4 Diskussion

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Zu den Hauptübertragungswegen einer HIV-Infektion zählt neben ungeschütztem Geschlechtsverkehr und Einbringen von erregerhaltigem Blut beim gemeinsamen Spritzengebrauch von i.v. Drogenkonsumenten die prä-, peri- oder postnatale Übertragung von der Mutter auf das Kind. Bei einer HIV-Infektion des Kindes ist die Infektion in utero oder bei der Geburt als der Hauptinfektionsweg anzusehen. Man geht davon aus, dass etwa 25% der Neugeborenen von HIV-infizierten Müttern in den Entwicklungsländern bei der Geburt infiziert werden. In Deutschland und in anderen europäischen Staaten war es möglich durch Präventionsmaßnahmen, wie eine antiretrovirale Therapie während der Schwangerschaft, einer primären Sectio vor Einsetzen der ersten Wehen und einem Verzicht auf das Stillen des Neugeborenen, die Zahl der prä-, peri- und postnatalen Übertragungen durch HIV-infizierte Mütter auf unter 1% zu reduzieren. Jedoch sind die Gesundheitsrisiken bzw. Langzeitschäden des Kindes aufgrund der antiretroviralen Therapie während der Schwangerschaft und nach der Geburt noch nicht abzuschätzen. Die Durchführung der Präventionsmaßnahmen in den Entwicklungsländern, in denen 95% der weltweit HIV-Infizierten leben, ist insbesondere aufgrund der hohen Kosten und der unzureichend ausgebauten Gesundheitswesen nur bedingt möglich. Hier stellte sich die Strategie der einmaligen Gabe von Nevirapine – ein Nicht-nukleosidischer Reverse Transkriptasehemmer – intrapartum als effektive Prophylaxe heraus [Guay et al. 1999]. Ein Nachteil dieser Strategie ist das Auftreten von Nevirapine-Resistenzen, die sich aufgrund der langen Halbwertszeit des Medikaments schon nach einer einmaligen Gabe ausbilden können [Eshleman et al. 2005, Flys et al. 2005, Johnson et al. 2005]. In klinisch-epidemiologischen Studien konnte gezeigt werden, dass der Zeitpunkt der Infektion bei der Mehrzahl der HIV-infizierten Kinder kurz vor der Geburt liegen muss. Der Mechanismus der perinatalen Infektion des Kindes ist jedoch bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wird postuliert, dass lokal produzierte HI-Viren aktiv durch die Eihaut transportiert werden, ins Fruchtwasser gelangen und wiederum durch einen aktiven Transport durch die Epithelzellen der Atmungswege oder des Magen-Darm-Traktes das Kind infizieren können. Die Identifizierung der Domäne auf gp120 von HIV-1, welche den Transport durch die Epithelien initiieren kann, und die auf diesen Ergebnissen aufbauende Entwicklung eines Inhibitors wäre zur Senkung der Transmissionsrate insbesondere in den Entwicklungsländern wünschenswert. In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe eines Zwei-Kompartiment-Systems mit Amnion-Zellen als Modell für den Transport von HIV-1 durch die Eihaut als initialer Schritt der Mutter-Kind-Übertragung die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 identifiziert werden.

4.1  Inhibition des Transportes durch mono- und polyklonale Antikörper

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Zu Beginn dieser Arbeit standen die Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Morgane Bomsel bezüglich des Transportes von zellfreien HI-Viren durch Epithelzellen den Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe gegenüber. In dem Modellsystem mit intestinalen Epithelzellen von Bomsel und Kollegen konnte im Gegensatz zu den Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe kein effizienter Transport von zellfreien HIV nachgewiesen werden [Hocini et al. 1999]. Eine Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse wäre die Anwesenheit von relativ hohen Konzentrationen an fötalem Kälberserum (FKS) im Versuchsansatz der anderen Arbeitsgruppe. Kage und Kollegen konnten in ihren Versuchen zeigen, dass Bestandteile im FKS den Transport von zellfreien Viren inhibieren [Kage et al. 1998]. Zudem diskutieren Bomsel und Kollegen die Beteiligung einer bestimmten Aminosäuresequenz auf gp41 am Transport von zell-assoziierten HIV durch Epithelzellen. Durch Zugabe von polyklonalen Antikörpern aus HIV-positiven Seren bzw. des monoklonalen Antikörpers 2F5, welche die Aminosäuresequenz ELDKWA auf gp41 erkennen, konnte die Transzytose inhibiert werden [Alfsen et al. 2001, Bomsel et al. 1998]. Gemessen wurde dabei die Menge an infektiösen Viren, die transportiert wurde. Nach unseren Ergebnissen ist für die Initialisierung des Transportes von HIV-1 die Bindung von gp120 an einen bislang unbekannten Rezeptor auf der Epithelzelle verantwortlich [Kage et al. 1998]. Aufgrund dieser Diskrepanzen in den Untersuchungsergebnissen, sollte der Einfluss des Antikörpers 2F5 auf den Transport von HIV in unserem Modellsystem untersucht werden, wobei eine Reduktion der Transportrate in Anwesenheit des Antikörpers 2F5 nicht erwartet wurde. Um erste Hinweise auf das in den Transport von HIV-1IIIB involvierte Epitop auf gp120 zu bekommen, wurden zusätzlich Versuche zur Inhibierung der Transzytose mit dem monoklonalen Antikörper 2G12, welcher ein Epitop auf gp120 erkennt, durchgeführt. Vor Durchführung der Transzytoseversuche wurde in Synzythien-Inhibierungsassays die neutralisierende Wirkung der Antikörper auf die beiden zur Verfügung stehenden Laborisolate HIV-1IIIB (Isolat LAI Acc. Nr. K02013) und HIV-1 Gruppe O (Isolat MP5180, Acc. Nr. L20571) untersucht. Diese Untersuchungen waren notwendig, um sicher zu gehen, dass der jeweilige Antikörper an das Virusisolat binden und somit einen Einfluss auf die Transzytose haben kann. HIV-1IIIB wurde von beiden Antikörpern wie in der Literatur beschrieben neutralisiert. Das von 2F5 erkannte Epitop ist konserviert. Die Glykosylierungsstellen auf gp120, die das Epitop von 2G12 bilden, sind für das Laborisolat HIV-1IIIB LAI beschrieben [Sanders et al. 2002]. Das Isolat HIV-1 Gruppe O konnte weder durch 2F5 noch durch 2G12 neutralisiert werden. Für 2F5 ist beschrieben, dass schon ein Aminosäureaustausch in der sensitiven Aminosäuresequenz LDKW zu einer Resistenz gegenüber dem Antikörper führt. In der Sequenz des O-Isolats kommt es in diesem Motiv zu einem Austausch von K zu E und somit zu einem Verlust der neutralisierenden Wirkung des Antikörpers [Purtscher et al. 1996]. Vergleicht man die Aminosäuresequenz des HIV-1 Gruppe O Isolats mit der Sequenz von HIV-1IIIB LAI in der Region der Bindungsstelle von 2G12 (Abb. 37), sieht man an den Positionen 295, 332 und 339 einen Aminosäureaustausch von N zu T (295 und 332) und von N zu E (339). Die an diesen Asparaginen gebundenen Mannosereste sind für die Bindung und der daraus resultierenden Neutralisierung durch 2G12 erforderlich. Virusisolate mit nur einem Aminosäureaustausch an diesen Stellen, was zu einem Verlust der Glykosylierungsstelle führt, sind weniger gut durch 2G12 zu neutralisieren [Scalan et al. 2002]. Das verwendete HIV-1 Gruppe O Isolat, welches drei der fünf Glykosylierungsstellen nicht besitzt, ist gegenüber 2G12 resistent.

Abb. 37: Aminosäurevergleich zwischen HIV-1IIIB LAI und HIV-1 Gruppe O (Isolat MP5180) im Bereich des Epitops von 2G12 auf gp120, die Glyko-Seitenketten an den Positionen 295, 332, 339, 386 und 392 stellen das Epitop von 2G12 dar.

