Henklein, Petra: N-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese

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Kapitel 2. Ergebnisse und Diskussion

2.1 Vergleich der Reaktivität von Fmoc-Aminosäurefluorid und -chlorid

Obwohl die Reaktivität vom Säurefluorid zum Säurejodid in der Reihe der Halogenide steigt, werden unter bestimmten Voraussetzungen in einigen Fällen für Fmoc-Aminosäurefluoride, in anderen Fällen für Fmoc-Aminosäurechloride bessere Ergebnisse für die Kupplung sterisch anspruchsvoller Aminosäuren erzielt.

Ein Vergleich der Umsetzungen von Fmoc-geschützten Alaninhalogeniden (Chlorid, Fluorid) mit MeAib-OMe in Anwesenheit von BSA zeigt, daß die Reaktion des Aminosäurechlorides zu höheren Kupplungsausbeuten führt [78] , [79] . Für die Umsetzungen von alpha, alpha-Dialkylaminosäurehalogeniden wie Fmoc-Aib-F/Cl mit MeAib-OMe läßt sich dieser Befund nicht bestätigen. Hier erhält man für das Fmoc-geschützte Aminosäurefluorid deutlich höhere Kupplungsausbeuten als für das entsprechende Aminosäurechlorid ( Abb. 10 ).

Abb. 10: Kupplung von a) Fmoc-Aib-X an Aib-OMe und b) Fmoc-Ala-X an MeAib-OMe in DCM mit BSA als HCl-Fänger

Eine Erklärung für die unterschiedlichen Kupplungsergebnisse könnte darin liegen, daß die Reaktion des Aminosäurechlorids nur zu höheren Umsetzungen führt, solange die Acylierungsreaktion schneller als die Oxazolonbildung des Aminosäurechlorides verläuft. Dies ist bei Fmoc-Ala-Cl gegeben. (Es können auch Oxazolone als Acylierungsmittel verwendet werden, aber sie besitzen im Vergleich zu Aminosäurehalogeniden eine geringere Reaktivität.) Da aber für Fmoc-Aib-Cl (siehe auch geminaler Dialkyleffekt 1.2.2 ) die Oxazolonbildung so schnell erfolgt, daß nur ein Teil (ca. 30%) Säurechlorid für die Acylierung zur Verfügung steht, ist ein echter Vergleich der Säurechlorid- und Säurefluoridaktivierung hinsichtlich der Acylierungseffizienz in diesem Fall nicht möglich.

Es ist deshalb notwendig, den Vergleich der Reaktivität von Aminosäurefluorid und Aminosäurechlorid mit solchen Schutzgruppen durchzuführen, mit denen eine als Konkurrenzreaktion ablaufende Oxazolonbildung ausgeschlossen werden kann.

2.2 Eigenschaften Arensulfonyl-geschützter Aminosäurehalogenide

Im Rahmen der Arbeit wurden mehrere Arensulfonylschutzgruppen auf ihre Anwendbarkeit für die Säurechloridaktivierung und weitere Nutzung in der Peptidchemie


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überprüft. In diesem Kapitel wird auf die verschiedenen Schutzgruppen eingegangen, die während der Untersuchungen verwendet wurden. Neben der Tosylschutzgruppe wurde die Pbf-Schutzgruppe (2, 2’, 4, 6, 7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl-) und sowohl o-, bzw. p- wie auch o, p-nitrosubstituierte Arensulfonylschutzgruppen eingesetzt ( Abb. 11 ).

Abb. 11: Im Rahmen der Arbeiten verwendete Arensulfonylschutzgruppen

Im Verlauf der Arbeit zeigte sich, daß die verschiedenen Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloride in ihren Reaktivitäten voneinander abweichen. Neben der Säurechloridaktivierung scheinen für die unterschiedlich hohe Reaktivität auch elektronische Effekte der entsprechenden Arensulfonyl-N-Schutzgruppe verantwortlich zu sein. Während es sich beim Tosyl- und Pbf-Schutz mit der Methyl- bzw. Methoxygruppe um Substituenten mit positiven Induktionseffekt handelt, liegen bei der NBS- bzw. DNBS-Gruppe Substituenten mit negativen Induktionseffekt am Aromaten vor. Die unterschiedlich starken elektronischen Effekte der Schutzgruppen haben eine zusätzliche Veränderung der Elektrophilie des Carbonylkohlenstoffes zur Folge. Dies führt zu einer unterschiedlich hohen Empfindlichkeit der Aminosäurechloride gegenüber Basen (siehe Nebenreaktionen 2.3.5 .). Die verschiedenenen Substituenten am Benzenrest bedingen auch eine unterschiedliche Stabilität (siehe Deblockierungen Kap. 2.4 .).

2.2.1 Tosyl-geschützte Aminosäuren

Um die bereits in der Einleitung aufgeführten Nebenreaktionen (Oxazolonbildung) bei der Überführung von urethangeschützten Aminosäuren in das Säurechlorid zu vermeiden, war ein Wechsel zu einer Schutzgruppe ohne einen reaktionsfähigen Carbonylsauerstoff notwendig.

Mit der Tosylschutzgruppe wurden Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die für Säurehalogenide bekannte höhere Reaktivität der Säurechloride im Vergleich zu den Säurefluoriden speziell für alpha-Aminosäurehalogenide nachzuweisen.

Die Eignung der Tosylschutzgruppe für die Herstellung von geschützten Aminosäurechloriden ist aus früheren Untersuchungen bekannt. SHEPPARD et al. beschrieben erstmals die erfolgreiche Kupplung von Tos-Aib-Cl an Aib-OMe im inerten organischen Lösungsmittel [65] .

2.2.2 Pbf-geschützte Aminosäuren

Der Nachteil der Tosylschutzgruppe, der ihre Anwendung begrenzt, sind die relativ


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drastischen Bedingungen bei der Entfernung des Tosylschutzes [80] , [81] . Für eine Peptidsynthese ist deshalb ein Wechsel zu solchen Arensulfonylschutzgruppen notwendig, die unter milderen Bedingungen abspaltbar sind.

Es konnte gezeigt werden [82] , daß durch Substitutionen am Phenylring die Abspaltbarkeit der Schutzgruppe verändert werden kann. So wurden in den letzten Jahren neue, von der Arensulfonylgruppierung ausgehende Schutzgruppen entwickelt ( Abb. 12 ). Die meisten dieser Schutzgruppen (Mts, Mtr, Pmc) kommen heute für den Schutz der Guanidinfunktion des Arginins zur Anwendung.

Abb. 12: Verschiedene Arensulfonylschutzgruppen

Die kürzlich entwickelte Mts-Schutzgruppe kann nur durch Methansulfonsäure bzw. Trifluormethansulfonsäure abgespalten werden [83] . Dagegen läßt sich die Mtr-Schutzgruppe, die eine Methoxygruppe mehr besitzt, schon durch Trifluoressigsäure abspalten [83] . Ramage und Mitarbeiter berichteten, daß die von ihnen vorgestellte Pmc-Schutzgruppe schneller und effizienter als die Mtr-Gruppe abspaltbar ist [84] . Vor kurzem wurde die Anwendbarkeit der Pmc-Schutzgruppe für den Nalpha-Schutz beschrieben [85] . Die Abspaltung vom alpha-Stickstoff ist aber nur durch Verwendung von HBr/Eisessig möglich.

Für die vorliegende Arbeit wurde die Pbf-Schutzgruppe (siehe Abb. 11 ) genutzt. Da diese Schutzgruppe aufgrund ihrer rigideren Struktur im Ether-5-Ring noch säurelabiler ist als die Pmc-Schutzgruppe [86] , sollte auch ihre Abspaltung vom alpha-Stickstoff der Aminosäure leichter erfolgen.

2.2.3 - und 4-Nitrobenzensulfonylaminosäuren

Die in der Literatur beschriebenen 2- bzw. 4-Nitrobenzensulfonylschutzgruppen (NBS) sollten eine gute Alternative zur Pbf-Schutzgruppe sein, da sie durch nucleophile Substitution abgespalten werden können [87] . Diese ursprünglich für Alkylierungen von Sulfonamiden entwickelten Schutzgruppen lassen sich mittels Thiolat über einen Additions-Eliminierungs-Mechanismus am Aromaten entfernen. Die Reaktion verläuft über den sogenannten Meisenheimer-Komplex, welcher unter Freisetzung von SO2 zerfällt, wobei das gewünschte Amin und ein Thioether entstehen ( Abb. 13 ). Als Nucleophil wurden sowohl Thiophenol als auch Mercaptoessigsäure genutzt.


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Abb. 13: Schema der Schutzgruppenabspaltung durch nucleophile Substitution

Die bisher von verschiedenen Gruppen durchgeführten Untersuchungen wurden nur an N-Alkylaminosäuren durchgeführt, bei denen die Abspaltung der NBS-Schutzgruppe ohne Probleme verlief. Unser Ziel war es, die Anwendbarkeit dieser Schutzgruppe auch für nicht alkylierte Aminosäuren zu testen.

2.2.4 Dinitrobenzensulfonylaminosäuren

Da die Abspaltung der o- bzw. p-NBS-Schutzgruppe von primären Aminosäuren sehr viel langsamer erfolgt als für N-alkylierte Aminosäuren, suchten wir nach einer alternativen Schutzgruppe, die schneller von primären Aminosäuren abgespalten werden kann. FUKUYAMA et al. berichteten kürzlich von der Verwendung des o-, p-Dinitroanalogen der NBS-Schutzgruppe, der DNBS-Gruppe [88] .

Abb. 14: Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe

Durch die zweite Nitrogruppe wird die Basizität des Aromaten noch weiter herabgesetzt, das Reaktionszentrum wird positiviert und die negative Ladung des bei der Reaktion als Zwischenprodukt entstehenden Anions kann besonders gut delokalisiert werden ( Abb. 14 ). Die DNBS-Schutzgruppe sollte sich somit leichter von Stickstoff der alpha-Aminofunktion abspalten lassen.

2.2.5 Synthese Arensulfonyl-geschützter Aminosäuren und ihrer Halogenide

Man kann Arensulfonyl-geschützte Aminosäuren grundsätzlich auf 2 Wegen erhalten. Am


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bekanntesten ist die Sulfonierung nach dem Schotten-Baumann-Prinzip. Im Verlauf der Arbeit zeigte sich jedoch, daß mit dieser Methode nicht immer optimale Ausbeuten möglich sind, da bei der Aufarbeitung Schwierigkeiten auftraten. Die Isolierung der Produkte war problematisch, da die Fällung selten vollständig verlief (Ausbeuten < 20%). Wir verwendeten deshalb eine Sulfonierungsmethode im nicht wäßrigen Lösungsmittelsystem. Bei dieser Methode wird als Lösungsmittel Acetonitril verwendet. Die Löslichkeit der zu sulfonierenden Aminosäure wird dabei durch Zugabe von BSA zur Reaktionslösung erhöht (siehe auch 5.3.3 ).

