Henklein, Petra: N-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese

Kapitel 5. Experimenteller Teil

5.1 Geräte

Die analytischen HPLC-Untersuchungen aller synthetisierten Peptide und Aminosäuren wurden an einer Shimatzu spd-6A (Anlage bestehend aus: LC-6A Pumpeinheit, scl-6A Systemcontroller, UC-6A Autoinjektor, CBM Communication Bus Modul) bzw. an einer Anlage der Firma Jasko (Anlage bestehend aus: PU-980 Pumpanlage, AS 950 Autoinjektor, Detektor UV 975 und einem Waters 474 Fluoreszenzdetektor) durchgeführt. Als Säulenmaterial benutzten wir eine Polyencap A300, 250 × 4 mm Säule (Bischoff Analysentechnik GmbH) sowie eine Eurosphere C-18, 5µm. Die Flußrate betrug in allen Fällen 1ml/min, lambda =220 , 250nm.

Die präparative Reinigung und Isolierung der Peptide erfolgte mittels HPLC unter Verwendung einer 20µm Polyencap A300-Säule (Bischoff Analysentechnik GmbH) an einem Shimatzu LC-8A-System (Anlage bestehend aus: LC-8A-Pumpen, SCLC-8A-Kontrolleinheit, SPD-6A-UV Detektor, Injektionseinheit und einer C-R4A Aufnahmeeinheit) bei einer Flußrate von 10 ml/min. Die Detektion der Peptide erfolgte bei 220nm.

Zur Aufnahme der IR-Spektren der synthetisierten geschützten Aminosäuren und den aus diesen hergestellten Aminosäurefluoriden und -chloriden stand ein Impact 400 (Nicolet) zur Verfügung.

Für die massenspektrometrischen Untersuchungen der Peptide und geschützten Aminosäuren wurde ein TSQ 700, Finnigan MAT 95 Gerät (sample flow 1µl/min Methanol/Wasser 1:1, 3-5 kV, 80°C) bzw. ein MALDI-TOF Instrument (Kratos) verwendet. Für die LC-MS-Untersuchungen wurde zusätzlich ein Applied Biosystem mit einem 785A Detektor und einer 140B Pumpeinheit genutzt. Als Ssäulenmaterial wurde eine Vydag C18 300A, 150×1, 5µm genutzt. Die Flußrate betrug 30µl/min, lambda =220nm.

Die Kupplungsausbeuten bei den manuellen Peptidsynthesen wurden mit einem UV-Spektrometer LKB Ultrospec II bestimmt.

Die Bestimmung der Extinktionskoeffizienten erfolgte an einem Perkin Elmer UV/VIS Spektrometer Lambda 9.

Die NMR-Untersuchungen wurden an einem Varian Gemini 200 Instrument bzw. an einem Bruker DMX 600 durchgeführt.

Die Untersuchungen zur chiralen Integrität der Aminosäuren mittels GC-MS wurden an einem Gerät der Firma Fisons Instruments (TRIO 1000) durchgeführt. Dabei wurde eine Chirasil-Val-Säule (50 m, 0,25 µm, Machery Nagel) verwendet.

Die CD-Messungen wurden an einem J720 Spektrometer (Jasco, Japan) durchgeführt.

Für die Bestimmung der Schmelzpunkte kam ein MEL-TEMP II (Laboratory Devices, USA) zum Einsatz (Schmelzpunkte nicht korrigiert).

Elementaranalysen wurden an einem Elemental Analyser 1106 der Firma Carlo Erba, Mailand durchgeführt.

Für dünnschichtchromatographische Untersuchungen wurde mit Kieselgel beschichtetes Glas der Firma Merck verwendet. Meistgenutztes Laufmittel war Chloroform/Methanol/Eisessig (9/1/0,1).