Die Inhibierungsversuche der Transzytose in Anwesenheit von 2F5 und 2G12 wurde nach diesen Ergebnissen ausschließlich mit HIV-1IIIB LAI untersucht. Bei der Durchführung der Transzytose mit einer Vorinkubation der jeweiligen Antikörper mit Virus konnte in Anwesenheit von 2G12 keine Reduktion des Partikeltransportes, gemessen mit der TaqMan™-PCR, beobachtet werden. Wurde jedoch in der gleichen Probe die Menge an infektiösen Viren bestimmt, so konnte hier im Vergleich zur Kontrolle nur 34 ± 18% der Menge an infektiösen Viren nachgewiesen werden. Dieser Unterschied kann wie folgt erklärt werden: Während der Inkubation der Viren mit dem Antikörper kam es zu einer Bindung des Antikörpers an das Virus. Der gebundene Antikörper blockierte dabei jedoch nicht die Bindungsstelle auf gp120, die an den zellulären Rezeptor bindet und die Transzytose initiiert. Es wurden mit 2G12 beladene und somit neutralisierte Viren durch die Epithelzellen transportiert (siehe Abb. 38b). Das von dem Antikörper erkannte Epitop auf gp120 hat somit keinen Einfluss auf die Transzytose. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit 2F5 erzielt. Hier konnten im Vergleich zur Kontrolle 86 ± 21% an transportierten HIV-Partikeln im unteren Kompartiment und in der gleichen Probe 52 ± 26% infektiöse Viren nachgewiesen werden. Wurden die Versuche mit einer Vorinkubation der FL-Zellen mit den jeweiligen Antikörpern durchgeführt, konnten ebenfalls keine Hinweise auf eine signifikante Reduktion der Transportrate in beiden Ansätzen festgestellt werden. Eine Reduktion des Partikeltransportes konnte auch hier nur in den Ansätzen mit 2F5 beobachtet werden (78 ± 16%), jedoch ist diese Hemmung nicht als spezifisch anzusehen. Immunglobuline der Klasse G tragen an jedem Fc-Teil ein kovalent gebundenes Oligosaccharid. Die N-glykosidisch gebundenen Oligosaccharide von IgG bestehen aus vier N-Acetylglucosamin- und drei Mannose-Resten sowie je einem Fucose- und Galaktose-Rest. In der Arbeit von Kage [Kage et al. 1998] konnte gezeigt werden, dass Oligosaccharide in der Lage sind, die Bindung von HIV-1 an den zellulären Rezeptor zu verhindern. Die Zuckerreste der eingesetzten Antikörper könnten ebenfalls durch Bindung an die Lektin-Domäne auf gp120 die Transzytose in den durchgeführten Versuchen hemmen. Diese Annahme konnte in Versuchen mit deglykosylierten Antikörpern bestätigt werden. In Transzytoseversuchen mit deglykosylierten 2F5 und 2G12 konnte keine Reduktion des Partikeltransportes nach einer Vorinkubation der Zellen mit den Antikörpern festgestellt werden. Die deglykosylierten Antikörper wurden im Synzythien-Inhibierungsassay auf ihre neutralisierende Aktivität gegenüber HIV-1IIIB untersucht. Die neutralisierende Wirkung war auch nach Entfernung der Oligosaccharide weiterhin vorhanden. Die reduzierte Menge an infektiösen Viren im unteren Kompartiment kann durch den Transport Antikörper gebundener Viren erklärt werden. Die Annahme eines Transportes der Immunglobuline durch die Epithelzellen als Erklärung der Ergebnisse kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der Transport von Immunglobulinen durch epitheliale Zellen ist nur bei Immunglobulinen der Klasse A und M beschrieben. Ausschließlich Antikörper dieser Klassen verfügen über eine J-Kette, welche an die spezifischen Rezeptoren auf den epithelialen Zellen binden und somit den aktiven Transport initiieren können. Ein weiterer Ort des Immunglobulin-Transports ist die Plazenta. Hier werden IgG-Immunglubuline der Unterklassen 2 und 4 über die Fc-Rezeptoren der Plazenta transportiert, ein Transport von Immunglobulinen durch die Eihaut ist bisher nicht beschrieben. Die in den Versuchen verwendeten Antikörper sind IgG-Immunglobuline der Unterklasse 1, die weder durch Epithelzellen noch durch die Plazenta transportiert werden. Aufgrund dieser Tatsache und der vorliegenden Ergebnisse muss man annehmen, dass mit den verwendeten monoklonalen Antikörpern beladene und dadurch neutralisierte Viren durch die Epithelzellen transportiert wurden.

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Abb. 38: Modell des HIV-Transports in Anwesenheit von humanen monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörpern: a Darstellung des Transports in Abwesenheit von Antikörpern, b Darstellung des Transports in Anwesenheit der monoklonalen Antikörper 2F5 oder 2G12, c Darstellung der Inhibierung des Transports in Anwesenheit von humanen polyklonalen Antikörpern aus Serum HIV-infizierter Probanden.

Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse bezüglich des mAk 2F5 bei der Inhibierung der Transzytose stehen – wie die Ergebnisse zum Transport von zellfreien Viren – den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Morgane Bomsel entgegen. Das Epitop ELDKWA, welches von 2F5 erkannt wird, spielt nach den hier gewonnenen Erkenntnissen keine Rolle bei der Transzytose von HIV-1. Der von Bomsel und Mitarbeitern beschriebenen Inhibierungen des Transportes von zell-assoziierten HI-Viren durch epitheliale Zellen durch 2F5 scheinen andere Mechanismen zugrunde zu liegen. Im von Morgane Bomsel entwickelten Arbeitsmodell zum Transport von zell-assoziierten HIV-1 durch die intakte Mucosa kommt es nach Kontakt der HIV-infizierten Zellen mit den Zellen der Mucosa zu einem Ausschütten der Viren in Richtung der Mucosa [Bomsel 1997]. Die epithelialen Zellen der Mucosa nehmen die freien Viren auf, transportieren diese durch die Zelle und schleusen sie auf der serosalen Seite wieder aus. Eine Inhibierung des Virusbuddings durch die 2F5-Antikörper werden von Bomsel und Arbeitskollegen ausgeschlossen, wobei weder die Durchführung der Untersuchungen zum Virusbudding in An- und Abwesenheit des Antikörpers noch die Ergebnisse dazu in den Veröffentlichungen dargestellt wurden. Die Inhibierung der Virusausschleusung durch 2F5-Antikörper könnte durch eine Bindung der Antikörper an virale Proteine auf der Oberfläche der HIV-infizierten Zellen ermöglicht werden. Aufgrund einer Kreuzvernetzung der Epitope durch die Antikörper wird das Ausschleusen der Viren verhindert bzw. die Viren auf der Oberfläche der Zellen fixiert und somit ein reduzierter Transport durch die epithelialen Zellen gemessen. In anderen Virus-Zell-Systemen wurde gezeigt, dass Antikörper gegen bestimmte virale Epitope die Freisetzung von Viruspartikeln inhibieren können. So inhibieren Anti-Neuraminidase-Antikörper die Freisetzung von Influenzaviren aus der infizierten Zellkultur, indem die viralen Oberflächenproteine auf der Wirtszelloberfläche – hier die Neuraminidase – über die Antikörper vernetzt werden [Compans et al. 1969]. Bomsel und Kollegen diskutieren die Unterschiede im Transport von HIV aus infizierten Zellen und zellfreien Viren mit der Zusammensetzung der Virusmembran nach Ausschleusen der Viren initiiert durch den Kontakt mit epithelialen Zellen [Bomsel 1997]. Nimmt man diese Hypothese an, können so auch die Unterschiede in den Ergebnissen der Inhibierung der Transzytose durch 2F5-Antikörper erklärt werden. Aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung der Virusmembran könnte der Transzytose von zellfreien Viren anderen Mechanismen zugrunde liegen und damit verbunden andere Rezeptoren auf der epithelialen Zelle an der Transzytose beteiligt sein als bei „zell-assoziierten“ HIV.

Während der hier vorgelegten Untersuchungen mit den beiden monoklonalen Antikörpern wurde auch von der Arbeitsgruppe, die uns die Antikörper zur Verfügung gestellt hat, der Transportvon zell-assoziierten HI-Viren durch intestinale Epithelzellen in Anwesenheit von 2F5 und 2G12 untersucht [Wolbank et al. 2003]. Bezüglich der Inhibierung des Transportes durch 2F5IgG stimmen die Ergebnisse mit unseren überein, obwohl hier – wie auch bei Bomsel und Kollegen – zell-assoziierte Viren verwendet wurden. Die in der Publikation beschriebene Reduktion des Transportes durch 2F5IgM und IgA lässt sich durch die Kreuzvernetzung der viralen Proteine auf der Oberfläche infizierter Zellen durch Antikörper erklären. Da dimere bzw. pentamere Antikörper zu einer stärkeren Kreuzvernetzung führen, kann damit der Unterschied zur Inhibierung durch IgG-Antikörper erklärt werden. Mit dem monoklonalen Antikörper 2G12 konnte die Arbeitsgruppe ähnliche Effekte sehen, die auf dem gleichen Mechanismus wie bei 2F5 beruhen. In der Veröffentlichung wurden jedoch keine Untersuchung zur Virusausschleusung in An- und Abwesenheit der jeweiligen Antikörper gezeigt. Eine Beteiligung der Epitope auf den Glykoproteinen, die durch die beiden monoklonalen Antikörper erkannt werden, in den Transport von HIV durch epitheliale Zellen lässt sich aus diesen Ergebnissen nicht ableiten.

