3 Ergebnisse

↓56

Die Infektion des Kindes durch die Mutter während der Schwangerschaft oder der Geburt stellt ein anwachsendes Problem – insbesondere in den Entwicklungsländern - dar. Aufgrund der in der Einleitung beschriebenen Probleme mit den verfügbaren Präventionsmaßnahmen werdenneue, effektive Maßnahmen gegen die vertikale Transmission von HIV, die auch in den Entwicklungsländern durchgeführt werden können, gebraucht. Mit diesem Hintergrund war das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Übertragungsmechanismus in Hinblick auf einer möglichen Entwicklung neuer Interventionsstrategien weiter aufzuklären.

3.1  Etablierung der TaqMan™-PCR-Systeme

↓57

Zur Messung des Transportes von HIV mussten zuerst geeignete Nachweissysteme etabliert werden, mit denen eine Quantifizierung der infektiösen und der physikalischen HIV-Partikel möglich war. Für den Nachweis von Viruspartikeln wurden TaqMan™-PCR-Systeme entwickelt, die eine exakte Quantifizierung der Genomäquivalente von HIV-1 und HIV-1 Subtypen ermöglichten. Es wurden zwei unterschiedliche TaqMan™-PCR-Systeme etabliert: zur Detektion von HI-Viren der Gruppe M und zur Detektion von HI-Viren der Gruppe O. Im Methodenteil sind Primer- und Sondensequenzen sowie die Zyklerbedingungen der beiden TaqMan™-PCR-Systeme aufgeführt. Eine HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR war bereits in der Arbeitsgruppe etabliert. Die Versuchsbedingungen wurden soweit übernommen, jedoch zusätzlich zur Verbesserung der Nachweisgrenze die Annealing-Temperatur optimiert. Dazu wurde die TaqMan™-PCR mit unterschiedlichen Annealing-Temperaturen von 55°C bis 62°C durchgeführt. Als Template wurde bei allen Optimierungsansätzen cDNA mit der gleichen Kopienzahl verwendet. Bei einer Annealing-Temperatur von 62°C wurden die niedrigsten CT-Werte ermittelt, d.h. die höchste Sensitivität erreicht und als optimierte Annealing-Temperatur in das Protokoll übernommen. Je niedriger der CT-Wert, desto früher findet eine messbare Amplifikation statt. Zur Optimierung der PCR-Bedingungen der HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR wurden Ansätze mit unterschiedlichen MgCl2-Konzentrationen von 1 bis 4 mM in 0,5 mM-Schritten in die TaqMan™-PCR eingesetzt. Eine MgCl2-Konzentration von 3,5 mM wurde als die Konzentration mit den niedrigsten CT-Werten bestimmt. Die weitere Optimierung der Zyklerbedingungen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Auch hier konnte bei einer Annealing-Temperatur von 62°C die beste Amplifikation beobachtet werden. Ansonsten wurde die HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR mit dem gleichen PCR-Ansatz und den gleichen Zyklerbedingungen wie die HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR durchgeführt. Nach der Optimierung wurden zur Quantifizierung und zur Bestimmung der Sensitivität bei beiden Systemen – wie im Methodenteil beschrieben - Standards hergestellt und in den Konzentrationen 5x100 bis 5x103 bei der HIV-1 Gruppe O env-TaqMan™-PCR und 1,5x101 bis 1,5x104 bei der HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR eingesetzt. Die Abbildungen 10 und 11 zeigt die Standardkurven der beiden TaqMan™-PCR-Systeme.

Abb. 10: Standardkurve zur HIV-1 Gruppe M-env-TaqMan™-PCR zur Quantifizierung von HIV-Genomen, auf der x-Achse sind die Kopienzahlen und auf der y-Achse die Anzahl der Zyklen aufgetragen, bei den angegebenen Messwerten handelt es sich jeweils um Doppelbestimmungen. Die Versuchsbedingungen sind im Kapitel 2.2.8 angegeben.

Abb. 11: Standardkurve zur HIV-1 Gruppe O-env-TaqMan™-PCR zur Quantifizierung von HIV-Genomen, auf der x-Achse sind die Kopienzahlen und auf der y-Achse die Anzahl der Zyklen aufgetragen, bei den angegebenen Messwerten handelt es sich jeweils um Doppelbestimmungen (siehe 2.2.8).

3.2 Etablierung des Modellsystems zur Messung des Transports von infektiösen und physikalischen HIV-Partikeln

↓58

Die bisherigen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe wurden entweder in einem Modellsystem mit menschlicher Eihaut [Rokos et al. 1998] oder mit kultivierten primären Mundschleimhautzellen [Kage et al. 1998] durchgeführt. Zur Etablierung des Modellsystems mit permanenten Zellkulturen (CaCo-2 bzw. FL-Zellen) wurden zu Beginn der Arbeit Transzytosekinetiken durchgeführt. Dazu wurden die Transzytosen wie in Kapitel 2.3.3 beschrieben durchgeführt. Das Medium aus dem unteren Kompartiment wurde nach je 30, 60 und 120 Minuten geerntet und durch neues Medium ersetzt. Die Ermittlung der transportierten Viren im Medium aus den unteren Kompartimenten erfolgte über die Endpunkttitration in Zellkulturen (siehe 2.3.6) und über die TaqMan-PCR nach RNA-Extraktion (siehe 2.2.5) und cDNA-Synthese (siehe 2.2.6). In Abbildung 12 sind exemplarisch für die Etablierung die Ergebnisse eines Transzytoseversuchs von HIV-1IIIB durch FL-Zellen dargestellt. Aufgetragen ist die kumulierte Menge an transportierten infektiösen Viren (Abb. 12a) und HIV-Partikeln (Abb. 12b) zu den angegebenen Zeitpunkten.

Abb. 12: Kinetik der Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Darstellung der transportierten infektiösen Viren (a: Angabe in TCID50/ml) und HIV-Partikel (b: Angabe in Genomäquivalente/µl) aus dem Medium des unteren Kompartiments nach 30, 60 und 120 Minuten einer Transportkinetik. Es wurden im oberen Kompartiment 6,4x104 TCID50/ml infektiöse Viren eingesetzt, dieser Titer entsprach 3,3x109 Genomäquivalente/ml. Über zwei Stunden wurden insgesamt ca. 1% an infektiösen Viren und 1,5% an HIV-Partikel transportiert.

Die Kinetik zeigt, dass schon nach 30 Minuten infektiöse Viren und HIV-Partikel im unteren Kompartiment nachzuweisen sind. Die Menge an transportierten Viren oder HIV-Partikel nimmt über die Zeit ab, das Transportsystem scheint nach dieser Zeit gesättigt zu sein. Eine Diffusion der Viren durch die Epithelzellen kann aufgrund der Sättigung weitgehend ausgeschlossen werden. Es werden in zwei Stunden ca. 1% der eingesetzten infektiösen Viren und ein vergleichbarer Prozentsatz von ca. 1,5% der eingesetzten HIV-Partikel durch die Epithelzellen transportiert. Die Kinetiken gleichen denen, die mit menschlicher Eihaut bzw. mit primären Mundschleimhautepithelzellen ermittelt wurden.

3.3 Werden auch nicht-infektiöse Partikel von der Epithelzelle transportiert?

↓59

Bei der Etablierung des Modellsystems zeigte sich, dass 1% der eingesetzten infektiösen Viren und 1,5% der eingesetzten Viruspartikel transportiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch nicht-infektiöse Partikel, die neben den infektiösen Viren den Hauptbestandteil der Überstände von infizierten Zellen (Virusstock) darstellen, transportiert werden. Mit den folgenden Versuchen, die in Anlehnung an die Methode 2.3.7 mit infektiösen und hitzeinaktivierten Virusstocks durchgeführt wurden, sollte dieser Vermutung nachgegangen werden. Zur Herstellung des inaktivierten Virusstocks wurde ein Aliquot für 30 Minuten auf 56°C erhitzt. Die Inaktivierung der Infektiösität konnte durch eine Endstufentitration bestätigt werden, es wurde nach der Hitzebehandlung kein infektiöses Virus mehr nachgewiesen. Zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an aufgenommenen und abgegebenen Viren der Versuche mit infektiösen Viren als 100% gesetzt und mit den Werten der Versuche mit inaktivierten Viren verglichen. Bei Verwendung von infektiösen Viren konnte in den Zellen in der HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR 2,8x102 Kopien/µl und im Überstand 1,1x102 Kopien/µl nachgewiesen werden. Beim inaktivierten Virusstock wurde in den Zellen nur 4,4x101 Kopien/µl und im Überstand nur 5,0x100 Kopien/µl nachgewiesen. Die Versuche zeigten, dass hitzeinaktivierte Partikel von den verwendeten Epithelzellen aufgenommen und abgegeben werden können. Jedoch ist die Menge deutlich reduziert, es werden im Vergleich zu den infektiösen Viren nur 16% der Menge aufgenommen, dementsprechend werden auch weniger Viren abgegeben (4,5% im Vergleich zu infektiösen Viren). Der Reduktion der Aufnahme und Abgabe von Viruspartikeln bei hitzeinaktivierten Viren im Vergleich zu unbehandelten Viruspräparationen steht im Gegensatz zur Beobachtung, dass ein vergleichbarer Prozentsatz an infektiösen und physikalischen Partikeln durch Zellen transportiert werden. Dieser Unterschied könnte dadurch erklärt werden, dass hitzebehandelte Viren zusätzlich zum spontanen Verlust von gp120 [Gelderblom et al. 1987 II] weitere Oberflächenproteine verlieren.

3.4 Sind die verwendeten Epithelzellen mit HIV-1 infizierbar?

Die vorherigen Versuche haben gezeigt, dass HIV-1IIIB von Epithelzellen aufgenommen werden kann. Im Rahmen der Untersuchung des Transportmechanismus sollte auch überprüft werden, ob es bei der Aufnahme von HIV-1 in die Epithelzelle auch zu einer Infektion d.h. zu einem Umschreiben der viralen, genomischen RNA in provirale DNA und zu einer Integration dieser DNA in das Wirtszell-Genom kommt. Hierzu wurden FL-Zellen wie im Methodenteil 2.3.7 beschrieben mit HIV-1IIIB inkubiert und die Zellen nach Trypsinieren und Waschen wieder ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die FL-Zellen erneut trypsiniert und anschließend die DNA extrahiert. In der HIV-1 env-TaqMan™-PCR wurden die Proben auf Vorhandensein von proviraler DNA untersucht, welche für eine erfolgreiche Infektion der Zelle stehen würde. In keinem der Ansätze konnte in den FL-Zellen provirale DNA nachgewiesen werden, eine Infektion der FL-Zellen durch HIV-1IIIB kann somit ausgeschlossen werden.

