2 Material und Methoden

2.1  Material

Eukaryonte Zellen

↓16

Molt 4/8

Klon 8 der humanen akuten T-Lymphoblastischen Leukämie-Zelllinie Molt 4

CEM x 174

Fusionsprodukt der humanen B-Zelllinie 721-174 und der humanen T-Zelllinie CEM

CACO-2

Colon, humanes colorectales Adenokarzinom

FL

humane Amnionzellen

293

humane epitheliale Nierenzellen, transformiert mit Adenovirus 5 DNA

Hep G2

Leber, humanes Hepatocellularkarzinom

Hela

Zellen eines humanen epithelialen Adenokarzinoms des Gebärmutterhalses

HT29/B6

Colon, humanes colorectales Adenokarzinom

   

Verwendete Viren

 

Laborstämme

HIV-1IIIB

 

HIV-1 BRU (LAV-1), Acc. Nr. K02013

HIV-1 Gruppe O

 

MVP5180, Acc. Nr. L20571, Primärisolat2, adaptiert an Molt4/8-Zellen

 

Referenzisolate (HIV-1)

↓17

Subtyp

Isolatbezeichnung

Datenbankeintrag (Acc. Nr.)

A

11562/96

kein Eintrag 1,2

C

484/97

kein Eintrag 1,2

D

3971/95

kein Eintrag 1,2

D

92UG024 3

U08805

F

93BR020 3

AF005494

G

ARP/173RU570 3

U08368

O

HIV-1 CA-9 3

X96522

1 Bei den Subtypen, die noch keinen Datenbankeintrag besitzen, wurden bei den Sequenzvergleichen auf Sequenzen zurückgegriffen, die in der Arbeitsgruppe bestimmt wurden (C. Kücherer, persönliche Mitteilung).
2 Primärisolate, von L. Gürtler, Universität Greifswald zur Verfügung gestellt.
3 HIV-1-Isolate vom NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

Bakterienstamm

E. coli XL1-Blue (Stratagene GmbH) Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F´ proAB lacqZΔM15 Tn10 (Tetr)]

Enzyme

Taq-DNA-Polymerase (Thermus aquaticus, InViTek, Berlin), DNA-Polymerase Combi Pol™ (InViTek, Berlin), T4-DNA-Ligase (Promega, Deisenhofen), Superscript Reverse Transkriptase (Invitrogen GmbH, Karlsruhe), Alkalische Phosphatase (Promega, Deisenhofen), Restriktionsenzyme: Pst1, Bam H1, Hind III, Bgl II, Nde I, Sac I, Xba I(Promega, Deisenhofen), Uracil-N-Glykosylase = UNG (Invitrogen GmbH, Karlsruhe), N-Glykosidase F (Roche, Mannheim)

Plasmide

↓18

pBlueskript II SK(+): (pBSSK+, Stratagene, USA): Fl (-) ori, ColE1 ori, LacI (nicht funktionell), lacZ (für Blau-Weiß-Selektion), multiple Klonierungsstelle mit flankierenden T3- und T7-Promotoren, Ampicillinresistenz, Größe: 3,0 kb

pBT1/BS: pBSSK+-Vektor mit proviralem HIV-1IIIB Genom (LAI Acc. Nr. K02013 [Wain-Hobson et al. 1985]:), dessen LTR Sac-I geschnitten ist, Ampicillinresistenz, Größe: 12,0 kb

pQE-90s: basiert auf pQE-Vektor von Qiagen, C-terminaler His-Tag

↓19

pFast His: basiert auf pFastBac1-Vektor (Life Technologies) zur Herstellung rekombinanter Baculoviren durch „site-specific“ Transposition in E. coli, C-terminaler His-Tag

pTriEx 3: (Novagen Inc., Darmstadt) durch drei Promotoren: T7lac, p10 und CMV Expression in Bakterien, Insektenzellen (Baculoviren) und Mammaliensystem, C-terminaler His-Tag und HSV-Tag, Ampicillin-Resistenz, Größe: 3,7 kb

pASK-IBA 6: (IBA GmbH, Göttingen) N-terminaler Strep-Tag®, periplasmatische Lokalisation des rekombinanten Proteins, Ampicillin-Resistenz, ori, tet-Promotor, tet-Repressor, Größe: 3,3 kb

↓20

pASK-IBA 7: (IBA GmbH, Göttingen), N-terminaler Strep-Tag®, cytosolische Lokalisation des rekombinanten Proteins, Ampicillin-Resistenz, ori, tet-Promotor, tet-Repressor, Größe: 3,2 kb

pEGFP-N3: (Clontech, Palo Alto, USA), codiert für GFP (Green Fluoresence Protein)

pCR II-TOPO-Cloning Vektor (Invitrogen GmbH, Karlsruhe)

Oligonukleotide (TibMolBiol, Berlin, metabion GmbH, Martinsried)

↓21

Die verwendeten Primer und Sonden sind im Methodenteil unter der jeweiligen Methode aufgeführt.

Kulturmedien und Zusätze

Dulbeccos modified Eagle Medium D-MEM (Gibco BRL, USA), fötales Kälberserum FKS (Gibco BRL, USA), Glutamin 2mM (Gibco BRL, USA), Natrium-Pyruvat (Gibco BRL, USA), Nicht-essentielle Aminosäuren NEAA (Gibco BRL, USA), PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+- und Mg2+-Ionen), RPMI 1640-Medium (Gibco BRL, USA), Trypsin/ EDTA (PAA Laboratories GmbH, Österreich, 0,5/0,5 (w/w) in PBS 1x)

Chemikalien

Agarose (peQ Lab, Erlangen), Ampicillin, Bisindolylamilorid, Chlorpromazin, β-Cyclodextrin, Cytochalasin D, Dimethylamilorid, EDTA, SDS, Tris, Wortmannin (alle Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München), Anhydrotetracyclin AHT (IBA GmbH, Göttingen), Agar (Oxoid GmbH, Wesel), Bacto-Hefeextrakt (Gibco BRL, USA), Bacto-Trypton (Gibco BRL, USA), Bovines Serumalbumin BSA (Merck, Darmstadt), Bromphenolblau (Bromma, Schweden), Coomassie Brilliant Blue G 250 (Merck, Darmstadt), Ethanol (Merck, Darmstadt), Ethidiumbromid (Serva, Heidelberg), Ficoll® 400 (Serva, Heidelberg), Formalaldehyd (Merck, Darmstadt), Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside IPTG (BTS Bio Tech, St. Leon), Kaliumchlorid (Merck, Darmstadt), Kristallviolett CV (Fluka, Schweiz), Lipofectin (Qiagen, Hilden), 5 x Loading Buffer (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot), Mercaptoethanol (Merck, Darmstadt), Natriumacetat (Merck, Darmstadt), Natriumchlorid (Merck, Darmstadt), Triton (Serva, Heidelberg), Natriumcarbonat (Merck, Darmstadt), Tween 20 (Fluka, Schweiz)

Technische Geräte

↓22

Blotting-Apparatur (Fast-Blot, Biometra, Göttingen), Elisa-Lesegerät (Easy Reader, EAR 400AT, SLT Lab Instruments, Österreich), Feuchtbrutschrank (Heraeus, Thermo Electron, Langenselbold), Immunfluoreszenzmikroskop Axiovert 2000 mit Software AxioVision 3.1 (Zeiss, Jena), Gradientenzykler Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg), Lichtmikroskop ID02 (Zeiss, Jena), Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg), Laborzentrifuge (Sorvall, Thermo Electron Langenselbold), Spektrometer (LKB Ultrospec III, Pharmacia), Gelelektrohporese-Kammer horizontal (Horizon 58, Gibco BRL, USA), SDS-Gelelektrophorese-Kammer vertikal (Mini V 8-10 Vertical Gel Electrophoresis Apparatus, BRL Life Technologies, Inc. USA), TaqMan® ABI 7700 (Perkin Elmer, USA), Videodokumentationssystem (Herolab GmbH, Wiesloch), Zykler DNA Engine MJ Research PTC 200 Peltier Thermal Cycler (Biozym, Oldendorf), Neubauer Zählkammer (Brand GmbH und Co KG, Wertheim)

Materialien für Zellkultur/ Eihautpräparation

Nitrozellulosefilter 0,3 µM Porendurchmesser für 24-Lochplatten PET (BD Falcon™, USA), Nitrocellulosefilter 8 µm Porendurchmesser für 6-Lochplatten (Corning Costar, Niederlande), Zellkulturflaschen 25 und 75 cm2 (TPP®, Schweiz), Zellkultur Testplatte 6, 12 und 24 well (TPP®, Schweiz), Nystatin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München), Penicillin/ Streptomycin (Biochrom KG, Berlin), sterile Handschuhe zur Befestigung der Eihaut am Kunststoffring (Größe 7,5, Ansell, USA), Kunststoffringe aus Hostaphon POM (22 mm Durchmesser, 12 mm Breite, Firma Reli, Berlin), Clip-Zange (Fa. Pilling Weck, USA), Titanligaturclips (Größe: mittel, AD. Krauth, Hamburg), Aterienklemmen (Aesculap, B. Braun Melsungen AG)

Materialen zur ELISA-Etablierung

Murex HTLV I + II-ELISA (Abbott GmbH und Co KG, Wiesbaden), Peroxidase konjugierter Anti-human IgG Antikörper von der Ziege (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München), neonatales Kälberserum NKS (Gibco BRL, USA), Harnstoff (Merck, Darmstadt), Natriumcarbonat (Merck, Darmstadt), Peroxidase konjugierter Anti-Kaninchen IgG Antikörper von der Ziege (Dianova, Hamburg), 96-Loch-Maxisorb©-Immunoplatten (Nunc GmbH und Co KG, Wiesbaden)

Materialien für Western Blot

↓23

4-Chloro-1-Naphtol, Triethanolamin (beide Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München), H2O2 (Merck, Darmstadt), Peroxidase konjugierter Anti-Kaninchen IgG Antikörper von der Ziege (Dianova, Hamburg)

Antikörper für APAAP

Brücken-Antikörper Anti-Maus IgG aus der Ziege (Dianova, Hamburg), APAAP-Komplex aus der Maus (Dianova, Hamburg)

Materialien für Immunisierung der Kaninchen

Freundsches Adjuvans komplett und inkomplett (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München)

Materialien für Immunfluoreszenztest

↓24

L-Lysin (Serva, Heidelberg), FITC konjugierter anti-Kaninchen IgG Antikörper aus der Ziege (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München)

2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.1  Expression von gp120

Zur Proteinexpression wurden drei unterschiedliche Expressionssysteme und damit verbunden auch unterschiedliche Expressionsvektoren verwendet. In der Tabelle 2 sind die Expressionssysteme zusammengestellt:

Tab. 2: Verwendete Expressionssysteme

Expressionssystem

Plasmid

Signalpeptid

Aufreinigung über

E. coli

pQE-90s

ohne

His-Tag

pTriEx 3

mit

His-Tag

Baculovirus

pFast His

mit

His-Tag

pTriEx 3

mit

His-Tag

Mammalian System

pTriEx 3

mit

His-Tag

(Säugerzellen)

pASK-IBA 6

mit

Strep-Tag®

pASK-IBA 7

mit

Strep-Tag®

2.2.1.1  PCR-Reaktion: (Amplifizierung des env-Fragments)

↓25

Die PCR wurde zur Amplifizierung der für die Klonierung benötigten env-Fragmente verwendet. Dabei wurden über die eingesetzten Oligonukleotide Restriktionsschnittstellen eingeführt, um somit die Klonierung der erhaltenen DNA-Fragmente in das jeweilige System zu ermöglichen.