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Da die Beteiligung definierter neutralisierender Antikörper an der Inhibition der Transzytose durch die vorgelegten Untersuchungen ausgeschlossen wurde, stellte sich die Frage, ob im Serum HIV-1 infizierter Individuen polyklonale Antikörper vorhanden sind, die den Transport von zellfreien Viren im verwendeten Modellsystem mit FL-Zellen hemmen können. Es konnte eine signifikante Reduktion des Transportes von HIV-Partikeln und infektiösen Viren durch bestimmte HIV-positive Seren nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass HIV-1 infizierte Patienten Antikörper besitzen, die gegen die in der Transzytose involvierte Domäne gerichtet sind. Während der Vorinkubation von HIV-positiven Serum und Virus kommt es zu einer Bindung von spezifischen Antikörpern aus dem Serum an die in den Transport involvierte Domäne auf gp120. Durch diese spezifische Bindung der Antikörper ist die Wechselwirkung zwischen HIV und dem spezifischen Rezeptor auf der Epithelzelle unterbunden, HIV wird nicht von der Zelle aufgenommen und transportiert (siehe Abb. 38c). Aufgrund der Lektineigenschaft der Domäne auf gp120 ist auch eine Bindung von Glykoseitenketten unspezifischer Antikörper aus HIV-positiven als auch HIV-negativen Seren möglich. Der Nachweis einer solchen Beeinflussung der Transzytose ist bereits im Zusammenhang mit deglykosylierten und nicht-deglykosylierten monoklonalen Antikörpern beschrieben worden und dient als Erklärung für die Reduktion des Transportes von HIV-1 in Anwesenheit von HIV-negativen Seren im Vergleich zur Kontrolle ohne Serum. Die Ergebnisse korrelieren mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe von Broliden und Kollegen [Broliden et al. 2001]. In dieser Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Transzytose von HIV-1 durch intestinale Zellen (CaCo-2) durch aufgereinigte HIV-spezifische IgA-Immunglobuline inhibiert werden kann. Die Immunglobuline wurden aus dem Genitalsekret, Speichel und Plasma von so genannten HEPS (Highly Exposed, Persistently Seronegative) Personen aufgereinigt. Bei diesem Kollektiv handelt es sich um Personen, die häufigen ungeschützten Geschlechtsverkehr mit HIV-positiven Individuen hatten, zum Zeitpunkt der Untersuchung noch nicht serokonvertiert waren, ein Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen HIV in den untersuchten Körperflüssigkeiten jedoch möglich war. Eine Reihe weiterer Arbeitsgruppen haben die Inhibierung der Transzytose von zell-assoziierten HIV durch intestinale Zellen in Anwesenheit unterschiedlicher Immunglobulinen, aufgereinigt aus unterschiedlichen Körperflüssigkeiten HIV-infizierter Individuen, untersucht [Alfsen et al. 2001, Bélec et al. 2001, Becquart et al. 2000, Devito et al. 2000, Hocini et al. 1999, Bomsel et al. 1998, Hocini et al. 1997]. Auch in diesen Arbeiten konnte der Transport von zell-assoziierten HIV-1 durch spezifische Antikörper der Immunglobulinklassen G, M und A inhibiert werden. Ob – wie oben bereits erwähnt - jedoch der Mechanismus der Inhibierung des Transportes von zell-assoziierten Viren vergleichbar ist mit der Inhibierung des Transportes von zellfreien Viren, ist nicht geklärt. Der Transport von zell-assoziierten Viren kann, wie bereits oben diskutiert, neben der eigentlichen Inhibierung des Transportmechanismus auch durch Antikörper bewirkt werden, die das Ausschleusen der Viren aus den infizierten Zellen und dort deren Freisetzung verhindern.

4.2 Identifizierung der in den Transport involvierten Domäne auf gp120

Durch Inhibitionsversuche mit Oligopeptidpools bzw. mit einzelnen Oligopeptiden konnte die Aminosäuresequenz auf gp120 identifiziert werden, die an dem Transport von HIV-1 durch Amnion-Zellen beteiligt ist. Dabei wird durch Vorinkubation der Zellen mit den inhibierenden Oligopeptiden bzw. dem auf der identifizierten Aminosäuresequenz basierenden Peptids Env362-420 die Bindungsstellen auf dem bisher noch nicht charakterisierten Rezeptor der epithelialen Zellen durch die Interaktion zwischen Peptid und Rezeptor für eine konkurrierende Bindung von HIV-1 blockiert. Das Peptid repräsentiert die Aminosäuresequenz auf gp120, über die die Interaktion zwischen Virus und zellulären Rezeptor stattfindet. Diese Aminosäuresequenz beginnt mit AS 362 auf der C3-Domäne, reicht über die variable V4-Domäne und endet mit AS 420 auf der C4-Domäne von gp120. Die im Modell mit Amnion-Zellen gezeigte Inhibierung der Transzytose von HIV-1 durch Env362-420 konnte in Versuchen mit CaCo-2-Zellen bestätigt werden.

Zur Identifizierung dieser Domäne wurden zunächst die Oligopeptidpools und anschließend die einzelnen Oligopeptide der inhibierenden Pools eingesetzt. Hier konnten die einzelnen Oligopeptide - bis auf Nr. 37 - den Transport in der gleichen Größenordnung inhibieren wie die jeweiligen Pools. Bei Pool 8 ist dieses Ergebnis dadurch erklärbar, dass sich in diesem Pool ausschließlich das Oligopeptid 38 mit einer hemmenden Wirkung befindet. Da in allen Versuchen jeweils eine Oligopeptidkonzentration von 100 µM eingestellt wurde, befanden sich zudem im Vergleich zu den Versuchen mit den Oligopeptidpools in den Versuchen mit den einzelnen Oligopeptiden diese in einer 5´fach höheren Konzentration. In Pool 7 sind zwei der inhibierenden Oligopeptide vorhanden, es gibt jedoch keine Abnahme der inhibierenden Wirkung, werden die Oligopeptide einzeln eingesetzt. Dieses Phänomen zeigt sich auch, wenn die inhibierenden Oligopeptide 34 bis 38 zusammen bzw. Env362-420 in die Transzytose eingesetzt wurden. Es zeigt sich kein synergistischer Effekt in der Inhibierungseffizienz gegenüber den Pools bzw. der einzelnen Oligopeptide. Werden mehrere Oligopeptide zusammen in die Versuche eingesetzt, treten diese Oligopeptide – aufgrund ihrer überlappenden Bereiche – in eine Konkurrenz um die Bindungsstelle auf dem Rezeptor. Zudem verhindern die überlappenden Regionen, dass benachbarte Oligopeptide ebenfalls am Rezeptor binden können. So behindert im Pool 7 das Oligopeptid 33 die Bindung von 34 bzw. bei den inhibierenden Oligopeptiden zusammen das Oligopeptid 37 die Bindung von Oligopeptid 38, welches die größte inhibierende Wirkung aufwies. Durch Einsetzen der Oligopeptide 34 bis 38 ist keine komplette Abdeckung des Rezeptors möglich. Zudem könnte dadurch, dass nicht alle Rezeptorbindestellen von einem Oligopeptid abgedeckt werden können, die Bindung an den Rezeptor weniger effizient sein. Ein ständiges Binden und Ablösen der Oligopeptide könnte die Folge sein und zu einer geringeren Reduktion der Transzytose von HIV-1 durch Amnionzellen führen. In Abbildung 39 sind die einzelnen Oligopeptide mit den überlappenden Bereichen dargestellt. Im Falle von Env362-420 kann auch die räumliche Struktur dieser Domäne eine Rolle spielen. Bei Betrachtung des gp120-Modell nach Leonard und Back (Einleitung, Abbildung 1.3, [Leonard et al. 1990, Back 1993]) wird deutlich, dass zwischen dem Cystein an Position 385 und dem Cystein an Position 418 eine Disulfidbrücke besteht und sich der V4-Loop bildet (siehe Abb. 39).

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Abb. 39: Aminosäuresequenz der inhibierenden Oligopeptide und Env362-420, überlappende Bereiche zwischen den Oligopeptiden sind rot dargestellt, grau hinterlegt sind die glykosylierten Aminosäuren

Dieser Loop könnte – ähnlich wie der V3-Loop – eine Rolle bei der Rezeptorbindung bzw. beim Transport von HIV durch epitheliale Zellen spielen. Env362-420 ist ein lineares Peptid und aufgrund der fehlenden Loop-Struktur ist hier – wie auch bei den Oligopeptiden – keine vollständige Bindung an den Rezeptor und somit keine effizientere Reduktion der Transzytose möglich. In der Abbildung 39 sind neben den überlappenden Bereichen auch die Glykosylierungsstellen von gp120 innerhalb dieser Domäne gekennzeichnet. Zur effektiven Bindung an den zellulären Rezeptor können auch einige dieser glykosylierten Aminosäuren nötig sein. Da jedoch weder die Oligopeptide noch Env362-420 glykosyliert sind, könnte auch hier der Grund für die nicht vollständige Reduktion des Transportes von HIV liegen. Die erreichte Reduktion könnte aber auch die maximal mögliche Reduktion darstellen. Ein weiterer Rezeptor – der im Verlauf dieses Kapitels näher beschrieben wird – könnte für den verbleibenden Transport verantwortlich sein.

