sowie einer maternalen Schicht (Dezidua).
• Abb. 6: Transportmechanismen der polarisierten Epithelzelle (Abbildung aus: Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts und James D. Watson: Molecular Biology of the Cell 1994.)
• Abb. 7: Zwei-Kompartiment-System zur Untersuchung der Transzytose mit Unterteilung des Versuchsaufbaus durch den Zellkultureinsatz in ein oberes und unteres Kompartiment.
• Abb. 8: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Messmethoden zur Ermittlung der Menge an transportierten Viren
• Abb. 9: Schematische Darstellung des Eihautmodells
• Abb. 10: Standardkurve zur HIV-1 Gruppe M-env-TaqMan™-PCR zur Quantifizierung von HIV-Genomen, auf der x-Achse sind die Kopienzahlen und auf der y-Achse die Anzahl der Zyklen aufgetragen, bei den angegebenen Messwerten handelt es sich jeweils um Doppelbestimmungen. Die Versuchsbedingungen sind im Kapitel 2.2.8 angegeben.
• Abb. 11: Standardkurve zur HIV-1 Gruppe O-env-TaqMan™-PCR zur Quantifizierung von HIV-Genomen, auf der x-Achse sind die Kopienzahlen und auf der y-Achse die Anzahl der Zyklen aufgetragen, bei den angegebenen Messwerten handelt es sich jeweils um Doppelbestimmungen (siehe 2.2.8).
• Abb. 12: Kinetik der Transzytose von HIV-1_IIIB durch FL-Zellen, Darstellung der transportierten infektiösen Viren (a: Angabe in TCID₅₀/ml) und HIV-Partikel (b: Angabe in Genomäquivalente/µl) aus dem Medium des unteren Kompartiments nach 30, 60 und 120 Minuten einer Transportkinetik. Es wurden im oberen Kompartiment 6,4x10⁴ TCID₅₀/ml infektiöse Viren eingesetzt, dieser Titer entsprach 3,3x10⁹ Genomäquivalente/ml. Über zwei Stunden wurden insgesamt ca. 1% an infektiösen Viren und 1,5% an HIV-Partikel transportiert.
• Abb. 13: Schematische Darstellung der Versuchsdurchführungen a: Inkubation der jeweiligen Antikörper mit der Virussuspension vor Beginn der Transzytose, Start der Transzytose nach Überführen der Lösung ins obere Kompartiment, b: Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den epithelialen Zellen vor Beginn der Transzytose, die Transzytose wurde durch Zufügen der Virussuspension gestartet.
• Abb. 14: Einfluss der monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12 auf die Transzytose von HIV-1_IIIB, Inkubation von HIV-1_IIIB mit dem jeweiligen Antikörper vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben, K = Kontrolle. Die angegebenen Transzytoseraten sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 15: Einfluss der monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12 auf die Transzytose von HIV-1IIIB, im Gegensatz zum Versuch in Abbildung 14 wurden erst die Zellen mit dem jeweiligen Antikörper inkubiert ehe die Versuche durch Zugabe von HIV-1_IIIB gestartet wurden, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben, K = Kontrolle. Die angegebenen Transzytoseraten sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 16: Einfluss von 2F5, 2F5 deglykosyliert (deglyk.), 2G12 und 2G12 deglykosyliert (deglyk.) auf den Transport von HIV-1_IIIB, Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den CaCo-2-Zellen vor Beginn der Transzytose, Ermittlung der Menge an transportierten HIV-Partikel über TaqMan™-PCR, K = Kontrolle.
• Abb. 17: Einfluss von HIV-1 negativen (HIV-) und HIV-1 positiven (HIV+) Serum auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Inkubation von HIV-1_IIIB mit dem jeweiligen Serum vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben. Zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten Viren in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100% Transzytose gesetzt. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 18: Einfluss von HIV-1 negativen (HIV-) und HIV-1 positiven (HIV+) Serum auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Inkubation der FL-Zellen mit dem jeweiligen Serum vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt und die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben. Zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten Viren in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100% Transzytose gesetzt. Die Angaben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 19: Einfluss von Plasmen einer dokumentierten Serokonversion (A bis E) und von Seren zweier Langzeitinfizierter (LTNP1 und 2) auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten HIV-1-Partikeln (Bestimmung über TaqMan™-PCR) im Vergleich zu HIV-negativen Serum bestimmt (nS = 100%-Transzytose). Bei den angegeben Werten handelt es sich um Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 20: Einfluss von gp120-Oligopeptiden auf die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollansatz ohne Oligopeptide (100% Transzytose) nach 240 Minuten, Auswertung über Endstufentitration des Mediums im unteren Kompartiment, K = Kontrolle, Ziffern 1 – 10 = Oligopeptidpools (siehe Tabelle 21). Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von wenigstens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 21: Einfluss der einzelnen Oligopeptide der Oligopeptidpools 7 und 8 (siehe Tabelle 21) auf die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollansatz ohne Oligopeptide (100% Transzytose) nach 240 Minuten, Auswertung über TaqMan™-PCR nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese aus Medium im unteren Kompartiment, K = Kontrolle, Ziffern 31-40 = einzelne Oligopeptide ARP740, angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen. 100%-Transzytose entsprechen 4x10³ Kopien/µl.