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist eine routinemäßig angewendete Methode zur Amplifizierung eines DNA-Abschnittes mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase [Saiki et al. 1988, Mullis et al. 1986]. Die Reaktion wird in drei Schritte unterteilt: DNA-Denaturierung, Bindung und Hybridisierung eines Primer-Paares am 3`- und am 5`-Ende des zu amplifizierenden Abschnittes und die Synthese der neuen DNA durch die hitzestabile DNA-Polymerase. Diese Reaktionsfolge wird in der Regel 20 – 30 mal wiederholt, so dass der gewünschte DNA-Abschnitt in expotenziell steigender Menge synthetisiert wird. Die optimalen Reaktionsbedingungen (Inkubationszeit und –temperatur, Konzentration der einzelnen Komponenten) sind von der jeweiligen Primer-Template-Kombination abhängig und müssen für jede Reaktion optimiert werden. Ein PCR-Ansatz besteht aus folgenden Komponenten: einer DNA-Polymerase mit dazugehörigem Puffer, Desoxynukleosidtri-phosphate = dNTP (mit den vier notwendigen Nukleotiden: Adenosin (dATP), Thymidin (dTTP), Guanin (dGTP) und Cytosin (dCTP)), Magnesiumchlorid MgCl2 und die jeweiligen Primerpaare. Um hier die zeitaufwendige Optimierung der PCR zu umgehen, wurden die PCR-Ansätze mit unterschiedlichen MgCl2-Konzentration (1, 2 und 3 mM) angesetzt. Für die Amplifikation wurden folgende vom Expressionssystem abhängigen Primer verwendet (Schnittstellen der Restriktionsenzyme sind unterstrichen):

Tab. 3: Zur Amplifizierung des env-Fragmentes verwendete Primer.

Expressions-vektor

Primer

Primersequenz

pQE-90 s

env pQE-s

5`-GAT CCC TGC AGA CAG AAA AAT TGT GGG TC-3`

env pQE-r

5`-GAT CCC TGC AGT CTT TTT TCT CTC TGC ACC AC-3`

pFast His, pTri Ex-3,

HIV 5800/ Bam-s

5`-GCG TGG ATC CGT GGC AAT GAG AGT GAA GG-3`

pASK-IBA 6/7

HIV 7350/ Bam-r

5`-GAT GTG GAT CCT CTT TTT TCT CTC TGC ACC AC-3`

Unterstrichen sind die Schnittstellen für Pst1 (in env pQE-r und env pQE-s) und BamH I (in HIV 5800/Bam-s und HIV 7350/Bam-r)

↓26

Als Template wurde das Plasmid pBT1/BS (100 ng/Ansatz) verwendet, welches das komplette HIV-1 LAI-Genom [Wain-Hobson et al. 1985] mit Deletionen in der LTR beinhaltet. Die Amplifikation erfolgte im Gradientenzykler nach folgendem Programm: Denaturierung bei 94°C für 2 min 20 sec, 4 Zyklen mit Hybridisierung (40 Sekunden 46 +/- 4°C), Synthese (2 Minuten 72°C) und Denaturierung (20 Sekunden 94°C), 30 Zyklen mit Hybridisierung (20 Sekunden 94°C), Synthese (2 Minuten 72°C) und Abschluss der Synthese 20 Minuten 72°C. Nach Ablauf der Reaktion wurde eine analytische Gelelektrophorese (siehe 2.2.3) durchgeführt, um Ausbeute, Reinheit und Größe des amplifizierten Fragments zu überprüfen. Stimmte die Größe des Fragments mit der zu erwartenden Größe überein, wurde das Fragment über das „PCR-Purification-Kit“ von Qiagen, Hilden nach Herstellerprotokoll aufgereinigt.

2.2.1.2 Restriktionsverdau und Dephosphorylierung

Die für das Vektorsystem pQE-90s amplifizierten Fragmente wurden - wie der Vektor - für die Klonierung mit dem Restriktionsenzym Pst1 geschnitten, für die anderen Vektorsysteme mit BamH I. Die Restriktion erfolgte nach Vorschrift des Enzymherstellers unter Verwendung der mitgelieferten Puffer. Nach dem Restriktionsverdau wurden die Fragmente mit Hilfe des „PCR-Purification-Kit“ von Qiagen aufgereinigt. Die einzelnen Vektoren wurden vor der Ligation dephosphoryliert, auch hierbei wurde nach der Vorschrift des Herstellers vorgegangen. Nach der Dephosphorylierung wurden die Vektoren über ein präparatives Agarose-Gel gereinigt und die Menge an geschnittenen Vektor und Fragment anschließend über ein analytisches Agarose-Gel bestimmt.

2.2.1.3 Ligation

Linearisierte DNA-Fragmente mit überhängenden, komplementären Enden wurden in „sticky end“-Ligation mit der T4 DNA Ligase verknüpft. Dabei wurde das einzuligierende Fragment in ca. dreifach molaren Überschuss zum Vektor eingesetzt. Die Ligationsansätze wurden über Nacht bei 16°C inkubiert.

2.2.1.4 Herstellung Z-kompetenter E.coli XL1

↓27

Die Präparation transformationskompetenter E. coli wurde mit dem „Z-competent Buffer Set“ (Zymo-Research, Kalifornien) durchgeführt. Hierzu wurden 50 ml SOB-Medium mit 500 µl einer frischen E. coli XL1 Übernachtkultur angeimpft und bei Raumtemperatur bis zu einer OD600 von 0,2 – 0,3 geschüttelt. Nach Pelletieren der auf 4°C abgekühlten Kultur wurde das Zellpellet mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und dann in 5 ml „Competent-Puffer“ aufgenommen. Gelagert wurden die kompetenten Zellen aliquotiert bei –70°C.

SOB-Medium

Bakto-Trypton

2,0 % (w/v)

Bakto-Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

NaCl

8,6 mM

KCl

2,5 mM

in aqua bidest

pH 7,0

2.2.1.5 Transformation Z-kompetenter E. coli XL1

100 µl der kompetenten Zellen wurden mit 5 µl Ligationsansatz gemischt und 60 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch auf ampicillinhaltigen LB-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Aufgrund des Resistenzgens in den jeweiligen Plasmiden können über die LBamp-Platten die transformierten Bakterien selektiert werden.

↓28

LB-Medium

Bakto-Trypton

1,0 % (w/v)

Bakto-Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

NaCl

172 mM

in aqua bidest

pH 7,0

2.2.1.6 Kolonie-PCR

Zur Überprüfung, ob die transformierten Bakterien Plasmide mit env-Sequenz beinhalten, wurde eine Kolonie-PCR angesetzt. Folgende Primer, die die C2V5-Region von HIV-1 amplifizieren, wurden verwendet:

Tab. 4: Primer zur Kolonie-PCR

Primer

Primersequenz

6537s

5`-AAT GTC AGC ACA GTA CAA TGT ACA C-3`

7254as

5`-CCA ATT GTC CCT CAT ATC TCC TCC TC-3`

↓29

Die PCR-Reaktion wurde in 0,2 ml Reaktionsgefäßen angesetzt. Als Template wurde mit einer sterilen Eppendorf-Spitze bzw. Zahnstocher eine Kolonie auf der LBamp-Platte gepickt und in die Reaktionslösung gebracht. Daraufhin wurde die PCR-Reaktion unter den nachfolgenden Bedingungen durchgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden anschließend über eine analytische Gelelektrophorese ausgewertet.

Tab. 5: Bedingungen zur Kolonie-PCR

1 x

Denaturierung

2 Minuten

94°C

30 x

Denaturierung

1 Minute

94°C

Hybridisierung und Synthese

2,5 Minuten

65°C

1 x

Abschluss der Synthese

10 Minuten

68°C

2.2.1.7 Restriktionsanalyse

Eine weitere Methode zur Überprüfung, ob die transformierten Bakterien das Plasmid mit der gewünschten env-Sequenz tragen, ist die Restriktionsanalyse. Zusätzlich ist es möglich, mit dieser Methode die Orientierung des eingebauten env-Fragmentes zu beurteilen. Hierzu werden die aus den transformierten Bakterien isolierten Plasmide mit den in der Tabelle 6 aufgeführten Restriktionsenzymen mit den jeweiligen Puffern nach Vorschrift des Herstellers für 60 Minuten bei 37°C inkubiert.

↓30

Tab. 6: Restriktionsenzyme und -muster zur Restriktionsanalyse der Klone

Plasmid

Restriktionsenzyme

Restriktionsmuster
(Größe der einzelnen Fragmente in kb)

pQE90s

Nde I, Hind III

1,6 und 3,7 kb

Bgl II

5,1 und 0,2 kb

pBSSK+

Bam H1

1,9 und 2,9 kb

pFast His

Bgl II

0,15; 0,47; 0,6; 1,7 und 3,1 kb

pTri Ex-3

Nde I

1,0; 1,7 und 3,8 kb

pASK-IBA 6/7

Bgl II, Pst 1

0,16; 0,6 und 4,0 kb

Anschließend wurden die Ansätze über eine Gelektrophorese aufgetrennt. In der Tabelle 6 sind die jeweiligen Restriktionsmuster bei korrektem Einbau aufgeführt.