Sowohl die Tosyl- als auch die Pbf-Aminosäuren wurden nach dem Schotten-Baumann-Prinzip hergestellt ( Tab. 3 ). Für die NBS- und die DNBS-Aminosäuren nutzten wir die neu entwickelte Synthesemethode (siehe 5.3.4 ). Die erhaltenen Arensulfonyl-geschützten Aminosäuren wurden mittels bekannter analytischer Methoden charakterisiert (IR, MS, HPLC, CHN und 1H-NMR).

Tab. 3: Überblick über die während der Arbeit synthetisierten Arensulfonyl-geschützten Aminosäuren

Aminosäure

Ausbeute

Aminosäure

Ausbeute

Aminosäure

Ausbeute

Tos-Ala-OH*

47%

o-NBS-Aib-OH

93%

p-NBS-MeAib-OH

58%

Tos-Aib-OH*

31%

o-NBS-MeAib-OH

73%

DNBS-Val-OH

93,6%

Pbf-Aib-OH*

30%

o-NBS-Ala-OH

91%

DNBS-Aib-OH

89,7%

Pbf-MeAib-OH*

31,7%

o-NBS-Val-OH

91%

DNBS-MeAib-OH

50,6%

 

 

p-NBS-Aib-OH

93%

 

 

* Die Aminosäuren wurden nach der Schotten-Baumann-Methode synthetisiert.

Die Fluoride der Tosyl- und Pbf-Aminosäuren wurde mittels Cyanurfluorid und Pyridin hergestellt. Versuche, das Fluorid mit DAST herzustellen, führten zu öligen Produkten.

Der Gehalt an Fluorid wurde mittels HPLC nach Umwandlung in den entsprechenden Methylester ermittelt. Die Fluoride konnten mit einer Ausbeute von 75-80% erhalten werden. Die Charakterisierung der Aminosäurefluoride erfolgte mittels IR-Spektroskopie. Es wurde die für Aminosäurefluoride charakteristische Bande bei 1840-1850cm-1 (siehe Abb. 15 ) gefunden.


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Abb. 15: Arensulfonyl-geschützte Aminosäurefluoride am Beispiel von Tos-Aib-F a) IR-Spektrum; b) HPLC-Profil

Alle synthetisierten Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloride wurden durch Umsetzung mit Thionylchlorid (SOCl2) in trockenem DCM hergestellt. In der Literatur wurden bisher lediglich Synthese und Anwendung von Tosylaminosäurechloriden [65] sowie einmalig die Synthese eines o-NBS-geschützten Aminosäurechlorides [89] beschrieben.

Die Aminosäurechloride wurden mittels IR-Spektroskopie charakterisiert und zeigten die für Säurechloride charakteristische Bande bei 1795-1805cm-1 ( Abb. 16 ). In einigen Fällen wurden NMR-Spektren aufgenommen.


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Abb. 16: Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride am Beispiel von Tos-Aib-Cl a) IR-Spektrum; b) HPLC-Profil

2.3 Kupplungen mit Arensulfonyl-geschützten Aminosäurehalogeniden

2.3.1 Tosylaminosäurehalogenide

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kupplungen sterisch anspruchsvoller Aminosäuren untersucht. Dazu zählen vor allem die Kupplungen von alpha, alpha-Dialkylaminosäuren an N-methylierte alpha, alpha-Dialkylaminosäuren. Die Tosylschutzgruppe sollte einen nebenreaktionsfreien Vergleich von Aminosäurefluorid und -chlorid gestatten. Die Kupplung von Tos-Aib-F/Cl an Aib-OMe und MeAib-OMe wurde dazu als Modellkupplung untersucht. Die Umsetzungen mit Aib-OMe wurden in DCM und die Reaktion mit MeAib-OMe in Toluen durchgeführt. Im letzteren Fall kam es bei der Freisetzung des MeAib-Methylesters mit DIEA in DCM zu einer teilweisen Hydrolyse des Esters. Ein Wechsel zu Toluen führte zu einer Unterdrückung der Nebenreaktion, wobei durch einen einfachen Filtrationsschritt Hydrolyseprodukte entfernt werden konnten. Die durch RAJESWARI [52] eingeführte und durch Wenschuh et al. [90] für die Kupplung sterisch gehinderter Aminosäurefluoride beschriebene Umsatzverbesserung durch Silylierung der Aminokomponente mit BSA wurde für das Tosylaminosäurechlorid nicht bestätigt. Die Kupplungsausbeuten der Tosylaminosäurechloride mit DIEA bzw. BSA als Fänger des entstehenden Hydrochlorides waren vergleichbar. Die Maskierung der


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basischen Aminofunktion ist demnach für Tosylaminosäuren überflüssig, da die Oxazolonbildung durch die Struktur der Schutzgruppe ausgeschlossen ist. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die früher erwähnte Bildung von Silylfluorid als Ursache für die Umsatzverbesserung im Falle der Fmoc-Aminosäurefluoride eher unwahrscheinlich ist.

Für die Kupplung von Tos-Aib-X (X=Cl, F) an Aib-OMe wurden sowohl für das Aminosäurefluorid als auch für das Aminosäurechlorid gute Ausbeuten erhalten. Aus Abb. 17 ist ersichtlich, daß das Aminosäurechlorid wesentlich schneller reagiert. Dies wird beim Übergang zum N-methylierten, sterisch stärker gehinderten MeAib-OMe noch deutlicher.

Abb. 17: Kupplungseffizienz von Tos-Aib-X an a) Aib-OMe (DCM) und b) MeAib-OMe (Toluen); unter Verwendung von DIEA

In vergleichbarer Zeit zeigt das Aminosäurefluorid kaum nennenswerte Reaktion, währenddessen durch Säurechloridaktivierung das Modellpeptid Tos-Aib-MeAib-OMe ( Abb. 18 ) mit einer Ausbeute von über 80% erhalten werden konnte. Bisher gelang die Synthese dieses Dipeptides bei Reaktionszeiten von 2 Wochen nur mit Ausbeuten von ca. 3% [57] .

Abb. 18: Massenspektrum des Rohpeptides Tos-Aib-MeAib-OMe


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Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß mit der Tosylschutzgruppe im Gegensatz zu den Fmoc-Derivaten die höhere Reaktivität des Aminosäurechlorides im Vergleich zum entsprechenden Aminosäurefluorid voll zur Wirkung kommt.

2.3.2 Pbf-Aminosäurehalogenide

Ein Vergleich der Pbf- mit der Tosylschutzgruppe ergab keine Unterschiede in den Ausbeuten für die Kupplung von Pbf-Aib-X (X = Cl, F) an Aib-OMe×HCl ( Abb. 19 a). Die Reaktionen mit Aib-OMe×HCl wurden in DCM durchgeführt, als HCl-Fänger wurde DIEA verwendet.

Die Umsetzungen von Pbf-Aib-X mit MeAib-OMe×HCl wurden wie schon für Tos-Aib-Cl beschrieben in Toluen durchgeführt. Das Hydrochlorid wurde mit DIEA freigesetzt (siehe 5.4.1 ). Für die Kupplung wurde einerseits mit einem Überschuß an Aminokomponente gearbeitet, so daß ein Basenzusatz für das Abfangen der entstehenden HCl entfiel. Andererseits wurden auch DIEA und BSA als HCl-Fänger getestet. Der Einsatz dieser HCl-Fänger führte aber zu keiner Umsatzerhöhung.

Abb. 19: Kupplungseffizienz von RSO2-Aib-X an a) Aib-OMe (DCM) und b) MeAib-OMe (Toluen); als Base wurde DIEA verwendet

Die Reaktion des Aminosäurefluorides mit MeAib-OMe führte, wie auch schon im Fall der Tosyl-geschützten Verbindung, zu Ausbeuten < 2%. Damit wird die Grenze der Anwendbarkeit der Aminosäurefluoride bei sterischer Hinderung der Kupplungskomponenten nochmals belegt.

Kupplungen von Pbf-MeAib-Cl an Aib-OMe×HCl wurden im Vergleich zu den Fmoc-geschützten Aminosäurefluoriden untersucht. Während mit Fmoc-MeAib-F und BSA in DCM nach 2 Stunden nur 35% des gewünschten Dipeptides gebildet wurden [91] , [92] , reagierte das Pbf-MeAib-Cl wesentlich schneller ( Abb. 20 ). In DCM erhielten wir nach 15 Minuten das gewünschte Produkt mit einer Ausbeute von 95%.


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Abb. 20: Vergleich der Kupplungsausbeuten für das Dipeptid Fmoc/Pbf-MeAib-Aib-OMe in DCM mit BSA (Fmoc) bzw. DIEA (Pbf) als HCl-Fänger

Durch die Kombination von Pbf-Schutzgruppe und Säurechloridaktivierung konnte ein Durchbruch bei der Kupplung sterisch stark gehinderter Aminosäuren erzielt werden. Erstmalig konnte durch Säurechloridaktivierung der Pbf-geschützten Aminosäure auch Pbf-MeAib an MeAib-OMe gekuppelt werden. Abb. 21 stellt ein Modell des Raumbedarfes dar, welche die 4 zusätzlichen Methylgruppen im MeAib-Dipeptid im Vergleich zum Alanylalanin verursachen.

Abb. 21: Vergleich des Raumbedarfes von Ala-Ala-OH und MeAib-MeAib-OH

Die Bildung des Dipeptides erfolgte unter moderaten Bedingungen in relativ kurzer Zeit (2,5h). Durch HPLC-Analyse konnte eine Ausbeute von 62% nachgewiesen werden. Um Nebenreaktionen zu vermeiden, wurde, wie schon bei der Reaktion von Pbf-Aib-Cl mit MeAib-OMe, mit einem Überschuß an Aminokomponente gekuppelt, so daß keine zusätzliche Base zum Abfangen der während der Reaktion freiwerdenden HCl benötigt wurde.

Das Dipeptid Pbf-MeAib-MeAib-OMe konnte nach HPLC-Reinigung in 52%iger Ausbeute erhalten werden. Die Struktur wurde mittels 1H-NMR, MS und CHN-Analyse bestätigt ( Abb. 22 ).


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Abb. 22: Pbf-MeAib-MeAib-OMe a) 1H-NMR-Spektrum b) HPLC-Profil des gereinigten Peptides

2.3.3 NBS-Aminosäurehalogenide

Wie schon für Pbf-MeAib-Cl gezeigt, gelingt auch mit NBS-geschützten Aminosäurechloriden eine Acylierung von MeAib-OMe ( Abb. 23 ).