Der Transport von HIV-1 durch intakte epitheliale Barrieren des menschlichen Körpers kann als initialer und essentieller Schritt einer HIV-Infektion angesehen werden. In der Literatur sind Transzytoseversuche mit unterschiedlichen Isolaten von HIV-1 und HIV-2 insbesondere mit HIV-1 Gruppe M Subtyp A, B und D beschrieben [Carreno et al. 2002, Alfsen et al. 2001, Bélec et al. 2001, Hocini et al. 2001, Lagaye et al. 2001, Hocini et al. 1999, Bomsel et al. 1998, Rokos et al. 1998, Bomsel et al. 1997, Hocini et al. 1997]. Alle untersuchten HIV-Isolate werden - mit unterschiedlicher Effizienz - durch Epithelzellen transportiert. Demnach muss die Region auf gp120, welche den Transport von HIV durch Epithelzellen initiieren kann, zwischen den einzelnen Isolaten bzw. Subtypen konserviert sein. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Primärisolate der HIV-1 Gruppe M Subtyp A, C, D, F und G sowie ein Isolat der Gruppe O durch Amnionzellen transportiert werden. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass durch Vorinkubation der Zellen mit Env362-420 der Transport aller verwendeten Subtypen inhibiert werden konnte. Der Sequenzvergleich zwischen Env362-420 und den Konsensussequenzen der HIV-1 Gruppe M Subtypen zeigte, dass nur bestimmte Aminosäuren zwischen allen Subtypen konserviert sind. Unter der Annahme, dass die den Transport induzierende Region zwischen den Subtypen konserviert sein muss, scheint es sich um ein diskontinuierliches Epitop zu handeln. Die benachbarten konservierten Aminosäuren können jeweils zu Bereichen zusammengefasst werden, somit besteht das Epitop aus zwei Bindungsdomänen. In der Abbildung 40 ist die Aminosäuresequenz des Peptids dargestellt, grau unterlegt sind die über alle Konsensussequenzen der HIV-1 Gruppe M konservierten Aminosäuren.

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Abb. 40: Aminosäuresequenz der den Transport inhibierenden Domäne auf gp120 (Env362-420), die mit grau unterlegten Aminosäuren stellen das in den Transport involvierte, diskontinuierliche Epitop dar, welches über alle Subtypen der HIV-1 Gruppe M konserviert ist, benachbarte konservierte Aminosäuren sind in zwei Bindungsdomänen (Bereiche) unterteilt.

Zur besseren Beschreibung des Epitops wurde die Konsensussequenz von HIV-1 Gruppe O ausgeschlossen, das hier gezeigte Epitop bezieht sich ausschließlich auf die vorwiegend vorkommende HIV-1 Gruppe M (major). In den Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Isolate der HIV-Subtypen mit einer unterschiedlichen Effizienz transportiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wird der Transport der einzelnen Subtypen unterschiedlich stark durch das Peptid gehemmt, die Inhibierung der Transzytose der Non B-Subtypen ist geringer als die bei Subtyp B. Neben den in Abbildung 40 grau unterlegten konservierten Aminosäuren gibt es möglicherweise weitere Aminosäuren dieser Sequenz, die bei der Rezeptorbindung eine Rolle spielen. Sind diese Aminosäuren in der gp120-Sequenz der Viren vorhanden, ist die Bindung an den Rezeptor effektiv, liegen jedoch Aminosäureaustausche vor, so ist die Wechselwirkung zwischen gp120 und dem zellulären Rezeptor eingeschränkt und der Transport reduziert. Aus den durchgeführten Experimenten können keine weiteren Aminosäuren identifiziert werden, die an der Rezeptorbindung beteiligt sind. Der Vergleich der Ergebnisse wird zudem dadurch erschwert, dass die Transzytoseversuche mit den einzelnen Primärisolaten mit unterschiedlichen Mengen an infektiösen Viren durchgeführt wurden. Die eingesetzten Virusmengen und die Menge an transportierten Viren wurde mit der TaqMan™-PCR bestimmt, da sich die Titration der Primärisolate auf PBMCs als schwierig und kostenintensiv herausgestellt hat. Es ist somit kein direkter Rückschluss auf die Menge an infektiösen Viren und dem Anteil an nicht-infektiösen Partikeln möglich.

In den Versuchen zum Einfluss des Peptids auf die Infizierbarkeit der Zielzellen zeigte sich, dass die Anzahl der infizierten Zellen in Anwesenheit des Peptids vergleichbar ist zur Kontrollinfektion in Abwesenheit des Peptids. Aus diesem Ergebnis kann man schließen, dass Env362-420 die Bindung von gp120 an den CD4-Rezeptor der Wirtszelle nicht beeinflusst. Eine Blockierung der Bindungsstelle durch das Peptid würde eine Bindung von HIV und somit eine Infektion der Zelle verhindern. In Abbildung 41 ist unter B die gefaltete Struktur von gp120 mit Darstellung der Bereiche, die an der CD4-Bindung beteiligt sind, gezeigt (Zeichnung entnommen aus: Coffin JM, Hughes SH and Varmus HE (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press). In dieser Darstellung wird deutlich, dass die in der vorliegenden Arbeit identifizierte Domäne auf gp120 (blau umrandet) die Bereiche, die in der CD4-Bindung involviert sind (grau hinterlegt), nicht überschneiden. Die Untersuchung der Seren, die den Transport von HIV-1 inhibiert haben, zeigte ebenfalls, dass Antikörper, die den Transport inhibieren, keine neutralisierende Wirkung besitzen müssen.

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Abb. 41: Schematische Darstellung von HIV-1 gp120: A Lineare Darstellung von HIV-1 gp120, variable Domänen gekennzeichnet durch orangefarbene Balken, Disulfidbrücken dargestellt durch orangefarbene Linien. B Gefaltete Darstellung von HIV-1 gp120, orangefarbene Darstellung der variablen Bereiche und der Disulfidbrücken, grau hervorgehobene Bereiche stellen die in CD4-Bindung involvierte Domänen dar und blau umrandet ist die identifizierte Sequenz des Peptids Env362-420. (Abbildung modifiziert nach Leonard et al. 1990 und Pollard et al. 1992, aus Coffin JM, Hughes SH and Varmus HE (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press)

Betrachtet man das gp120-Modell nach Leonard und Back (Einleitung, Abbildung 1.3, [Leonard et al. 1990, Back 1993]), so liegen höchstens zwei der an der CD4-Bindung beteiligten Aminosäuren in der inhibierenden Sequenz. Abbildung 42 zeigt diese Aminosäuren:

Abb. 42: In CD4-Bindung involvierte Aminosäuren aus Env362-420, die Aminosäuren 368 (D) und 370 (E) (rot) in der Sequenz GDPEI stellen die AS dar, die nach dem Modell von Leonard et al. 1990 und Back 1993 in die CD4-Bindung involviert sind.

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Hier könnte man die fehlende Beeinflussung der CD4-Bindung durch das Peptid dadurch erklären, dass zwei Aminosäuren zur Bindung des Peptids an den CD4-Rezeptor nicht ausreichend sind und es sich zudem bei Env362-420 um ein lineares Peptid aus 59 Aminosäuren handelt, welches möglicherweise aufgrund der fehlenden räumlichen Struktur und der Größe der Bindungsstelle für CD4 auf gp120 nicht mit den CD4-Rezeptor interagieren kann.

In der Arbeit von Wolbank und Mitarbeitern [Wolbank et al. 2003] wird gezeigt, dass keine Transzytose von „zell-assoziierten“ HIV-1 durch intestinale Zellen in Anwesenheit von 2G12 IgM bzw. IgA zu beobachten ist, während 2G12 IgG keinen Einfluss auf die Transzytose besitzt. Im Kapitel 4.1 wird bereits diskutiert, dass die Hemmung der Transzytose nicht darauf beruht, dass die Antikörper direkt an die Domäne, die am Transport beteiligt ist, binden, sondern auf anderen Mechanismen. Das Epitop von 2G12 befindet sich – wie das Peptid – in der Nähe der C4/V4-Region von gp120. Dieses Epitop wird hauptsächlich aus Mannose-Resten der Glykane der Aminosäuren Asparagin an der Position 295 und 332 gebildet. Eine Beteiligung der Glykane der Asparagine an den Positionen 339, 386 und 392 wird diskutiert [Sanders et al. 2002, Scalan et al. 2002]. Die Aminosäuren an der Position 386 und 392 des postulierten 2G12-Epitops befinden sich in der Aminosäuresequenz des Peptids (Abb. 43).