• Abb. 22: Aminosäuresequenz der den Transport inhibierenden Domäne auf gp120, abgeleitet von ARP740, dargestellt sind zusätzlich die einzelnen inhibierenden Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38, aus denen sich die Sequenz von Env362-420 zusammensetzt.
• Abb.23: Sequenzvergleich der inhibierenden Oligopeptide aus ARP740 (Env362420) und ARP7035, grau unterlegte Buchstaben bedeuten Aminosäureaustausch und grau unterlegte Striche (-) Deletionen, oberhalb der Env362-420-Sequenz sind die einzelnen Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38, von denen die Sequenz von Env362-420 abgeleitet wurde und unterhalb der korrespondierenden Sequenz aus ARP7035 sind die dazugehörigen Oligopeptide ARP7035.34 bis ARP7035.38 dargestellt.
• Abb. 24: Inhibierung der Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen in Anwesenheit von Env362-420 (100 µM) im Vergleich zu den Inhibierungen in Anwesenheit der inhibierenden Oligopeptide aus ARP740 und ARP7035, Auswertung über TaqMan™-PCR, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollversuche ohne Oligopeptid bzw. Peptid, 100% Transzytose entsprechen 4x10² Kopien/µl. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) wenigstens dreier unabhängiger Versuche.
• Abb. 25: Transzytose von HIV-1IIIB durch CaCo-2-Zellen in Anwesenheit von Env362-420, Auswertung über TaqMan™-PCR, Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei Versuchen
• Abb. 26: Aminosäuresequenzvergleiche zwischen Env362-420 und der Konsensussequenz der HIV-1 Gruppe M, den Konsensussequenzen ausgewählter HIV-1 Gruppe M Subtypen und der Konsensussequenz der HIV-1 Gruppe O mit Angabe der Sequenzhomologie in %, grau unterlegt sind die über alle Konsensussequenzen konservierten Aminosäuren, gelb unterlegt sind die zusätzlich über die Konsensussequenzen der Gruppe M konservierten Aminosäuren (. = gleiche Aminosäure wie Env362-420, - = Deletion im Vergleich zu Env362-420).
• Abb. 27: Schematische Darstellung der Lokalisierung des Peptids Env362-420
• Abb. 28: Ergebnisse der Transzytoseversuche in Anwesenheit von Env362-420 mit verschiedenen HIV-1 Gruppe M und Gruppe O Isolaten durch FL-Zellen, dargestellt ist die prozentuale Transzytose bezogen auf die jeweiligen Kontrollversuche mit dem gleichen Subtyp, Auswertung über TaqMan™-PCR. Bei DI handelt es sich um das Isolat 3971/95 und bei DII um das Isolat 92UG024 des Subtyps D, K = Kontrolle, Angabe von Mittelwerten mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Ansätzen, bei den Isolaten DII, G und O ist keine Angabe der Standardabweichung möglich, da es sich hier nur um Doppelwerte handelt.
• Abb. 29: Aminosäuresequenzvergleich zwischen den verwendeten Virusisolaten und dem Peptid Env362-420 (= Subtyp B), mit Angabe der Sequenzhomologie, grau unterlegt sind die über alle Isolate konservierten Aminosäuren.
• Abb. 30: ELISA ausgewählter HIV-1 positiver Seren zur Untersuchung auf Antikörper gegen Env362-420, Durchführung des ELISA mit optimierten Bedingungen (siehe 2.4.1), aufgeführte Werte der Seren sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren (weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -)
• Abb. 31: Ergebnisse des Peptid-ELISAs mit in den Transzytoseversuchen verwendeten Seren: A bis E sind die Plasmen der dokumentierten Serokonversion in der Reihenfolge ihrer Abnahme, 1 bis 2 sind die Seren der Langzeitinfizierten, S1 und S2 Seren der ersten Transzytoseversuchen mit deutlich Antikörpertiter gegen gp120, K+ ist die Positivkontrolle, aufgeführte Werte sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren: weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -
• Abb. 32 : Ergebnisse der Peptid-ELISAs mit Seren aus Krankheitsverläufen, schwarz gestrichelte Linie in den einzelnen Studienkollektiven stellt den Mittelwert aller in diesem Kollektiv ermittelten Extinktionen dar (A, B, C,… bedeutet jeweils ein Patient/Proband).
• Abb. 33 : Ergebnisse der Peptid-ELISAs mit Seren aus dokumentierten Serokonversionen, aufgeführte Werte der Seren sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren: weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -
• Abb. 34 : Aminosäuresequenz von Env362-420mod. zur Immunisierung, Aminosäuren, die zur Sequenz des bisher verwendeten Peptids verändert wurden, sind grau hinterlegt.