Abb. 23: Kupplungslösung o-NBS-MeAib-Cl + MeAib-OMe nach 2h

Überraschenderweise verlief die Umsetzung unter Verwendung von NBS-Schutz schneller als mit Pbf-Schutz ( Abb. 25 ).


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Abb. 24: Kupplung von o-NBS-MeAib-Cl an MeAib-OMe in Abhängigkeit vom jeweiligen HCl-Fänger in DCM/Toluen

Die Versuche mit o-NBS-Aminosäurechloriden wurden in Toluen durchgeführt. Dabei wurden die besten Kupplungsausbeuten mit DIEA als Base erhalten ( Abb. 24 ). Da die NBS-Aminosäurechloride schlecht in Toluen löslich sind, wurden die Reaktionen in einem Gemisch von DCM/Toluen durchgeführt. Dies führte zu einer Steigerung der Umsätze.

Erwartungsgemäß zeigte ein Vergleich der Schutzgruppen, daß die Reaktivitäten des o-NBS-Aminosäurechlorides und des p-NBS-Aminosäurechlorides ähnlich sind. Die Acylierungsreaktion mit Pbf-Aminosäurechlorid verlief im gleichen Zeitraum langsamer. (siehe Abb. 25 ).

Abb. 25: Einfluß der Nalpha-Schutzgruppe auf die Reaktion von RSO2-MeAib-Cl mit MeAib-OMe; die Reaktionen wurden in Toluen bzw. Toluen/DCM mit DIEA durchgeführt

2.3.4 DNBS-Aminosäurehalogenide

Anhand der Kupplung von DNBS-Val-Cl an Val-OEt×HCl wurden unterschiedliche Bedingungen für die Reaktion der DNBS-Aminosäurechloride getestet. Die Umsetzungen wurden in Toluen, DMF und DCM durchgeführt. Als Fänger der entstehenden HCl wurden BSA bzw. DIEA verwendet.

Abb. 26: Kupplungsausbeuten für das Dipeptid DNBS-Val-Val-OR a) mit BSA und b) mit DIEA


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Wie aus Abb. 26 ersichtlich ist, lieferten die Kupplungen Ausbeuten von über 75%, wobei die Reaktionen schon nach 1 Minute abgeschlossen waren. DCM erwies sich als Lösungsmittel der Wahl.

Die Kupplung von DNBS-Aib-Cl an MeAib-OMe×HCl wurde in getrocknetem Toluen durchgeführt (siehe Kap. 2.3.1 .). Es wurde eine teilweise Zersetzung des Aminosäurechlorides beobachtet (siehe auch Kap. 2.3.5 .). In Abb. 27 sind die für die verschiedenen Schutzgruppen erhaltenen Umsätze der Acylierung von RSO2-Aib-Cl mit MeAib-OMe dargestellt.

Abb. 27: Vergleich der Umsätze für die Synthese von RSO2-Aib-MeAib-OMe mit DIEA (Tos) bzw. mit BSA (Pbf, o-NBS, DNBS) in Toluen

Durch Verwendung des später auch für die Razemisierungs- und in situ Aktivierung genutzten beta-Naphthylamides (NA) als Carboxylschutz konnte die in DCM auftretende Zersetzung des Aminosäuremethylesters zur Säure (siehe Kap. 2.3.1 .) umgangen werden.

Untersucht wurden neben den Acylierungen von MeAib-OMe auch die Acylierungen von Aib-Ala-NA, sowie die Kupplungen von DNBS-MeAib-Cl und DNBS-Aib-Cl an das Tripeptid MeAib-Aib-Ala-NA.


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Die Bildung von DNBS-MeAib-Aib-Ala-NA war nach 10 Minuten beendet. Die Umsetzung verlief bei Einsatz von 1,5 Äquivalenten Aminosäurechlorid quantitativ.

Die Umsetzung von MeAib-Aib-Ala-NA mit DNBS-MeAib-Cl wurde in DCM/Toluen oder in DCM durchgeführt. Als HCl-Fänger wurden sowohl DIEA als auch BSA verwendet. Wir konnten beobachten, daß - wie bei der entsprechenden Reaktion der o-NBS-Derivate - die Umsetzungen mit BSA langsamer verlaufen als mit DIEA, was durch eine partielle Silylierung erklärbar ist.

Abb. 28: Kupplungseffizienz von RSO2-MeAib-Cl an MeAib-SGC mit der o-/p-NBS-Gruppe und der DNBS-Gruppe

Abb. 28 zeigt einen Umsatzvergleich für die Reaktion von RSO2-MeAib-X mit MeAib-SGC (SGC=Carboxylschutzgruppe) unter Verwendung verschiedener NBS-Schutzgruppen. Für die Kupplung mit DNBS-MeAib-Cl konnten Ausbeuten erhalten werden, die mit denen der Kupplung von NBS-MeAib-Cl an MeAib-OMe vergleichbar sind.

2.3.5 Nebenreaktionen bei Synthesen mit Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloriden

Bei Verwendung von Arensufonyl-geschützten Aminosäurechloriden wurden 2 Nebenreaktionen beobachtet, die einen Einfluß auf die Synthesen von Peptiden, die sterisch gehinderte Aminosäuren enthalten, haben.

Obwohl gezeigt wurde, daß die Reaktivität NBS-geschützter Aminosäurechloride größer ist als die der Pbf- bzw. Tosyl-geschützten Aminosäurechloride (siehe 2.3.3 .), nahmen die Umsätze für die Kupplung von RSO2-Aib-Cl an MeAib-OMe×HCl von der Tosyl- über die Pbf- zu den NBS-Schutzgruppen ab. Verlief die Reaktion des Tosyl-Aib-Cl noch zu 80%, konnte mit DNBS-Aib-Cl nur noch eine Ausbeute von 62% erhalten werden (siehe auch Abb. 27 ). Ursache für die geringeren Ausbeuten kann die erhöhte Instabilität durch Wechsel des Substituenteneffektes der verschiedenen Reste am Benzylring des entsprechenden Aminosäurechlorides gegenüber Basen sein. Wir haben beobachtet, daß Arensulfonyl-geschütztes Aib-Cl generell empfindlicher gegen alkalische Fragmentierung als andere Aminosäuren wie z.B. proteinogene Aminosäuren ist. Zugabe von einem Äquivalent DIEA zu RSO2-Aib-Cl führte innerhalb von Sekunden zum Zerfall des


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Aminosäurechlorides. Mit BSA bzw. Collidin verlief die Zersetzung des Aminosäurechlorides wesentlich langsamer bzw. es erfolgte eine Hydrolyse des Chlorides. Deshalb findet man in der Reaktionslösung neben dem Benzensulfonamid auch RSO2-Aib-OH, da bei längeren Reaktionszeiten auch die Hydrolyse eine Rolle spielt.

Abb. 29: Pbf-Amid

Durch HPLC-, NMR- und IR-Charakterisierung des gebildeten Produktes konnten wir zeigen, daß es sich bei dem Zerfallsprodukt um ein Benzensulfonamid handelt ( Abb. 29 ).

Zu Vergleichszwecken wurde das o-NBS-Amid durch Umsetzung von o-NBS-Cl mit Ammoniak hergestellt. In Abb. 30 sind die IR-Spektren von synthetisch hergestellten und aus der Reaktionslösung gewonnenem Amid dargestellt, die in den charakteristischen Banden identisch sind.

Abb. 30: IR-Spektrum des bei der Reaktion gebildeten Nebenproduktes (NP) im Vergleich zu o-NBS-Amid

HPLC-Untersuchungen von o-NBS-Aib-Cl zeigten, daß es schon bei der Herstellung des Aminosäurechlorides zur Bildung von geringen Mengen des Amides kommt, welches aber durch Umkristallisation entfernt werden kann. Durch die beschriebene Fragmentierung wird die Ausbeute der Acylierungen von RSO2-Aib-Cl mit sterisch stark gehinderten Systemen limitiert. Es werden aber gute Kupplungsausbeuten erzielt, wenn die


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Acylierungsreaktion schneller verläuft als die Fragmentierung. Eine weitere Nebenreaktion wurde während der Acylierung vom MeAib-SGC mit RSO2-MeAib-Cl beobachtet. Hier kam es zur Bildung eines Nebenproduktes, dessen Retentionszeit größer war als die des Dipeptides. Das isolierte Produkt zeigte im IR-Spektrum die für Säureanhydride typischen Banden bei 1830 und 1750 cm-1 ( Abb. 31 ). ESI-MS-Untersuchungen der isolierten Fraktion bestätigten die Vermutung, daß es sich bei dem Nebenprodukt um das symmetrische Anhydrid (RSO2-MeAib)2O handelt. Dieses Anhydrid ist offensichtlich nicht mehr zur Acylierung von MeAib-OMe in der Lage, da die Verlängerung der Reaktionszeit nicht zur Erhöhung der Ausbeute an Dipeptid führte. Erstaunlich ist die Stabilität des Anhydrides im wäßrig-organischen Lösungsmittelsystem der HPLC, was auf eine starke Abschirmung des Anhydrides selbst gegen Wasser deutet.

Abb. 31: IR-Spektrum des bei der Synthese von Pbf-MeAib-MeAib-OMe isolierten symmetr. Anhydrides

Ein Vergleich mit synthetisch hergestelltem symmetrischem RSO2-MeAib-Anhydrid ergab identische Retentionszeiten. Durch die Anhydridbildung im Verlauf der Reaktion kommt es zu Ausbeuteverlusten, da Aminosäurechlorid für die gewünschte Acylierung verloren geht. Durch Erhöhung des Säurechloridüberschusses sollte es möglich sein, bessere Ausbeuten zu erhalten.

2.4 Abspaltung der Arensulfonylschutzgruppen

Die Deblockierung der untersuchten Arensulfonylschutzgruppen erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Substituenten am Aromaten mit verschiedenen Abspaltreagenzien. Während die Pbf-Schutzgruppe acidolytisch entfernt wird, lassen sich die NBS-Schutzgruppen mittels Thiolaten abspalten. Dabei ist die DNBS-Schutzgruppe leichter spaltbar als die monosubstituierten Nitrobenzensulfonylschutzgruppen.


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2.4.1 Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe

Die gute Abspaltbarkeit der Pbf-Gruppe von der Guanidinofunktion des Arginins mit TFA wurde in der Literatur beschrieben [93] . Überraschenderweise läßt sich die Pbf-Schutzgruppe unter diesen Bedingungen nicht von der Nalpha-Position der Aminosäure abspalten [97] .