2.2.1.8 Sequenzierung der Klone

Zur Überprüfung der env-Sequenz in der extrahierten Plasmid-DNA wurde eine Sequenzierung nach der Didesoxykettenabbruchmethode nach Sanger [Sanger et al. 1992] durchgeführt. Das Prinzip einer Polymerase-Ketten-Reaktion mit einem kontrollierten basenspezifischen Abbruch der enzymatischen Replikation durch den Einbau fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleosidtriphosphat-Analoga (ddNTP), denen am 3`-Ende eine OH-Gruppe fehlt, wurde dazu verwendet („cycle sequencing“). Die DNA-Fragmente wurden anschließend über ein 4,8 %iges Polyacrylamid-Harnstoff-Gel, welches eine Auftrennung der Fragmente mit nur einer Base Unterschied erlaubt, aufgetrennt. Durch Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe während des Gel-Laufs entsteht ein Sequenzierungsmuster, das über ein Computerprogramm (Apple, Ismaning) ausgewertet wurde. Die Sequenzdaten wurden mit den Programmen Sequence Analysis, MT Navigator und Autoassembler ausgewertet. Anschließend wurden die Sequenzen mit dem Blast-Programm über die NCBI-Homepage (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit der öffentlichen Datenbank verglichen. In den nachfolgenden Tabellen sind der Sequenzierungsansatz und das PCR-Programm zur Sequenzierung angegeben.

↓31

Tab. 7: Sequenzierungsansatz

BigDyeSequenz-PreMix (ABI, Weiterstadt)

3,0 µl

Primer (12 µM)

1,0 µl

Plasmid-DNA (300 bis 500 ng)

x µl

H2O

ad 10 µl

Tab. 8: PCR-Programm Sequenzierung

1 x

Denaturierung

2 Minuten

94°C

28 x

Denaturierung

15 Sekunden

96°C

Hybridisierung

15 Sekunden

55°C

Synthese

4 Minuten

60°C

Für die Sequenzierung wurden folgende Primer verwendet:

↓32

Tab. 9: Sequenzierungsprimer

Primer

Primersequenz

6537 s

5`-AAT GTC AGC ACA GTA CAA TGT ACA C-3`

7254 as cons

5`-CCA ATT GTC CCT CAT ATC TCC TCC TC-3`

2 s

5`-TTA ATT GTG GAG GGG AAT TTT TCT-3`

2 as

5`-AGA AAA ATT CCC CTC CAC AAT TAA 3`

5 as cons

5`-TCC TTG GAT GGG AGG GGC ATA CAT TGC-3`

pQE s

5`-CGC CCT GCC ACT CAT CG-3`

pQE r

5`-GTT CTG AGG TCA TTA CTG G-3`

env6380r

5`-TGT TAC AAC TTG TCA ACG TAT AGC TGG TAG-3`

Die Primer wurden so gewählt, dass die Sequenz in beiden Richtungen überprüft werden konnte.

2.2.1.9 Umklonierung: StrepTag®-Kassette aus pASK-IBA-7 mit env-Sequenz in pFast His und pTriEx-3

Um bei der Expression im Baculovirussystem und in Säugerzellen ebenfalls die Möglichkeit der Aufreinigung über einen StrepTag® zu haben, wurde die Strep-Tag®-Kassette mit env-Sequenz aus pASK-IBA 7 in den pFast His-Vektor direkt und in den pTriEx 3-Vektor über pBSSK+ kloniert. Hierzu wurden die Vektoren pFast His, pASK-IBA 7 und pBSSK+ mit den Restriktionsenzymen XbaI und Hind III nach Protokoll geschnitten. Die geschnittenen Vektoren und das StrepTag®-env-Fragment wurden über Gelextraktion aufgereinigt. Die StrepTag®-env-Kassette wurde wie beschrieben in pFast His und pBSSK+ ligiert. Zur Klonierung der Kassette in pTriEx-3 wurde sowohl pTriEx-3 als auch pBSSK+ mit SacI und Hind III verdaut. Die Ligation und die weiteren Schritte erfolgten wie vorher beschrieben.

2.2.1.10 Proteinexpression in E. coli

↓33

Nach Klonierung und Überprüfung der Sequenz wurde das infrage kommende Plasmid, welches die komplette env-Sequenz in richtiger Orientierung trägt, in E. coli transformiert und das rekombinante gp120 exprimiert. Hierzu wurde LBamp-Flüssigmedium mit den transformierten E. coli angeimpft (Verhältnis 1:50 bis 1:100) und bei 200 UpM bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 bis 0,7 wachsengelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Nullwert entnommen, die Bakterien hierzu pelletiert, in Ladepuffer (5 x Loading Buffer, MBI, Fermentas) resuspendiert, für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und bei –20°C eingefroren. Um den Abbau der Proteine zu verhindern, wurde den jeweiligen Proben ein Protease-Inhibitor (complete™ Mini Proteasen-Inhibitoren-Cocktail, Boehringer Mannheim) hinzugefügt. Die restliche Kultur wurde bei pQE 90s mit 2mM IPTG inokuliert und bei pASK-IBA mit 2 µg/l AHT. IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) inhibiert den lacIq-Repressor auf pQE 90s und das rekombinante Protein kann exprimiert werden. Bei pASK-IBA wird der tetA-Promotor durch AHT (Anhydrotetracyclin) optimal induziert. Nach 2 bis 3 Stunden wurden weitere Proben entnommen, die wie der Nullwert behandelt wurden. Die entnommenen Proben wurden anschließend über eine SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe der Coomassie Brilliant Blue-Färbung bzw. eines Western Blots auf das rekombinante Protein hin untersucht.

2.2.1.11 Aufreinigung über Nickel-NTA

Durch die Klonierung des env-Fragmentes in den pQE-Vektor trägt das rekombinante Protein eine Sequenz von 6 Histidinen am 3`-Ende. Die Affinität der 6xHis-Sequenz zu Ni2+-Ionen wurde zur Aufreinigung über Ni-Agarose ausgenutzt. Die Aufreinigung erfolgte wie im Handbuch zum „QIAexpressionist-Kit“ (Qiagen, Hilden) beschrieben. Hierbei wurden die rekombinanten Proteine unter denaturierenden und nativen Bedingungen im kleinen Ansatz über Säulen und im großen Ansatz über eine FPLC-Anlage aufgereinigt.

2.2.1.12 Aufreinigung über Strep-Tactin®

Durch die Klonierung des env-Fragmentes in den pASK-IBA 6 und 7 Vektor trägt das rekombinante Protein ein Strep-Tag® und kann über Strep-Tactin® aufgereinigt werden. Die Aufreinigung des rekombinanten gp120 erfolgte mit dem „Strep-Tag® Starter-Kit“ (IBA GmbH, Göttingen) nach Vorschrift des Herstellers.

2.2.1.13 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese

↓34

Zur Untersuchung aller bei den unterschiedlichen Methoden zur Proteinexpression entnommener Proben auf das Vorhandensein des rekombinanten Proteins wurden diese über eine diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli [Laemmli 1970] aufgrund ihres Molekulargewichts aufgetrennt. Hierzu wurden ein 5 %iges Sammelgel und ein 7,5 %iges Trenngel verwendet. Als Marker zur Größenbestimmung der aufgetrennten Proteine diente Mark 12™ Unstained Standard (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) und der pre-stained Protein Standard SeeBlue® Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe). Die Gele liefen im SDS-haltigem Laufpuffer. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele entweder mit Coomassie Brilliant Blue-Lösung gefärbt oder die aufgetrennten Proteine mit Hilfe des Semi-Dry-Verfahrens auf Nitrocellulosemembran transferiert.

2.2.1.14 Western Blot

Die Proteine im SDS-Gel wurden mit dem elektrischen Transfer in der Blotting-Apparatur Fast-Blot (Biometra, Göttingen) im Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran (Gibco BRL®, USA) aufgebracht. Die rekombinanten Proteine wurden mit unterschiedlichen Antikörpern nach den Protokollen der jeweiligen Hersteller nachgewiesen.

Tab. 10: Verwendete Systeme zur Identifizierung der gp120-Bande im Western Blot

Plasmid

Antikörper

nachgewiesen wird:

Hersteller

pQE 90s, pTriEx-3, pFastHis

Penta-His HRP Kon-jugat

His-Tag

Qiagen, Hilden

pASK-IBA

Strep-Tactin alkaline phosphatase Konjugat (ST-AP)

Strep-Tag®

IBA GmbH, Göttingen

alle Plasmide

polyklonale Antikörper aus HIV-Positiv-Kontrolle*

gp 120

Genelab®, Singapur

*Zum direkten Nachweis von gp120 wurde ein Western Blot mit der Positiv-Kontrolle aus Genelab® HIV-1 Western Blot (Genelab®, Singapur) nach Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Protokoll wurde insofern abgeändert, das statt der mitgelieferten Blotstreifen die hergestellten Nitrozellulosemembranen eingesetzt wurden.

2.2.1.15 Bestimmung der Proteinkonzentration

↓35

Die Menge an rekombinanten Protein nach Aufreinigung über Ni-NTA bzw. Strep-Tactin® wurde mit dem „BCA Protein Assay“ (Pierce Biotechnology, USA) nach Herstellerangaben bestimmt. Zur Quantifizierung wurde eine Standardreihe herangezogen, welche bei jeder Bestimmung parallel angesetzt wurde. Die Standardreihe bestand aus einer Verdünnungsreihe einer Lösung aus bovinem Serumalbumin (BSA) mit den Konzentrationen: 2000, 1000, 750, 500, 250, 100, 20 und 0 µg/ml.

2.2.1.16 Kopplung an Beads

Zur Untersuchung der Transzytose wurde das aufgereinigte gp120 an fluoreszierende Mikropartikel (Fluoresbritecarboxy NYO 0,1 micron Microspheres, Polysciences, Inc. Europe, Eppenheim) kovalent gekoppelt. 200 bis 400 ng der Proteine wurden nach der „Carbodiimide“ Methode („Carbodiimide Kit for Carboxylated Microparticles“, Polysciences, Inc. Europe, Eppenheim) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Da die Mikropartikel aufgrund ihrer Größe durch eine Zentrifugation nicht zu pelettieren waren, musste die Kopplung mit Hilfe des MicroKros Ho l low Fiber Filter-Systems (Polysciences, Inc Europe, Eppenheim) erfolgen. Auch hier wurde nach der Vorschrift des Herstellers gearbeitet.

2.2.1.17 Proteinexpression im Baculovirus-System

Die Proteinexpression im Baculovirus-System wurde am Deutschen Rheuma Forschungszentrum, Berlin in der Forschungsgruppe Molekularbiologie unter der Leitung von PD Dr. rer. nat. Roland Lauster durchgeführt. Die Untersuchung auf Expression von gp120 über Western Blot und die Aufreinigung über Nickel-NTA wurde am Robert Koch-Institut durchgeführt. Um den Abbau der Proteine zu verhindern wurde den jeweiligen Proben ein Protease-Inhibitor (complete™ Mini Proteasen-Inhibitoren-Cocktail, Boehringer Mannheim) hinzugefügt.