3.5 Hemmung der Transzytose durch humane monoklonale Antikörper

Zur Untersuchung, ob humane gegen die HIV-1 Glykoproteine gp120 und gp41 gerichtete neutralisierende, monoklonale Antikörper in der Lage sind den Transport von HIV-1 durch epitheliale Zellen zu hemmen, wurden die beiden gut charakterisierten monoklonalen Antikörper 2F5IgG [Muster et al. 1993] und 2G12IgG [Buchacher et al. 1994] in die Transzytoseversuche eingesetzt. Die Antikörper wurden von Prof. Hermann Katinger, Institut für angewandte Mikrobiologie, Wien freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Beide Antikörper sind gegen nicht immundominante Epitope gerichtet. 2F5 erkennt ein Epitop bestehend aus 16 aufeinanderfolgenden Aminosäuren (NEQELLELDKWASLWN) in der Nähe des C-Terminus von gp41 [Parker et al. 2001]. 2G12 erkennt ein Epitop in der Nähe der C4/V4-Region von gp120. Dieses Epitop wird aus Mannose-Resten der Glykane der Aminosäuren Asparagin an der Position 295 und 332 gebildet. Für die Bindung von 2G12 an gp120 sollen neben den erwähnten Glykanen auch noch Glykane der Asparagine an den Positionen 392, 339 und 386 eine Rolle spielen [Sanders et al. 2002, Scalan et al. 2002]. 2F5 und 2G12 neutralisieren in vitro verschiedene T-Zell-adaptierte Viren [Purtscher et al 1994] und primäre Isolate der Subtypen A, B, C and E [Xu et al. 2001, Mascola et al. 1997, Purtscher et al. 1996, Trkola et al. 1996] sowie chimäre humane-simiane Immunodefizienz Viren (SHIV) [Li et al. 1998, Li et al. 1997]. In Kombination mit weiteren monoklonalen Antikörpern und HIV-Immunglobulin als passive Immunisierung konnte in vivo eine Infektion von Macaquen durch eine intravenöse oder mukosale Gabe von SHIV verhindert werden [Hofmann-Lehmann et al. 2002, Baba et al. 2000, Mascola et al. 2000, Mascola et al. 1999]. Zudem gibt es in ersten klinischen Studien der Phase 1 Hinweise darauf, dass die Gabe von 2F5 und 2G12 antivirale Effekte bei chronisch HIV-1-infizierten Patienten haben könnte [Stiegler et al. 2002].

3.6 Bestimmung der minimalen Wirkkonzentration

↓60

Vor der Durchführung der Transzytoseversuche wurde mittels des Synzythium-Inhibierungsassay die Wirkung der Antikörper auf die in den Transzytoseversuchen verwendeten Laborisolate von HIV-1 untersucht (siehe 2.3.8). Zur Bestimmung der minimalen Wirkkonzentration wurden die beiden monoklonalen Antikörper in verschiedenen Konzentrationen in den Synzythien-Inhibierungsassay (SIA) eingesetzt. Bei HIV-1IIIB konnte für 2F5 eine minimale Wirkkonzentration zwischen 1 und 5 µg/ml und für 2G12 von etwa 5 µg/ml ermittelt werden. Diese Konzentrationen stimmen mit den Literaturangaben überein. Zur 50 %igen Neutralisierung des Isolats HIV-1IIIB wird mit 2F5 1,6 µg/ml und mit 2G12 4,6 µg/ml im Synzythien-Inhibierungsassay benötigt (EC50-Werte) [Trkola et al. 1996, Purtscher et al. 1994]. Weder 2F5 noch 2G12 neutralisieren wie erwartet das HIV-1 Gruppe O Virusisolat. Aufgrund dieser Befunde und der Analyse der Aminosäuresequenz kann daher angenommen werden, dass diese Antikörper nicht an HIV-1 Gruppe O Viren binden. Die Untersuchungen der Inhibierung der Transzytose durch 2G12 oder 2F5 wurde aufgrund dieser Ergebnisse nur mit HIV-1IIIB durchgeführt.

3.6.1  Transzytose in Anwesenheit humaner monoklonaler Antikörper

Die Transzytoseversuche in Anwesenheit der jeweiligen humanen monoklonalen Antikörper wurden, wie im Kapitel 2.3.3 im Methodenteil beschrieben mit FL-Zellen und zum Teil mit CaCo-2-Zellen durchgeführt. Es zeigte sich eine deutlich geringere Transportrate durch CaCo-2-Zellen im Vergleich zu FL-Zellen, die folgend dargestellten Ergebnisse beziehen sich daher fast ausschließlich auf die Versuche mit FL-Zellen. Die mit CaCo-2-Zellen durchgeführten Versuche zeigten vergleichbare Ergebnisse. Der Einfluss der Antikörper auf die Transzytose wurde entweder in Ansätzen mit einer Inkubation der jeweiligen Antikörper mit HIV-1IIIB (Abbildung 13a) [Hocini et al. 2001] oder in Ansätzen mit einer Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den auf den Filtern gewachsenen FL-Zellen vor Beginn der Transzytose untersucht (Abbildung 13b) [Alfsen et al. 2001, Hocini et al. 1997].

Abb. 13: Schematische Darstellung der Versuchsdurchführungen a: Inkubation der jeweiligen Antikörper mit der Virussuspension vor Beginn der Transzytose, Start der Transzytose nach Überführen der Lösung ins obere Kompartiment, b: Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den epithelialen Zellen vor Beginn der Transzytose, die Transzytose wurde durch Zufügen der Virussuspension gestartet.

↓61

Bei den Versuchen mit einer Inkubation der Antikörper mit HIV-1IIIB vor Beginn der Transzytose wurden 20 µg der Antikörper mit einer 1:10-Verdünnung des Virusstocks für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Hierbei sollte eine Bindung der Antikörper an gp120 bzw. gp41 der HI-Viren erfolgen. Danach wurde die Lösung in das obere Kompartiment der mit Epithelzellen bewachsenen Filter gegeben und somit die Transzytose gestartet. Nach 120 Minuten wurde das Medium aus dem unteren Kompartiment entnommen und über RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und anschließender TaqMan™-PCR die Menge an transportierten Viruspartikeln bestimmt. Die Menge an transportierten infektiösen Virus der gleichen Probe aus dem unteren Kompartiment wurde durch Infektion von CEMx174-Zellen mit einer DNA-Extraktion nach 10 Tagen Kultivierung und anschließender TaqMan™-PCR ermittelt. Zu jedem Versuch wurde eine Kontrolle ohne Antikörper mitgeführt. Bei der Auswertung der Ergebnisse wurde die Menge an transportierten Partikeln und infektiösen Viren in der Kontrolle als 100 % Transzytose gesetzt und die Werte aus den parallel angesetzten Versuchen mit den Antikörpern darauf bezogen. Die Auswertung der Versuche ergab, dass in Anwesenheit von 2F5 der Transport von HIV-1 Partikeln nur um etwa 14% (86% ± 21%) reduziert wurde, die Versuche mit 2G12 dagegen ergaben keine Reduktion der Transportrate im Vergleich zur Kontrolle. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde in Anwesenheit von 2F5 die Menge an nachweisbaren infektiösen Viren im unteren Kompartiment auf 52% (± 26%) und in Anwesenheit von 2G12 auf 34% (± 18%) reduziert (Abb. 14). Diese Reduktion des Infektiösitätstiters lässt sich durch die neutralisierende Kapazität der Antikörper erklären.

Abb. 14: Einfluss der monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12 auf die Transzytose von HIV-1IIIB, Inkubation von HIV-1IIIB mit dem jeweiligen Antikörper vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben, K = Kontrolle. Die angegebenen Transzytoseraten sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.

Zusätzlich wurden die Versuche noch mit einer Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den FL-Zellen vor Beginn der Transzytose durchgeführt (Abb. 15). Hierbei wurde eine Lösung aus D-MEM mit 20 µg des jeweiligen Antikörpers ins obere Kompartiment gegeben. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C wurde durch Zugabe des Virusstocks die Transzytose gestartet. Im Weiteren wurden die Versuche wie oben beschrieben durchgeführt. Auch hier konnte nur in Anwesenheit von 2F5 eine geringe Reduktion des Transports an HIV-Partikeln (auf 78% ± 16%)) beobachtet werden, in Anwesenheit von 2G12 kam es zu keiner Reduktion. Eine Reduktion des Transportes an infektiösen HI-Viren zeigte sich bei beiden monoklonalen Antikörpern: bei 2G12 belief sie sich auf 71% (± 27%) und bei 2F5 auf 66% (± 26%). Aufgrund der Ergebnisse über den Transport an HIV-Partikeln in Anwesenheit der monoklonalen Antikörper kann davon ausgegangen werden, dass der Transport von HIV-1-Viruspartikeln durch Epithelzellen durch diese Antikörper nicht inhibiert werden kann. Die Reduktion des Titers an infektiösen Viren kann mit der neutralisierenden Wirkung der beiden monoklonalen Antikörper erklärt werden.

↓62

Abb. 15: Einfluss der monoklonalen Antikörper 2F5 und 2G12 auf die Transzytose von HIV-1IIIB, im Gegensatz zum Versuch in Abbildung 14 wurden erst die Zellen mit dem jeweiligen Antikörper inkubiert ehe die Versuche durch Zugabe von HIV-1IIIB gestartet wurden, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben, K = Kontrolle. Die angegebenen Transzytoseraten sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.

In den Untersuchungen von Kage et al. [Kage et al. 1998] wurde gezeigt, dass die an Antikörper gebundenen Zuckerseitenketten eine Hemmung des Virustransports bewirkte. Zur Untersuchung, welchen Einfluss der Glykoanteil der verwendeten monoklonalen Antikörper auf die Transzytose von HIV-1IIIB besitzt, wurden daher beide Antikörper mit N-Glycosidase F behandelt (siehe 2.3.9). Im Synzythien-Inhibierungsassay wurden die deglykosylierten Antikörper auf ihre neutralisierende Wirkung gegenüber HIV-1IIIB untersucht. Bei einer Konzentration von 20 µg deglykosylierter Antikörper pro Ansatz (gleiche Konzentration wie in den Transzytoseversuchen) konnte keine Veränderung der neutralisierenden Wirkung im Vergleich zu den jeweiligen unbehandelten Antikörpern festgestellt werden. Die deglykosylierten Antikörper wurden in die Transzytoseversuche mit einer Vorinkubation der Zellen mit den Antikörpern eingesetzt. Parallel wurden Antikörper nach dem gleichen Protokoll mit anschließender Dialyse nur ohne Zugabe der Glycosidase F behandelt und ebenfalls in die Transzytoseversuche eingesetzt. Als epitheliale Zellen wurden bei diesen Versuchen CaCo-2-Zellen verwendet. In der Abbildung 16 sind die Ergebnisse der Versuche dargestellt, da es sich bei den Versuchen nur um Doppelwerte handelt konnte keine Standardabweichung angegeben werden. Die Auswertung erfolgte über die Bestimmung der transportierten Partikel mit der TaqMan™-PCR. In Anwesenheit des nicht-deglykosylierten Antikörpers 2F5 wurde der Transport auf 75% und bei 2G12 auf 78% im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert. Wurden die Versuche mit den deglykosylierten Antikörpern durchgeführt, konnte kein Unterschied in der Transportrate zu den Kontrollen festgestellt werden. Die beobachtete Hemmung der Transzytose von Viruspartikeln durch die Antikörper beruht im Wesentlichen auf der Wirkung der Zuckerseitenketten.