Erste Versuche der Schutzgruppenabspaltung führten wir mit einer Lösung von Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat (TMSO) in Trifluoressigsäure (TFA) durch. Für unsere Untersuchungen nutzten wir das Dipeptid Pbf-MeAib-MeAib-OMe. Durch Monitoring mittels HPLC konnten wir feststellen, daß die Schutzgruppe abgespalten wurde. MS-Untersuchungen zeigten jedoch, daß im entstandenen Produkt auch MeAib-OH enthalten war. Um auszuschließen, daß das Ergebnis durch Zerfall des Dipeptides während der Aufnahme des Massenspektrums bedingt ist, wurde der durch Etherfällung erhaltene Niederschlag mit Fmoc-Chlorid umgesetzt und die dabei gewonnenen Produkte mittels HPLC analysiert. Durch diese Untersuchung konnte gezeigt werden, daß es schon während der Abspaltung der Schutzgruppe zu einer Spaltung der Dipeptidbindung kommt. Ein Zerfall während der MS-Untersuchungen kann also ausgeschlossen werden. Die Verwendung von Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) in TFA erbrachte ähnliche Ergebnisse wie die von TMSO. Die Schutzgruppe konnte zwar entfernt werden, während der Abspaltung kam es aber ebenfalls zu einer Spaltung der Peptidbindung. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von TFA/Dimethylsulfid (DMS) als Abspaltungsreagenz. Es konnte der freie Dipeptidester MeAib-MeAib-OMe mit einer Ausbeute von 87% erhalten werden. Die Abspaltdauer betrug eine Stunde. Der erhaltene Ester wurde durch IR- und MS-Untersuchungen charakterisiert ( Abb. 32 ).

Abb. 32: Massenspektrum des Dipeptides MeAib-MeAib-OMe

Erstaunlicherweise konnte der Aib-enthaltende Dipeptidester Pbf-Aib-MeAib-OMe mit identischen Abspaltbedingungen nicht freigesetzt werden. Die offensichtlich säurelabilere Aib-MeAib-Bindung wurde schon durch reine TFA ohne weitere Zusätze gespalten.

In diesem Zusammenhang soll auf die durch Untersuchung verschiedener Gruppen [94] , [95] , [96] , [97] gefundenen Ergebnisse hingewiesen werden, die bei Synthesen von Peptaibolen wie Alamethicin und Emerimicin nachwiesen, daß Aib-Pro-Bindungen säurelabil sind. So beobachteten Jung et al., daß die Aib-Pro-Bindung im Alamethicin und Trichotoxin A 40 mit TFA in nur 3 Stunden gespalten wird. Vergleichende


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Untersuchungen am Modellpeptid Ac-Aib-Pro-NH2 zeigten, daß hier eine Spaltung der Aib-Pro-Bindung schon nach 15 Minuten abgeschlossen ist [94] . Warum Aib-MeAib-Bindungen instabiler als MeAib-MeAib-Bindungen sind, ist nach dem heutigen Erkentnisstand schwer erklärbar.

Die von uns beobachtete Spaltung des Dipeptides erfolgt möglicherweise über die Ausbildung eines Misch-Anhydrides mit TFA ( Abb. 33 ). Während der HPLC-Untersuchungen der Schutzgruppenabspaltung konnten wir ein Zwischenprodukt detektieren, das bei längerer Lagerung unter HPLC-Bedingungen zur Pbf-Aminosäure umgewandelt wird.

Abb. 33: Spaltung von Pbf-Aib-MeAib-OMe durch TFA

Diese Hypothese wird dadurch erhärtet, daß beim Versetzen von Pbf-Aib-Cl mit TFA ein Produkt entsteht, welches einen Peak mit einer Retentionszeit lieferte, die mit der des Zwischenproduktes identisch war.

Abb. 34: HPLC-Profile a) TFA + Pbf-Aib-MeAib-OMe sofort vermessen; RT (Pbf-Aib-O-TFA): 11,7min b) TFA + Pbf-Aib-MeAib-OMe, 24h in AN/H2O gelagert; RT (Pbf-Aib): 13,8min

ohne Inkubation

Probe 24h in AN/H2O

Die Behandlung des Dipeptides mit TFA führte zu einem Produkt, das chromatographisch mit Pbf-Aib-OH identisch ist ( Abb. 34 ). Die ausbleibende analoge Spaltung für MeAib-MeAib-OMe könnte durch die starke sterische Hinderung für eine Anhydridbildung erklärt werden.


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Versuche, der Zersetzung des Dipeptides durch Verwendung von verdünnter TFA entgegenzuwirken, zeigten keinen Erfolg. Auch hier entstand wieder das gemischte Anhydrid, welches in wäßrigem Milieu zur Säure weiter reagierte.

Die hohe Säurelabilität der Aib-MeAib-Peptidbindung machte die Verwendung von Schutzgruppen notwendig, die entweder säurelabiler sind bzw. sich auf anderem Wege abspalten lassen.

2.4.2 Abspaltung der NBS-Schutzgruppe

MILLER et al. haben kürzlich beschrieben, daß sich die o-NBS-Schutzgruppe von Aminogruppen leichter abspalten läßt als die p-NBS-Schutzgruppe [89] . Vermutlich spielen dabei sterische Effekte eine Rolle.

Die Abspaltung der o-NBS-Schutzgruppe vom o-NBS-MeAib-MeAib-Dipeptid gelang bereits innerhalb von 10 Minuten. Als Nucleophil verwendeten wir eine in der Literatur beschriebene Lösung von beta-Mercaptoethanol (ME) und DBU in DMF [98] . Bei Synthesen in Lösung erwies sich die Aufarbeitung der Reaktionslösung als umständlich, da sich das verwendete ME nur unvollständig abtrennen ließ und das MeAib-Dipeptid durch die sekundäre Aminogruppe schwer detektierbar ist.

Mit der von MILLER beschriebenen Methode war die o-NBS-Schutzgruppe von nicht alkylierten Aminosäuren jedoch nicht abspaltbar. Auch nach 7h Reaktionszeit konnten wir chromatographisch noch NBS-geschütztes Aib-MeAib-Dipeptid nachweisen. Versuche, das entstandene Produkt massenspektrometrisch ohne Isolierung aus der Reaktionslösung nachzuweisen, scheiterten am schwer abzutrennenden DBU, welches alle Signale überdeckte.

FUKUYAMA verwendete für die NBS-Schutzgruppenabspaltung von N-Alkylaminosäuren Thiophenol/K2CO3 [87] . Wir testeten dieses Reagenz am Beispiel von o-NBS-Val-OH. Innerhalb von 30 Minuten erfolgte eine vollständige Deblockierung. Da die verwendete Abspaltlösung sehr oxydationsempfindlich und damit ihre Anwendung zeitlich begrenzt ist, muß mit hohen Überschüssen an Thiolat gearbeitet werden.

2.4.3 Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe

Verwendung von Thiophenol/K2CO3

Die in der Literatur beschriebene Abspaltung der o-NBS-Gruppe von primären Aminosäuren mit 5% Thiophenol (TP) in DMF wurde von uns für die DNBS-Gruppe getestet [87] , [89] . Das für die Abspaltung der Schutzgruppe notwendige Thiophenolat wurde mit K2CO3 gebildet. Durch HPLC-Untersuchungen konnten wir zeigen, daß schon nach 10 Minuten kein geschütztes Dipeptid mehr vorhanden ist.

Verwendung von Mercaptoethanol/Base

Die bereits beschriebene Abspaltmethode für die o-NBS-Schutzgruppe mit ME:DBU (2:1) war auf die DNBS-Schutzguppe nicht anwendbar [98] . Unsere Versuche, auf diese Weise die DNBS-Gruppe vom DNBS-Valin abzuspalten, waren unbefriedigend. Nach 10 Minuten waren erst 10% der Schutzgruppe abgespalten. Eine Erhöhung der DBU-Menge verringerte die Ausbeute; nach 10 Minuten waren erst 2% der Schutzgruppe abgespalten. Der Übergang zum weniger basischen Triethylamin (TEA) erhöhte die


37

Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltung erheblich. Für die Abspaltung wurden 2 Äquivalente TEA (bezogen auf ME) verwendet. Nach 10 Minuten konnte kein Ausgangsstoff mehr bestimmt werden (HPLC). Die Abspaltung mit ME/TEA konnte erfolgreich auf DCM als Lösungsmittel übertragen werden, wodurch das aufwendige Entfernen von DMF vor der Aufarbeitung vermieden werden konnte. Weitere Untersuchungen zeigten, daß es in DMF -im Gegensatz zu DCM- zu Nebenreaktionen während der Abspaltung kommt (siehe Nebenreaktionen Kap. 2.6.4 .).

Durch die Verwendung von ME/TEA (2:1) konnten erstmals Peptide erhalten werden, die Aib-MeAib- bzw. MeAib-Aib-Sequenzen enthalten. Dafür wurde das Nalpha-DNBS-geschützte Peptid bei Raumtemperatur mit der Abspaltlösung (10facher Überschuß an Mercaptoethanolat) versetzt und 30 Minuten gerührt. Bei Versetzen des Peptides mit dem Thiolat tritt eine intensive Rotfärbung auf, die im Verlauf der Reaktion verschwindet. Dies ist durch zwischenzeitliche Bildung eines Anions (siehe Abb. 14 ) zu erklären, welches dann zum Thioether weiterreagiert. Vom erhaltenen, ungeschützten Peptid wurden Mercaptoethanol und der entstandene Thioether durch präparative Säulenchromatographie entfernt.

2.5 Synthesen mit in situ gebildeten Arensulfonyl-geschützten Aminosäurehalogeniden

Eine attraktive Alternative zur Verwendung preformierter Aminosäurechloride besteht in einer in situ Aktivierung der geschützten Aminosäuren mittels SOCl2. Der Vorteil der in situ Säurechloridbildung besteht u. a. darin, daß die Aminosäurechloride nicht gelagert werden müssen und so auch Aminosäuren mit labilen Schutzgruppen einsetzbar sind. In der Literatur findet man verschiedene Methoden für die in situ Bildung von Aminosäurechloriden. Einerseits wird die Herstellung Fmoc-geschützter Aminosäurechloride unter Wärmezufuhr in Toluen als mehrstündiger Prozeß beschrieben [99] . Andererseits wurden Z-geschützte Aminosäurechloride schon nach wenigen Minuten unter Verwendung von Pyridin als Katalysator erhalten [100] , [101] . Kürzlich wurde auch die Verwendung von Triphosgen für eine in situ Aktivierung von Fmoc-Aminosäuren beschrieben [102] .

2.5.1 Modelluntersuchungen zur in situ Säurechloridbildung

Um eine Vorstellung von Reaktionszeiten sowie der Effektivität verschiedener Basenzusätze zu erhalten, untersuchten wir die in situ Aktivierung mittels SOCl2 am Modell der Bildung des Essigsäurechlorides. Dazu wurde eine 0,1M Essigsäurelösung in DCM mit SOCl2 und einer Base versetzt und die Bildung des Chlorides IR-spektroskopisch bei Raumtemperatur verfolgt. Als Basen verwendeten wir Collidin, DIEA oder Pyridin.


