Henklein, Petra: N-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese

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Kapitel 3. Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Anwendung geeigneter Nalpha-Schutzgruppen die hohe Reaktivität der Säurechloride für die Peptidsynthese nutzen zu können und so bisher nicht zugängliche, sterisch extrem gehinderte Aminosäurereste enthaltende Peptide zu synthetisieren. Arensulfonylschutzgruppen, die im Gegensatz zu den gebräuchlichen N-Schutzgruppen vom Urethantyp keine reaktionsfähige Carbonylgruppierung enthalten und damit nicht zur Bildung von Oxazolonen befähigt sind, erlauben einen ersten Vergleich der Reaktivitäten von alpha-Aminosäurefluoriden und -chloriden für N-Acylierungen. Es wurden im Rahmen dieser Arbeit substituierte Arensulfonylschutzgruppen bezüglich ihrer Eignung als Nalpha-Schutzgruppe von Aminosäurechloriden für den stufenweisen Aufbau von Peptiden und die Möglichkeit einer in situ Aktivierung mit Thionylchlorid untersucht. Die erarbeiteten Methoden fanden Anwendung beim Einbau extrem gehinderter Aminosäurereste in ein biologisch aktives CRF-Analogon.

Bei Verwendung der Tosylschutzgruppe zeigt der Reaktivitätsvergleich von alpha-Aminosäurefluorid und -chlorid, daß die Aminosäurechloride deutlich reaktiver als die Aminosäurefluoride sind. Dieser Vorteil kommt allerdings nur in Systemen zum Tragen, in denen ein Verlust des Aminosäurechlorides durch Nebenreaktionen wie z. B. der Oxazolonbildung ausgeschlossen ist. Im Fall der Fmoc-Aminosäure-halogenide erzielt man mit den Säurechloriden im Vergleich zu den entsprechenden Säurefluoriden dann höhere Kupplungsausbeuten, wenn die Acylierung schneller als die konkurrierende Oxazolonbildung erfolgt. Für Synthesen unter Verwendung der Fmoc-Chemie sind die Aminosäurefluoride in der Regel die effizienteren Acylierungsreagenzien, da die Fmoc-Aminosäurechloride eine viel schnellere Oxazolonbildung in Gegenwart von Basen zeigen.

Bei Acylierungen mit den verschiedenen Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloriden zeigten sich Unterschiede in den Reaktivitäten entsprechend der elektronischen Effekte der Substituenten der Arensulfonylschutzgruppe.

Unter Verwendung der Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloride gelang erstmalig die effiziente Kupplung von RSO2-Aib/MeAib-Cl an MeAib-SGC. Die zum Vergleich durchgeführte Synthese mit Aminosäurefluoriden führte nicht zum gewünschten Produkt. Grund dafür ist die zu geringe Reaktivität der Aminosäurefluoride.

Hinsichtlich der Stabilität stellten wir fest, daß sowohl das NBS-Aib-Cl als auch das DNBS-Aib-Cl im Vergleich zu den Tosyl und Pbf-Analoga instabiler in Gegenwart von Basen sind, was sich mit den unterschiedlichen induktiven Effekten der verschiedenen Benzensubstituenten erklären läßt. Diese Instabilität führt zu Umsatzeinbußen für die Kupplung von RSO2-Aib-Cl an MeAib-SGc in der Reihenfolge RSO2-: DNBS = NBS>Pbf>Tosyl.

Durch den unterschiedlichen elektronischen Einfluß der verschiedenen Substituenten am Benzenrest ergeben sich abgestufte Abspaltbedingungen für die einzelnen Schutzgruppen. Während sich die Tosyl-Schutzgruppe nur unter drastischen Bedingungen vom Peptid entfernen läßt (Na/fl. NH3), kann die Pbf-Schutzgruppe unter relativ milden Bedingungen mit einem Gemisch aus TFA/DMS abgespalten werden. Im Gegensatz dazu lassen sich die


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Nitro-substituierten Arensulfonylschutzgruppen relativ problemlos mittels Thiolaten abspalten.