• Abb. 35 : Ergebnisse des Immunfluoreszenztest mit Präserum und Immunserum aus Tier 1
• Abb. 36: Transzytose HIV-1IIIB durch FL-Zellen nach Inkubation der Viren mit Präseren und Immunseren, die Seren wurden 1:10 (Tier 1 und 2) bzw. 1:100 (Tier 1)verdünnt in die Versuche eingesetzt, Angabe der Standardabweichung bei Tier 1 1:100-Verdünnung nicht möglich, da nur zwei auswertbare Versuche vorlagen. Angabe von Mittelwerten mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.
• Abb. 37: Aminosäurevergleich zwischen HIV-1_IIIB LAI und HIV-1 Gruppe O (Isolat MP5180) im Bereich des Epitops von 2G12 auf gp120, die Glyko-Seitenketten an den Positionen 295, 332, 339, 386 und 392 stellen das Epitop von 2G12 dar.
• Abb. 38: Modell des HIV-Transports in Anwesenheit von humanen monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörpern: a Darstellung des Transports in Abwesenheit von Antikörpern, b Darstellung des Transports in Anwesenheit der monoklonalen Antikörper 2F5 oder 2G12, c Darstellung der Inhibierung des Transports in Anwesenheit von humanen polyklonalen Antikörpern aus Serum HIV-infizierter Probanden.
• Abb. 39: Aminosäuresequenz der inhibierenden Oligopeptide und Env362-420, überlappende Bereiche zwischen den Oligopeptiden sind rot dargestellt, grau hinterlegt sind die glykosylierten Aminosäuren
• Abb. 40: Aminosäuresequenz der den Transport inhibierenden Domäne auf gp120 (Env362-420), die mit grau unterlegten Aminosäuren stellen das in den Transport involvierte, diskontinuierliche Epitop dar, welches über alle Subtypen der HIV-1 Gruppe M konserviert ist, benachbarte konservierte Aminosäuren sind in zwei Bindungsdomänen (Bereiche) unterteilt.
• Abb. 41: Schematische Darstellung von HIV-1 gp120: A Lineare Darstellung von HIV-1 gp120, variable Domänen gekennzeichnet durch orangefarbene Balken, Disulfidbrücken dargestellt durch orangefarbene Linien. B Gefaltete Darstellung von HIV-1 gp120, orangefarbene Darstellung der variablen Bereiche und der Disulfidbrücken, grau hervorgehobene Bereiche stellen die in CD4-Bindung involvierte Domänen dar und blau umrandet ist die identifizierte Sequenz des Peptids Env362-420. (Abbildung modifiziert nach Leonard et al. 1990 und Pollard et al. 1992, aus Coffin JM, Hughes SH and Varmus HE (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press)
• Abb. 42: In CD4-Bindung involvierte Aminosäuren aus Env362-420, die Aminosäuren 368 (D) und 370 (E) (rot) in der Sequenz GDPEI stellen die AS dar, die nach dem Modell von Leonard et al. 1990 und Back 1993 in die CD4-Bindung involviert sind.
• Abb. 43: In 2G12-Bindung involvierte Aminosäuren aus Env362-420, die Aminosäuren 386 und 392 (rot) stellen die AS dar, deren Glykane neben weiteren an Aminosäuren gekoppelten Glykanen das Epitop von 2G12 bilden.
• Abb. 44: Laborphasen der primären HIV-Infektion (Abbildung entnommen aus Fiebig et al. 2003) WB: Western Blot (N negativ, I unbestimmt, P^* positiv ohne p31 Bande, P positiv mit p31 Bande), Ab: HIV-Antikörper, RNA: HIV-RNA, LS-Ab: HIV-Ak bestimmt mit einem sensitiven/weniger sensitiven ELISA, p24 Ag: HIV p24- Antigen. Erklärung der mit I bis VI benannten Laborphasen in Tabelle 26.
• Abb. 45: Schematische Darstellung einer HIV-Infektion über eine intakte Schleimhaut. 1. Zellfreie Viren aus Körperflüssigkeiten wie z.B. Samenflüssigkeit. 2. Binden der zellfreien Viren über die Transzytosedomäne Env362-420 an einen zellulären Rezeptor mit anschließender Transzytose durch die epitheliale Zelle. 3. Freisetzung der infektiösen Viren auf der basolateralen Seite. 4. Binden der freien Viren an DC-SIGN auf dendritischen Zellen der Submucosa. 5. Transport von HIV, gebunden an dendritische Zellen, durch die lymphatischen Gefäße zu den Lymphknoten. 6. Infektion von CD4+ T-Lymphozyten im Lymphknoten. 7. Infektion von in der Submucosa vorkommender CD4+ T-Lymphozyten.