38

Abb. 35: In situ Herstellung von Essigsäurchlorid; 1eq. HAc+1eq. SOCl2+xeq. DIEA; 0.1M in DCM

In Abb. 35 ist die Abhängigkeit der Säurechloridbildung von der Basenmenge am Beispiel von DIEA dargestellt. Die dargestellten Spektren wurden nach 10 Minuten Reaktionszeit aufgenommen. Bei Verwendung von 1eq. Base kam es in allen Fällen zur Bildung von Anhydrid. Den größten Anteil an Anhydridbildung konnten wir beim Vergleich der 3 Basen für DIEA beobachten. Dies läßt sich aufgrund der Basizität erklären, die für DIEA am größten ist. Dadurch ist bei Verwendung von DIEA die Carboxylatbildung am stärksten und die Anhydridbildung tritt als Konkurrenzreaktion auf.

Abb. 36: In situ Herstellung von Essigsäurechlorid; 1eq. HAc + 1eq. SOCl2 + 0,5eq. Base, 0,1M in DCM; t=10’


39

Abb. 36 stellt die Effizienz der eingesetzten Basen dar. Alle Untersuchungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Während die Spektren der Umsetzungen mit Collidin und DIEA nach 10 Minuten noch deutliche Säurebanden zeigen, ist beim Ansatz mit Pyridin die Carbonylbande für die Carbonsäure bei 1714 cm-1 fast vollständig verschwunden.

2.5.2 In situ Aktivierung von DNBS-Aminosäuren

Für die Anwendung der in situ Technik auf DNBS-geschützte Aminosäuren untersuchten wir zuerst die Bildung von DNBS-Val-Cl ( Abb. 37 ). Dazu wurden die Reaktionsbedingungen in Hinblick auf Reaktionszeit, Konzentration und Temperatur geändert.

Abb. 37: In situ Aktivierung von DNBS-Val-Cl

Das entstandene Aminosäurechlorid wurde indirekt durch Überführung in den Methylester mittels HPLC nachgewiesen. Dazu wurde ein Aliquot des Reaktionsansatzes in eine 5%ige Pyridin/Methanol-Lösung überführt und dann chromatographisch untersucht.

Abb. 38: Säurechloridbildung mit 1eq. SOCl2, 30min

(1) = 0,5 eq. Pyridin, 20°C

(2) = 1,0 eq. Pyridin, 20°C

(3) = 0,5 eq. Pyridin, 45°C

(4) = 1,0 eq. Pyridin, 45°C


40

Erwartungsgemäß steigt die Ausbeute an Aminosäurechlorid durch Erhöhung der Temperatur ( Abb. 38 ).

Die besten Ausbeuten an DNBS-Val-Cl wurden unter Verwendung von zwei Äquivalenten SOCl2 und einem Äquivalent Pyridin in DCM als Lösungsmittel erhalten. Die Konzentration der Lösung betrug 0.8M. Die Aminosäurechloridausbeuten betrugen nach 30 Minuten Rühren bei 45°C max. 90-95%. Versuche mit einem 1:1 Gemisch von DCM/DMF führten zu keiner Verbesserung der Ausbeute an Chlorid ( Abb. 39 ).

Abb. 39: Ausbeuten der Säurechloridbildung mit Xeq. SOCl2, 10min, 45°C

(1) = 1,5 eq, Pyridin, 0,3M

(2) = 1,0 eq. Pyridin, 0,3M

(3) = 1,0 eq. Pyridin, 0,8M

2.5.3 Kupplung von in situ gebildetem DNBS-Val-Cl

Nachdem die Bedingungen für die in situ Aminosäurechloridbildung optimiert wurden, konnte die Anwendbarkeit der in situ Technik am schon für preformierte DNBS-Aminosäurechloride genutzten Modell der Kupplung von DNBS-Val an Val-OBzl/Val-OEt untersucht werden. Dabei zeigte sich, daß trotz identischer Reaktionsbedingungen die Ausbeuten der Umsetzung nur noch bei ca. 10% lagen.

Der eingesetzte Überschuß an SOCl2 führt zur Freisetzung von HCl in der Reaktionslösung, welche ihrerseits zu Protonierung der Aminokomponente führt. Es ist deswegen notwendig, sowohl die entstandene HCl als auch das noch vorhandene SOCl2 abzufangen, ohne dabei das entstandene Aminosäurechlorid zu beeinträchtigen. Wir setzten deshalb t-Butanol als SOCl2-Fänger ein. Mittels IR-Untersuchungen konnten wir zeigen, daß das Thionylchlorid mit 3eq. t-Butanol abgefangen werden kann, ohne das es zu einem nennenswerten Abfall der Säurechloridbande kommt. Abb. 40 zeigt eine Verschiebung der Chloridbande des Thionylchlorides zu höheren Wellenzahlen. Es wurden deshalb vor Kupplungsbeginn 3eq. t-Butanol zum in situ gebildeten Säurechlorid gegeben.

Abb. 40: : IR-spektroskopische Untersuchung der Reaktion von SOCl2 mit t-BuOH


41

Für eine vollständige Umsetzung von DNBS-Val mit SOCl2 waren 2 Äquivalente Base notwendig. Dabei konnten mit DIEA die besten Ergebnisse erzielt werden. In Abb. 41 sind die Reaktionsbedingungen noch einmal schematisch dargestellt.

Abb. 41: Schematische Darstellung der Synthese von DNBS-Val-Val-OR durch in situ Aktivierung

Der Übergang zu einem polareren Lösungsmittelgemisch (DCM/DMF) führte nicht zu einer Umsatzsteigerung. Es wurden die in Abb. 42 dargestellten Kupplungsausbeuten erhalten.


42

Abb. 42: Vergleich der Ausbeuten für die Synthese von DNBS-Val-Val-OR in DCM bzw. DCM/DMF, t=10min, c=0.3M

(1) = 1,0 eq. DIEA

(2) = 1,5 eq. DIEA

(3) = 2,0 eq. DIEA

(4) = 2,0 eq. Collidin

2.5.4 Synthesen mit in situ gebildeten sterisch gehinderten DNBS-Aminosäurehalogeniden

Nachdem wir nachgewiesen haben, daß die in situ Aktivierung für die Synthese des Modellsystems DNBS-Val-Val-OR anwendbar ist, wandten wir uns sterisch anspruchsvolleren Modellen zu; MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA bzw. Aib-MeAib-Aib-Ala-NA. Die Synthese der Modellpeptide, deren Synthetisierbarkeit wir schon mit preformierten Aminosäurechloriden gezeigt haben (siehe Kap. 2.3.4 .), wurde in Lösung durchgeführt. Um die anfallenden Reinigungsoperationen zwischen den einzelnen Syntheseschritten chromatographisch gut verfolgen zu können, wählten wir auch hier als Startaminosäure Alanin-beta-naphthylamid. Dadurch war es möglich, die säulenchromatographischen Reinigungen mittels Fluoreszenzdetektion zu verfolgen. Ein allgemeines Schema des Reaktionsablaufes ist in Abb. 43 dargestellt.

Abb. 43: Allgemeines Syntheseschema für die Kupplung in situ gebildeter, sterisch anspruchsvoller Aminosäureschloride

Bei der Synthese der Tetrapeptide stellten wir fest, daß die Kupplungsausbeuten stark von


43

der Effizienz des zugegebenen SOCl2-Fängers sowie von der eingesetzten Menge der Base abhängen. Bei vergleichbaren Reaktionsbedingungen korrelierten die Ausbeuten der Kupplung von in situ gebildetem Säurechlorid mit der sterischen Hinderung der eingesetzten Aminokomponente. Während man für die Umsetzung von DNBS-Aib mit Ala-NA noch einen Umsatz von ca. 85% erhält, liegt die Ausbeute für DNBS-MeAib an Ala-NA nur bei 61%, obwohl die analoge Dipeptidbildung mit den preformierten Aminosäurechloriden beider Aminosäuren quantitativ verläuft ( Abb. 44 ).

Abb. 44: Kupplungseffizienz von in situ gebildeten und preformierten DNBS-MeAib-Cl bzw. DNBS-Aib-Cl an Ala-NA

(1) DNBS-Aib-Ala-NA in situ Aktivierung

(2) preformiertes Chlorid

(3) DNBS-MeAib-Ala-NA in situ Aktivierung

(4) preformiertes Chlorid

Wie Abb. 45 zeigt, konnten die Umsätze für die Kupplung von DNBS-MeAib an Ala-NA durch Variation der eingesetzten Basenmenge optimiert werden. Wir konnten so die Ausbeuten auf 96% steigern.

Abb. 45: Umsatzvergleich für die Kupplung von DNBS-MeAib-Cl an Ala-NA mit X eq. Base

(1) = 2 eq. DIEA

(2) = 3 eq. DIEA

(3) = 3 eq. BSA

Für die Reaktion von in situ gebildeten DNBS-MeAib-Cl mit Aib-Ala-NA bzw. mit MeAib-Aib-Ala-NA konnten selbst bei Variation der Basenmenge keine hohen Ausbeuten erreicht werden, da in zunehmenden Maße die Bildung von symmetrischem Anhydrid von DNBS-MeAib als Nebenreaktion auftrat. Die Charakterisierung dieses Nebenproduktes erfolgte durch chromatographischen Vergleich mit synthetisch hergestelltem Anhydrid (Kap. 2.3.5 .).


44

Wir versuchten durch den Einsatz anderer SOCl2-Fänger die Nebenreaktionen einzuschränken. Geeignete Fänger sollten tertiäre Amine bzw. Alkohole sein. Für die Kupplung testeten wir neben t-BuOH auch t-BuNH2, Triphenylmethanol und Tritylamin. In Abb. 46 sind die für die Kupplungen mit den verschiedenen Fängern erhaltenen Ausbeuten dargestellt.

Abb. 46: Kupplung von in situ gebildeten DBS-MeAib-Cl an Ala-NA, Aib-Ala-NA (30 min) bzw. an MeAib-Aib-Ala-NA (t = 4h)

(1) = t-BuOH

(1) = t-BuNH2

(1) = Trityl-MeOH

(1) = Tritylamin

Beim Einsatz von t-BuNH2 als Scavenger bei der Reaktion von DNBS-MeAib-Cl mit Aib-Ala-NA bzw. MeAib-Aib-Ala-NA konnte bereits nach 2 Minuten chromatographisch die Bildung von 17% des entsprechenden t-Butylamides nachgewiesen werden.