Abb. 16: Einfluss von 2F5, 2F5 deglykosyliert (deglyk.), 2G12 und 2G12 deglykosyliert (deglyk.) auf den Transport von HIV-1IIIB, Inkubation der jeweiligen Antikörper mit den CaCo-2-Zellen vor Beginn der Transzytose, Ermittlung der Menge an transportierten HIV-Partikel über TaqMan™-PCR, K = Kontrolle.

3.7 Einfluss humaner Seren auf den Transport von Viren

3.7.1  Transzytose in Anwesenheit humaner Seren

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Die beiden neutralisierenden mAk waren nicht in der Lage den Transport von HIV-1-Partikeln durch epitheliale Zellen signifikant zu hemmen. Es stellte sich die Frage, ob humane, polyklonale Antikörper, die gegen die Oberflächenproteine von HIV gerichtet sind, die Transzytose beeinflussen. Um dieser Frage nachzugehen, wurden zwei Seren von HIV-infizierten Probanden ausgewählt, die im Western Blot deutliche Banden gegen gp120 aufwiesen. Da die Transzytose durch Serumbestandteile gehemmt werden kann, wurden parallel Versuche mit HIV-1 negativen Seren durchgeführt. Wie die Versuche mit den monoklonalen Antikörpern wurden auch hier die Versuche mit einer Vorinkubation der Viren (Abbildung 13a) bzw. der Zellen mit Serum (Abbildung 13b) vor Beginn der Transzytose angesetzt.

Für die Versuche mit vorheriger Inkubation von Serum und HIV-1IIIB wurden 30 µl Serum auf ein Gesamtvolumen von 300 µl eingesetzt (Abb. 17). Die jeweiligen Seren wurden mit einer 1:10 Verdünnung des Virusstocks in D-MEM versetzt und für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Im Weiteren wurden die Versuche wie im Kapitel 3.5.2 beschrieben durchgeführt.

Abb. 17: Einfluss von HIV-1 negativen (HIV-) und HIV-1 positiven (HIV+) Serum auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Inkubation von HIV-1IIIB mit dem jeweiligen Serum vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt, die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben. Zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten Viren in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100% Transzytose gesetzt. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.

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In Anwesenheit von HIV-1 negativem Serum wurde die Transzytose von HIV-1 Partikeln im Vergleich zur Kontrolle ohne Serum im Ansatz um etwa 15% reduziert. Durch vorherige Inkubation der Viren mit Serum HIV-1 infizierter Individuen konnte der Transport von HIV-1IIIB um etwa den Faktor 3,3 (auf 31%) im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne Serum reduziert werden. Setzt man die transportierten Viruspartikel in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100%, so reduziert sich in Anwesenheit von HIV-1 positiven Seren die Transzytoserate auf 36 ± 11%. Die Inhibierung der Transzytose in Anwesenheit von Serum HIV-1 infizierter Personen wurde bei Betrachtung der Reduktion des Transportes an infektiösen Viren deutlicher. In Anwesenheit positiver Seren konnte im unteren Kompartiment nur noch 0,06% der infektiösen Viren im Vergleich zu den Kontrollversuchen nachgewiesen werden, während in den Versuchen mit HIV-negativen Serum noch 52% ermittelt werden konnte.

Viel deutlicher wird die inhibierende Wirkung der Seren HIV-1 infizierter Individuen bei einer vorherigen Inkubation der Seren mit FL-Zellen bevor durch Zugabe des Virusstocks die Transzytose gestartet wurde. Hier konnte der Transport von HIV-1 Partikeln in Anwesenheit des negativen Serums auf 41% gesenkt werden, in Anwesenheit des positiven Serums auf 3%. Wird die Menge an transportierten Viruspartikeln in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100% Transzytose gesetzt, erhält man eine Reduktion des Transportes durch Serum HIV-1 infizierter Personen um etwa den Faktor 16 (auf 6 ± 1%, Abb. 18).

Abb. 18: Einfluss von HIV-1 negativen (HIV-) und HIV-1 positiven (HIV+) Serum auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Inkubation der FL-Zellen mit dem jeweiligen Serum vor Versuchsbeginn, die Menge an transportierten HIV-Partikeln wurde über die TaqMan™-PCR ermittelt und die Titerbestimmung erfolgte wie in Kapitel 2.3.6 beschrieben. Zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten Viren in den Versuchen mit HIV-1 negativen Seren als 100% Transzytose gesetzt. Die Angaben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Versuchen.

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Während bei den ermittelten Werten sich die beiden verwendeten Seren in der Inhibierung nicht unterscheiden, gibt es hier bei der Reduktion des Titers an infektiösen Viren unterschiedliche Ergebnisse. Serum 1 (99-3090) inhibierte den Transport um den Faktor 500, während der Faktor bei Serum 2 (01-0163) noch höher war und kein Virus mehr nachgewiesen werden konnte. HIV-negatives Serum inhibierte den Transport infektiöser Viren nur um etwa Faktor 2. Die Inhibition durch die Normalseren könnte wieder auf die Anwesenheit der Glykoseitenketten der im Serum vorhandenen Proteine zurückzuführen sein. Ein Erklärungsansatz für die Inhibierung des Transportes in Anwesenheit von Seren HIV-1 infizierter Personen wäre das Vorhandensein von polyklonalen Antikörpern, die gegen die in den Transport von HIV-1 durch Epithelzellen involvierte Domäne auf gp120 gerichtet sind. Für die Transzytoseversuche wurden Seren verwendet, die über deutliche Mengen an Antikörpern gegen gp120 - gemessen im Western Blot - verfügen, unabhängig vom Infektionszeitpunkt und –stadium des Patienten. Zur Klärung der Frage, ob und zu welchen Zeitpunkt der Infektion diese Antikörper gebildet werden, wurden die Transzytoseversuche mit Plasmen einer dokumentierten Serokonversion und mit Seren zweier Langzeitinfizierter LTNP (= Long Term Non-Progressor) durchgeführt. LTNP- Seren wurden nach folgenden Kriterien ausgesucht: 1. bekannter Infektionszeitpunkt (sogenannter „Follow-up“) 2. deutliche Reaktion der Antikörper im Western Blot gegen gp41, gp120 und gp160 und 3. kein nachweisbares p24-Antigen. Die Tabelle 20 zeigt die Western Blot- (Genelab® HIV-1 Western Blot) und ELISA-Ergebnisse (Murex HIV-ELISA) der verwendeten Seren bzw. Plasmen sowie die Viruslast.

Tab. 20: Western Blot, ELISA-Daten und Viruslast der Serokonversion (Plasmen A bis E) bzw. Langzeitinfizierten (LTNP).

A

B

C

D

E

LTNP

gp 41 Abs

+

gp 120 Abs

((+))

(+)

+

gp 160 Abs

(+)

+

+

+

p 24 Abs

(+)

+

+

+

+

((+))

p 24 Ag

+

+

ELISA

((+))

+

+

+

+

Viruslast

1,8x105

2,9x106

1,3x105

1,1x105

nb

Die Bestimmung der Viruslast erfolgte in der TaqMan™-PCR nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese (Angabe der Viruslast in Kopien/ml Plasma), Abs = Antikörper, Ag = Antigen, nb = nicht bestimmt, A-E = Seren einer dokumentierten Serokonversion in der Reihenfolge ihrer Abnahme, LTNP = Seren von „Long-Term Non-Progressor“, + = positiv/reaktiv, (+) = schwach positiv/reaktiv, ((+)) = fraglich, — = negativ.

Bei Plasma A bis E handelt es sich um eine dokumentierte Serokonversion in Reihenfolge der Abnahme und bei LTNP um die Seren Langzeitinfizierter. Zur Viruslastbestimmung wurden aus dem Pellet von 200 µl des jeweiligen Plasmas nach Zentrifugation für 90 Minuten bei 15.800xg die RNA extrahiert, in cDNA umgeschrieben und zur Quantifizierung in die HIV-1 Gruppe M env-TaqMan™-PCR eingesetzt. Die ermittelten Kopienzahlen wurden auf 1 ml Plasma umgerechnet. Aufgrund der deutlicheren Inhibierung des HIV-Partikeltransportes in den bisher durchgeführten Versuchen wurde nur die Menge an transportierten Viruspartikeln über die TaqMan™-PCR bestimmt. In der Abbildung 19 sind die Ergebnisse der Transzytosen in Anwesenheit der Plasmen der Serokonversion (A-E) und der Seren zweier Langzeitinfizierter (LTNP1 und 2) veranschaulicht. In der Darstellung wurde die Menge an transportierten HIV-Partikeln in den Ansätzen mit HIV-negativen Serum als 100%-Transzytose gesetzt und die Werte der übrigen Seren oder Plasmen darauf bezogen.

↓66

Abb. 19: Einfluss von Plasmen einer dokumentierten Serokonversion (A bis E) und von Seren zweier Langzeitinfizierter (LTNP1 und 2) auf den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, zur Auswertung der Versuche wurde die Menge an transportierten HIV-1-Partikeln (Bestimmung über TaqMan™-PCR) im Vergleich zu HIV-negativen Serum bestimmt (nS = 100%-Transzytose). Bei den angegeben Werten handelt es sich um Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.