2.2.1.18 Proteinexpression in Säugerzellen

↓36

Zur Proteinexpression in Säugerzellen wurden unterschiedliche Zelllinien: 293, HeLa und Hep G2 mit den Plasmiden pTriEx 3 und pTriEx-Strep transfiziert. Hierzu wurden ca. 5 bis 6x105 Zellen in eine 25 cm2-Zellkulturflasche eingesät und bis zu einer 20-40 %igen Konfluenz wachsen gelassen. Die Transfektion wurde mit Lipofectin (Qiagen, Hilden) nach Herstellerprotokoll mit 4 µg Plasmid pro Ansatz durchgeführt. Als Transfektionskontrolle wurde pro Ansatz 400 ng pEGFP mit transfiziert. Durch Transfektion von pEGFP kommt es zu einer frühen Expression des Green Fluorescence Protein (GFP), welches im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden kann. Als Kontrolle wurden die Zellen mit pBSSK+ transfiziert. Die Zellen und der Zellüberstand wurde nach vier Tagen abgenommen und auf die Expression von gp120 mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese, Western Blot und APAAP hin untersucht. Um den Abbau der Proteine zu verhindern wurde den jeweiligen Proben ein Protease-Inhibitor (complete Mini Proteasen-Inhibitoren-Cocktail, Boehringer Mannheim) hinzugefügt.

2.2.2 Plasmid-Präparation

Die Präparation erfolgte aus Zellpellets frischer 3 ml-Übernachtkulturen mit dem „Nucleospin-Kit“ (Macherey und Nagel, Düren) nach Protokoll des Herstellers. Zur Aufreinigung größerer Mengen an Plasmid-DNA wurde eine 100 ml-Kultur mit dem „JET Star 2.0 Plasmid Maxi Kit“ (Genomed GmbH, Bad Oeynhausen) aufgearbeitet. Die Konzentration der extrahierten Plasmid-DNA wurde anschließend durch Messung im Photometer bestimmt.

2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese

Analytische Gelelektrophorese

Nach Mischen der DNA-Proben mit 10fach Probenpuffer wurde die DNA gelelektrophoretisch bei 5-10V/cm in einer horizontalen Gelelektrophoresekammer (Gibco/BRL, USA) mit 1xTAE-Laufpuffer in 0,8 bis 2 %igen Agarose-Gelen in Abhängigkeit von der Größe der DNA-Fragmente in 1xTAE mit 0,25 µg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Zur Größenbestimmung der DNA wurde ein Marker (100bp Ladder plus, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) mit aufgetrennt. Die Agarosegele wurden anschließend mit Hilfe eines Videodokumentationssystems (Herolab GmbH, Wiesloch) nach Visualisierung mit UV-Licht (366 nm) dokumentiert und ausgewertet [Sambrook et.al 1989].

Präparative Gelelektrophorese

↓37

Die Reinigung der Vektoren nach dem Restriktionsverdau erfolgte über präparative Agarose-Gele. Die Auftrennung wurde wie bei der analytischen Agarose-Gelelektrophorese beschrieben durchgeführt. Nach Beendigung der Auftrennung wurden die Banden mit UV-Licht sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Die DNA wurde anschließend mit dem „JETquick Gel Extraction-Kit“ von Genomed, Bad Oeynhausen nach Angaben des Herstellers präpariert.

10 x TAE-Puffer

10fach Probenpuffer

Tris

400 mM

Ficoll 400

25 % (v/v)

EDTA

10 mM

Bromphenolblau

0,25 % (w/v)

Natriumacetat

500 mM

in 10 x TAE-Puffer

in aqua bidest

pH 7,9

2.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration

durch eine photometrische Bestimmung:

Der Gehalt an DNA kann über eine photometrische Messung bestimmt werden. Das Extinktionsmaximum von Nukleinsäuren liegt bei einer Wellenlänge von 260 nm. Ein Absorptionswert von 1,0 bei einer Schichtdicke von 1 cm entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger bzw. 37 µg/ml einzelsträngiger Nukleinsäure. Die Reinheit der Probe kann durch eine zusätzliche Messung bei 280 nm (halbmaximale Extinktion von Nukleinsäuren und Absorptionsmaximum von Proteinen) und der Quotientenbildung aus der optischen Dichte bei 260 und 280 nm bestimmt werden. Liegt dieser Quotient bei zwischen 1,6 und 2,0 ist eine Verunreinigung mit Proteinen auszuschließen.

durch Ethidiumbromidfärbung im Agarose-Gel:

↓38

Die zu bestimmende DNA und ein DNA-Konzentrationsstandard (λ Hind Marker, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) wurden dazu elektrophoretisch auf einem Agarose-Gel geeigneter Konzentration aufgetrennt. Über einen Vergleich der Bandenintensitäten konnte die Konzentration der DNA abgeschätzt werden.

2.2.5 RNA-Extraktion

RNA wurde aus den Proben der Transzytoseversuche mittels des „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen, Hilden) extrahiert. Zur Extraktion der RNA aus dem Medium aus dem unteren Kompartiment der Transzytoseversuche (siehe 2.3.3) wurde das Protokoll zur „RNA clean-up“ mit Modifikationen verwendet. 100 µl der jeweiligen Proben wurden mit zunächst 350 µl RLT-Puffer mit 1 % β-Mercaptoethanol und danach mit 250 µl 98 % Ethanol versetzt. Diese Mischung wurde in eine „QIA spin column“ überführt und diese 15 sec bei 8000xg zentrifugiert. Die Säule wurde anschließend zunächst mit 700 µl Waschpuffer RW 1 und danach zweimal mit alkoholhaltigem RPE-Puffer gewaschen. Eluiert wurde die RNA mit 30 µl E. coli t-RNA-haltigem Wasser (0,1 mg tRNA/ml, tRNA aus E. coli MRE600, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) und zur Aufbewahrung bei – 70°C eingefroren.

Zur Extraktion der RNA aus Zellpellets wurden die pelletierten Zellen in 350 µl RLT-Puffer mit 1 % β-Mercaptoethanol aufgenommen und zur Homogenisierung über eine „QIAshredder column“ gegeben. Das Lysat wurde mit 350 µl 70 % Ethanol versetzt in eine „QIAspin column“ überführt. Die weitere Aufreinigung erfolgte wie im „RNA clean-up“-Protokoll beschrieben.

2.2.6 RT-PCR: Synthese von cDNA aus RNA

↓39

Bei der cDNA-Synthese wird mit Hilfe der Reversen Transkriptase „Superscript“ (RNA–abhängige DNA-Polymerase, Gibco/BRL, USA) eine RNA-Sequenz in die komplementäre Einzelstrang-cDNA umgeschrieben.

Tab.11: Ansatz zur cDNA-Synthese

Konzentration final

5xRT-Puffer

1 x

DTT (100 mM)

10 mM

dNTP (25 mM)

10 mM

OligodT-Primer (500 ng/µl)

750 ng

Reverse Transkriptase (RT)

300 Units

H2O

ad 30 µl

Als Primer wurde ein OligodT-Primer verwendet, welcher komplementär zum OligoA-Schwanz der RNA ist. Die Synthese wurde nach dem Protokoll des RT-Herstellers durchgeführt. Pro Ansatz wurden 15 µl der extrahierten RNA eingesetzt. Die cDNA-Synthese wurde nach folgendem Programm durchgeführt:

↓40

Tab. 12: Zyklerbedingungen RT-PCR

1 x

Denaturierung

5 Minuten

65°C

1 x

Synthese

52 Minuten

37°C

1 x

Inaktivierung der RT

15 Minuten

72°C

Die cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei –70°C aufbewahrt.

2.2.7 DNA-Extraktion

Zur Bestimmung der Menge an proviraler DNA in den Zellpellets aus den Transzytoseversuchen wurde mit Hilfe des „QIAamp® DNA Mini Kit“ der Firma Qiagen, Hilden extrahiert. Die DNA-Extraktion wurde nach Resuspendieren der pelletierten Zellen in 200 µl PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+- und Mg2+-Ionen) nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Nach Elution der DNA in 100 µl AE-Puffer wurde die Konzentration im Photometer bestimmt.

2.2.8 Quantitative Real-time PCR (TaqMan™)

↓41

Über die quantitative Real-time PCR ist es möglich, die initiale Kopienzahl des Templates durch eine Analyse des von Zyklus zu Zyklus zunehmenden Fluoreszenzsignals, welches ein Resultat der Amplifikation des Templates während der PCR-Zyklen darstellt, zu ermitteln. Hierzu wird eine spezielle, fluorogene Sonde verwendet, die aus einem der Zielsequenz komplementären Oligonukleotid – lokalisiert zwischen den beiden Primern – mit einem fluoreszenten 5`-Reporterfarbstoff (FAM: 6`-Carboxy-Fluoreszein) und einem 3`-Quencherfarbstoff (TAMRA: 6`-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamine) besteht. Zusätzlich ist das 3`-Ende der Sonde durch einen Phosphatrest blockiert, damit die Sonde nicht als Primer fungieren kann. Durch Anregung dieser Sonde durch Licht der Wellenlänge 488 nm wird die Fluoreszenz durch die räumliche Nähe des Reporter-Farbstoffs zum Quencher durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) unterdrückt. Während der Amplifikation bindet die Sonde zunächst spezifisch an die Zielsequenz des Amplikons, wird aber in der Elongationsphase von der Taq-Polymerase verdrängt. Hierbei entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur, die die 5`-3`-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase aktiviert. Die Sonde wird geschnitten, die räumliche Nähe des Reporter-Farbstoffs zum Quencher aufgehoben und die Emission des Reporters kann gemessen werden. Die Emission des Reporters steigt entsprechend der Zunahme des PCR-Produkts an, da für jedes synthetisierte Molekül ein spezifisches Signal erzeugt wird.

Die PCR wurde mit dem ABI PRISM™-7700-Sequence Detector (TaqMan™, ABI, Weiterstadt) quantitativ und in Echtzeit durchgeführt. Die Real-time PCR wird nach folgendem Programm durchgeführt: 1. Schritt: Uracil-N-Glykosylase (UNG)-Behandlung zur Beseitigung von potentiell vorhandenen Kontaminationen durch PCR-Produkte, Schritt 2: Aktivierung der Taq-Polymerase und Inaktivierung der UNG und Schritt 3: 45 Zyklen bestehend aus der Denaturierung und Annealing bzw. Elongation.

Es wurden zwei unterschiedliche TaqMan™-PCR-Systeme zur Bestimmung der transportierten HIV-Partikel eingesetzt. Die HIV-1 Gruppe M env-PCR zur Detektion von HIV-1 Gruppe M und die HIV-1 Gruppe O env-PCR zur Detektion von HIV-1 Gruppe O. In den nachfolgenden Tabellen sind die jeweiligen Primer- und Sondensequenzen, die PCR-Ansätze und die PCR-Bedingungen aufgeführt.