Verwendet man dagegen das sterisch stärker gehinderte Tritylamin, so wird innerhalb von 2 Minuten nur 1,7% des entsprechenden Amids gebildet. Will man umgekehrt sterisch weniger anspruchsvolle Carboxylkomponenten mittels in situ gebildeten Aminosäurechloriden umsetzen, ist die Nutzung des Tritylamins als Fänger für SOCl2 erwartungsgemäß nicht möglich, da hier die Amidbildung mit dem Scavenger schneller verläuft als mit der Aminokomponente. Dies konnten wir durch Zugabe von Tritylamin zu in situ gebildeten DNBS-Val-Cl chromatographisch nachweisen. Für einfache, nicht gehinderte Aminosäuren ist t-BuOH (siehe Kap. 2.5.3 .) als Fänger besser geeignet.

Für die sterisch anspruchsvolle Reaktion von DNBS-MeAib-Cl mit MeAib-Aib-Ala-NA konnten durch in situ Aminosäurechloridbildung mit Tritylamin als SOCl2-Fänger Umsätze von ca. 55% in 2h erreicht werden (im Vergleich dazu reagiert preformiertes DBS-MeAib-Cl mit MeAib-Aib-Ala-NA in gleicher Zeit zu 74%). Die Reaktionszeiten für die Bildung der MeAib-MeAib-Peptidbindung verlängerten sich von 10 Minuten auf 4 Stunden. Es gelang damit erstmals ein Tetrapeptid herzustellen, welches mehrere Aib- und MeAib-Reste enthält.

Das Tetrapeptid MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA wurde vollständig durch in situ aktivierte Aminosäurechloride hergestellt. Das vergleichbare Tetrapeptid mit einem N-terminalen Aib-Rest war nur bis zur Tripeptidstufe durch in situ gebildete Aminosäurechloride herstellbar, da bei der Kupplung von in situ hergestellten DNBS-Aib-Cl die Nebenreaktionen, wie Anhydridbildung und Fragmentierung, überwogen.


45

Tab. 4 zeigt die für die einzelnen Reaktionsschritte erhaltenen Ausbeuten. Bei den Kupplungen mit in situ gebildeten Aminosäurechloriden wurden bis auf die Umsetzung von DNBS-MeAib-Cl mit MeAib-Peptid Ausbeuten von über 85% erhalten. Zum Vergleich wurden auch die Ausbeuten, die für die Acylierung mit preformierten Aminosäurechloriden erhalten wurden, dargestellt.

Tab. 4: Ausbeuten von Acylierungen mit in situ gebildeten bzw. preformierten Aminosäurechloriden

Peptid

Kupplungsschritt

Ausbeute [%] (in situ Aktivierung)

Ausbeute [%] (preformiertes Chlorid)

MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA

DNBS-Aib-Cl an Ala-NA

86

99

 

DNBS-MeAib-Cl an Aib-Ala-NA

90

97

 

DNBS-MeAib-Cl an MeAib-Aib-Ala-NA

55*, (4eq. Cl)

86*

Aib-MeAib-Aib-Ala-NA

DNBS-Aib-Cl an Ala-NA

86

99

 

DNBS-MeAib-Cl an Aib-Ala-NA

90

97

 

DNBS-Aib-Cl an MeAib-Aib-Ala-NA

___

52

* die Reaktionszeit betrug 4h, ansonsten 30 min

Die erhaltenen Tetrapeptide wurden mittels MS, HPLC und 1H-NMR charakterisiert. Dabei zeigte sich in den NMR-Spektren der Tetrapeptide eine Aufspaltung der Methylgruppen-Signale sowohl der MeAib- wie auch der Methylgruppen der Aib-Reste ( Tab. 17 ). Diese Aufspaltung war in den Dipeptiden Pbf-MeAib-MeAib-OMe bzw. Pbf-Aib-MeAib-OMe noch nicht zu beobachten. Dies läßt darauf schließen, daß die Methylgruppen stereochemisch nicht äquivalent sind.

Unsere Untersuchungen zur in situ Aktivierung von DNBS-Aminosäuren zeigten die prinzipielle Anwendbarkeit dieser Methode für die Synthese. Allerdings war für eine erfolgreiche Säurechloridbildung, anders als in der Literatur [100] , [101] beschrieben, mehr als ein Äquivalent SOCl2 erforderlich. Dies machte die Zugabe eines Reaktionszusatzes zum Abfangen von überschüssigen SOCl2 nötig. Unsere Untersuchungen zeigten, daß dieser Reaktionszusatz in Abhängigkeit der jeweiligen Reaktionspartner zu wählen ist.

Ein Vergleich mit Ausbeuten, die mit preformierten Aminosäurechloriden erhalten wurden, zeigt, daß Synthesen mit preformierten Aminosäurechloriden vorzuziehen sind, da man mit ihnen bessere Kupplungsausbeuten erhalten kann. Die Nutzung der in situ-Technik bietet sich dagegen in Fällen an, wo säurelabile Seitenketten eine Lagerung der Aminosäurechloride verbieten.


46

2.6 Anwendung der Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloride in der Festphasensynthese

2.6.1 Synthesen mit o-NBS-MeAib-Cl

Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl die NBS- als auch die DNBS-Schutzgruppe auf ihre Anwendbarkeit für die Festphasensynthese untersucht.

Abb. 47: Syntheseschema des Tetrapeptides

Als Modell für o-NBS-Aminosäurechloride wurde die Kupplung von o-NBS-MeAib-Cl an ein Tripeptidharz untersucht. Die Synthese wurde am o-Chlortrityl-Harz durchgeführt; in Abb. 47 ist das allgemeine Schema der Kupplung dargestellt.

Die erfolgreiche Abspaltung der Schutzgruppe war an der Bildung des gelben Thioethers erkennbar. Das Tetrapeptid wurde nach präparativer HPLC-Reinigung mit 33%iger Ausbeute erhalten ( Abb. 48 ).

Durch die Synthese des Tetrapeptides konnte gezeigt werden, daß ein Einbau o-NBS-geschützter, sterisch gehinderter Aminosäurechloride an der festen Phase möglich ist.


47

Abb. 48: HPLC-Profil des gereinigten Tetrapeptides

2.6.2 Beladungsbestimmungen

Bei der Abspaltung der DNBS-Gruppe mittels Thiolen entsteht der entsprechende Thioether, für den bei Verwendung von ME/DCM bei 332 nm ein Extinktionskoeffizient epsilon von 11500 cm²×mol-1 und bei Verwendung von ME/DMF bei 342 nm ein Extinktionskoeffizient epsilon von 8950 cm²×mol-1 bestimmt wurde.

Für die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten des bei der Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe mit beta-Mercaptoethanol entstehenden Thioethers wurden UV-Spektren der Abspaltlösungen bei unterschiedlichen Konzentrationen aufgenommen<1>. Die durchgeführten Beladungsbestimmungen lieferten Werte, die mit vorher für Fmoc-gekuppelte Aminosäuren ermittelten Werten übereinstimmten.

Für die Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe mit Thiophenol konnte kein Extinktionskoeffizient ermittelt werden. Da die Lösung sehr oxydationsanfällig ist, wurden keine reproduzierbaren Werte erhalten.


48

2.6.3 Synthese eines Urocortin-Analogons

Ein sehr interessanter Aspekt für die Anwendung der DNBS-Aminosäurechloride sollte in der Kompatibilität mit der in der Peptidchemie vorrangig angewandten Fmoc-Chemie bestehen. Um diese Anwendung für spezielle Syntheseprobleme an der festen Phase unter Einbeziehung der Fmoc-Strategie zu demonstrieren, wählten wir den Einbau mehrerer Aib- bzw. MeAib-Reste zwischen die beiden Bindungsdomänen des Urocortins, eines Vertreters der CRF-Familie (Corticotropin releasing factor). Dadurch sollte der konformationelle Einfluß sterisch stark gehinderter Aminosäurereste auf die biologische Aktivität des entsprechenden Analogons untersucht werden.

CRF ist ein aus 41 Aminosäuren bestehendes Peptid, welches im Körper zahlreiche Funktionen ausübt. So fungiert es als Neuroregulator für die streßinduzierte Ausschüttung von ACTH und beta-Endorphinen und beeinflußt außerdem viele physiologische Prozesse wie die Catecholaminfreisetzung, die Nahrungsaufnahme oder die Regulierung der Körpertemperatur. Zur Familie der CRF-Peptide gehören neben dem CRF noch Urotensin sowie Urocortin und Sauvagine (nur aus 40 Aminosäuren bestehend), die ebenfalls CRF-Rezeptoren aktivieren [103] .

Primärstruktur des Urocortins:

 

DDPPLSIDLTFHCLRTLLELA

-

RTQSQRERAE

-

QNRIIFDSV-NH2

Als Ergebnis von Struktur-Wirkungs-Untersuchungen konnten Beyermann und Mitarbeiter zeigen [104] , [105] , [106] , daß in den Peptiden der CRF-Familie zwei separate Bindungsstellen für die Rezeptorbindung existieren, wobei eine Bindungsstelle im N- und die andere im C-Terminus liegen. Durch die hohe Flexibilität der Peptide in wäßriger Lösung ist es schwierig, deren biologische Konformation nachzuweisen. Einbau einer alpha-Helix (bestehend aus Lysin- und Glutaminsäureresten) zwischen die beiden Rezeptorbindungsstellen des Urocortins führte zu einem hochaktiven Analogon (UEK), dessen biologische Aktivität auch durch den Austausch verschiedener Aminosäuren dieser „Connector“-Helix durch Alanin nicht verringert wird. Diese Untersuchungen führten zu der Annahme, daß die biologische Aktivität der CRF-Peptide hauptsächlich vom Abstand und der relativen Orientierung der beiden Rezeptor-Bindungsstellen und damit durch die Connector-Struktur bestimmt wird. Diese Vermutung wird auch durch die Synthese von Analoga gestützt, die als Spacer epsilon-Aminocapronsäureeinheiten besitzen. Diese Analoga besitzen trotz des Einbaus der flexiblen Aminocapronsäurereste noch volle intrinsische Aktivität, aber wegen der hohen Flexibilität eine relativ geringe biologische Aktivität. Der Einbau mehrerer aufeinanderfolgender MeAib-Reste sollte zu einer im Vergleich zu Aminocapronsäure stabilen Connectorkonformation führen, weshalb interessante Erkenntnisse für Struktur-Wirkungs-Untersuchungen erwartet wurden. Nach TONIOLO ist für Peptide bestehend aus MeAib-Aib- bzw. Aib-MeAib-Einheiten die Bildung einer helikalen Konformation zu erwarten [57] .

Für unsere Untersuchungen gingen wir vom hochaktiven Modellagonisten UEK aus.