Es wurden Plasmen der Serokonversion eingesetzt, die weder über eine Viruslast noch über Antikörper gegen HIV-1 verfügen (Plasma A), die über eine Viruslast aber nicht über Antikörper gegen die Hüllproteine von HIV-1 verfügen (Plasma B) und die über eine Viruslast und unterschiedliche Mengen an Antikörpern gegen die Hüllproteine verfügen (Plasma C, D und E). Plasma A inhibierte die Transzytose erwartungsgemäß nicht im Vergleich zum HIV-1 negativen Serum. Plasma B inhibierte die Transzytose geringfügig, aber nicht signifikant (auf 81 ± 3%). Plasma C, D und E hemmten die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen signifikant (zwischen 80 und 97 % Hemmung), jedoch nicht so deutlich, wie die Seren der Langzeitinfizierten (99,4 ± 1%). Während die Seren der Serokonversion über eine geringe Menge an Antikörpern gegen gp120 verfügen, wurden die Seren Langzeitinfizierter nach dem Kriterium ausgewählt, eine deutliche gp120-Bande im Western Blot zu besitzen. Bei der Auswertung der Versuche mit den Plasmen der Serokonversion muss jedoch beachtet werden, dass die Plasmen unterschiedliche Mengen an freien Viren gemessen mit der TaqMan™-PCR nach RNA-Extraktion aus den jeweiligen Plasmen beinhalten. Durch die in den Plasmen vorkommenden Viren bzw. vorkommendes freies gp120 könnte die gemessene Inhibierung der Transzytose ebenfalls erklärt werden. Die Ergebnisse der Transzytoseversuche mit Plasma B zeigten jedoch, dass die relativ hohe Viruslast von 1,8x105 Kopien/ml keinen signifikanten Einfluss auf die Transportrate in den durchgeführten Transzytoseversuchen besitzt. Durch dieses Ergebnis kann die signifikante Inhibierung der Transzytose durch die Plasmen C (Viruslast 2,9x106 Kopien/ml), D (Viruslast 1,3x105 Kopien/ml) und E (Viruslast 1,1x105 Kopien/ml) durch die vorhandenen Antikörper gegen gp120 und gp160 erklärt werden. Die Auswertung der Versuche hat gezeigt, dass Seren bzw. Plasmen der frühen als auch der späten Infektionsphase die Transzytose von HIV-1 inhibieren können. Es konnte durch die Untersuchung von Serum oder Plasma der Serokonversion gezeigt werden, dass schon früh nach Infektion Antikörper entwickelt werden, die gegen die Domäne auf gp120 gerichtet sind, die an dem Transport von HIV-1 durch Epithelzellen beteiligt ist. Zudem kann mit den Probenpanel des Serokonverters, welches sowohl Seren ohne Antikörper gegen gp120 und ohne Inhibierungseffizienz als auch Seren mit Antikörpern gegen gp120 und mit einer Inhibierungseffizienz beinhalten, ausgeschlossen werden, dass Bestandteile in den Seren die Transzytose von HIV-1 durch epitheliale Zellen unspezifisch hemmen.

3.7.2 Untersuchung der Seren und Plasmen auf neutralisierende Antikörper

Nachdem eine inhibierende Wirkung der Seren HIV-infizierter Personen nachgewiesen werden konnte, wurden die Seren auf Anwesenheit neutralisierender Antikörper untersucht. Hierzu wurde der Synzythien-Inhibierungsassay SIA, wie im Methodenteil unter 2.3.8 beschrieben, durchgeführt. Es wurden alle in den Transzytoseversuchen verwendeten Seren – negative und positive – in den SIA eingesetzt. Dabei wurden die Patientenseren nur auf neutralisierende Antikörper gegen HIV-1IIIB getestet. In nur einem Serum eines Langzeitinfizierten konnten neutralisierende Antikörper gegen HIV-1IIIB nachgewiesen werden. Alle anderen besitzen wie erwartet keine im SIA nachweisbaren neutralisierenden Antikörper gegen das verwendete HIV-1 Isolat. Die Ergebnisse des SIA zeigen, dass unter Berücksichtigung der Annahme, dass die Inhibierung der Transzytose auf das Vorhandensein von spezifischen gegen das in den Transport involvierte Epitop gerichtete Antikörper beruht, diese inhibierenden Antikörper keine neutralisierende Wirkung auf HIV-1IIIB besitzen. Sowohl die Untersuchungen mit den neutralisierenden, monoklonalen Antikörpern als auch mit Seren HIV-Infizierter belegen, dass neutralisierende Epitope und die postulierte am Transport beteiligte Domäne auf gp120 unterschiedliche Strukturen auf gp120 darstellen.

3.8 Expression von gp120 in unterschiedlichen Expressionssystemen

↓67

Es sollten die Epitope, welche die Transzytose von HIV-1IIIB vermitteln, auf gp120 lokalisiert werden. Die Arbeit von Kage et al. [Kage et al. 1998] hat gezeigt, dass aufgereinigtes gp120 aus Kulturüberständen HIV-infizierter Zellen gekoppelt an Mikrobeads durch Epithelzellen transportiert wird. Diese Beobachtung sollte zur Identifizierung der für den Transport von HIV-1 durch epitheliale Zellen verantwortlichen Domäne auf gp120 herangezogen werden. Hierfür sollte rekombinantes gp120 in unterschiedlichen Expressionssystemen hergestellt werden. Durch Expression in E. coli erhält man unglykosyliertes gp120, im Baculovirussystem oder nach Expression in Säugerzellen glykosyliertes gp120. Nach Kopplung an fluoreszierende Mikrobeads sollte untersucht werden, ob die mit unglykosylierten bzw. glykosylierten gentechnisch hergestellten gp120 beladenen Mikrobeads durch Epithelzellen transportiert werden. Es sollte mit dem Expressionssystem weiter gearbeitet werden, bei dem das an Mikrobeads gekoppelte rekombinante gp120 den Transport durch epitheliale Zellen initiieren kann. Nach gezielter Mutagenese sollten dann die exprimierten Proteine gereinigt, an Beads gekoppelt und in Transzytoseversuche eingesetzt werden.

3.8.1  Expression von gp120 in E. coli

Mittels PCR wurde das env-Fragment amplifiziert und in das Plasmid pQE 90s kloniert. Nach Überprüfung durch Sequenzierung wurde der Klon, welcher die vollständige und korrekte env-Sequenz enthielt, zur Proteinexpression eingesetzt. Die Expression von gp120 wurde mit Hilfe des Western Blots (siehe 2.2.1.14) untersucht. Anschließend wurde gp120 über den His-Tag unter denaturierenden und nativen Bedingungen über eine Nickelsäule aufgereinigt. Die Menge an gp120 aufgereinigt unter nativen Bedingungen (1000 ml Ansatz, Proteinmenge unter der Nachweisgrenze) war so gering, dass eine Kopplung an Mikrobeads nicht möglich war. Eine Kopplung an Mikrobeads erfolgte nur mit dem unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigtem gp120. Hier lag die Ausbeute aus einem 500 ml Ansatz bei 340 ng aufgereinigtem Protein. Die gekoppelten Mikrobeads wurden anschließend in die Transzytoseversuche eingesetzt. Die Versuche wurden wie im Kapitel 2.3.3 beschrieben durchgeführt, anstelle von zellfreien Viren wurden die gekoppelten Mikrobeads eingesetzt. Als Kontrolle dienten Glycin-gekoppelte Beads. Nach Beendigung der Transzytose nach 120 Minuten wurde das Medium im unteren Kompartiment entnommen und die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzphotometer (TECAN SPECTRAFluor Plus, Extinktionsfilter 535 nm, Emissionsfilter 595 nm) bestimmt. Ebenso wurden die Ausgangsfluoreszenz und die Fluoreszenz im oberen Kompartiment nach Ablauf des Versuchs ermittelt. Die Versuche ergaben, dass weder die Glycin-gekoppelten noch die gp120-gekoppelten Beads durch die Epithelzellen transportiert wurden. Das unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigte gp120 kann den Transport durch Epithelzellen nicht initiieren. Eine Durchführung der Versuche mit nativen gp120 war aufgrund der geringen Ausbeute nicht möglich. Auch durch Wechsel des Plasmids und Klonierung des env-Fragmentes in pASK-IBA-Vektoren mit der Möglichkeit der Aufreinigung über einen Strep-Tag® konnten keine ausreichenden Mengen nicht denaturiertes gp120 hergestellt werden.

3.8.2 Expression von gp120 im Baculovirussystem

Nach der Klonierung des env-Fragmentes in pFast His und pTriEx 3 wurden die Plasmide zur Expression ins Rheumaforschungszentrum gegeben. Die mit Baculovirus infizierten Insektenzellen (Sf9) wurden im Robert Koch-Institut auf die Expression von gp120 mit Hilfe des Western Blots untersucht. Es konnte in den Zellen zwar gp120 nachgewiesen werden, jedoch erwies sich hier ebenfalls die Aufreinigung als Problem. Es war nicht möglich unter nativen Bedingungen ausreichende Mengen an Protein aufzureinigen.

3.8.3 Expression von gp120 in Säugerzellen

↓68

Die Expression von gp120 in Säugerzellen wurde mit unterschiedlichen Plasmiden in unterschiedlichen Zelllinien durchgeführt, um ein System mit einer möglichst hohen Ausbeute an rekombinanten gp120 zu erhalten. Die Zellen wurden mit Hilfe der APAAP (Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase)-Methode und des Western Blots auf Expression von gp120 untersucht. Hier lag die Expressionsrate deutlich unter den Expressionsraten der anderen Expressionssysteme. Aufgrund der geringen Expression und der Probleme bei der Aufreinigung über His-Tag oder Strep-Tag® konnte auch hier nicht genügend natives gp120 zur Kopplung an Mikrobeads aufgereinigt werden.

Die Untersuchung der für den Transport durch die Epithelzellen verantwortlichen Bereiche auf gp120 über gentechnisch hergestelltem und mutiertem gp120 war aufgrund der geringen Ausbeute bei der Aufreinigung unter nativen Bedingungen in den verwendeten Expressionssystemen nicht möglich.

3.9 Identifizierung der in den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen involvierten Domäne auf gp120

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Oligopeptide, die sich von der Sequenz des gp120 ableiten, in der Lage sind, den Transport von HIV-1 durch Zellen zu inhibieren. Im Rahmen des Europäischen Verbundes war es möglich beim EU Programme EVA/MRC Centralised Facility for AIDS Reagents; NIBSC, UK überlappende Peptide (20-mer) von HIV-1 gp120 (Grant Number QLK2-CT-1999-00609 and GP828102) zu erhalten.

3.9.1  Überlappende Oligopeptide von HIV-1

↓69

Die überlappenden Oligopeptide (Bestellnummern ARP7035 und ARP740) basieren auf den Aminosäuresequenzen von gp120 zweier verschiedener HIV-1 Isolate. Ein Satz Oligopeptide besteht aus 47 (ARP740.1-.47) bzw. 48 (ARP7035.1-.48) Peptiden mit einer Länge von 20 Aminosäuren, die jeweils mit einem Bereich von 10 Aminosäuren überlappen. Die Aminosäuresequenz der Oligopeptide ARP740 (Tabelle 28 im Anhang) leiten sich von der Aminosäuresequenz des HIV-1 Subtyp B-Isolates HxB2-1A ab. Bei ARP7035 basiert die Sequenz auf dem molekularen Klon ACH320.3.1/W61D aus dem Dutchfield Isolat von HIV-1 (ACH320). Pro Oligopeptid wurde 1 mg geliefert und daraus eine Stocklösung mit einer Konzentration von 10 mM in DMSO hergestellt. In die Transzytoseversuche wurden zunächst nur die Oligopeptide des HxB2-1A-Isolats (ARP740.n) eingesetzt, da hier die größte Homologie zum verwendeten HIV-1IIIB-Laborisolat vorlag. Im Bereich von gp120 besteht zwischen den aus den Oligopeptiden gebildeten Aminosäuresequenz und der von HIV-1IIIB [Wain-Hobson et al. 1985] eine Homologie von etwa 90%.