5.2 Chemikalien

Fluka:

Piperidin, DIEA, Cyanurfluorid, (Diethylamino)schwefeltrifluorid (DAST), n-Hexan, DMF, Pyridin (getrocknet über Molekularsieb Baker 3A), Collidin, SOCl₂, TFE, BSA, Mercaptopropionsäure, Trityl-MeOH, Tritylamin, DNBS-Cl

Baker:

DCM (Destillation über P₄O₁₀ und Na₂CO₃), Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäure, Ethanol, Methanol (getrocknet durch Reaktion mit Magnesium und anschließender Destillation), Diethylether, Chloroform (getrocknet über Molekularsieb Baker 3A), Toluen, Acetonitril

Novabiochem:

o-Cl-Tritylharz; TMSO, H-Val-OBzl, TFMSA

Merck:

Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kieselgel 60, 0,04-0,06 µm Korngröße

Bachem:

MeAib-OH, beta -Ala-Naphthylamid

Aldrich:

o- und p-NBS-Cl, AIB-OH, Dimethoxybenzaldehyd

Ferak Berlin:

beta -Mercaptoethanol

Pbf-Chlorid wurde freundlicherweise von Prof. L. A. Carpino zur Verfügung gestellt.

5.3 Synthesen der Aminosäurederivate

5.3.1 Synthese der Aminosäuremethylester

Zu 7,5 ml Methanol (-40°C) wurde vorsichtig unter Rühren 10 mmol Thionylchlorid getropft. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurden 5 mmol Aminosäure zum Reaktionsgemisch gegeben und über Nacht gerührt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde durch mehrmaliges Abrotieren mit Methanol entfernt. Der Ester wurde anschließend in wenig Methanol gelöst und mit trockenem n-Hexan versetzt. Nach Aufbewahrung im Tiefkühlschrank bildete sich ein weißer Feststoff.

HCl×Aib-OMe:

HCl×MeAib-OMe:

weißer Feststoff

weißer Feststoff

Ausbeute:

88,78%

Ausbeute:

71,2%

Fp.:

188-190°C

Fp.:

Zersetzung zwischen 130-150°C

IR (KBr):

(C=O): 1754 cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1746 cm^-1

MS:

[M+H]: 132; ber.: 131

5.3.2 Synthese von Referenzsubstanzen

Tosylamid [112]

0,01 mmol Arensulfonylchlorid (2 g) wurden mit einem Überschuß einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung versetzt. Die Lösung wurde nach 10 Minuten in 550 ml Wasser gegeben und mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde abgesaugt und mit Wasser neutral gewaschen. Umkristallisation erfolgte aus Ethanol.

Tosylamid:

o-NBS-Amid:

weißer Feststoff

gelber Feststoff

Ausbeute:

74%

Ausbeute:

62%

Fp.:

132°C

Fp.:

182-185°C

IR (KBr):

(NH₂-SO₂) 1576 cm^-1; (SO₂) 1332, 1159 cm^-1

IR (KBr):

(NH₂-SO₂) 1542 cm^-1; (SO₂) 1338, 1161 cm^-1

MS:

[M+H]: 172; ber.:171

Symmetrische Anhydride von geschützten Aminosäuren

Für die Herstellung des Anhydrides von RSO₂-AA-OH wurde nach einer Vorschrift von BENOITON [113] für Fmoc-Aminosäureanhydride gearbeitet. Es wurden 0,135 mmol RSO₂-AA-OH in 2,7 ml Essigester gelöst und mit 0,099 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (20,4 mg) versetzt. Die Lösung wurde anschließend noch 2,5 Stunden gerührt und dann auf -20°C abgekühlt. Nach ca. 2h wurde der ausgefallenen Harnstoff in der Kälte abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in trockenem DCM aufgenommen und über Nacht nochmals auf -20°C abgekühlt. Das entstandene Produkt wurde filtriert und mit trockenem n-Hexan gewaschen.

DNBS-Aib-Anhydrid:

DNBS-MeAib-Anhydrid:

weißer Feststoff

weißer Feststoff

Ausbeute:

61%

Ausbeute:

43%

IR (KBr):

(C-O-C) 1825, 1729 cm^-1, (SO₂) 1350, 1173 cm^-1

IR (KBr):

(C-O-C) 1821, 1751 cm^-1, (SO₂) 1348, 1147 cm^-1

Pbf-MeAib-Anhydrid:

weißer Feststoff

Ausbeute:

65%

Fp.:

91-95°C

IR (KBr):

(C-O-C) 1820, 1751 cm^-1, (SO₂) 1318, 1136 cm^-1

MS:

[M+H]: 721; ber.: 720

5.3.3 Tosyl- und Pbf-Aminosäuren nach dem Schotten-Baumann-Verfahren

Die entsprechende Aminosäure wurde zu einer basischen (siehe Tab. 9 ) Lösung gegeben. Unter Rühren wurde das gelöste Arensulfonylchlorid anschließend portionsweise zum Reaktionsansatz gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur einige Stunden geschüttelt/gerührt.