Abb. 43: In 2G12-Bindung involvierte Aminosäuren aus Env362-420, die Aminosäuren 386 und 392 (rot) stellen die AS dar, deren Glykane neben weiteren an Aminosäuren gekoppelten Glykanen das Epitop von 2G12 bilden.

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Trotz dieser Überlappung der Epitope konnte eine Inhibierung durch 2G12 IgG in den Versuchen nicht gezeigt werden. Diese Ergebnisse können damit erklärt werden, dass an der Bindung von 2G12 an gp120 ausschließlich die Glykane der Aminosäuren 295 und 332 beteiligt sind. Bei einer Durchführung der Transzytoseversuche mit dimeren IgA bzw. pentameren IgM, könnte aufgrund der Größe der Antikörper die räumlich angrenzende Sequenz abgedeckt und die Transzytose inhibiert werden. Neben der Kreuzvernetzung, die ein Ausschleusen bzw. ein Freisetzen der Viren aus den infizierten Zellen verhindert, könnte diese Erklärung auch auf die von Wolbank und Kollegen durchgeführten Versuche mit 2G12 übertragen werden. Nach Freisetzung der Viren aus den infizierten Zellen, die möglicherweise durch die Beteiligung der Aminosäuresequenz ELDKWA nur durch mAk 2F5 gehemmt wird, greifen die für die Transzytose von zellfreien Viren in Anwesenheit von mAk 2G12IgM und IgA beschriebenen Mechanismen der Abdeckung der inhibierenden Domäne.

Als ein Rezeptor auf den Epithelzellen für das Virus wird das Glykosphingolipid Galactosylceramid (GalCer) von verschiedenen Arbeitsgruppen diskutiert. GalCer wird besonders auf der apikalen Oberfläche epithelialer Zellen exprimiert [Simons et al. 1988], es ist Bestandteil der Mikrodomänen, welche bei der Endozytose [Brown et al. 1998, Rietveld et al. 1998] und Transzytose [Verkade et al. 2000, Hansen et al. 1999] eine wichtige Rolle spielen. Die Arbeitsgruppe um Morgane Bomsel konnte die Transzytose von zell-assoziierten HIV-1 in Anwesenheit von Antikörpern gegen GalCer auf 12% reduzieren [Bomsel 1997]. Eine Verringerung der Transportrate konnte auch in Versuchen mit zellfreien Viren und Antikörper gegen GalCer gesehen werden, hier wurde der Transport jedoch nur auf 60% reduziert [Hocini et al. 2001]. Die Region auf gp120, welche mit dem GalCer-Rezeptor auf den epithelialen Zellen interagieren kann, ist seit 1993 bekannt. Die Aminosäuren 206 bis 275 binden an GalCer-Rezeptoren [Bhat et al. 1993]. Diese Aminosäuren liegen im Bereich der in dieser Arbeit verwendeten Oligopeptidpool 4 (AS 182 bis 231) und 5 (AS 232 bis 286). In Versuchen mit den beiden Oligopeptidpools sah man eine Reduktion des Transports gegenüber der Kontrolle. In Anwesenheit des Pools 4 konnte die Transzytose von HIV-1 auf 74% und in Anwesenheit von Pool 5 sogar auf 38% reduziert werden. Die GalCer-bindende Region besitzt einen Einfluss auf die Transzytose von HIV-1, es muss aber einen weiteren noch unbekannten zellulären Rezeptor für die Transzytose von HIV-1 durch die Epithelzellen geben, da die Reduktion mit den Oligopeptidgruppen 7 und 8 effektiver war. Mit Hilfe des Peptids sollte in Weiterführung der Arbeit der Rezeptor auf den Epithelzellen weiter charakterisiert werden können.

4.3 Etablierung eines Peptid-ELISAs zur Untersuchung von Seren auf Antikörper gegen Env362-420

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Seren bzw. Plasmen von HIV-1 infizierten Individuen den Transport von HIV-1 durch humane Amnion-Zellen inhibieren können. Es wurde postuliert, dass die Reduktion in Anwesenheit der HIV-1 positiven Seren auf ein Vorhandensein von spezifischen Antikörpern gegen die in den Transport involvierte Domäne auf gp120 beruht. Die Domäne auf gp120, welche den Transport von HIV-1 durch Bindung an einen zellulären Rezeptor initiieren kann, konnte in den Versuchen mit den überlappenden Oligopeptiden weiter charakterisiert werden. Zur Klärung der Frage, ob spezifische Antikörper in HIV-1 positiven Seren für die Inhibierung verantwortlich waren, wurde ein Peptid-ELISA etabliert. Aufgrund der Lektin-bindenden Eigenschaften des Peptids interagiert dieses Peptid auch mit Glykoanteilen der im Serum vorkommenden Immunglubuline der Klasse G (IgG). Dies führt zu hohen Backgroundwerten bei den HIV-1 negativen Seren und erschwerte die Etablierung des ELISAs. Zur Reduzierung des Backgrounds wurden nach Optimierung der übrigen Versuchsbedingungen ELISAs unter Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen an Harnstoff in den Probenverdünner, Waschpuffer und Konjugat durchgeführt. Durch Zugabe von Harnstoff sollten die unspezifischen Bindungen zwischen den Glykoanteilen der Immunglobulinen und dem Peptid gelöst werden. Eine Erniedrigung der Werte der negativen Seren konnte nicht beobachtet werden, jedoch eine Zunahme der Extinktionen bei HIV-1 positiven Seren. Die stark variierenden Werte bei den negativen Seren lassen sich durch unterschiedliche Mengen an IgG erklären. Bei HIV-1 positiven Seren konkurrieren die spezifischen Antikörper mit den noch im Serum vorhandenen Liganden (Glykoseitenketten) um die Bindung an das Peptid. Durch Harnstoff werden diese Bindungen wieder gelöst, es entsteht eine neue Konkurrenz um die freien Bindungsstellen und neue Möglichkeiten zur spezifischen Bindung. Spezifisch gebundene Antikörper sollten durch Harnstoff in den eingesetzten Konzentrationen nicht verdrängt werden.

↓97

Der mit Harnstoff-Zugabe optimierte Peptid-ELISA wurde zur Untersuchung der HIV-1 positiven Seren und Plasmen verwendet. Die HIV-1 positiven Seren der ersten Versuche als auch die Seren der Long Term Non-Progressor, die in den Transzytoseversuchen eine inhibierende Wirkung besessen haben, verfügen über Antikörper gegen das Oligopeptid. Es zeigte sich jedoch, dass die Seren der LTNPs im Mittel geringere Antikörpertiter gegen Env362-420 besaßen als die HIV-1 positiven Seren der ersten Versuche, obwohl die Seren der LTNPs die Transzytose um etwa den Faktor 5 besser inhibiert haben als die HIV-1 positiven Seren. Bei der Untersuchung der Plasmen der dokumentierten Serokonversion zeigte sich zudem, dass alle Plasmen, einschließlich derer, die den Transport inhibieren konnten, nicht über Antikörper gegen das Peptid verfügen. Im ELISA werden im Wesentlichen nur solche Antikörper reagieren, die gegen lineare Epitope gerichtet sind, Antikörper gegen konformationsabhängige Epitope jedoch nicht. Die Blockierung der Transzytose durch Antikörper bei den Serokonvertern konnte auf der Induktion vor allem von konformationsabhängigen Antikörpern beruhen. Auch die Diskrepanz zwischen der Inhibierung der Transzytose und den Antikörpertitern bei den Seren der LTNPs ließe sich mit konformationsabhängigen Antikörpern erklären.