↓42

Tab. 13: Verwendete Primer und Sonde für HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR.

Primer/ Sonde

Sequenz

env sense SK 68i

5`-TTC TTX GGA GCA GCX GGA AGC ACX ATG G-3`

env reverse SK 69i

5`-TTM ATG CCC CAG ACX GTX AGT TXC AAC A-3`

env-Sonde

5`-FAM-TGA CGC TGA CGG TAC AGG CCA GAC A-TAMRA-3`

(metabion GmbH, Martinsried), X = Inosin, 5`-Reporterfarbstoff: FAM 6`-Carboxy-Fluoreszein, 3`-Quencherfarbstoff: TAMRA 6`-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamine

Tab. 14: Verwendete Primer und Sonde für HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR.

Primer/ Sonde

Sequenz

HIV1-O-7825F

5`-AAG AGC AGT AGG ATT GGG AAT GC-3`

HIV1-O-7954R

5`-GTC CTG CTG TTG CAC TAT ACC C-3`

HIV1-O-7876Probe

5`-FAM-TTG CCG CTG CGC CCA TAG TGC XT A-TAMRA-3`

(TibMolBiol, Berlin), X = Modif., 5`-Reporterfarbstoff: FAM 6`-Carboxy-Fluoreszein, 3`-Quencherfarbstoff: TAMRA 6`-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamine

Tab. 15: env-TaqMan™-PCR-Ansatz.

Konzentration final

cDNA

5,0 – 20,0 µl

Rox-Puffer 10 x

1 x

dNUTP1

200 µM

MgCl2

3,5 mM

sense Primer

0,25 µM

reverse Primer

0,25 µM

Sonde

100 nM

UNG2

0,5 Units

Taq-DNA-Polymerase

1,25 Units

H2O

ad 50 µl

1 dNUTP: Desoxynukleosidtriphosphate mit Uridin (dUTP) statt Thymidin (dTTP) zur Präventionstechnik mit 2Uracil-N-Glykosylase (UNG), welche im ersten Schritt der Real-time PCR Uracil aus Uracil-haltiger DNA freisetzt und somit Kontaminationen mit PCR-Produkten beseitigt.

↓43

Tab. 16: env-TaqMan™-PCR-Bedingungen

1 x

Hydrolyse (UNG)

5 Minuten

50°C

1 x

Inaktivierung UNG/Denaturierung Probe

7 Minuten

94°C

45 x

Denaturierung

30 Sekunden

94°C

Hybridisierung und Elongation

1 Minute

62°C

2.2.9 Standards für TaqMan™-PCR

Für die Etablierung der quantitativen TaqMan™-PCR-Systeme und zur Quantifizierung der Proben über eine Standardkurve wurden für beide PCR-Systeme Standards hergestellt:

HIV-1 Gruppe M env-PCR-Standards

Als Standard wurde eine gereinigte Präparation des Plasmids pBT1/BS eingesetzt. Das Plasmid enthält die genomische Information von HIV-1 LAI mit Deletionen in der LTR. Zur Quantifizierung der Proben wurde eine serielle 1:10-Verdünnung hergestellt und in die TaqMan™-PCR eingesetzt. Über eine Standardkurve konnte die Kopienzahl in der unbekannten Probe bestimmt werden.

HIV-1 Gruppe O env-PCR-Standards

↓44

Zur Etablierung der HIV-1 Gruppe O env-PCR und zur späteren Quantifizierung der Proben wurden Standards kloniert. Hierfür wurde eine präparative PCR mit den Primern der HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR (HIV1-O-7825F und HIV1-O-7954R) angesetzt (Tabelle 17 und 18).

Tab. 17: präparative PCR-Bedingungen

1 x

Denaturierung

2 Minuten

94°C

30 x

Denaturierung

1 Minuten

94°C

Hybridisierung und Synthese

2,5 Minuten

55°C

1 x

Abschluss der Synthese

10 Minuten

65°C

Tab. 18: präparative PCR-Ansatz

Konzentration final

cDNA

5,0 µl

Puffer III 10 x

1x

5 x Optimizer

1x

dNTPs

200 µM

MgCl2

3,5 mM

HIV1-O-7825F

0,25 µM

HIV1-O-7954F

0,25 µM

Combi Pol™

2,0 Units

H2O

ad 50 µl

↓45

Als Template diente cDNA aus einer RNA-Extraktion eines HIV-1 Gruppe O-Virusstocks. Die aufgereinigten Fragmente dieser präparativen PCR wurden in den pCR®II-TOPO-Cloning-Vektor des „TOPO TA Cloning Kits“ (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) nach Angabe des Herstellers kloniert. Nach der Transformation in Z-kompetente E. coli wurden Über-Nacht-Kulturen der Kolonie, die das Plasmid mit dem korrekten Insert trägt, hergestellt und die Plasmide anschließend aufgereinigt. Nach Bestimmung der Plasmid-Konzentration im Photometer wurden die Plasmide seriell 1:10 verdünnt und in die TaqMan™-PCR eingesetzt.

2.3 Zellbiologische Methoden

2.3.1  Zellkultivierung

Die Zellen wurden je nach benötigter Zellzahl in 25 cm2- oder 75 cm2 Zellkulturflaschen bei 37°C, in feuchter Atmosphäre bei 5% CO2-Begasung kultiviert. Die adhärenten Zellen (FL, CACO-2, 293, Hela, HepG2) wurden in D-MEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum FKS und je nach Zelllinie zusätzlich mit 2 mM Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 1% Natrium-Pyruvat kultiviert. Die Zellen wurden ein bis zweimal die Woche nach lösen der Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung 1:5 bis 1:10 umgesetzt. Die Suspensionszellen (Molt 4/8 und CEMx174) wurden in RPMI 1640 komplettiert mit 10% FKS und 2 mM Glutamin kultiviert. Hier wurden die Zellen alle 3-4 Tage im Verhältnis 1:10 bzw. 1:20 umgesetzt. Für die jeweiligen Versuche wurden die Zellen vor der Aussaat in der Neubauer-Zählkammer gezählt und auf die gewünschte Zellzahl eingestellt.

2.3.2 Virusanzucht

Die Anzucht von HIV-1IIIB erfolgte auf CEMx174-Zellen und die Anzucht von HIV-1 Gruppe O auf Molt 4/8-Zellen. Ansonsten wurde bei beiden Viren nach dem gleichen Protokoll gearbeitet. 2x104 Zellen/ml wurden mit einer MOI (multiple of infection) von 10-3 mit den jeweiligen Viren infiziert. Die Zellen wurden solange weiter kultiviert bis ein deutlicher virusspezifischer cytopathischer Effekt (CPE) zu sehen war. Die Zellen wurden daraufhin ausgedünnt und mit einer geeigneten Menge an nicht infizierten Zellen versetzt. Das Verhältnis infizierte zu nicht-infizierten Zellen sollte bei ca. 1:5 liegen. Betrug die Anzahl der Synzythien ca. 60 bis 80 % der gesamten Kultur, wurden die Viren geerntet. Die gesamte Kultur wurde dafür für 15 Minuten bei 4°C und einer Umdrehung von 700xg zentrifugiert. Der virushaltige und zellfreie Überstand wurde aliquotiert und bei –70°C aufbewahrt.

2.3.3 Durchführung der Transzytoseversuche

↓46

Die Transzytoseversuche wurden mit dem in Abbildung 7 gezeigtem Zwei-Kompartiment-System durchgeführt.

Abb. 7: Zwei-Kompartiment-System zur Untersuchung der Transzytose mit Unterteilung des Versuchsaufbaus durch den Zellkultureinsatz in ein oberes und unteres Kompartiment.

Zur Durchführung der Transzytoseversuche wurden epitheliale Zellen auf Falcon Nitrocellulosefiltern (0,3 µm Porendurchmesser, BD Falcon™, USA) bis zur vollständigen Konfluenz angezüchtet. Als epitheliale Zellen wurden in den Versuchen FL - (humane Amnionzellen, 1 bis 2x104 Zellen/Filter) oder CaCo-2- (Zellen eines humanen Colonadenokarzinoms, 105 Zellen/Filter) Zellen verwendet. Zur Etablierung eines Monolayers wurden die Zellen in D-MEM suplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) über sieben Tage kultiviert.

↓47

Die Zellen wurden zur Entfernung des FKS zweimal mit PBS gewaschen. Ins untere Kompartiment wurden 800 µl D-MEM, ins obere Kompartiment 300 µl D-MEM, das zellfreie HIV-1 Gruppe O- bzw. HIV-1IIIB-Viren enthielt, gegeben. Nach Zugabe der Viren wurde das System bei 37°C und 5% CO2 über 120 bzw. 240 Minuten inkubiert. Nach diesen Inkubationszeiten wurde jeweils das Medium aus dem unteren Kompartiment entfernt und der Virustiter über Endstufentitration (siehe 2.3.6) auf Molt 4/8 - bzw. CEMx174 – Zellen bestimmt sowie die Anzahl der transportierten Partikel über RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und anschließender quantitativen Real-Time TaqMan™-PCR ermittelt (Abb. 8).

Abb. 8: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Messmethoden zur Ermittlung der Menge an transportierten Viren

Daneben wurde der Virustiter bzw. die Partikelanzahl im oberen Kompartiment vor Versuchsbeginn und nach Beendigung der Transzytose mit den genannten Methoden bestimmt. Neben der Bestimmung der Infektiösität im unteren Kompartiment über Endstufentitration wurde die Infektiösität ebenfalls mit Hilfe der TaqMan™-PCR bestimmt. Hierzu wurden 105 CEMx174-Zellen in 5 ml Kulturmedium mit 200 µl Medium aus dem unteren Kompartiment infiziert. Die Ansätze wurden über 10 Tage kultiviert und dann ein Zellpellet aus 1500 µl Zellsuspension bei –20°C zur DNA-Extraktion eingefroren. Der Versuchsaufbau der Transcytose wurde den unterschiedlichen Versuchen angepasst und in den jeweiligen Abschnitten im Ergebnisteil beschrieben. Die Dichtigkeit der mit FL-Zellen bewachsenen Filter wurde nach Beendigung des jeweiligen Versuchs in jedem Ansatz mit einer Kristallviolett-Lösung (CV) bestimmt [Rokos et al. 1998].