3.9.2 Transzytose in Anwesenheit der Oligopeptide ARP740

Aus Praktikabilitätsgründen wurden die Oligopeptide in zehn Gruppen (Pools) mit in der Regel fünf aufeinander folgenden Oligopeptiden unterteilt (Tabelle 21) und jeder Pool in die Transzytoseversuche eingesetzt. Die in der Tabelle 21 unterstrichenen Oligopeptide konnten nicht in DMSO gelöst werden und wurden daher nicht untersucht. Die Transzytoseversuche wurden mit FL-Zellen wie im Kapitel 2.3.3 beschrieben durchgeführt. Zu Beginn der Versuche wurden die Zellen mit den jeweiligen Pools zur Absättigung der für den Transport wichtigen Rezeptoren für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.

Tab. 21: Einteilung der Oligopeptide ARP740 in die verschiedenen Pools.

Pool

Nummer der Oligopeptide

Pool

Nummer der Oligopeptide

1

ARP740.1, .2, .3, .4, .5

6

ARP740.26, .27, .28, .29, .30

2

ARP740.6, .7, .8, .9, .10

7

ARP740.31, .32, .33, .34, .35/36

3

ARP740.11, .12, .13, .14, .15

8

ARP740.37, .38, .39, .40

4

ARP740.16, .17, .18, .19, .20

9

ARP740.41, .42, .43, .44, .45

5

ARP740.21, .22, .23, .24, .25

10

ARP740.46, .47

Unterstrichene Oligopeptide ließen sich nicht in DMSO lösen und wurden daher nicht in die Versuche eingesetzt.

↓70

Die Endkonzentration der einzelnen Oligopeptide im Versuchsansatz war 20 µM, die von DMSO 1%. In Vorversuchen wurde gezeigt, dass 1 % DMSO im Kulturmedium von den FL-Zellen toleriert wurde und keinen Einfluss auf den Transport von Viren hat. Die Transzytose wurde durch Zugabe von HIV-1IIIB gestartet und jeweils nach 120 und 240 Minuten das Medium aus dem unteren Kompartiment abgenommen und die transportierte Virusmenge über eine Endstufentitration bestimmt. Parallel zu den Versuchsansätzen mit Oligopeptiden wurden Kontrollen mit 1% DMSO durchgeführt. Die in den Kontrollansätzen ermittelte Menge an transportierten Viren wurde als 100%-Transzytose gesetzt und die in den Versuchsansätzen ermittelten Werte darauf bezogen. Die Abbildung 20 fasst die Ergebnisse der Versuche mit den einzelnen Oligopeptidpools zusammen. In Anwesenheit des Oligopeptidpools 7 konnte der Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen auf 12 ± 1% des Transportes in den Kontrollansätzen reduziert werden, in Anwesenheit des Oligopeptidpools 8 sogar auf 5 ± 2%. Die Ergebnisse zeigen, dass die Oligopeptide der Pools 7 und 8 in der Lage sind, den Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen signifikant zu inhibieren.

Abb. 20: Einfluss von gp120-Oligopeptiden auf die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollansatz ohne Oligopeptide (100% Transzytose) nach 240 Minuten, Auswertung über Endstufentitration des Mediums im unteren Kompartiment, K = Kontrolle, Ziffern 1 – 10 = Oligopeptidpools (siehe Tabelle 21). Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von wenigstens drei unabhängigen Versuchen.

Die Ergebnisse aus der Titration konnten mit den Ergebnissen aus der TaqMan™-PCR bestätigt werden (Tabelle 22), wobei die gemessenen Werte eine noch deutlichere Inhibierung nachwiesen.

↓71

Tab. 22: Ergebnisse der Transzytosen von HIV-1IIIB in Anwesenheit der Oligopeptidpools 7 und 8 aus ARP740.

Probe

Kopien/ µl

%-Transcytose

%-Inhibierung

Kontrolle

1,6x102

100

0

Oligopeotidpool 7

1,5x101

8 ± 6

92± 6

Oligopeptidpool 8

2,4x100

1 ± 1

99 ± 1

Angabe der gemessenen Kopienzahl/µl im unteren Kompartiment nach 240 Minuten, Auswertung über TaqMan™-PCR.

Zur weiteren Charakterisierung der beiden inhibierenden Pools wurden die Oligopeptidpools 7 und 8 in ihre einzelnen Oligopeptide aufgesplittet und einzeln in die Transzytose eingesetzt. Vor Beginn der Transzytose wurden die FL-Zellen mit 100 µM der jeweiligen Oligopeptide für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die weitere Durchführung und Auswertung erfolgte wie oben beschrieben. Aufgrund der guten Übereinstimmung zwischen den ermittelten Werten durch Endstufentitration und TaqMan™-PCR wurde auf die zeitaufwendige Titration im folgenden verzichtet und die Versuche ausschließlich über die TaqMan™-PCR ausgewertet. Die Abbildung 21 zeigt die grafische Darstellung der Ergebnisse.

Durch Vorinkubation der Zellen mit einzelnen Oligopeptiden aus gp120 kann die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen signifikant inhibiert werden. Dabei reduzierte das Oligopeptid ARP740.34 den Transport von HIV-Partikeln auf 8 ± 2%, ARP740.35/36 auf 5 ± 3% und ARP740.38 auf 6 ± 0,5% bezogen auf die Kontrollversuche ohne Oligopeptid. Die Oligopeptide ARP740.34 und ARP740.35/36 waren in Pool 7 und ARP740.38 im Pool 8 enthalten.

↓72

Abb. 21: Einfluss der einzelnen Oligopeptide der Oligopeptidpools 7 und 8 (siehe Tabelle 21) auf die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollansatz ohne Oligopeptide (100% Transzytose) nach 240 Minuten, Auswertung über TaqMan™-PCR nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese aus Medium im unteren Kompartiment, K = Kontrolle, Ziffern 31-40 = einzelne Oligopeptide ARP740, angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen. 100%-Transzytose entsprechen 4x103 Kopien/µl.

In den darauf folgenden Versuchen wurden die Oligopeptide 34, 35/36 und 38 gemeinsam in die Transzytose eingesetzt. Hierbei wurde auch das zwischen den inhibierenden Oligopeptiden liegende Oligopeptid ARP740.37 mit einbezogen. Die Durchführung erfolgte wie beschrieben, auch hier wurde über die TaqMan™-PCR ausgewertet. In Anwesenheit der Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38 konnte der Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen um den Faktor 11 (auf 9% ± 3%) im Vergleich zur Kontrolle inhibiert werden (Abbildung 24).

Anhand dieser Ergebnisse wurde die Aminosäuresequenz ermittelt (Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38, Abb. 22). Die Sequenz basierend auf der Sequenz von ARP740, im weiteren Env362-420 genannt, sieht wie folgt aus:

↓73

Abb. 22: Aminosäuresequenz der den Transport inhibierenden Domäne auf gp120, abgeleitet von ARP740, dargestellt sind zusätzlich die einzelnen inhibierenden Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38, aus denen sich die Sequenz von Env362-420 zusammensetzt.

Der Aminosäuresequenz der Oligopeptide ARP740 liegt eine definierte Sequenz eines HIV-1 Subtyp B-Isolats zugrunde. Die Oligopeptide ARP7035 basieren auf der Aminosäuresequenz eines weiteren HIV-1 Subtyp B-Isolats, welche nur eine 75%ige Homologie gegenüber ARP740 im Bereich der inhibierenden Oligopeptide aufweist. Es kommt auf einer Länge von 59 Aminosäuren zu 9 Aminosäureaustauschen und 6 Deletionen. Die Abbildung 23 zeigt die Aminosäuresequenzen der korrespondierenden Oligopeptide aus ARP7035 der Aminosäuresequenz von Env362-420 gegenübergestellt.

Abb.23: Sequenzvergleich der inhibierenden Oligopeptide aus ARP740 (Env362420) und ARP7035, grau unterlegte Buchstaben bedeuten Aminosäureaustausch und grau unterlegte Striche (-) Deletionen, oberhalb der Env362-420-Sequenz sind die einzelnen Oligopeptide ARP740.34 bis ARP740.38, von denen die Sequenz von Env362-420 abgeleitet wurde und unterhalb der korrespondierenden Sequenz aus ARP7035 sind die dazugehörigen Oligopeptide ARP7035.34 bis ARP7035.38 dargestellt.

↓74

Zwischen der Aminosäuresequenz des verwendeten HIV-1IIIB-Laborisolats und der Sequenz der Oligopeptide ARP7035 besteht im Bereich der inhibierenden Oligopeptide eine Homologie von nur 56%, bei ARP740 liegt im Bereich der inhibierenden Oligopeptide eine Homologie von 100% vor. Durch Versuchsansätze mit den korrespondierenden Oligopeptiden aus ARP7035 sollte nun überprüft werden, ob auch hier eine Inhibierung der Transzytose erfolgt. Diese Untersuchungen zeigten, dass auch hier eine inhibierende Wirkung vorhanden ist. In Anwesenheit der Peptide konnte der Transport gegenüber der Kontrolle auf 11 ± 5% reduziert werden (Abbildung 24).

Für weitere Untersuchungen wurde ein Peptid der Aminosäuresequenz von Env362-420 (ARP740.34-.38), das durch Auftragssynthese hergestellt wurde, verwendet.

3.9.3 Transzytose in Anwesenheit des Peptids Env362-420

Das Peptid Env362-420 wurde zur Herstellung einer Stocklösung von 10 mM in DMSO gelöst und in einer Konzentration von 100 µM in die Transzytoseversuche eingesetzt. Die Versuche wurden wie mit den Oligopeptiden beschrieben durchgeführt.

↓75

Abb. 24: Inhibierung der Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen in Anwesenheit von Env362-420 (100 µM) im Vergleich zu den Inhibierungen in Anwesenheit der inhibierenden Oligopeptide aus ARP740 und ARP7035, Auswertung über TaqMan™-PCR, Angabe in %-Transzytose bezogen auf Kontrollversuche ohne Oligopeptid bzw. Peptid, 100% Transzytose entsprechen 4x102 Kopien/µl. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) wenigstens dreier unabhängiger Versuche.

In Anwesenheit des Peptids konnte der Transport von HIV-1IIIB durch Amnionzellen im Vergleich zur Kontrolle ohne Peptid auf 9% ± 1% reduziert werden (Abbildung 24). Diese Reduktion entspricht der Reduktion, die in Anwesenheit der Oligopeptide ARP740.34 bis .38 erreicht werden konnte.