Nachdem ein Zusammenhang zwischen der Inhibierung der Transzytose und dem Vorkommen von Antikörpern gegen Env362-420 gemessen werden konnten, sollte die Frage geklärt werden, ob die Anwesenheit von Antikörpern gegen die Transzytosedomäne einen Einfluss auf die Prognose einer Infektion mit HIV besitzt. Eine Infektion mit HIV-1 führt, ob mit oder ohne antiretrovirale Therapie, von Patient zu Patient zu sehr unterschiedlichen Krankheitsverläufen. Hierbei spielt die Dauer der Latenzphase vor Einsetzen der ersten HIV-assoziierten Symptome, die auf einen fortschreitenden Immundefekt schließen lassen, eine entscheidende Rolle. Bei der Etablierung des Peptid-ELISAs mit einer Reihe von HIV-positiven Seren wurde nicht in allen Seren Antikörper gegen Env362-420 nachgewiesen. Hier könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass eine Expression von Antikörpern gegen die Transzytosedomäne nicht bei jedem Patienten stattfindet und somit die unterschiedliche klinische Progression - neben weiteren Faktoren - damit zusammenhängen könnte. Bezüglich dieser Fragestellung wurden sowohl Verlaufsseren als auch dokumentierte Serokonversionen auf Antikörper gegen Env362-420 untersucht. Das erste Studienkollektiv beinhaltete Verlaufsseren von Patienten, die entweder über den gesamten Untersuchungszeitraum an AIDS erkrankt waren, die sich in der Latenz oder im LAS/ARC-Stadium befanden oder von Patienten, die in dieser Zeit eine Stadienprogredienz durchmachten. Einen Einfluss auf die Prognose der Krankheit durch Hemmung der Transzytose von HIV-1 im Körper HIV-infizierter Patienten konnte mit den Seren definierter Krankheitsverläufe über den Nachweis von Antikörpern gegen das lineare Oligopeptid Env362-420 nicht gesehen werden. Fast alle untersuchten Seren waren im Peptid-ELISA reaktiv, Patienten im AIDS-Stadium hatten nach den Patienten im LAS/ARS-Stadium im Mittel sogar die höchsten Extinktionen. Zur Stützung der Hypothese, dass Antikörper gegen Env362-420 einen positiven Einfluss auf die Prognose der Krankheit haben könnten, sollten die Seren aus der Latenzphase die höchsten und die Seren aus der Stadienprogredienz sowie der AIDS-Patienten die geringsten Extinktionen haben. Bei der Bewertung der Ergebnisse muss beachtet werden, dass die Patienten teilweise stark erhöhte IgG-Konzentrationen im Blut aufwiesen. Eine erhöhte IgG-Konzentration könnte aufgrund der Lektin-bindenden Eigenschaften von Env362-420 zu falsch erhöhten Extinktionen führen. Rechnet man die gemessenen Extinktion mit einem Faktor um, sodass sich die Extinktionen bei allen Proben auf einen IgG-Gehalt von 16 g/l beziehen, verringern sich die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (Tabelle 25). Es gibt bei Patienten in unterschiedlichen Phasen der HIV-Infektion nur geringfügige Unterschiede in der Antikörperexpression gegen das lineare Env362-420, somit ist kein Rückschluss auf die Prognose der Krankheit möglich. Die Untersuchung der Verlaufsseren ließ den Schluss zu, dass bei einer manifestierten Infektion die Transzytose keine Rolle bezüglich der Prognose der Krankheit spielt. Es bleibt jedoch noch die Frage offen, ob über den Nachweis von konformationsabhängige Antikörper ein Rückschluss auf die Prognose der Krankheit möglich wäre.

Tab. 25: Korrektur der ermittelten Extinktionen in den einzelnen Studienkollektiven.

Patientenkollektiv

Mittelwert gemessene Extinktion im Peptid-ELISA

Mittelwert IgG [g/l]

Mittelwert korrigierte Extinktion (bezogen auf 16 g/l IgG)

AIDS

0,503

23,6

0,344

Stadienprogression

0,413

25,1

0,288

Latenz

0,349

19,9

0,268

LAS/ARC

0,554

23,9

0,376

Aufgeführt sind die Mittelwerte der Extinktion von jedem Kollektiv, die Mittelwerte der IgG-Konzentrationen und die Mittelwerte bezogen auf einen IgG-Gehalt von 16 g/l (ausführliche Tabelle im Anhang unter Tab. 31).

↓98

Das zweite Studienkollektiv beinhaltete Seren dokumentierter Serokonversionen, die soweit auf unterschiedliche HIV-Marker untersucht waren, dass eine Laborphaseneinteilung nach Fiebig [Fiebig et al. 2003] möglich war. In Abbildung 44 ist die der Einteilung zugrunde liegende Laborphaseneinteilung grafisch dargestellt und in der Tabelle 26 die Progression der unterschiedlichen HIV-Marker in den einzelnen Phasen aufgeführt.

Abb. 44: Laborphasen der primären HIV-Infektion (Abbildung entnommen aus Fiebig et al. 2003) WB: Western Blot (N negativ, I unbestimmt, P* positiv ohne p31 Bande, P positiv mit p31 Bande), Ab: HIV-Antikörper, RNA: HIV-RNA, LS-Ab: HIV-Ak bestimmt mit einem sensitiven/weniger sensitiven ELISA, p24 Ag: HIV p24- Antigen. Erklärung der mit I bis VI benannten Laborphasen in Tabelle 26.

Tab. 26: Tabellarische Darstellung der Laborphasen einer primären HIV-Infektion (zu Abb. 44, Fiebig et al. 2003)

Laborphasen

Tage nach Infektion

Dauer [Tage]

Laborparameter

0

0

-

Zeitpunkt der Infektion

I

12

3-5

Nachweis HIV-spezifischer RNA im Blut

II

17

3-5

RNA-Nachweis und p24-Antigen-Test positiv, keine Antikörper

III

22

3-5

HIV-IgM-spezifischer ELISA positiv, Western Blot negativ

IV

27

3-5

wie III, fraglicher Western Blot

V

32

69,5

wie IV, reaktiver Western Blot ohne p31-Bande

VI

> 100

ohne Endpunkt

wie V, Western Blot mit p31-Bande

↓99

In der Tabelle 26 ist die Einteilung der untersuchten Seren in die einzelnen Laborphasen dargestellt. Von einer dokumentierten Serokonversion (Patient A-E aus Kapitel 3.6.1) sind Seren zu jeder Laborphase vorhanden. Bei den anderen Serokonversionen sind aus den frühen Phasen (I und II) keine Proben vorhanden, sonst entweder ab Phase III oder IV (mit Ausnahme von Patient f: erst ab Phase V). Gleichzeitig wurde in Tabelle 27 den einzelnen Phasen die Ergebnisse aus dem Peptid-ELISA zugeordnet. Gab es mehrere Seren zu einer Laborphase wurden, bei unterschiedlicher Antikörperexpression, diese in der Tabelle vermerkt. Die Antikörperproduktion gegen Env362-420 ist von Patient zu Patient sehr unterschiedlich. In den Seren der Patienten A-E und a sind zu keiner Abnahme Antikörper gegen Env362-420 nachweisbar. Die Patienten b und c dagegen verfügen schon in der frühen Laborphase III über Antikörper gegen die Transzytosedomäne. Nach der Laborphaseneinteilung dürften zu diesem Zeitpunkt nur IgM-Antikörper gegen HIV gebildet worden sein, die Reaktivität im Peptid-ELISA ist somit nur durch eine Detektion von IgM-Antikörpern gegen Env362-420 zu erklären. Der im Peptids-ELISA verwendete POD-konjugierte Antikörper soll laut Hersteller nur IgG detektieren, vielleicht ist jedoch bei einem hohen Background an IgM-Antikörpern eine Detektion dieser nicht auszuschließen. Während bei Patient c schon nach kurzer Zeit keine Antikörper mehr gegen die Transzytosedomäne nachweisbar sind, bleiben sie bei Patient b fast in jeder folgenden Probe nachweisbar. Auch die Seren der Patienten d, e und f verfügen ab Phase IV bzw. V über Antikörper. Hier sind Seren aus früheren Phasen nicht vorhanden.

Tab. 27: Einteilung der Seren der dokumentierten Serokonversionen in die Laborphasen der primären HIV-Infektion und Zuordnung der ELISA-Ergebnisse,

Phase der

Patient

Infektion

A-E

a

b

c

d

e

f

I

nb

nb

nb

nb

nb

nb

II

nb

nb

nb

nb

nb

nb

III

nb

+

+

nb

nb

nb

IV

(+)

+/-

nb

V

+

+/-

+

+/-

VI

+/-

+

+

Detaillierte Aufführung der Stadieneinteilung unter Tabelle 32 im Anhang, Patient A-E = Seren der dokumentierten Serokonversion aus Kapitel 3.6.1, Patienten a bis f nur im Peptid-ELISA getestete Seren aus Kapitel 3.8.7.3, nb Seren aus dieser Phase der Infektion sind nicht vorhanden, +: nur positive Ergebnisse aller Seren aus dieser Phase, (+): nur schwach positive Ergebnisse aller Seren aus dieser Phase, +/-: erste Seren dieser Phase positiv folgende negativ, —: nur negative Ergebnisse aller Seren dieser Phase.