2.3.4 Gewinnung und Präparation von menschlicher Eihaut

↓48

Um die Ergebnisse der Transzytoseversuche mit FL-Zellen auf komplexe Gewebe übertragen zu können, wurde ein Teil der Versuche in einem Eihautmodell [Rokos et al. 1998] durchgeführt. Das Eihautmodell stellt unter Laborbedingungen die beste Möglichkeit dar, den Virusübertritt von der Mutter auf das Kind zu untersuchen. Die in den Versuchen verwendete Eihaut wurde von der Klinik für Geburtsmedizin der Charité, Humboldt Universität in Zusammenarbeit mit PD Dr. Axel Schäfer bezogen. Es wurden sowohl Eihäute von Spontangeburten als auch von primären Kaiserschnitten (vor Einsetzen der ersten Wehen) verwendet. Die frische Eihaut wurde von der Plazenta abgeschnitten und dreimal in sterilem PBS gespült. Zur Verarbeitung wurde die Eihaut nach Reinigung und Entfernen der Blutreste in RPMI 1640-Medium mit Nystatin und Antibiotika überführt. Nach der Überprüfung, ob beide Schichten der Eihaut noch intakt und zusammen waren, wurden 5cmx5cm große Stücke ausgeschnitten und mit der fetalen Seite nach oben über einen Plastikring gestülpt. Die Befestigung der Eihaut erfolgte mit einem Handschuhring (1cm breiter Streifen vom kleinen Finger eines sterilen Handschuhs) und Titanligaturclips. Die so präparierten Eihäute wurden auf eine Zellkulturmembran in einer 6-Lochplatte gesetzt (siehe Abb. 9) und die Transzytoseversuche wie in Kapitel 2.3.3 beschrieben durchgeführt.

Abb. 9: Schematische Darstellung des Eihautmodells

Dabei wurde ins untere Kompartiment des Eihautmodells 3 ml Medium und ins obere Kompartiment 1 ml Virussuspension gegeben. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C wurde 1 ml Medium aus dem unteren Kompartiment entnommen und 1 ml frisches Medium hinzugefügt, nach 20 bzw. 24 Stunden wurde die Transzytose beendet und das gesamte Medium aus dem unteren Kompartiment entnommen. In dem nach 3 und 20 bzw. 24 Stunden entnommenem Medium wurde wie bereits oben beschrieben die Menge an transportierten Viren bestimmt. Anschließend wurde die Dichtigkeit der Eihaut mit Kristallviolett ermittelt [Rokos et al. 1998].

2.3.5 CV-Test: Testung auf Dichtigkeit der FL-Filter

↓49

Zur Überprüfung der Dichtigkeit der Filter wurden in Anlehnung an Rokos et al. [Rokos et al. 1998] 50 µl einer Kristallviolett-Lösung (0,02 % Kristallviolett (CV), 0,2 % Formaldehyd, 1,5 % Ethanol in PBS) ins obere Kompartiment bei FL-Filtern und 1 ml beim Eihautmodell gegeben. Im unteren Kompartiment befanden sich 200 µl bzw. 2 ml PBS mit 1 % FKS. Die Filter wurden für 120 bzw. 240 Minuten bei 4°C inkubiert, danach die Zellen oder die Eihaut im Lichtmikroskop auf undichte Stellen hin untersucht. Das PBS aus dem unteren Kompartiment wurde entnommen und im Fotometer bei der Messwellenlänge von 620 nm und Referenzwellenlänge von 450 nm auf Vorhandensein von CV untersucht. Gemessen wurde die Differenz von PBS und der Lösung im unteren Kompartiment. Konnte eine Zunahme in der Extinktion festgestellt werden, war der untersuchte Filter undicht und wurde aus der Auswertung genommen.

2.3.6 Bestimmung des Virustiters über Endstufentitration

Zur Bestimmung des Virustiters der Ausgangsvirussuspension bzw. des Mediums im unteren Kompartiment wurde je ein Aliquot sofort 1:10, 1:5 bzw. 1:3 mit Kulturmedium verdünnt, diese wurden dann seriell 1:3 oder 1:5 weiterverdünnt. Danach wurde je Verdünnungsstufe 200 µl in zwei Vertiefungen einer 24-Loch-Flachbodenmikrotiterplatte überführt. Zur Optimierung der Nachweisgrenze wurden jeweils 200 µl des Mediums aus dem unteren Kompartiment unverdünnt in eine Vertiefung der 24-Loch-Platte gegeben. Zuvor waren die Löcher dieser Mikrotiterplatte mit 800 µl einer Wirtszellsuspension mit 2x104 Zellen/ml beschickt worden. Als Wirtszellen wurden Molt 4/8 oder CEMx174 verwendet. Nach Ausbringen der Verdünnungen auf die Mikrotiterplatte wurden diese 16 bis 18 Tage mit mehrmaligem Ausdünnen der Zellen bei 37°C im CO2-begasten Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Zellen im Lichtmikroskop auf einen cytopathischen Effekt (CPE) hin untersucht, jede Kultur mit einem Anzeichen eines HIV-charakteristischen CPEs wurde als positiv gewertet. Die Berechnung des Virustiters als TCID50 (50% tissue culture infectious dose, 50% infizierte Gewebekultur) wurde nach der Vorschrift von Kaerber und Reed & Muench [Reed & Muench 1938, Kaerber 1931] durchgeführt und auf 1 ml des Versuchsansatzes bezogen.

D = Basis der Verdünnungsreihe

D0 = erster Verdünnungsschritt

TCID50/ml = D(n/p + 0,5)/ D0x D x V

p = Anzahl der Parallelbestimmungen

V = eingesetztes Volumen an Virussuspension

n = Anzahl der positiven Proben

2.3.7 Aufnahme und Abgabe von HIV-1

↓50

Zur Untersuchung der Aufnahme und der Abgabe von HIV-1IIIB von FL-Zellen wurden 2x105 Zellen/Vertiefung einer 6-Loch-Platte oder 5x104 Zellen/Vertiefung einer 12-Loch-Platte eingesät und über 3 bis 4 Tage kultiviert. Vor Versuchsbeginn wurden die Zellen zur Entfernung des FKS zweimal mit PBS gewaschen und die Viruslösung (1:10 verdünnter Virusstock in D-MEM) dazugegeben. Die Zellen wurden daraufhin für 60 Minuten bei 37°C inkubiert, um die Aufnahme der Viren in die Zelle zu ermöglichen. Im Anschluss daran wurde die Viruslösung abgenommen, die Zellen dreimal mit Trypsin/EDTA-Lösung gewaschen und für 10 Minuten mit Trypsin/EDTA bei 37°C inkubiert. Die Proteasebehandlung sollte dazu dienen, an der Oberfläche haftenden Virus freizusetzen und zu inaktivieren (Verdau der Oberflächenproteine des Virus). Nach der Trypsinierung der Zellen wurden sie in 1 ml FKS-haltigem Zellkulturmedium aufgenommen. Ein Aliquot von 500 µl wurde für die RNA-Extraktion zur Bestimmung der Menge an aufgenommenen Viren nach Pelletieren der Zellen bei –70°C eingefroren. Die restlichen Zellen wurden in eine Vertiefung einer neuen 12-Loch-Platte ausgesät und über 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde zellfreier Überstand für die RNA-Extraktion zur Bestimmung der abgegebenen Virusmenge abgenommen. Gleichzeitig wurde mit 200 µl zellfreien Überstand 105 CEMx174-Zellen infiziert. Diese wurden über 10 Tage kultiviert, die Zellen (1,5 ml) geerntet und die DNA extrahiert. Zur Bestimmung der Ausgangsvirusmenge wurde die eingesetzte Viruslösung auf CEMx174-Zellen austitriert.

2.3.8 Synzythien-Inhibierungsassay (SIA)

Zur Bestimmung der minimalen Wirkkonzentration der neutralisierenden Antikörper 2F5 und 2G12 bzw. zur Untersuchung der eingesetzten HIV-1 positiven Seren auf Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern wurde ein Synzythien-Inhibierungsassay (SIA) durchgeführt [Purtscher et al. 1996]. Hierzu wurden die monoklonalen Antikörper in unterschiedlichen Konzentration bzw. 30 µl der jeweiligen Seren mit 102 bis 103 HI-Viren (HIV-1IIIB und HIV-1 Gruppe O) für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Virusmenge im Ansatz wurde über eine Endstufentitration bestimmt. Nach der Inkubation wurde zu jedem Ansatz 2 x 104 CEMx174-Zellen/ml zugegeben und die Ansätze über mehrere Tage bei 37°C kultiviert. Wenn in der parallel dazu angesetzten Kontrolle ohne Serum bzw. ohne monoklonale Antikörper der erste cytopathische Effekt (CPE) beobachtet werden konnte, wurde der Versuch ausgewertet. War in den Versuchsansätzen kein CPE zu beobachten, so wurde hier eine Infektion der Zielzelle durch Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern verhindert.

2.3.9 Deglykosylierung der humanen, monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12

Zur Untersuchung des Einflusses der Glykoanteile der verwendeten Antikörper auf den Transport von HIV-1IIIB durch epitheliale Zellen wurde durch Inkubation der Antikörper mit N-Glykosidase F (Roche Deutschland Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen) die Zuckerreste abgespalten. Durch eine anschließende Dialyse gegen PBS wurden die Zuckerreste und das Enzym aus der Antikörperlösung entfernt. Die Immunglobuline der Klasse G tragen an der Amid-Gruppe eines Asparaginrestes im Fc-Teil des Proteins ein N-glykosidisch gebundenes Oligosaccharid. Im Falle von IgG besteht das Oligosaccharid aus vier N-Acetylglucosamin-, drei Mannose-Resten, ein Fucose sowie ein Galactose-Rest. Das verwendete Enzym N-Glykosidase F spaltet alle Typen Asparagin-gebundener N-Glykanketten. Zur Deglykosylierung wurde eine antikörperhaltige PBS-Lösung (pH 7,2, 100 µg Antikörper) mit 10 µl des Enzyms versetzt (10 Einheiten Enzym) und über Nacht bei 37°C inkubiert. Gleichzeitig wurden Kontrollen aus Antikörpern ohne Enzym ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Deglykosylierung wurden die Antikörper der Ansätze mit Enzym und der Kontrollansätze in einer Dialyse über 24 Stunden gegen PBS aufgereinigt. Nach abgeschlossener Dialyse wurde mit Hilfe einer diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese (siehe 2.2.1.13) mit anschließender Coomassie Brilliant Blue-Färbung die erfolgte Deglykosylierung der Antikörper überprüft. Die deglykosylierten Antikörper müssen im Gel aufgrund der geringeren Größe weiter wandern als die glykosylierten Antikörper. Nach Überprüfung wurden die aufgereinigten Antikörper in die Transzytoseversuche eingesetzt.