 

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEIE

-

KEEKEKKRKE

-

QNRKLLDEV

 

darr

 

darr

 

darr

 

UEK(1-21)

 

EK-Einheit

 

UEK(32-40)

 

(Bindungsdomäne 1)

 

(Connector-Sequenz)

 

(Bindungsdomäne 2)


49

Anstelle der EK-Linkersequenz sollte die Sequenz -Ala-MeAib-MeAib-Aib- in das Urocortin-Analogon eingebaut werden:

 

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEI

-

A(MeAib)2Aib

-

QNRKLLDEV

Die C- und N-terminalen Sequenzen Aib-UEK (32-40) bzw. UEK (1-20) wurden mittels Fmoc-Chemie am Tentagel S RAM-Harz hergestellt. Die Linkersequenz wurde mittels Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloriden eingebaut. Ein Syntheseschema ist in Abb. 49 dargestellt.

Abb. 49: Syntheseschema des Urocortinanalogons

Nach Abspaltung vom Harz wurde ein Produktgemisch erhalten. Die massenspektrometrische Untersuchung des erhaltenen Gemisches ergab neben dem Zielpeptid als wesentliche Bestandteile Fragmente mit der Masse 2392 und 1396. Aus den gefundenen Massen kann geschlossen werden, daß es sich bei den beiden Fragmenten um UEK-(1-20)-Ala-OH (M = 2392 g/mol) und MeAib-MeAib-Aib-UEK-(32-40) (M = 1396 g/mol) handelt. Offenbar wird nicht nur die Aib-MeAib-Bindung durch TFA gespalten (siehe Kap. 2.4.1 .), sondern es kommt auch bei der Ala-MeAib-Bindung während der acidolytischen Abspaltung vom Harz zu einer unerwünschten Peptidspaltung. MeAib-enthaltende Peptide sollten deshalb besser an Träger-Harzen synthetisiert werden, deren Abspaltung unter weniger sauren Bedingungen erfolgen kann (Cl-Trityl-Harz).

Die chromatographische Reinigung des erhaltenen Produktgemisches ergab das gewünschte Peptid.

Mit dieser erfolgreichen Synthese eines bisher nicht synthetisierbaren Peptides mit zwei benachbarten MeAib-Resten konnte gezeigt werden, daß der Einbau sterisch extrem gehinderter Aminosäuren mittels DNBS-geschützter Aminosäurechloride sehr gut im


50

Rahmen der konventionellen Fmoc-Strategie am Harz möglich ist.

2.6.3.1 CD-spektroskopische Untersuchungen

Zur Untersuchung der Konformationseigenschaften des erhaltenen Peptides wurden CD-spektroskopische Messungen durchgeführt. Zur Diskussion der Ergebnisse wurden außerdem CD-Spektren vom UEK, Des(23-29)UEK, Acp1, Acp2 und vom (Ala)4-UEK gemacht. Beim Acp1 bzw. Acp2 sind die beiden aktiven Zentren des Urocortins durch ein bzw. zwei epsilon-Aminocapronsäurereste verbunden, beim (Ala)4-UEK besteht die Connector-Einheit aus 4 Alaninen ( Tab. 5 ).

Tab. 5: Darstellung der für die CD-Untersuchungen verwendeten Peptide

Name

Struktur

 

 

UEK

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEIE

-KEEKEKKRKE-

QNRKLLDEV

des(23-29)UEK

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEIE

-KKE-

QNRKLLDEV

Acp1

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEIE

-acp-

QNRKLLDEV

Acp2

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEIE

-(acp)2-

QNRKLLDEV

(Ala)4-UEK

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEI

-(Ala)4-

QNRKLLDEV

MeAib-UEK

DDPPLSIDLTFHLLRTLLEI

-A(MeAib)2Aib-

QNRKLLDEV

Die Untersuchung der Peptide wurde in wäßriger Lösung durchgeführt. Die Konzentration der gemessenen Peptide war 10-4M. In Abb. 50 sind diese Spektren dargestellt.


51

Abb. 50: CD-Spektren der untersuchten Peptide

Es wird deutlich, daß sowohl das Analogon mit dem Ala-MeAib-MeAib-Aib-Connector als auch das mit den 4 Alaninresten, wie das UEK, einen hohen helikalen Anteil besitzen. Dabei ist der helikale Anteil des (Ala)4-UEK höher als der des MeAib-UEK. Im Gegensatz dazu zeigen die Acp-enthaltenden Analoga keine stabile Konformation, das heißt, der Einbau von MeAib und Aib führt zu einer bevorzugten Sekundärstruktur des Analogons.

2.6.3.2 Untersuchungen zur biologischen Aktivität

Zur Charakterisierung der biologischen Aktivität des von uns synthetisierten Peptides UEK (1-20)-Ala-MeAib-MeAib-Aib-UEK (32-40) wurden Untersuchungen an Leydigzellen der Maus durchgeführt [103] . Die Bestimmung der biologischen Aktivität beruht auf der Messung der CRF-induzierten Testosteronproduktion der Leydigzelle.


52

Abb. 51: Darstellung der biologischen Aktivität anhand der gemessenen EC50-Werte der Testosteronproduktion

 

 

(1) = Urocortin

(2) = Des(23-29)UEK

(3) = Acp-1

(3) = Acp-2

(3) = MeAib-UEK

EC50-Wert

[nM]

0,6

5,5

71,4

115

464

Zum Vergleich wurden auch hier UEK, Des(23-29)UEK, Acp1, Acp2 und (Ala)4-UEK getestet (siehe Tab. 5 ). Abb. 51 stellt die erhaltenen EC50-Werte dar, das heißt die Konzentration, bei der 50% des maximal möglichen Effektes erzielt wurden. Dabei wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit das (Ala)4-UEK nicht mit dargestellt, da es einen EC50-Wert besitzt, der dem UEK vergleichbar ist (1,8 nM).

Es wird deutlich, daß dem Peptid durch den Einbau der MeAib-Reste keine ideale Anpassung an den Rezeptor ermöglicht wird, so daß die biologische Aktivität nur noch ca. 1/1000 der des nativen und des helikalen Peptides, 1/100 des gleich großen Des(23-29)UEK und ca.1/6 bzw. 1/4 der Aktivität der Acp-enthaltenden Peptide beträgt.

Das legt die Vermutung nahe, daß die Orientierung der beiden Rezeptorbindungsstellen durch die Strukturinduktion der MeAib-Reste anders ist als beim Des(23-29)UEK und daß dadurch eine Wechselwirkung mit dem Rezeptor nicht mehr im gleichem Maß gegeben ist. Es wird außerdem deutlich, daß die zu vermutenden Konformationsunterschiede zwischen den untersuchten Analoga mittels CD-Spektroskopie der Peptide in wäßriger Lösung nicht erfaßt werden können. Möglicherweise wird am Rezeptor auch eine andere Konformation als in Wasser angenommen, das heißt, die Konformation in Wasser reflektiert möglicherweise nicht die biologisch aktive Konformation. Um eine eindeutige Aussage dazu machen zu können, ist die dreidimensionale Strukturbestimmung dieser Peptidanaloga notwendig.

2.6.4 Nebenreaktionen Arensulfonyl-geschützter Aminosäurehalogenide im Verlauf der SPPS

Beim schrittweisen Aufbau von Peptiden an der festen Phase führen unvollständige Acylierungsreaktionen zu Nebenprodukten, die entsprechende Aminosäureauslassungen (Fehlsequenzen) aufweisen. Derartige Fehlsequenzen können durch Acetylierungen der nicht umgesetzten Aminogruppen nach einem Kupplungsschritt vermieden werden, wobei die acetylierten Nebenprodukte vom Endprodukt zumeist problemlos chromatographisch abgetrennt werden können. Wir haben bei der Verwendung von DNBS-Aminosäurechloriden für die Synthese von Peptiden mit Acetylierung nach jedem


53

Kupplungsschritt jedoch festgestellt, daß eine Base-katalysierte Nebenreaktion auftritt, die zu einer irreversiblen Modifizierung der N-terminalen Aminogruppe führt. Bei der Synthese von Valx-Lys(Boc)-Harz (x=4) haben wir beobachtet, daß schon nach Einbau des 2. Valinrestes eine Verminderung in der Kupplungsausbeute auftritt. Es konnte durch Synthese von entsprechenden Referenzsubstanzen ausgeschlossen werden, daß der Kettenabbruch durch N-Acetylierung des DNBS-Val-Lys(Boc)-Harzes am Sulfonamidstickstoff während des Capping-Schrittes mit Ac2O erfolgte. Tatsächlich kommt es während der Acetylierung der unumgesetzten Aminogruppen zu einer Nebenreaktion an der DNBS-Schutzgruppe unter Abspaltung von SO2 ( Abb. 52 ).

Abb. 52: Nebenreaktion während der Acetylierung; R = Aminosäureseitenkettenrest, R’ = Restpeptid am Harz

Das Auftreten dieser Nebenreaktion war an einer starken Braunfärbung der Reaktionslösung zu erkennen. Auch die Anwendung schwächerer Basen (TEA anstelle DIEA) verhinderte den Verlust des SO2 nicht.

Für die Synthese einer „difficult sequence“, dem Homo-oligo-Valin am Lys(Boc)-Tentagel-Harz, haben wir deshalb auf einen Acetylierungsschritt verzichtet. Die Ausbeuten beim schrittweisen Aufbau mit DNBS-Val waren jedoch niedriger als für die entsprechenden Umsetzungen mit Fmoc-Val. Während die erste Kupplung von DNBS-Valin an Lysin(Boc)-Harz noch mit guten Ausbeuten verlief, nahm die Kupplungsausbeute mit steigender Kettenlänge des Peptides ab. DNBS-Valin wurde mit Standardmethoden (Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und dem Additiv 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in DCM/DMF) gekuppelt. Die Beladung nahm mit jedem Kupplungsschritt trotz negativem Kaisertest ab ( Abb. 53 ) [107] .


54

Abb. 53: Abnahme der Beladung für die DNBS-Valin-Kupplung an verschiedenen Harzen

Um untersuchen zu können, warum es zu diesem Abfall der Kupplungsausbeuten kommt, wurden am o-Chlortrityl- und am MBHA-Harz (Amidharz) jeweils Val4-Lys-OH bzw. Val5-Lys-NH2 synthetisiert und die Rohpeptide anschließend mittels LC-MS analysiert. Beide Rohpeptide zeigten neben dem gewünschten Val4-Lys-OH bzw. Val5-Lys-NH2 Produkte, die auf eine Nebenreaktion bei der Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe zurückzuführen sind ( Abb. 55 ).

Dabei wird, wie kürzlich für p-NBS-Aminosäuren beschrieben [108] , unter Baseneinfluß die Nitrogruppe durch das Nucleophil Thiolat ausgetauscht. Die so modifizierte Schutzgruppe (Thioether) läßt sich nicht mehr unter den selben Bedingungen abspalten und verbleibt am Peptid ( Abb. 54 ).