3.9.4 Transzytose durch CaCo-2 Zellen in Anwesenheit des Peptids Env362-420

Zur Untersuchung, ob es sich bei der Inhibierung des Transportes von HIV-1 durch FL-Zellen in Anwesenheit von Env362-420 nicht um eine zellspezifische Inhibierung handelt, wurden Transzytoseversuche mit CaCo-2 als weitere Epithelzelllinie durchgeführt. Der Versuchsaufbau wurde ansonsten nicht verändert. Durch Vorinkubation der CaCo-2 Zellen mit Peptid konnte der Transport von HIV-1IIIB um den Faktor 20 (5 ± 1%) im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne Peptid reduziert werden (Abbildung 25). Die Versuche zeigten, dass die Rezeptoren sowohl auf FL- als auch auf CaCo-2 Zellen, die den Transport von HIV-1 durch Epithelzellen initiieren, von Env362-420 blockiert werden können.

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Abb. 25: Transzytose von HIV-1IIIB durch CaCo-2-Zellen in Anwesenheit von Env362-420, Auswertung über TaqMan™-PCR, Mittelwerte mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei Versuchen

3.9.5 Einfluss des Peptids Env362-420 auf die Infektiösität

Zur Untersuchung des Einflusses von Env362-420 auf die Infektiösität wurden Versuche wie im Methodenteil unter 2.3.10 beschrieben durchgeführt. Es wurden pro Versuch je zwei Ansätze mit Peptid und zwei Kontrollansätze mit 1% DMSO angesetzt. Nach Inkubation der CEMx174-Zellen mit Env362-420 oder mit DMSO wurden die Zellen mit HIV-1IIIB für 60 min inkubiert. Anschließend wurden diese Zellen abzentrifugiert und eine Verdünnungsreihe hergestellt. Zu den einzelnen Verdünnungsstufen wurden dann nicht-infizierte CEMx174-Zellen hinzugegeben. Nach 11 Tagen wurde der Versuch ausgewertet und die Entwicklung des cythopatischen Effekts (CPE) in den Kontrollansätzen mit der Entwicklung in den Ansätzen mit Env362-420 verglichen. Es konnte in allen Versuchsansätzen keine Reduktion der infizierten Zellen gegenüber der Kontrolle festgestellt werden. Env362-420 hat somit keinen nachweisbaren Einfluss auf die Infizierbarkeit der CD4+ CEMx174-Zellen.

3.9.6 Inhibition der Transzytose von anderen HIV-1 Subtypen

Der Transport von HIV-1IIIB durch FL-Zellen kann durch das Peptid Env362-420 inhibiert werden. Die Versuche, die zur Identifizierung dieser Domäne geführt haben, wurden mit Oligopeptiden des HIV-1 Subtyp B Isolats HxB2-1A und einem Virusstock des HIV-1 Subtyps B (HIV-1IIIB: Isolat Bru Acc. Nr. K02013) durchgeführt. Zwischen der Aminosäuresequenz der Oligopeptide und der des Virusstocks liegt im Bereich von gp120 die Sequenzhomologie bei 90% und im Bereich von Env362-420 bei 100%. Aufgrund der hohen Sequenzdiversität im env-Gen von HIV-1, stellt sich nun die Frage, ob eine subtypen- und gruppenübergreifende Inhibierung des Transportes von HIV-1 durch FL-Zellen in Anwesenheit des Peptids möglich ist. Zunächst wurde die Aminosäuresequenz von Env362-420 mit den Konsensussequenzen ausgewählter HIV-1 Gruppe M Subtypen und der Konsensussequenz von HIV-1 Gruppe O verglichen. Die Konsensussequenzen wurden der Datenbank HIV Sequence Database (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html) entnommen. Die Sequenzvergleiche wurden mit dem Blast-Programm über die NCBI-Homepage (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html) durchgeführt. In der Abbildung 26 sind die Ergebnisse der Aminosäuresequenzvergleiche unter Angabe der Sequenzhomologie dargestellt. Env362-420 besitzt eine Sequenzhomologie von 81% zur Konsensussequenz von HIV-1 Subtyp B und zur Konsensussequenz der HIV-1 Gruppe M von 67%. Die Sequenzvergleiche zu den übrigen Subtypen der HIV-1 Gruppe M ergaben eine Homologie von nur 57% zur Konsensussequenz von Subtyp G und reichten bis zu einer Homologie von 71% zur Konsensussequenz von Subtyp D.

↓77

Abb. 26: Aminosäuresequenzvergleiche zwischen Env362-420 und der Konsensussequenz der HIV-1 Gruppe M, den Konsensussequenzen ausgewählter HIV-1 Gruppe M Subtypen und der Konsensussequenz der HIV-1 Gruppe O mit Angabe der Sequenzhomologie in %, grau unterlegt sind die über alle Konsensussequenzen konservierten Aminosäuren, gelb unterlegt sind die zusätzlich über die Konsensussequenzen der Gruppe M konservierten Aminosäuren (. = gleiche Aminosäure wie Env362-420, - = Deletion im Vergleich zu Env362-420).

Env362-420 überspannt einen zwischen den einzelnen Subtypen und Gruppen stark variablen Bereich, die V4-Region. Die V4-Region gehört zu den hypervariablen Domänen von gp160, die über einen Anteil an konservierten Aminosäuren von weniger als 30% verfügen [Starcich et al. 1986, Willey et al. 1986]. Die V4-Region wird eingegrenzt von den konservierten Domänen C3 und C4 [Modrow et al. 1987]. In der Abbildung 27 ist die Lokalisation von Env362-420 auf der Aminosäuresequenz von gp120 schematisch dargestellt.

Abb. 27: Schematische Darstellung der Lokalisierung des Peptids Env362-420

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Zur Überprüfung, ob durch Env362-420 auch eine subtypübergreifende Inhibierung des Transportes möglich ist, wurden Transzytoseversuche mit unterschiedlichen HIV-1 Gruppe M Subtypen und einem Vertreter der HIV-1 Gruppe O durchgeführt. Bei den verwendeten Viren handelt es sich um auf PBMCs (periphere Blut-Monozyten) angezüchtete Virusstocks. Die Durchführung erfolgte wie beschrieben. Pro Subtyp wurden mindestens drei Versuche mit Peptid und drei Versuche ohne Peptid durchgeführt. Die Ermittlung der transportierten Viren erfolgte ausschließlich über die quantitative TaqMan™-PCR, da die überwiegende Mehrzahl der Virusisolate nicht auf permanenten Zellen wächst. In der Abbildung 28 sind die Ergebnisse der Transzytoseversuche mit den unterschiedlichen Subtypen in Anwesenheit von Env362-420 grafisch dargestellt. Eine Zuordnung der Transzytoseergebnisse zu den jeweils eingesetzten Virusisolaten mit Isolatbezeichnung findet sich im Anhang unter Tabelle 29 Zur Einschätzung des Inhibierungspotentials des Peptids gegenüber den HIV-1 Gruppe M- und Gruppe O-Isolaten wurde der Grafik die Inhibierung des Transportes von HIV-1IIIB (Subtyp B) ebenfalls zugefügt. Bei der Auswertung der Versuche zeigte sich, dass in Anwesenheit von Env362-420 die Transzytosen der in den Versuchen verwendeten HIV-1 Gruppe M- und HIV-1 Gruppe O-Isolaten durch FL-Zellen inhibiert werden kann. Aufgrund der Aminosäuresequenzunterschiede zwischen den Sequenzen der verwendeten Viren und Env362-420 ist die Inhibierungseffizienz der Transzytose der Non-B Subtypen mindestens um den Faktor 2,6 und maximal um den Faktor 7 schlechter als mit HIV-1 Subtyp B.

Abb. 28: Ergebnisse der Transzytoseversuche in Anwesenheit von Env362-420 mit verschiedenen HIV-1 Gruppe M und Gruppe O Isolaten durch FL-Zellen, dargestellt ist die prozentuale Transzytose bezogen auf die jeweiligen Kontrollversuche mit dem gleichen Subtyp, Auswertung über TaqMan™-PCR. Bei DI handelt es sich um das Isolat 3971/95 und bei DII um das Isolat 92UG024 des Subtyps D, K = Kontrolle, Angabe von Mittelwerten mit Standardabweichung (Fehlerbalken) von mindestens drei unabhängigen Ansätzen, bei den Isolaten DII, G und O ist keine Angabe der Standardabweichung möglich, da es sich hier nur um Doppelwerte handelt.

Da die Aminosäuresequenzen der verwendeten Viren des Subtypenpannels nicht mit den Konsensussequenzen übereinstimmen, sind in Abbildung 29 die Aminosäuresequenzabgleiche zwischen Env362-420 und den verwendeten Virusisolaten unter Angabe der Sequenzhomologie aufgeführt. Die Sequenzen der einzelnen Isolate wurden, soweit sie vorlagen, der Datenbank (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html) entnommen oder in der eigenen Arbeitsgruppe von Frau Dr. C. Kücherer sequenziert (Sequenzen freundlicherweise von Frau Dr. C. Kücherer zur Verfügung gestellt).

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Abb. 29: Aminosäuresequenzvergleich zwischen den verwendeten Virusisolaten und dem Peptid Env362-420 (= Subtyp B), mit Angabe der Sequenzhomologie, grau unterlegt sind die über alle Isolate konservierten Aminosäuren.

Es ist an den Ergebnissen nicht zu erkennen, dass der Transport von Subtypen mit hoher Sequenzhomologie besser inhibiert wird als der Transport von Subtypen mit geringerer Homologie. Das Primärisolat 11562/96 vom HIV-1 Gruppe M Subtyp A besitzt neben Subtyp B die größte Homologie zu Env362-420, die Transzytose wird jedoch im Vergleich zu den anderen Subtypen nicht am effektivsten inhibiert. Die deutlichste Reduktion der Transzytose zeigte sich in den Versuchen mit dem Primärisolat 484/97 vom Subtyp C und 93BR020 vom Subtyp F, hier wurde der Transport auf 22 ± 4% bei Subtyp C und auf 23 ± 0,3% bei Subtyp F gegenüber den Kontrollansätzen ohne Peptid gehemmt. Dabei besitzen beide Isolate verglichen mit den anderen verwendeten Subtypen eine geringere Sequenzhomologie zu Env362-420, bei Isolat C beträgt die Homologie 56% und bei Isolat F 61%. Es wurden zwei unterschiedliche Virusisolate des Subtyps D in die Versuche eingesetzt. Bei den zuerst durchgeführten Versuchen mit Subtyp DI (3971/95) konnte der Transport nur auf 67 ± 11% reduziert werden, obwohl die Sequenzhomologie zwischen Subtyp B und D im Vergleich zu den anderen Subtypen relativ hoch ist. In den anschließend durchgeführten Versuchen mit einem weiteren D-Isolat (DII: 92UG024), welches eine etwas geringere Homologie zu Env362-420 aufwies, ließ sich der Transport durch das Peptid auf 42% reduzieren. Überraschend war, dass die Transzytose von dem Vertreter von HIV-1 Gruppe O durch Env362-420 in der gleichen Größenordnung inhibiert wurde wie die Transzytose von HIV-1 Gruppe M Subtyp A. Bei HIV-1 Gruppe O liegt nur eine Sequenzhomologie zu Env362-420 von 49% vor.