Bei den Patienten mit einer frühen Antikörperbildung könnte die Ausbreitung von HIV im Körper – hier insbesondere in immunologisch privilegierte Bereiche - behindert werden. Bei der Ausbreitung von HIV im menschlichen Körper ist das Virus auch in Kompartimenten des menschlichen Körpers nachweisbar, die vom übrigen Körper immunologisch getrennt sind. Zu diesen Kompartimenten zählen das Gehirn, die Augen, der Hoden beim Mann und der Uterus (Fetus) bei der Frau. Diese Regionen werden durch physiologische Schranken (z.B. Blut-Hirn Schranke, Blut-Testis Schranke) vom peripheren Blut bzw. Immunsystem getrennt. Trotz dieser vorhandenen Schranken, die zusätzlich vor einem Eindringen von Pathogenen und Toxinen schützen soll, wird HIV in der Samenflüssigkeit des Mannes [Krieger et al. 1991] und im zentralen Nervensystem [An et al. 1999, Resnick et al. 1988] gefunden. Die Samenflüssigkeit setzt sich aus unterschiedlichen Flüssigkeiten und Zellen verschiedener Organe zusammen: reife Spermien aus dem Keimzell-Kompartment (Tubulus contortus = Ort der Spermiogenese im Hoden), Sekrete unterschiedlicher Drüsen (u.a. Prostata), abgeschilferte Epithelzellen der Harnröhre und Leukozyten. Im Falle einer HIV-Infektion kann sowohl zellfreies Virus als auch HIV-infizierte Lymphozyten und Makrophagen [Quayle et al. 1997, Mermin et al. 1991] in der Samenflüssigkeit nachwiesen werden. Über die Herkunft der HIV-infizierten Zellen und zellfreien Viren wird noch diskutiert. Als Ursprung kommen entweder die akzessorischen Drüsen und die Harnröhre oder der Hoden mit den Keimzell-Kompartment in Frage [Kiessling et al. 1995, Tomlinson et al. 1992, Olsen et al. 1984]. Da der Hoden unter einer speziellen immunologischen Regulation liegt, vermutet man, dass die Leukozyten dort ein isoliertes Reservoir – getrennt von den Leukozyten des peripheren Bluts – repräsentieren. In der Literatur wird die Vermutung aufgestellt, dass die HIV-infizierten Zellen lokal im Hoden produziert werden und somit das Resultat eines Transports von zellfreiem Virus über die Blut-Testis Schranke und einer anschließenden Infektion der im Hoden vorhandenen Lymphozyten und Makrophagen darstellen. Untersuchungen zur Viruslast im peripheren Blut im Vergleich zur Samenflüssigkeit als auch die Analyse der Gensequenzen der in den beiden Körperflüssigkeiten vorkommenden Viruspopulationen haben gezeigt, dass die Viruslast in der Samenflüssigkeit von der im Blut unabhängig ist und die Leukozyten in der Samenflüssigkeit ein getrenntes HIV-Reservoir zum peripheren Blut darstellen [Byrn et al. 1998, Kiessling et al. 1998, Byrn et al. 1997]. Als ein vom übrigen Körper distinktes HIV-Reservoir für Reinfektionen wird auch das Zentrale Nervensystem (ZNS) diskutiert. Das ZNS gehört zu den immunologisch privilegierten Bereichen und wird durch die Blut-Hirn Schranke vom peripheren Blut getrennt. Einige Publikationen konnten zeigen, dass HIV von den Endothelzellen der Blut-Hirn Schranke über einen ähnlichen Mechanismus wie bei der Transzytose von HIV durch Epithelzellen aufgenommen und auf der anderen Seite infektiös wieder freigesetzt werden kann [Banks et al. 1997]. Im ZNS kann nun die Infektion von Mikroglia-Zellen und Makrophagen erfolgen [An et al. 1999, Bagasra et al. 1996, Moses et al. 1994, Wiley et al. 1986]. Virale Proteine wie gp160 sind toxisch für die Zellen des ZNS und mit fortschreitender Infektion wird die Blut-Hirn Schranke für die weitere Invasion von HIV zerstört und es kommt zu einer Dysfunktion des ZNS. Die Infektion des Gehirns mit HIV kann zu einer HIV-assoziierten Enzephalopathie (HIVE) führen. HIVE tritt bei 15-20% der nicht therapierten Patienten im Stadium der kompletten Immunsuppression auf. Bei den Patienten, die schon in der frühen Infektionsphase über Antikörper gegen die Transzytosedomäne verfügten, könnte die Ausbreitung der Viren in die „abgeschotteten“ Kompartimente im Körper inhibiert werden. Das Anlegen von Virusreservoiren, die vom Immunsystem und der antiretroviralen Therapie abgetrennt sind, ist dadurch eingeschränkt. Hier wäre dadurch ein positiver Einfluss auf die Prognose der Krankheit möglich. Mit Hilfe der untersuchten Serokonversionen kann nur eine Aussage über den unterschiedlichen Beginn der Antikörperexpression getroffen werden, jedoch liegen keine weiteren Daten zur Krankheitsentwicklung vor. Alle untersuchten Patienten wurden schon in der Phase der Serokonversion therapiert.

4.4 Entwicklung von Immunseren gegen Env362-420

↓100

Zur Entwicklung von Antikörpern, die die Transzytose von HIV-1 durch epitheliale Zellen hemmen, wurden Kaninchen mit Env362-420mod. immunisiert. Die Immunseren wurden – wie auch die Präseren – im Peptid-ELISA, im Synzythien-Inhibierungsassay, im Western Blot und im Immunfluoreszenztest untersucht. Bei den Immunseren zeigte sich ein Unterschied zwischen dem im Peptid-ELISA ermittelten hohen Antikörpertiter und der im Immunfluoreszentest ermittelten Bindung an virales gp120. Bei der Immunisierung der Kaninchen mit dem linearen Peptid werden im wesentlichen Antikörper gegen lineare Epitope gebildet. Die Konformation des Peptids stimmt nicht mit der nativen, dreidimensionalen Struktur dieser Domäne überein und es ist somit wahrscheinlich, dass die gebildeten Antikörper nicht effizient an gp120 binden. Die Glykosylierung des gp120 könnte ebenfalls die Spezifität der Bindung beeinträchtigen. Bei der Durchführung des Peptid-ELISA mit Platten, die mit Env362-420 und nicht mit Env362-420mod. beschichtet waren, zeigte sich eine Reduktion des Antikörpertiters bei Tier 1 von 1:128.000 um den Faktor 16 auf 1:8000. Schon der Austausch von vier Aminosäuren führt zu einer geringeren Bindung an ein lineares Peptid, so ist eine Reduktion der Bindung der Antikörper an natives gp120 von HIV-1IIIB, welcher die Sequenz von Env362-420 trägt, nicht überraschend.

Werden die Immunseren in den Konzentrationen in Transzytoseversuche eingesetzt, die auch ein positives Signal im IFT hervorgerufen haben, so kann der Transport von HIV-1 im Vergleich zur Kontrolle mit den Präseren um den Faktor 8 reduziert werden. Die Transzytose von HIV ist durch Immunseren, die gegen die Domäne Env362-420 auf gp120 gerichtet sind, prinzipiell zu hemmen. Weitere Untersuchungen zur Eingrenzung der Epitope auf gp120, die an dem Transport von HIV-1 beteiligt sind, wären im Hinblick auf eine Impfung (passiv oder aktiv) notwendig. Immunseren, die nur gegen einen Teil der Sequenz gerichtet sind, könnten den Transport effektiver inhibieren. Es wäre zudem zu diskutieren, ob Antikörper, die durch Immunisierung mit einem nicht-linearen Peptid (dh. mit einer Disulfidbrücke zwischen dem Cystein an Position 385 und dem Cystein an Position 418), erhalten werden, die Transzytose effizienter inhibieren können.