Abb. 54: Austausch einer Nitrogruppe durch das angreifende Nucleophil

Die beobachteten Massendifferenzen bestätigten die Vermutung, daß es auch bei DNBS-geschützten Aminosäuren zu dieser Nebenreaktion kommen kann ( Tab. 6 ). Für die o-NBS-Gruppe als Nalpha-Schutzgruppe wurde diese Nebenreaktion nicht beobachtet, so daß man davon ausgehen kann, daß bei der DNBS-Schutzgruppe die Nitrogruppe in p-Position ausgetauscht wurde.


55

Abb. 55: HPLC-Profil des vom Harz abgespaltenen Rohpeptides NH2-(Val)5-Lys-NH2

Versuche, die DNBS-Schutzgruppe in DCM abzuspalten (bei den Synthesen in Lösung erfolgreich durchgeführt), ergaben für die Poly-Val-Sequenz am Harz nur eine unvollständige Freisetzung der Aminofunktion. Möglicherweise reicht hier die Solvatation mit DCM nicht aus, da im Falle assoziierender Peptidsequenzen stärker polare Lösungsmittel, wie z.B. DMF, notwendig sind.

Tab. 6: Durch LC-MS-Untersuchungen gefundene Nebenprodukte bei der Harzsynthese

Peptid

Harz

Abspaltung der SG

berechnete Masse

gefundene Massen

Val4-Lys-OH

Chlortrityl

ME/TEA/DMF

542

443, 542,
704, 803

Val5-Lys-NH2

MBHA

ME/TEA/DMF

640

442, 541, 640,
604, 703, 802

Val5-Lys-NH2

MBHA

TP/K2CO3/DMF

640

541, 640,
627, 726

Val4-Lys-OH

Chlortrityl

TP/K2CO3/DMF

542

443, 542,
628, 727

MILLER et al. beschrieben kürzlich eine erste Peptidsynthese am Harz unter Verwendung von o-NBS-Aminosäuren. Sie benutzten zur Entfernung der Schutzgruppe TP/K2CO3 in DMF [89] . Um zu überprüfen, ob die Abspaltung der Schutzgruppe unter diesen Bedingungen auch für das Modell Valx-Lys möglich ist, synthetisierten wir am Chlortrityl- bzw. am MBHA-Harz Val4-Lys-OH bzw. Val5-Lys-NH2. Durch LC-MS-Untersuchungen konnten wir neben dem gewünschten Val4-Lys-OH auch o-NBS-Val3-Lys-OH und o-NBS-Val4-Lys-OH nachweisen. Dies führt zu der Vermutung, daß sich die o-NBS-Schutzgruppe mit zunehmender Kettenlänge immer schlechter abspalten läßt ( Abb. 56 ).


56

Abb. 56: HPLC-Profil des Rohpeptides NH2-(Val)4-Lys-OH, synthetisiert mit o-NBS-Val-Cl

Wir vermuten, daß es mit Zunahme der Kettenlänge zwischen den aromatischen Systemen der Schutzgruppen zu intermolekularen Wechselwirkungen kommt, die zur Peptidassoziation und damit zur erschwerten Abspaltung führt, wie es bereits von LARSEN für die Fmoc-Gruppe beschrieben wurde [109] . LARSEN und Mitarbeiter konnten durch Nutzung der Nahen FTIR-Spektroskopie anhand der Synthese von (Ala)6-Lys(Boc)-OH nachweisen, daß das am Harz gebundene Fmoc-geschützte Peptid zur Ausbildung von beta-Strukturen neigt, während beim ungeschützten Peptid meist random coil, das heißt ungeordnete Strukturen vorlagen. Ihre Untersuchungen mit Boc-geschützten Peptiden zeigten, daß die Fmoc-Schutzgruppe einen starken Einfluß auf die Konformation der Peptidkette hat, da mit der Boc-Schutzgruppe synthetisierte Peptide nur random coil Strukturen aufwiesen.

Die Ergebnisse zeigen, daß die DNBS-Schutzgruppe in Kombination mit Aminosäurechloriden hinsichtlich der Überwindung assoziationsbedingter Syntheseschwierigkeiten beim Aufbau von Peptiden im Vergleich mit der Fmoc-Gruppe eher von Nachteil ist.

2.7 Untersuchungen zur Stereomutation von DNBS-Aminosäurehalogeniden

2.7.1 Einfluß der Abspaltbedingungen auf die Stereomutation

Um ausschließen zu können, daß es beim Abspalten der Schutzgruppe zu einem Verlust an chiraler Integrität kommt, wurde das Dipeptid Val-Lys-NH2 am Tentagel S RAM-Harz synthetisiert. Dabei wurde DNBS-Valin mittels Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und dem Additiv 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) an Lysin gekuppelt. Das so erhaltene Dipeptid wurde mit verschieden konzentrierten Thiophenolatlösungen versetzt. Weitere Abspaltversuche erfolgten mit Mercaptoethanol/Triethylamin. Dabei wurde mit verschiedenen Mengen ME gearbeitet. Die Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe kann


57

visuell an einer anfänglichen tiefen Rotfärbung der Lösung, die später verschwindet, verfolgt werden.

Die Untersuchungen der Stereomutation wurden nach einer Methode von KUSUMOTO durchgeführt [110] . Bei dieser Methode hydrolysiert man die zu untersuchenden Peptide 24h bei 120°C in DCl. Anschließend werden die so erhaltenen Aminosäuren mit iso-Propanol/HCl und Trifluormethylsilylamin (TFMSA) derivatisiert [111] und mittels GC-MS analysiert. Durch die Verwendung von DCl kann man die während der Peptidhydrolyse auftretende Racemisierung bestimmen, da bei einer Veränderung der Konfiguration während der Hydrolyse der Wasserstoff durch Deuterium ausgetauscht wird.

Tab. 7: Ergebnisse der Untersuchungen zum Auftreten von Stereomutation bei Abspaltung der DNBS-Gruppe

 

6 Äquivalente ME

10 Äquivalente ME

20 Äquivalente ME

% D-Val

0,031
(±0,014%)

0,049
(±0,018)

0,025
(±0,020)

 

2% Thiophenol

5% Thiophenol

 

% D-Val

0,037
(±0,017)

0,021
(±0,005)

 

Die Ergebnisse in Tab. 7 zeigen, daß zumindest für unser Modellpeptid kein signifikanter Verlust chiraler Integrität unter den Deblockierungsbedingungen auftritt.

2.7.2 Untersuchungen zur Stereomutation bei der Kupplung von DNBS-Val-Cl

Obwohl für Sulfonylschutzgruppen am Nalpha-Stickstoff der Verlust der chiralen Integrität von alpha-Aminosäuren über Oxazolonbildung ausgeschlossen werden kann, könnte die Dinitrosubstitution an der Arensulfonyl-Gruppe durch elektronische Effekte die Polarisierung der Calpha-H-Bindung und damit eine Base-katalysierte Stereomutation durch Protonenabstraktion befördern. Deshalb untersuchten wir die Kupplung von DNBS-Val-Cl an Alanin. Um das synthetisierte Dipeptid auch nach Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe mittels UV-Detektion chromatographisch nachweisen zu können, wurde Alanin als beta-Naphthylamid eingesetzt. Mit diesem Carboxylschutz war es möglich, zusätzlich zum UV- auch mit einem Fluoreszenzdetektor zu arbeiten. Da hierbei die zu untersuchenden Substanzen bei einer Wellenlänge angeregt werden und deren emittierte Strahlung bei einer anderen gemessen wird, steigt die Empfindlichkeit der Nachweismethode erheblich.

Untersuchungen mit DNBS-D, L-Val-Ala-NA zeigten, daß sich sowohl die geschützten als auch die freigesetzten Dipeptiddiastereomere chromatographisch gut trennen ließen ( Abb. 57 ).

Abb. 57: HPLC-Profile von a) DNBS-D,L-Val-Ala-NA und b) D, L-Val-Ala-NA


58

Die Stereomutation wurde für unter in situ Aktivierungsbedingungen hergestelltes und für preformiertes DNBS-Val-Cl untersucht. Die Kupplungen mit in situ gebildetem Säurechlorid wurden mit 2 bzw. 4 Äquivalenten Base bezogen auf das Aminosäurechlorid durchgeführt. Als Lösungsmittel diente sowohl DCM als auch ein 1:1 Gemisch aus DCM/DMF. Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgte mit der 10fachen Menge an beta-Mercaptoethanol in DCM. Als SOCl2-Fänger wurde t-Butanol benutzt.

Tab. 8: Stereomutation für die Kupplung von DNBS-Val-Cl an Ala-NA

Aktivierung

Base

Menge

LM

% Stereomutation (UV-220nm*)

in situ gebildetes AS-Chlorid

DIEA

2eq.

DCM

0,061

in situ gebildetes AS-Chlorid

Collidin

2eq.

DCM

0,058

in situ gebildetes AS-Chlorid

DIEA

4eq.

DCM

0,056

in situ gebildetes AS-Chlorid

Collidin

4eq.

DCM

0,058

in situ gebildetes AS-Chlorid

DIEA

2eq.

DCM/DMF

0,041

in situ gebildetes AS-Chlorid

Collidin

2eq.

DCM/DMF

0,054

preformiertes AS-Chlorid

DIEA

1eq.

DCM

0,042

preformiertes AS-Chlorid

Collidin

1eq.

DCM

0,039

* Die bei 250nm erhaltenen Werte weichen nicht von den bei 220nm erhaltenen Werten ab

Die chromatographischen Untersuchungen wurden mit einem UV-Detektor (220nm bzw. 250nm) und mit einem Fluoreszenzdetektor (ex. 250nm, em. 350nm) durchgeführt. Das erhaltene Dipeptid wurde massenspektrometrisch analysiert. Die Ausbeuten der Kupplungen lagen zwischen 70% und 98% (Reaktionen nicht optimiert).

Aus den in Tab. 8 aufgeführten Daten geht hervor, daß für die Kupplung mit in situ gebildeten und mit preformierten DNBS-Aminosäurechloriden kein nennenswerter Verlust an optischer Integrität zu beobachten ist.


Fußnoten:

<1>

Durch Messung der UV-Absorptionsspektren des Thioethers kann eine Quantifizierung Harz-gebundener DNBS-Gruppen in der Abspaltlösung nach folgender Gleichung vorgenommen werden:

 

 

A = Extinktion

V = Volumen der Abspaltlösung [l]

X = Verdünnung der Meßlösung

epsilon = Extinktionskoeffizient [l_mol-1_cm-1]

d = Schichtdicke [cm]

W = Einwaage an Harz [g]


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