Bei der Auswertung der Versuche sollte bedacht werden, dass in die Versuche unterschiedliche Ausgangsvirusmengen eingesetzt wurden. In früheren Versuchen der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass der Transport von HIV-1 durch Epithelzellen von der eingesetzten Virusmenge abhängig ist [Seeger 2003]. Je höher die eingesetzte Virusmenge ist, desto mehr Virus bezogen auf die Ausgangsmenge wird transportiert. Rückschlüsse aus dem Vergleich zwischen den einzelnen Versuchen mit den unterschiedlichen Subtypen untereinander sind deshalb nur bedingt möglich und vorsichtig zu diskutieren. Zusammenfassend kann postuliert werden, dass das Oligopeptid Env362-420 mit den verschiedenen HIV-1 um den Rezeptor auf den FL-Zellen konkurriert.

3.9.7 ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen Env362-420 in humanen Seren/ Plasmen

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Es konnte gezeigt werden, dass durch Seren HIV-1 infizierter Personen die Transzytose von HIV-1 durch Amnionzellen inhibiert werden kann. Hier wurde die Hypothese aufgestellt, dass polyklonale Antikörper aus den Seren, die gegen die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 gerichtet sind, für diese Inhibierung verantwortlich sind. Im Weiteren konnte mit Env362-420 der Transport von HIV-1 durch Epithelzellen signifikant inhibiert werden. Es stellt sich nun die Frage, ob die inhibierenden Seren über Antikörper gegen Env362-420 verfügen und somit die Hypothese der Inhibierung der Transzytose durch spezifische polyklonale Antikörper bestätigt werden kann.

Die Versuche zur Optimierung (siehe 2.4.1) geben deutliche Hinweise darauf, dass Seren HIV-1 positiver Individuen über Antikörper gegen Env362-420 verfügen können. Daher wurden nach der Optimierung eine Reihe von HIV-1 negativen und positiven Seren in den Peptid-ELISA eingesetzt. In Abbildung 30 sind die Ergebnisse der verwendeten HIV-positiven Seren dargestellt. Aufgeführt sind die jeweiligen Extinktionen bei einer Serumverdünnung von 1:100 abzüglich des Mittelwerts der verwendeten HIV-1 negativen Seren (16 Seren). Als Seren mit Antikörpern gegen das Peptid wurden Seren gewertet, die nach Abzug des Mittelwerts der Extinktionen der negativen Seren noch mindestens eine Extinktion von 0,1 aufwiesen. Bis auf einige Ausnahmen scheinen nur geringe Mengen an Antikörpern gegen das Oligopeptid Env362-420 in HIV-1 positiven Personen vorhanden zu sein, einige der HIV-1 positiven Seren besitzen überhaupt keine Antikörper gegen das Peptid.

Abb. 30: ELISA ausgewählter HIV-1 positiver Seren zur Untersuchung auf Antikörper gegen Env362-420, Durchführung des ELISA mit optimierten Bedingungen (siehe 2.4.1), aufgeführte Werte der Seren sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren (weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -)

3.9.7.1  Untersuchung der verwendeten Seren auf Antikörper gegen das Peptid Env362-420

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Mit dem etablierten ELISA wurden die in den Tranzytoseversuchen verwendeten Seren und Plasmen auf Antikörper gegen das Peptid untersucht. Eingesetzt wurden die Seren mit einer deutlichen Bande im Western Blot bei Antikörpern gegen gp120 aus Kapitel 3.6.1, die Seren der Langzeitinfizierten und die Plasmen der Serokonversion (siehe ebenfalls 3.6.1). In Abbildung 31 sind die Ergebnisse grafisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass in den HIV-1 positiven Seren, die in den ersten Transzytoseversuchen (Kapitel 3.6.1) verwendet wurden, Antikörper vorhanden sind, die gegen Env362-420 gerichtet sind. Auch die Seren der Langzeitinfizierten (LTNP) zeigten eine deutliche Extinktion im Peptid-ELISA. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit den Seren Langzeitinfizierter, ließen sich in den Plasmen der dokumentierten Serokonversion keine Antikörper gegen das Oligopeptid nachweisen.

Abb. 31: Ergebnisse des Peptid-ELISAs mit in den Transzytoseversuchen verwendeten Seren: A bis E sind die Plasmen der dokumentierten Serokonversion in der Reihenfolge ihrer Abnahme, 1 bis 2 sind die Seren der Langzeitinfizierten, S1 und S2 Seren der ersten Transzytoseversuchen mit deutlich Antikörpertiter gegen gp120, K+ ist die Positivkontrolle, aufgeführte Werte sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren: weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -

3.9.7.2 Untersuchung von Verlaufsseren auf Antikörpern gegen das Peptid Env362-420

Eine Ausbildung von Antikörpern gegen die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 könnte einen positiven Verlauf auf die Prognose der Krankheit besitzen. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden Seren von definierten Infektions- oder Krankheitsverläufen in den Peptid-ELISA eingesetzt. Die einzelnen Seren waren klinisch gut charakterisiert und jeweils einem Krankheitsbild zugeordnet. Es wurden pro Patient drei Seren eingesetzt. Ein Studienkollektiv beinhaltete Seren von Patienten, die über den gesamten Untersuchungszeitraum bereits an AIDS erkrankt waren, zwei weitere mit Seren von Patienten, die entweder in der Latenzphase oder in der LAS/ARC-Phase blieben und ein Studienkollektiv mit Patienten, die während der Untersuchung eine Stadienprogredienz durchmachten. In der Abbildung 32 sind die Ergebnisse des Peptid-ELISAs mit den beschriebenen Seren dargestellt. Bildet man die Mittelwerte der Antikörpertiter der vier Gruppen (schwarze gestrichelte Linien in Abbildung 32), sieht man, dass Patienten mit LAS/ ARC im mittel die höchsten Antikörpertiter haben, gefolgt von den Patienten mit AIDS und Patienten in der Progression.

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Abb. 32 : Ergebnisse der Peptid-ELISAs mit Seren aus Krankheitsverläufen, schwarz gestrichelte Linie in den einzelnen Studienkollektiven stellt den Mittelwert aller in diesem Kollektiv ermittelten Extinktionen dar (A, B, C,… bedeutet jeweils ein Patient/Proband).

Die Patienten in der Latenzphase besaßen im mittel die geringsten Antikörpertiter. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass bei einer bestehenden Infektion die Transzytose keinen Einfluss auf den Krankheitsverlauf besitzt. Vorstellbar wäre jedoch weiterhin ein Einfluss der Transzytose in der frühen Infektionsphase. Hier könnte durch eine frühe Expression der Antikörper die Ausbreitung von HIV-1 im Körper gehemmt werden. Leider ist der Infektionszeitpunkt bei den Patienten der verwendeten Verlaufsseren nicht bekannt, es sind aus dieser Phase keine Seren verfügbar. Untersuchungen von Seren dokumentierter Serokonversionen könnten Aufschluss über den Zeitpunkt der Antikörperbildung gegen diese Domäne geben. Längere Verläufe von diesen dokumentierten Serokonversionen mit möglichen unterschiedlichen Krankheitsverläufen gibt es leider nicht.

3.9.7.3 Untersuchung von dokumentierten Serokonversionen auf Antikörpern gegen das Peptid Env362-420

Zur Untersuchung, ob es Unterschiede in der Antikörperexpression gegenüber Env362-420 zu Beginn einer Infektion mit HIV-1 kommt, wurden Seren von sechs dokumentierten Serokonversionen untersucht. Eine Beantwortung der Frage, ob eine frühe Expression von Antikörpern gegen die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 einen Einfluss auf die Prognose der Krankheit besitzt, ist mit diesen Seren nicht möglich, da diese Seren nur in der Anfangsphase der Infektion gewonnen wurden und zudem die Patienten schon während der Serokonversion mit einer antiretroviralen Therapie begonnen haben. Bei den Patienten, die an dieser Studie teilgenommen haben, wurde zum frühest möglichen Zeitpunkt nach einem bekannten Infektionsrisiko mit der Serumabnahme begonnen. Diese Proben wurden in einer HIV-spezifischen PCR auf das Vorhandensein von HIV-RNA und in ELISAs bzw. Western Blots auf HIV-spezifische Antikörper untersucht (C. Kücherer, persönliche Mitteilung). Die Infektion wurde bei den ersten Proben entweder durch den Nachweis von HIV-spezifischer RNA im Serum oder durch HIV-spezifische Antikörper (siehe Tab. 32) nachgewiesen. Bei den Patienten a, d, e und f (Abb. 33) waren neben der HIV-spezifischen HIV-RNA zu diesem Zeitpunkt HIV-spezifische Antikörper sowohl in beiden HIV-ELISAs als auch im Western Blot detektierbar, bei Patient b waren Antikörper gegen HIV nur in einem ELISA (Bio-Rad) nachweisbar (Western Blot und Murex-ELISA negativ), bei Patient c gab es in beiden ELISAs eine fragliche Reaktion (Western Blot negativ). Nach dem Verlauf einer unbehandelten HIV-Infektion befanden sich die Patienten a, d, e und f zu Beginn der Probennahme am Übergang zur Phase III mit nachweisbarer HIV-RNA und beginnender Antikörper-Expression, d.h. ca. 4 bis 6 Wochen nach Infektion. Die Patienten b und c befanden sich bei der ersten Probennahme in der Phase II vor detektierbarer Antikörpermenge im Serum, d.h. zwischen 2 bis 4 Wochen nach dem Infektionsereignis. Den Patienten wurde nach dem Nachweis der HIV-Infektion über 16 bis maximal 28 Wochen in unterschiedlichen Anständen 6- bis 7-mal Blut abgenommen. Hier betrug der Mindestabstand zwischen zwei Abnahmen 2 Wochen und der maximale Abstand 8 Wochen. Die einzelnen Seren der Patienten wurden 1:100 verdünnt in den etablierten Peptid-ELISA eingesetzt. In der Abbildung 33 sind die Ergebnisse der ELISA-Testung dargestellt.

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Abb. 33 : Ergebnisse der Peptid-ELISAs mit Seren aus dokumentierten Serokonversionen, aufgeführte Werte der Seren sind Extinktionen abzüglich des Mittelwerts der HIV-1 negativen Seren: weiße Balken: ++, hellgrau: +, dunkelgrau: (+), schwarz: -

Es zeigte sich, dass Patient b, welcher zu Beginn der Probennahme noch in der frühen Infektionsphase war, Antikörpertiter gegen Env362-420 besitzt. Die Antikörpertiter nehmen jedoch zum Ende des Untersuchungszeitraumes ab. Dagegen verfügt Patient c, der sich zu Anfang in der ähnlichen Phase befand, nur in der ersten Abnahme über Antikörper gegen Env362-420. Bei den Patienten am Übergang zur Phase III besitzen die Patienten a und d keine oder nur geringe Antikörpertiter, während Patient e und f über deutliche Antikörpertiter verfügen. Es ist jedoch auffällig, dass bei den Patienten mit Antikörpern die Menge an messbaren Antikörpern schwankt. Bei jedem Verlauf sind Abnahmen ohne Antikörper zu finden.