2.3.10 Einfluss von Env362-420 auf Infektiösität

↓51

Geeignete Peptide, die sich von der gp120-Sequenz ableiten, können durch Anlagerung an CD4 auf den Zielzellen von HIV-1 einen Einfluss auf die Infektiösität besitzen. Zur Untersuchung dieses Einflusses wurde das Peptid Env362-420 (100 µM) mit 105 CEMx174-Zellen/ml in serumfreiem RPMI 1640 für 30 Minuten inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde Virus dazugegeben und weiter für 60 Minuten bei 37°C inkubiert, um eine Infektion der CEMx174-Zellen zu ermöglichen. Im Anschluss daran wurden die nicht gebundenen Viren durch mehrmaliges Waschen der Zellen mit RPMI 1640 entfernt. Die Zellen wurden anschließend auf frische CEMx174-Zellen titriert (1:100, 1:5 ff), so dass am Ende 2x104 Zellen/Ansatz erreicht wurde. Die Ansätze wurden für mehrere Tage bei 37°C kultiviert, bis in den Kontrollansätzen ohne Peptide keine Veränderung in der Ausbildung eines CPE in den Verdünnungsstufen mehr beobachtet werden konnte. Die Versuche mit den Peptiden wurden mit den Kontrollversuchen verglichen und eine Aussage über den Einfluss auf die Infektiösität getroffen.

2.3.11 Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen

Die Bindung von Env362-420mod. wurde an folgenden epithelialen Zelllinien untersucht: FL-, CaCo-2-, HT29/B6 (Colorektales Adenokarzinom)- und Hela (Cervixkarzinom)-Zellen. Hierzu wurden die Zellen mit einer Zellzahl von 1 bis 4x104 Zellen/Kammer auf Kammer-Objektträgern (BD Falcon™, USA) angezüchtet. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen nach Abnahme des Überstandes zweimal mit PBS gewaschen und nach Zugabe von FKS-freien Medium auf 12°C pre-equilibriert. Nach der Pre-Equlibrierung wurde Env362-420mod., gelöst in Kulturmedium (Konzentration 100 µM), zu den Zellen gegeben, auf die Kontrollzellen D-MEM mit der entsprechenden Menge an DMSO. Die erste Inkubation zur optimalen Bindung des Peptids an die Zelloberfläche wurde für 30 Minuten bei 12°C durchgeführt. Zur Reorganisation der Plasmamembranen der Zellen sowie zur Stabilisierung der Bindung wurden die Zellen anschließend für 8 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen zu 4°C transferiert und nicht gebundene Peptide durch dreimaliges Waschen von je 15 Minuten mit PBS entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit einer 4%´gen Formalinlösung fixiert, zur Entfernung des Formalins mit PBS gewaschen und 15 Minuten mit Lysin-Puffer (10 mM Lysin in PBS) zur Blockierung freier Aldehydgruppen inkubiert. Nach der Blockierung wurde Kaninchenserum (Immunserum von Tier 1, siehe 2.5.1) 1:100 verdünnt in Lysin-Puffer auf die Zellen gebracht und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligen Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit dem 2. Antikörper (anti-Kaninchen-FITC-Antikörper 1:20 verdünnt in PBS mit 10 mM Lysin) für 90 Minuten bei 37°C. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, getrocknet und eingedeckelt. Die Auswertung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (Filter 480 – 510 nm). Hier wurde die Fluoreszenz durch Bindung von Env362-420mod. an die Zellen im Vergleich zur Kontrolle mit DMSO beurteilt. Die Durchführung dieser Methode erfolgte in Anlehnung an Alfsen et al. [Alfsen et al. 2001].

2.3.12 Alkalische-Phosphatase-anti alkalische-Phosphatase Technik (APAAP)

Zum Nachweis einer Expression von gp120 in den Säugetierzellen wurden 24 und 48 Stunden nach der Transfektion von abgeschabten Zellen Zytofugenpräparate angelegt. Als Kontrolle dienten die Zellen der Transfektion mit pBSSK+. Die Zytofugenpräparate wurden in 4% Formalin fixiert und in PBS“ohne“ bei 4°C aufbewahrt. Die APAAP-Technik zum Nachweis von gp120 mit spezifischen Antikörpern (2G12) wurde nach einer auf dem Protokoll von Cordell [Cordell et al. 1984] basierenden von der Arbeitsgruppe modifizierten Vorschrift durchgeführt [Niedrig et al. 1993]. Um die Zellwand der formalinfixierten Zellen permeabel für die Antikörper zu machen, wurden die Präparate vor der APAAP-Reaktion mit 1% Triton X100 behandelt. Die Auswertung erfolgte mit dem Lichtmikroskop, als positive Kontrolle dienten Zytofugenpräparate mit HIV-1 infizierten CEMx174-Zellen.

2.4 Serologische Methoden

2.4.1  Peptid-ELISA

Testprinzip

↓52

Im ersten Schritt wird das Antigen (Ag), in diesem Falle das synthetisierte Peptid, an einen nicht löslichen Träger (Maxisorb© Immunoplate von Nunc GmbH und Co KG, Wiesbaden) gebunden. Während dieser Inkubation nicht-gebundenes Ag wird nach der Beschichtungszeit abgewaschen. Zur Absättigung freier Bindungsstellen werden die Vertiefungen der Immunoplatte anschließend mit einer proteinhaltigen Pufferlösung wie z.B. 10% neonatales Kälberserum (NKS) in PBS inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen können die zu untersuchenden Seren einpipetiert werden. In einer definierten Inkubationsdauer binden die gegen das Ag gerichteten spezifischen Antikörper an das Ag. Während des folgenden Waschvorgangs werden nicht gebundene Antikörper wieder entfernt. Im nächsten Schritt werden die Platten mit einem Enzym-konjugierten gegen humane Antikörper gerichteten Antikörper inkubiert. Nach dieser Inkubation wird überschüssiges Konjugat entfernt und die Substratlösung dazugegeben. Das Substrat wird in Anwesenheit des gekoppelten Enzyms in ein farbiges Endprodukt umgesetzt, diese Umsetzung kann nach Zusetzung der Stopp-Lösung im Photometer bei einer definierten Wellenlänge gemessen werden. Die gemessene Extinktion ist ein Maß für die Menge an spezifischen Antikörpern im untersuchten Serum.

Beschichtung der Platten

Die Platten wurden mit einer Peptid-haltigen Carbonatpufferlösung beschichtet. Hierzu wurde eine definierte Menge Peptid (siehe Optimierung der Versuchsbedingungen) in Carbonatpuffer (100 mM, pH 9,6) gelöst, in die Vertiefungen der zu beschichteten Platte pipetiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Beendigung der Beschichtung wurde überschüssiger Peptid-Puffer durch mehrmaliges Waschen mit PBS-Puffer entfernt.

Blockierung der nicht-abgesättigten Bindungsstellen

Freie Bindungsstellen der verwendeten Immunoplatten nach Beschichtung müssen zur Reduzierung der unspezifischen Reaktionen blockiert werden. Dazu wurde in die Vertiefungen der Immunoplatte eine proteinhaltige PBS-Lösung (siehe Optimierung der Versuchsbedingungen) pipetiert und für 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde die proteinhaltige PBS-Lösung durch mehrmaliges Waschen mit PBS-Puffer wieder entfernt. Die Platten wurden entweder nach Trocknung bei –20 °C aufbewahrt oder direkt in den ELISA eingesetzt.

Durchführung des Peptid-ELISAs

↓53

Der ELISA wurde in Anlehnung an das Protokoll des Murex HTLV I + II-ELISAs von Abbott -teilweise mit den mitgelieferten Reagenzien- durchgeführt. Die HIV-positiven und HIV-negativen Seren wurden in Probenverdünner (Murex HTLV I + II-ELISA) verdünnt und 100 µl der Serumverdünnung in die jeweiligen Vertiefungen einer mit Peptid beschichteten Platte pipetiert. Nach einer bestimmten Inkubationsdauer in der feuchten Kammer wurden die Seren nach fünfmaligen Waschen mit Waschpuffer (Murex HTLV I + II-ELISA) wieder entfernt. Der mit Peroxidase konjugierte Anti-human IgG Antikörper von der Ziege (Peroxidase conjugate-goat anti-human IgG gamma chain specific affinity isolated antibody, Sigma-Aldrich USA, zweiter Antikörper) wurde in Probenverdünner verdünnt und je 50 µl der Konjugatlösung in die jeweiligen Vertiefungen gegeben. Nach der 30 minütigen Inkubation bei 37°C wurde mit fünf Waschschritten der zweite Antikörper wieder entfernt. Im Anschluss daran wurde 100 µl der Substratlösung (Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid, Murex HTLV I + II-ELISA) zugegeben und wieder für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zufügen von 50 µl einer Stopplösung (0,5 N Schwefelsäure, Murex HTLV I + II-ELISA) wurden die jeweiligen Extinktionen bei 450 nm mit 620 nm als Referenzwellenlänge gegen Luft gemessen. Die Mittelwerte der Extinktionen der HIV-1 negativen Seren wurden von den Werten der HIV-1 positiven Seren abgezogen. Seren die nach Abzug der Mittelwert von über 0,1 lagen, wurden als positiv bewertet.

Optimierung der Versuchsbedingungen

Zur Optimierung der Versuchsbedingungen wurden ELISAs mit aus der Serumbank ausgesuchten HIV-1 positiven und negativen Seren angesetzt. Es wurden folgende Versuchsparameter optimiert: Serumverdünnung, die Verdünnung des zweiten Antikörpers, Peptidkonzentration zur Beschichtung, Blockierungsreagenz, Temperatur und Dauer der Seruminkubation und Zusammensetzung des Probenverdünners und Waschpuffers. Die Tabelle 19 zeigt die Ergebnisse der Optimierung. Aufgrund der hohen Extinktionswerte der HIV-negativen Seren wurde versucht, nach Optimierung des Peptid-ELISAs mit unterschiedlichen Harnstoffkonzentrationen im Probenverdünner und im Waschpuffer diese Werte zu senken. Die jeweiligen ELISAs zur Optimierung wurden in Anlehnung an das Murex-Protokoll durchgeführt. Bereits optimierte Parameter wurden in das Protokoll übernommen.

Tab. 19: Optimierung des Peptid-ELISAs.