4.5 Transzytose von HIV-1IIIB durch menschliche Eihaut

Die mit dem Amnion-Modellsystem zur Untersuchung der Transzytose erzielten Ergebnisse wurden in Versuchen mit menschlicher Eihaut auf komplexe Gewebe übertragen. Hierzu wurde der Transport von HIV-1IIIB durch die menschliche Eihaut unterschiedlicher Spenderinnen nach Vorinkubation der Viren mit den Immunseren oder den dazugehörigen Präseren untersucht. Eine Reduktion der Transzytose in Anwesenheit der Immunseren konnte nicht festgestellt werden. Demnach muss ein zweiter Rezeptor auf epithelialen Zellen existieren, der ebenfalls den Transport von HIV-1 initiieren kann. In Kapitel 4.3 wird das Glykosphingolipid Galactosylceramid (GalCer) als weiterer Rezeptor für die Transzytose von HIV-1 beschrieben. Dieser Rezeptor wird ebenfalls auf epithelialen Zellen exprimiert. Die unterschiedlichen Ergebnisse in der Hemmung der Transzytose mit Env362-420 bzw. mit Immunseren gegen diese Domäne können damit erklärt werden, dass beide Rezeptoren den Transport von HIV-1 initiieren können. Welcher Rezeptor hauptsächlich zum Transport gebraucht wird, hängt von der Expression dieser Rezeptoren auf der jeweiligen epithelialen Zelle ab. Im verwendeten Modellsystem zur Identifizierung der involvierten Domäne auf gp120 wurden permanente Amnionzellen eingesetzt, die den Rezeptor exprimieren, der von Env362-420 erkannt wird. Im Eihautmodell besteht jedoch die Zellschicht aus dem - der mütterlichen Seite zugewandten - Chorion und dem – der kindlichen Seite zugewandten – Amnion. Zur Erreichung des unteren Kompartiments des Versuchsaufbaus müssen die Viren erst die Chorion- und anschließend die Amnionschicht überwinden. Die unterschiedlichen Ergebnisse zu dem Modellsystem mit Amnionzellen können damit erklärt werden, dass der Transport durch die Chorionschicht durch einen alternativen Rezeptor initiiert wird. Ein möglicher Grund dafür könnte eine geringere Expression des „Env362-420-Rezeptors“ sein. Bei dem alternativen Rezeptor könnte es sich dann um das oben bereits erwähnte Galactosylceramid handeln. Da die Sequenz auf gp120, welche mit GalCer interagiert, bekannt ist, könnte diese Vermutung durch Transzytoseversuche mit menschlichen Eihaut entweder mit den der Sequenz entsprechenden Oligopeptiden oder einem neu synthetisierten Peptid untersucht werden. Hinweise auf Unterschiede im Transportmechanismus zwischen Epithelzellen unterschiedlicher Herkunft zeigten sich auch schon während einer in der Arbeitsgruppe durchgeführten Doktorarbeit [Seeger 2003]. Hier wurde der Einfluss von bestimmten Inhibitoren auf den Transport von HIV-1 und HSV-1 durch Mundschleimhautepithelzellen und menschlicher Eihaut untersucht. Dabei fördert z.B. Mucin den Transport von HSV-1 durch die menschliche Eihaut und inhibiert den Transport durch primäre Mundschleimhautepithelzellen. Auch hier wurden unterschiedliche Rezeptoren für den Transport auf den verwendeten Epithelzellen diskutiert.

4.6 Zusammenfassung und Ausblick

↓101

In dieser Arbeit konnte erstmals eine Domäne auf gp120 identifiziert werden, welche in den Transport von HIV-1 durch Amnionzellen involviert ist. Durch Sequenzalignments zwischen dieser Sequenz und den Konsensussequenzen der HIV-1 Subtypen aus der Gruppe M konnten die über alle getesteten Subtypen konservierten Aminosäuren ermittelt werden. Unter der Annahme, dass diese Domäne über die Subtypen konserviert ist und unter Berücksichtigung der Alignments könnte das Epitop auf 25 konservierte Aminosäuren reduziert werden. Es würde sich dabei um diskontinuierliche Erkennungsstrukturen bestehend aus 2 konservierten Bereichen zwischen den Aminosäuren 362 und 420 handeln. Env362-420 hemmt die Infektion von CD4-positiven Zellen nicht, Antikörper gegen diesen Bereich besitzen keine messbare neutralisierende Wirkung. In Seren von HIV-1 positiven Individuen, die den Transport von HIV-1IIIB durch epitheliale Zellen inhibiert haben, konnten Antikörper gegen Env362-420 nachgewiesen werden. Ebenso konnte die Transzytose von HIV-1 durch Immunseren, die durch Immunisierung von Kaninchen mit Env362-420mod. gewonnen wurden, inhibiert werden. Damit konnte die Hypothese aus Kapitel 4.1 gestützt werden, dass der Transport durch Antikörper gegen diese Domäne gehemmt werden kann. Ob ein Zusammenhang zwischen der Expression von Antikörpern gegen Env362-420 und dem Risiko einer vertikalen Transmission von HIV-infizierten Müttern bestehen könnte, wäre möglich, müsste jedoch noch geklärt werden. Untersuchungen von Verlaufsseren auf Antikörper gegen Env362-420 haben gezeigt, dass Patienten mit einer etablierten Infektion unabhängig vom Krankheitsstadium über Antikörper gegen diesen Env-Bereich verfügen und somit ein Einfluss auf die Prognose der Krankheit nicht zu belegen ist. Jedoch im Gegensatz dazu gibt es in der frühen Infektionsphase Unterschiede im Zeitpunkt der beginnenden und der Dauer der Antikörperexpression. In dieser Phase könnte durch Hemmung der Transzytose eine Ausbreitung von HIV in immunologisch privilegierte Bereiche wie das Gehirn und der Hoden beeinträchtigt werden. Darüber hinaus kann die Inhibierung des Transportes über die Blut-Hirn Schranke eine antiretrovirale Therapie in ihrem Erfolg unterstützen. Studien haben gezeigt, dass der Wirkstoffspiegel der antiretroviralen Medikamente im ZNS deutlich geringer liegen als im Serum, so dass die Gefahr besteht, dass die wirksame antivirale Konzentration nicht erreicht wird und sich dort ein Virusreservoir – unabhängig vom Selektionsdruck durch die Medikamente – halten kann. Im Weiteren kann durch Inhibierung des Transportes von HIV über die Blut-Testis Schranke die Viruslast in der Samenflüssigkeit reduziert werden. Es ist beschrieben, dass von der Viruslast im Blut kein Rückschluss auf die Viruslast in der Samenflüssigkeit gezogen werden kann. So führt eine Reduktion der Viruslast während der antiretroviralen Therapie im Blut nicht zwangsläufig auch zu einer verminderten Infektiösität der Samenflüssigkeit [Byrn et al. 1998, Liuzzi et al. 1996, Hamed et al. 1993]. Mit der Identifizierung der Domäne Env362-420 auf gp120 ist man der Identifizierung des Rezeptors auf der epithelialen Zellöberfläche, der den Transport von HIV initiiert, einen großen Schritt näher gekommen und somit auch der Aufklärung des Transportmechanismuses. Diese Erkenntnisse ermöglichen in der Zukunft die Etablierung neuer Interventionsmaßnahmen gegen die Übertragung von HIV von der Mutter auf das Kind. Als in Frage kommende Strategien wäre eine aktive oder passive Immunisierung bzw. das Design von synthetischen Inhibitoren zu nennen. Die Durchführung von Inhibitionsversuchen mit Env362-420 bzw. der Immunseren mit menschlicher Eihaut lassen die Vermutung zu, dass ein weiterer – möglicherweise bereits in der Literatur beschriebener - Rezeptor für den Transport verantwortlich ist. In weiteren Untersuchungen zum Einfluss der Transzytose auf den Krankheitsverlauf muss geklärt werden, welcher Rezeptor auf den unterschiedlichen Epithelzellen jeweils den Transport von HIV initiiert. Im Bezug auf die Prävention einer Infektion mit HIV sollte der Transport durch Schleimhautzellen in Anwesenheit von Env362-420 näher untersucht werden. Erste Hinweise darauf, dass Epithelzellen, die bei der sexuellen Übertragung von HIV eine Rolle spielen (Zellen des weiblichen Genitaltraktes sowie Zellen des Intestinaltraktes), Env362-420mod. binden können und somit in der Lage sind, HIV über diesen Mechanismus zu transportieren, zeigen die Immunfluoreszenzbilder im Kapitel 3.8.9. Die Infektion des Menschen mit HIV könnte demnach nach folgendem Mechanismus ablaufen: das Glykoprotein gp120 bindet über die Domäne Env362-420 an epitheliale Zellen und initiiert dadurch die Transzytose des Viruspartikels durch die Epithelzelle bzw. durch Zellschichten. Dendritische Zellen in der Epithelschicht können dann gp120 über DC-SIGN binden und im Organismus weiter verbreiten (siehe Abb. 45).

Abb. 45: Schematische Darstellung einer HIV-Infektion über eine intakte Schleimhaut. 1. Zellfreie Viren aus Körperflüssigkeiten wie z.B. Samenflüssigkeit. 2. Binden der zellfreien Viren über die Transzytosedomäne Env362-420 an einen zellulären Rezeptor mit anschließender Transzytose durch die epitheliale Zelle. 3. Freisetzung der infektiösen Viren auf der basolateralen Seite. 4. Binden der freien Viren an DC-SIGN auf dendritischen Zellen der Submucosa. 5. Transport von HIV, gebunden an dendritische Zellen, durch die lymphatischen Gefäße zu den Lymphknoten. 6. Infektion von CD4+ T-Lymphozyten im Lymphknoten. 7. Infektion von in der Submucosa vorkommender CD4+ T-Lymphozyten.


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13.03.2008