Während die Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe vom Pbf-MeAib-MeAib-OMe ohne Probleme verlief, erhält man unter analogen Bedingungen für Pbf-Aib-MeAib-OMe nicht den gewünschten Dipeptidester, sondern es wird eine Spaltung der Peptidbindung beobachtet. Auch gegenüber 50% TFA erwies sich die Aib-MeAib-Bindung als instabil. In der Literatur wurde bisher nur die Aib-Pro-Bindung als besonders säurelabil beschrieben. Diese Säurelabilität der Aib-MeAib-Bindung erforderte für entsprechende Synthesen eine alternative Schutzgruppe, wie sie durch nucleophil abspaltbare Schutzgruppen, vom Arensulfonyltyp beschrieben ist. So gelang es unter Verwendung der DNBS-Schutzgruppe erstmals Peptide herzustellen, die säurelabile Aib-MeAib-Bindungen enthalten. Die Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe gelingt in relativ kurzer Zeit (30 min) mit ME/TEA in DCM.

Untersuchungen zur in situ Säurechloridbildung von DNBS-Aminosäuren zeigten eine prinzipielle Anwendbarkeit dieser Technik für die Peptidsynthese. Allerdings war für eine erfolgreiche Chloridaktivierung, anders als in der Literatur beschrieben, mehr als ein Äquivalent SOCl2 erforderlich. Dies machte die Zugabe eines Reaktionszusatzes zum Abfangen des überschüssigen SOCl2 nötig. Unsere Untersuchungen zeigten, daß dieser Reaktionszusatz in Abhängigkeit von der Reaktivität der jeweiligen Komponenten zu wählen ist.

Mit Hilfe der o-NBS-Schutzgruppe war es möglich, an der festen Phase MeAib-OH an Aib zu kuppeln. Dies konnten wir mit der erfolgreichen Synthese des Tetrapeptides MeAib-Aib-Phe-Phe-OH, in welches die N-alkylierte Aminosäure via Säurechlorid eingebaut wurde, zeigen.

Da die Abspaltbedingungen für die DNBS-Gruppe mit der Fmoc-Strategie kompatibel sind, kann man den Einbau sterisch stark gehinderter Aminosäuren über DNBS-Aminosäurechloride unter Nutzung der vorrangig verwendeten Fmoc-Strategie durchführen. Wir demonstrierten diese Kombination anhand der Synthese eines biologisch aktiven Peptides, in welches wir im Rahmen von Struktur-Wirkungs-Untersuchungen die Sequenz Ala-MeAib-MeAib-Aib einbauten. Während der TFA-Abspaltung des Peptides vom Harz kam es zu einer partiellen Spaltung der Peptidbindung zwischen Ala und MeAib, was auf eine prinzipielle Labilität von AA-MeAib-Bindungen hinweist (AA = nicht N-alkyliert). Als eine weitere Nebenreaktion bei der Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe an der festen Phase wurde ein Austausch der Nitrogruppe in para-Position des Benzenrestes durch das angreifende Thiolat beobachtet. Diese Reaktion tritt insbesondere in polaren Lösungsmitteln wie DMF auf, wird aber in unpolaren Lösungsmitteln wie DCM weitgehend unterdrückt. Weiterhin haben unsere Untersuchungen gezeigt, daß die DNBS-Schutzgruppe für eine durchgängige Anwendung in der Festphasensynthese nicht vorteilhaft ist, da für Peptide, die zur Selbstassoziation neigen, dieser Assoziationseffekt und damit Syntheseprobleme verstärkt werden.

Von uns durchgeführte Untersuchungen zum Erhalt der chiralen Integrität zeigten, daß die Kupplungen von DNBS-Val-Cl an Ala-NA ohne Stereomutation verliefen.


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Mon Sep 16 13:41:08 2002