Optimierte Parameter

Differenz1

Konstante Parameter2

Serumverdünnung

1:20

0,669

Plattenbeschichtung 0,5µg/well,

1:40

0,683

Konjugatverdünnung 1:5000,

1:100

0,581

Blockierung 10% FKS

1:200

0,625

Konjugatverdünnung3

1:5000

0,581

Plattenbeschichtung 0,5µg/well,

(zweiter Antikörper)

1:10.000

0,358

Serumverdünnung 1:100,

1:20.000

0,202

Blockierung 10% FKS

Plattenbeschichtung4

0,25 µg Peptid

0,232

Serumverdünnung 1:100, Konju-

0,5 µg Peptid

0,417

gatverdünnung 1:5000, Blockier-

1,0 µg Peptid

0,426

ung 10% FKS, Probenverdünner

10,0 µg Peptid

0,455

und Konjugat 10% NKS

Blockierung

10% NKS

0,417

Plattenbeschichtung 0,5µg/well,

3% BSA

0,379

Serumverdünnung 1:100, Konju-

5% FKS/5% NKS

0,330

gatverdünnung 1:5000, Probenver-

10% Milchpulver

0,325

dünner und Konjugat 10% NKS

Temperatur

37°C

0,391

siehe Blockierung, Blockierung

Raumtemperatur

0,152

10% NKS

4°C

0,06

Seruminkubation

1 Stunde

0,007

Siehe Blockierung, Blockierung

2 Stunden

0,201

10% NKS, Temperatur 37°C

18 Stunden

0,476

24 Stunden

0,431

Harnstoffkonzentration

1M

0,435

siehe Blockierung, Blockierung

im Probenverdünner

2M

0,432

10% NKS, Temperatur 37°C,

und Waschpuffer

3M

0,598

Seruminkubationsdauer 18

4M

0,697

Stunden, Konjugat zusätzlich 1M

5M

0,444

Harnstoff

Soweit keine weitere Angabe zu den ELISA-Bedingungen der einzelnen Optimierung gemacht wurden, wurden die Bedingungen aus dem Murex-Protokoll verwendet. 1Differenz bedeutet Extinktion der HIV-positiven Seren abzüglich der Extinktion der HIV-negativen Seren. 2bei den Ansätzen dieser Optimierung gleich bleibende Parameter, 3Konjugat: Peroxidase conjugate-goat anti-human IgG gamma chain specific affinity isolated antibody (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) 4Angabe der Peptidmenge bezieht sich auf eine Vertiefung einer 96-Lochmikrotiterplatte.

Optimierte Testdurchführung

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Basierend auf dem Murex-Protokoll und der oben beschriebenen Durchführung der Beschichtung und Blockierung wurde der Peptid-ELISA mit folgenden Änderungen und Zusätzen durchgeführt:

• Peptidkonzentration zur Beschichtung:

0,5 µg/Vertiefung einer 96-

Lochmikrotiterplatte

• Blockierungsreagenz:

10% NKS

• Serumverdünnung:

1:100, 1:200

• Probenverdünner:

10% NKS, 4 molar Harnstoff (final)

• Temperatur der Seruminkubation:

37°C

• Dauer der Seruminkubation:

18 bis 24 Stunden

• Waschpuffer:

zusätzlich 4 molar Harnstoff

• Konjugatverdünnung:

1:5000, 10% NKS, 1 molar Harnstoff

2.5 Untersuchungen an mit Env362-420 immunisierten Kaninchen

2.5.1  Immunisierung und Boostern der Kaninchen

Zur Herstellung von Immunseren wurden zwei Kaninchen (Versuchsvorhaben: Herstellung von Ak gegen HIV-Glykoprotein gp120, Anzeigennummer H0142/03) mit einem Peptid auf Grundlage des Sequenzalignements immunisiert (s. Kapitel 3.3.8). Das Peptid wurde an das Trägerprotein KLH (keyhole limpet haemocyanin, Hämozyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke) gekoppelt (1mg Peptid/1mg KLH) und in PBS aufgenommen. Vor der ersten Immunisierung wurde den Kaninchen Blut aus der Ohrvene abgenommen, über Nacht bei 4°C stehen gelassen, zentrifugiert (10 min, 700xg) und der Überstand abgenommen. Die Präseren wurden anschließend aliquotiert und bei -20°C eingefroren.

↓55

Zur Grundimmunsierung wurde 1ml der Peptid-KLH-Konjugat- Lösung in PBS mit 1 ml Freundsches Adjuvans komplett vermischt. Diese Mischung wurde dem jeweiligen Kaninchen in zwei Portionen subkutan als Depot injiziert. Bei der Boosterung 14 Tage nach Grundimmunisierung wurde in der gleichen Weise verfahren. Jedoch wurde hier die Peptid-KLH-Konjugat-Lösung mit inkomplettem Freundschem Adjuvans vermischt. 10 Tage nach der Boosterung wurde den Kaninchen erneut Blut aus der Ohrvene entnommen und daraus Serum wie oben beschrieben gewonnen. Die Kaninchenseren (Präseren und Seren nach der Boosterung) wurden zur Bestimmung des Antikörpertiters in einen modifizierten Peptid-ELISA eingesetzt, zur Charakterisierung der Bindung an virales gp120 im Western Blot und im Immunfluoreszenztest untersucht und das neutralisierende Potential im Synzythien-Inhibierungsassay (SIA) bestimmt. Anschließend wurden die Seren in die Transzytoseversuche mit FL-Zellen und menschlicher Eihaut eingesetzt.

2.5.2 Charakterisierung der Immunseren

Peptid-ELISA

Zur Bestimmung der Antikörpertiter in den Kaninchenseren vor und nach der Immunisierung wurde ein ELISA in Anlehnung an den in Kapitel 2.4.1 beschriebenen Peptid-ELISA durchgeführt. Abweichend von dem Protokoll wurden die Immunoplatten mit dem zur Immunisierung verwendeten Peptid beschichtet und als Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde der POD-konjugierte Anti-Kaninchen IgG-Antikörper von der Ziege in einer Verdünnung von 1:2500 verwendet. Die einzelnen Seren wurden 1:1000 vorverdünnt und seriell 1:2 bis 1:1.024.000 weiterverdünnt eingesetzt. Die Extinktionen der jeweiligen Präseren wurden von den Extinktionen der Seren nach Immunisierung abgezogen. Als Antikörpertiter wurde die letzte Verdünnung gewertet, bevor die Extinktionen unter dem Schwellenwert der Extinktion der Präseren plus 0,2 OD lag.

Synzythien-Inhibierungsassay (SIA)

Der Synzythien-Inhibierungsassay wurde wie in Kapitel 2.3.8 beschrieben durchgeführt. Es wurden sowohl die Präseren als auch die Seren nach der Immunisierung 1:10 und 1:100 verdünnt in den Assay eingesetzt. Beurteilt wurde die Ausbildung von Synzythien nachdem im Kontrollansatz ohne Kaninchenserum ein CPE zu sehen war. Ansätze, die zu diesem Zeitpunkt keinen CPE zeigten, beinhalten neutralisierende Antikörper.

Western Blot

↓56

Vor Durchführung des Western Blots wurde HIV-1IIIB-Überstand nach Zentrifugation (90 Minuten bei 15.800xg) und Aufnahme in Ladepuffer über eine diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese wie in Kapitel 2.2.1.13 beschrieben aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden mit Hilfe des Semi-Dry-Verfahrens auf Nitrocellulosemembran transferiert und diese in Streifen geschnitten in den Western Blot eingesetzt. Zur Überprüfung der Auftrennung und Transfer der HIV-Proteine wurden ein Western Blot nach dem Genelab® HIV-1 Western Blot Protokoll mit der mitgelieferten HIV-1 Positivkontrolle durchgeführt. Vor Untersuchung der Kaninchen-Seren wurden die einzelnen Streifen für 60 Minuten auf dem Schüttler zur Blockierung freier Bindungsstellen in einer 5%´gen Magermilchpulverlösung in PBS (Blockierungspuffer) inkubiert. Nach dreimaligen Waschen mit PBS-T (PBS + 0,1% Tween 20) erfolgte die Seruminkubation. Hierfür wurden die Seren 1:10, 1:100, 1:200 und 1:400 verdünnt in Blockierungspuffer mit dem jeweiligen Blotstreifen für 60 Minuten bei Raumtemperatur geschwenkt. Anschließend erfolgte nach dreimaligem Waschen die Konjugatinkubation. Der Peroxidase-konjugierte Anti-Kaninchen IgG-Antikörper aus der Ziege wurde 1:2500 in Blockierungspuffer verdünnt eingesetzt. Nach 60 Minuten wurden die Streifen wiederum dreimal mit PBS-T gewaschen und danach mit Substrat für 30 bis 60 Minuten inkubiert. Als Substrat diente 4-Chloro-1-Naphtol mit H2O2 (2 ml 4-Chloro-1-Naphtol-Stock + 10 ml Triethanolamin-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,5 + 5 µl H2O2). Die Reaktion konnte nach Ablauf der Inkubationszeit mit PBS gestoppt werden. Die Beurteilung der Banden erfolgte nach Trocknung der Streifen. Anhand des mitgeführten Größenstandards konnte die gp120-Bande identifiziert und die Blots mit Präserum bzw. Serum nach Immunisierung auf das Vorhandensein dieser spezifischen Bande hin beurteilt werden.

Immunfluoreszenztest

Im Immunfluoreszenztest wurde die Bindung der Kaninchenseren an zellassoziiertes gp120 von HIV-1IIIB-infizierten Zellen untersucht. Hierzu wurden HIV-infizierte CEMx174-Zellen durch direkte Zugabe von Formaldehyd (37%) ins Medium fixiert. Die Endkonzentration betrug 4% Formaldehyd und die Inkubationszeit bei Raumtemperatur 30 Minuten. Anschließend wurden die fixierten Zellen zur Entfernung des Formaldehyds dreimal mit PBS gewaschen. Vor Inkubation mit den jeweiligen Kaninchenseren wurden die Zellen in PBS mit 10 mM Lysin aufgenommen und zur Blockierung von freien Aldehydgruppen für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Seruminkubation erfolgte nach Zugabe der einzelnen Seren bzw. Serumverdünnungen für 105 Minuten bei 37°C. Hier wurden die Seren in Verdünnungen von 1:10 bis 1:200 eingesetzt. Nach der Seruminkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und anschließend in der Konjugatlösung (anti-Kaninchen IgG-FITC-Antikörper 1:20 verdünnt in PBS mit 10 mM Lysin) aufgenommen. Zur Bindung der FITC-markierten Antikörper wurden die Ansätze 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden nicht-gebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Zur Mikroskopie wurden die Zellen in PBS auf einen Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen abgedeckt. Mit einem Fluoreszenzmikroskop (Filter 480 – 510 nm) konnte Bindung der Antikörper in den Kaninchenseren an zellassoziiertes gp120 durch Überprüfung der Fluoreszenz im Vergleich zwischen Präserum und Serum nach Immunisierung beurteilt werden.


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13.03.2008