Zusammenfassend zeigt die Untersuchung der Proben von dokumentierten Serokonversionen, dass zu Beginn der HIV-Infektion es unterschiedliche Antikörpertiter gegen das identifizierte Peptid gibt. Ein Einfluss durch Antikörper gegen die Domäne auf HIV-1, welche für die Überwindung von Barrieren innerhalb des Körpers und somit für die Ausbreitung verantwortlich sein könnte, auf die Prognose der Krankheit ist nach diesen Ergebnissen möglich.

3.9.8 Immunisierung von Kaninchen

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Mit Immunseren gegen die identifizierte Domäne sollten nach den Versuchen mit den unterschiedlichen Subtypen sowie der Nachweise von Antikörpern gegen Env362-420 in Seren HIV-infizierter Individuen die Möglichkeit der Hemmung des Transportes durch Blockierung der in den Transport involvierten Domäne auf den verwendeten Viren untersucht werden. In Anlehnung an die Aminosäurevergleiche zwischen Env362-420 und den verwendeten Virusisolaten (Abb. 29) wurde ein zweites Peptid (Env362-420mod.) mit vier Aminosäureaustauschen zur Synthese und Kopplung an KLH in Auftrag gegeben. Die Abb. 34 zeigt die veränderte Aminosäuresequenz.

Abb. 34 : Aminosäuresequenz von Env362-420mod. zur Immunisierung, Aminosäuren, die zur Sequenz des bisher verwendeten Peptids verändert wurden, sind grau hinterlegt.

Zwei Kaninchen wurden nach Abnahme der Präseren mit dem Peptid-KLH-Komplex immunisiert und die Seren nach der 1.Boosterung (Immunseren) sowie die Präseren für weitere Versuche verwendet. Zunächst wurde in einem modifizierten Peptid-ELISA die Reaktivität der Kaninchenseren gegen Env362-420mod. gemessen. Bei Tier 1 wurde ein Antikörpertiter von 1:128.000 und bei Tier 2 von 1:32.000 ermittelt. Die Präseren reagierten nicht. Zusätzlich wurden die Seren von Tier 1 auf eine Reaktivität gegenüber Env362-420 getestet. Hier lag der Antikörpertiter nur noch bei 1:8.000. Im Synzythien-Inhibierungsassay konnten weder in den Präseren noch in den Immunseren neutralisierende Antikörper nachgewiesen werden. In einem Immunfluoreszenztest (IFT) mit HIV-1IIIB-infizierten Zellen wurde die Spezifität der Immunseren gegenüber viralem gp120 untersucht. Die Abbildung 35 zeigt die Ergebnisse der Immunfluoreszenztests mit dem Präserum und dem Immunserum von Tier 1. Eine spezifische Bindung der Antikörper im Serum nach der Boosterung konnte bis zu einer Verdünnung von 1:100 gesehen werden. In den parallel durchgeführten Immunfluoreszenztesten mit dem Präserum konnte ab einer Verdünnung von 1:50 keine (unspezifische) Bindung mehr detektiert werden. Neben der Untersuchung der Seren im Immunfluoreszenztest wurde die Spezifität gegenüber viralem gp120 im Western Blot bestimmt. Hierzu wurde aus virushaltigem Zellkulturüberstand HIV durch Ultrazentrifugation pelletiert, die viralen Proteine über ein SDS-Page aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. In diesem Test konnte nur bis zu einer Verdünnung der Immunseren von 1:10 bis 1:50 eine Bande in der Größe von gp120 gesehen werden. Hier scheint eine geringere Sensitivität vorzuliegen, welche in der Menge an transferiertem Protein auf die Nitrozellulosemembran begründet sein kann.

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Abb. 35 : Ergebnisse des Immunfluoreszenztest mit Präserum und Immunserum aus Tier 1

Die Ergebnisse der Charakterisierung der Präseren und Immunseren sind in der Tabelle 23 zusammengefasst.

Tab. 23: Charakterisierung der Immunseren.

Tier 1

Tier 2

Präserum

Immunserum

Präserum

Immunserum

Peptid (Env362-420mod)-ELISA

0

1:128.000

0

1:32.000

Peptid (Env362-420)-ELISA

nb

1:8.000

nb

nb

neutralisierende Antikörper

Western Blot

1:10-1:50

1:10

Immunfluoreszenztest

1:100

1:100

Untersuchung der Spezifität der Immunseren im Peptid-ELISA gegen die verwendeten Peptide, im Western Blot und in der Immunfluoreszenz gegen virales gp120, Untersuchung auf neutralisierende Antikörper im Synzythien-Inhibierungsassay (SIA), nb = nicht bestimmt.

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Bei der Charakterisierung der Immunseren im Western Blot und mit dem Immunfluoreszenztest wird deutlich, dass die hohen Antikörpertiter im Peptid-ELISA sich nicht in einer hohen Bindungskapazität an viralem gp120 widerspiegeln. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden die Seren in die folgenden Transzytoseversuche 1:10 und 1:100 verdünnt eingesetzt. In diesen Konzentrationen ist eine Bindung der Peptid-spezifischen Antikörper an viralem gp120 nachweisbar.

Zur Untersuchung der Inhibierung der Transzytose wurden vor Beginn die Viren entweder mit 1:10 oder 1:100 verdünnten Kaninchenseren in D-MEM für 20 Minuten bei 37°C inkubiert, um die Bindung der Antikörper an die für die Transzytose essentielle Domäne zu ermöglichen. Zur Auswertung wurde die Menge an transportierten Viren – gemessen mit der TaqMan™-PCR – in den Versuchen nach Vorinkubation der Viren mit dem jeweiligen Präserum als 100% gewertet und die Menge in den Versuchen mit den Immunseren darauf bezogen. In der Abbildung 36 sind die Ergebnisse der Versuche dargestellt.

Abb. 36: Transzytose HIV-1IIIB durch FL-Zellen nach Inkubation der Viren mit Präseren und Immunseren, die Seren wurden 1:10 (Tier 1 und 2) bzw. 1:100 (Tier 1)verdünnt in die Versuche eingesetzt, Angabe der Standardabweichung bei Tier 1 1:100-Verdünnung nicht möglich, da nur zwei auswertbare Versuche vorlagen. Angabe von Mittelwerten mit Standardabweichung (Fehlerbalken) aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.

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Nach Vorinkubation der Viren mit dem Immunserum wurde bei einer Serumkonzentration im Ansatz von 10% die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen auf 17 ± 14% bei Tier 1 und auf 5 ± 3% bei Tier 2 in Vergleich zum Kontrollversuch mit Präserum reduziert, bei einer Serumkonzentration von 1% im Ansatz auf 30%. Aus diesen Ergebnissen kann man folgern, dass eine Bindung der Antikörper an die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 der eingesetzten Viren den Transport der Viren durch FL-Zellen inhibiert. Dies bestärkt die Annahme, dass Antikörper gegen die identifizierte Domäne in Seren HIV-infizierter Individuen für die Hemmung der Transzytose verantwortlich sind und somit Antikörper gegen das Peptid mögliche Inhibitoren der Transzytose von HIV-1 durch Epithelien darstellen.

3.9.9 Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen

Nach Generierung von Antikörpern gegen Env362-420mod. war es möglich die Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen nachzuweisen. Neben den FL- und CaCo-2-Zellen wurden noch Hela-Zellen (humanes Cervixkarzinom) und HT19/B6-Zellen (humanes colorektales Adenokarzinom) eingesetzt. In Tabelle 24 sind die Ergebnisse dargestellt.

Tab. 24: Nachweis der Bindung von Env362-420mod. an epitheliale Zellen.

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Während die Kontrollansätze, die nur mit DMSO inkubiert wurden, eine schwache Fluoreszenz zeigen, ist die Fluoreszenz bei den Ansätzen mit der Inkubation mit Env362-420mod. bei allen eingesetzten Zellen sehr deutlich zu sehen. Bei Fl-, Hela- und Caco-2-Zellen sieht man, dass der Rezeptor für Env362-420mod. an den Zellverbindungen (tight junctions) lokalisiert ist (Tab. 24, weiße Pfeile). Bei den HT29/B6-Zellen sieht man eine Verteilung der Fluoreszenz über die gesamte Zelle (Tab. 24, roter Pfeil). Der Env362-420mod.-bindende Rezeptor ist auf allen untersuchten Epithelzellen vorhanden. Da die Transzytose durch FL- als auch CaCo-2-Zellen in Anwesenheit von Env362-420 inhibiert werden kann, kann man postulieren, dass der Transport durch Hela- und HT29/B6-Zellen ebenfalls mit dem Peptid inhibierbar ist.

3.9.10 Untersuchung der Transzytose von HIV-1IIIB im Eihautmodell

Die Transzytose von HIV-1IIIB durch FL-Zellen lässt sich nach Vorinkubation der Viren mit den Immunseren aus Kapitel 3.8.8 inhibieren. Zur Übertragung dieser Ergebnisse auf komplexe Gewebe, wurde der Transport von HIV-1IIIB auch in einem Eihautmodell untersucht. Hierzu wurde die Eihaut kurz nach der Geburt wie im Methodenteil unter Kapitel 2.3.4 beschrieben präpariert und für die Transzytoseversuche auf Filtereinheiten in einer 6-Loch-Platte gesetzt. Der Virusstock wurde vor Start der Transzytose entweder in 1:10 oder 1:100 verdünnten Kaninchenserum für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Der Start der Transzytose erfolgte nach Überführung der Virus-Kaninchenserum-Mischung in das obere Kompartiment des Versuchsmodells. Es wurden jeweils die Präseren als auch die Immunseren in die Versuche eingesetzt. Die Menge an transportierten Viren nach 3 und 24 Stunden im unteren Kompartiment wurde mittels TaqMan™-PCR nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese bestimmt. In den durchgeführten Versuchen mit Eihäuten unterschiedlicher Spenderinnen, sowie von Spontangeburten und Kaiserschnitten konnte durch Vorinkubation der Viren mit den Kaninchenseren keine Reduktion des Transportes von HIV-1IIIB im Vergleich zu den Versuchen mit den Präseren gesehen werden. Eine Übertragung der Ergebnisse im Modellsystem mit FL-Zellen auf komplexe Gewebe scheint zu unterschiedlichen Ergebnissen zu führen.


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13.03.2008