Nach Beendigung der Reaktion wurde der Ether abgetrennt bzw. der Reaktionsansatz mit Ether extrahiert, um überschüssige Reaktanten zu entfernen. Die wäßrige Phase wurde dann mit 50 %iger HCl auf pH 3-4 gebracht. Dabei fiel das gewünschte Produkt aus. Es wurde dann noch 2h gerührt und durch Filtration isoliert.

Tab. 9: Reaktionsbedingungen für die Herstellung der Tosyl- und Pbf-Aminosäuren

Menge

Base

org. LM

T_Reakt.

Reinigung

Tosyl-AS

0,01 mol

20 ml 1N NaOH

Ether

3-4 h

Umkristallisation aus 60% EtOH

Pbf-AS

0,018 mol

20 ml 4,5M Na₂CO₃

Dioxan

12 h

Flash-Chromatographie; Kieselgel 60, EE/n-Hexan/HAc 95/5/1

Tos-Ala:

Tos-Aib:

weißer Feststoff

weißer Feststoff

Ausbeute:

47%

Ausbeute:

31%

Fp.:

130-133°C

Fp.:

145-147°C

IR (KBr):

(C=O): 1712 cm^-1, (SO₂): 1343, 1150 cm^-1

IR(KBr):

(C=O): 1710 cm^-1, (SO₂): 1323, 1152 cm^-1

MS:

[M-H]: 242; ber.: 243

MS:

[M-H]: 256; ber.: 257

Pbf-Aib-OH:

Pbf-MeAib-OH:

weiße Kristalle

weiße Kristalle

Ausbeute:

30%

Ausbeute:

31,7%

Fp.:

195-200°C

Fp.:

140-143°C

IR (KBr):

(C=O): 1707 cm^-1, (SO₂): 1312, 1128 cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1709 cm^-1, (SO2): 1318, 1126 cm^-1

MS:

[M-H]: 354; ber.: 355

MS:

[M+H]: 370; [M-H]: 368; ber. 369

Elementaranalyse für C₁₇H₂₅NO₅S:

Elementaranalyse für C₁₈H₂₇NO₅S:

ber.:

C: 57,46%; H: 7,04%; N: 3,94%

ber.:

C: 58, 45%; H: 7,32%; N: 3,79%

gef.:

C: 55,97%; H: 6,82%; N: 3,80%

gef.:

C: 58,53%; H: 7,14%; N: 3,60%

1H-NMR:

(ppm, MeOD), delta 1.31 (s,6,AS-Me₂), 1.49 (s,6,Pbf-Me₂), 2.09, 2.47, 2.56 3× (s, 3, Ar-Me), 3.01 (s, 2, CH₂)

¹H-NMR:

(ppm, MeOD), delta 1.48 (s,6,AS-Me₂), 1.49 (s,6,Pbf-Me₂), 2.1, 2.49, 2.55 3× (s, 3, Ar-Me), 2.82 (s, 3, N-Me), 3.03 (s, 2, CH₂)

5.3.4 NBS- und DNBS-Aminosäuren

5 mmol Aminosäure wurden in 15 ml Acetonitril suspendiert. Zu dieser Mischung wurde 10,8 mmol BSA (2,63 ml) gegeben und bei 50-60°C bis zur vollständigen Lösung der Aminosäure gerührt. Nach Abkühlung des Reaktionsgemisches wurden 4,9 mmol Arensulfonylchlorid zum Ansatz gegeben und bei Raumtemperatur bis zur Beendigung der Reaktion (DC-Kontrolle - Laufmittel: CHCl₃/MeOH/HAc=9/1/0,1) gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Lösung eingeengt und in Essigester aufgenommen. Die organische Phase wurde 3× mit 50%iger HCl extrahiert und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Die so erhaltene Lösung wurde eingeengt, die Arensulfonyl-geschützte Aminosäure kristallisierte aus trockenem EE/n-Hexan aus. Die Reinigung der Substanzen erfolgte durch Umkristallisation bzw. Flash-Chromatographie (Laufmittel: EE/HAc=9,85/0,15). Das Laufmittel wurde unter Zugabe von Toluen abgezogen, um die Essigsäure zu entfernen.

o-NBS-Ala-OH:

o-NBS-Val-OH:

Hellgelber Feststoff

Hellgelber Feststoff

Ausbeute:

91,2%

Ausbeute:

88.5%

Fp.:

153-159°C

Fp.:

112-114°C

IR (KBr):

(C=O) 1720 cm^-1; (SO₂) 1350, 1172 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1714 cm^-1; (SO₂) 1360, 1167 cm^-1

MS:

[M-H]: 272; ber.: 273

MS:

[M-H]: 301; ber.: 302

Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:

ber.:

C: 39,42%; H: 3,65%; N: 10,2%

gef.:

C: 39,60%; H: 3,57%; N: 9,99%

o-NBS-Aib-OH:

o-NBS-MeAib-OH:

Hellgelber Feststoff

Hellgelber Feststoff

Ausbeute:

93,6%

Ausbeute:

73%

Fp.:

175-178°C

Fp.:

145-148°C

IR (KBr):

(C=O) 1706 cm^-1; (SO₂) 1332, 1164 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1728 cm-1; (SO₂) 1341, 1167 cm^-1

MS:

[M-H]: 287; ber.: 288

MS:

[M-H]: 301; ber.: 302

Elementaranalyse für C₁₀H₁₂N₂O₆S:

Elementaranalyse für C₁₁H₁₄N₂O₆S:

ber.:

C: 41,66%; H: 4,16%; N: 9,7%

ber.:

C: 43,7%; H: 4,63%; N: 9,27%

gef.:

C: 41,53%; H: 4,07%; N: 9,33%

gef.:

C: 43,69%; H: 4,54%; N: 8,98%

p-NBS-Aib-OH:

p-NBS-MeAib-OH:

Hellgelber Feststoff

Hellgelber Feststoff

Ausbeute:

93%

Ausbeute:

58%

Fp.:

166-169°C

Fp.:

180-184°C

IR (KBr):

(C=O) 1711 cm^-1; (SO₂) 1338, 1169 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1715 cm^-1; (SO₂) 1353, 1144 cm^-1

MS:

[M-H]: 287; ber.: 288

MS:

[M-H]: 301; ber.: 302

DNBS-Val-OH:

DNBS-Aib-OH:

Gelber Feststoff

Hellgelber Feststoff

Ausbeute:

93,6%

Ausbeute:

89,7%

Fp.:

139-142°C

Fp.:

183-185°C

IR (KBr):

(C=O) 1723 cm^-1; (SO₂) 1354, 1172 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1711 cm^-1; (SO₂) 1357, 1169 cm^-1

MS:

[M-H]: 346; ber.: 347

MS:

[M-H]: 332; ber.: 333

¹H-NMR:

(ppm, CD₃OD): delta 0.91, 0.94; 0.99, 1.02 2× (d, 3, CH₃), 2.2 (qqd, 1, C-H), 4.08, 4.11 (d, 1, N-CH), 8.38, 8.40; 8.55, 8.61 2× (d, 1, Ar-H), 8.70 (s, 1, Ar(NO₂)-H)

¹H-NMR:

(ppm, CD₃OD), delta 1.82 (s, 6, Me₂), 8.32, 8.36 (d, 1, Ar-H), 8.56, 8.60 (d, 1, Ar-H), 8.71 (s, 1, Ar(NO₂)-H)

¹³C-NMR:

(ppm, CD₃OD), delta 18.1 (1, CH₃), 20.0 (2, CH₃), 32.4 (1, CH), 63.7 (1, CHR), 121.4, 128.0, 133.8, 140.6, 149.6, 151.6 (6, Ar-C), 174.1 (C=O)

¹³C-NMR:

(ppm, CD₃OD), delta 27.1 (2, CH₃), 63.7 (1, CMe₂), 121.6, 128.1, 133.3, 142.7, 149.5, 151.4 (6, Ar-C), 177.2 (C=O)

Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:

ber.:

C: 36,03%; H: 3,3%; N: 12,61%

gef.:

C: 38,13%; H: 3,49%; N:11,80%

DNBS-MeAib-OH:

Hellgelber Feststoff

Ausbeute:

50,6%

Fp.:

178-185°C

IR (KBr):

(C=O) 1709 cm^-1; (SO₂) 1349, 1169 cm^-1

MS:

[M-H]: 346; ber.: 347

¹H-NMR:

(ppm, CD₃OD), delta 1.5 (s, 6, Me₂), 3.00 (s, 3, N-CH₃), 8.32, 8.36; 8.56, 8.60 2× (d, 1, Ar-H), 8.71 (s, 1, Ar(NO₂)-H)

¹³C-NMR:

(ppm, CD₃OD): delta 26.7 (2, CH₃), 33.4 (3, N-CH₃), 66.2 (1, CMe₂), 121.3, 127.8, 133.3, 141.2, 150.2, 151.5 (6, Ar-C), 177.1 (C=O)

Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:

ber.:

C: 38,04%; H: 3,74%; N: 12,1%

gef.:

C: 38,51%; H: 3,78%; N:11,62%

5.3.5 Arensulfonyl-geschützte Aminosäurefluoride

3 mmol RSO₂-Aminosäure wurden in 20 ml trockenem DCM suspendiert und mit 3 mmol (0,25 ml) trockenem Pyridin versetzt. Unter Rühren wurden dann langsam 6 mmol (0,505 ml) Cyanurfluorid zugetropft und die Lösung 2h bei Raumtemperatur gerührt. Dabei fiel Cyanursäure aus. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Lösung mit zerstoßenem Eis extrahiert, um überschüssiges Cyanurfluorid zu hydrolysieren. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel bis auf einen kleinen Rest am Rotationsverdampfer entfernt. Man erhält das Aminosäurefluorid aus DCM/n-Hexan. Die Kristallisation des Aminosäurefluorides kann durch Abkühlung auf -18°C (Tiefkühlschrank) unterstützt werden.

Für die Lagerung empfiehlt sich eine Aufbewahrung im Exsikkator über Phosphorpentoxid.

Tos-Ala-F:

Tos-Aib-F:

Hellroter Feststoff

Hellroter Feststoff

Ausbeute:

81,6%

Ausbeute:

74,4%

Fp.:

85°C

Fp.:

118°C

IR (KBr):

(C=O): 1845 cm^-1, (SO₂): 1339, 1156 cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1846 cm^-1, (SO₂): 1319, 1147 cm^-1

Pbf- Aib-F:

Pbf-MeAib-F:

Weiße Kristalle

Weiße Kristalle

Ausbeute:

40%

Ausbeute:

46%

IR (KBr):

(C=O): 1841cm^-1, (SO₂): 1313, 1132cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1830cm^-1, (SO₂): 1302, 1133cm^-1

¹H-NMR:

(CDCl₃) delta 1.47 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.57 (s, 6, AS-Me₂), 2.11, 2.47, 2.52 3× (s, 3, Me-Ar), 2.72 (s, 3, N-Me), 3.04 (s, 2, CH₂)

5.3.6 Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride

500 mg Arensulfonyl-geschützte Aminosäure wurden in 2,5 ml Dichlormethan in einem 50 ml Kolben suspendiert. Unter Rühren wurden dann 1 ml Thionylchlorid zur Suspension gegeben und das Reaktionsgemisch ca. 45 Minuten unter Rückfluß erhitzt (45°C) bis sich die Aminosäure vollständig gelöst hatte. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurde das überschüssige Thionylchlorid 3× mit trockenem Dichlormethan abgezogen. Das Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechlorid kristallisierte aus trockenem DCM/n-Hexan bzw. trockenem Ether/n-Hexan aus. Die Kristallisation des Aminosäurechlorides kann durch Abkühlung auf -18°C (Tiefkühlschrank) unterstützt werden.

Zur Verbesserung der Kristallisation wurde bei der Herstellung der DNBS-Aminosäurechloride zusätzlich noch 0,1 Äquivalent Collidin zur Reaktionslösung gegeben.

Tos-Ala-Cl:

Tos-Aib-Cl:

Hellgelbe Kristalle

Hellgelbe Kristalle

Ausbeute:

88,6%

Ausbeute:

87,8%

Fp.:

103°C

Fp:

115°C

IR (KBr):

(C=O): 1785 cm^-1, (SO₂): 1329, 1152 cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1803 cm^-1, (SO₂): 1325, 1149 cm^-1

Pbf-Aib-Cl:

Pbf-MeAib-Cl:

Hellbraune Kristalle

Hellbraune Kristalle

Ausbeute:

74,5%

Ausbeute:

72,1%

Fp.:

115-120°C

IR (KBr):

(C=O): 1801 cm^-1, (SO₂): 1314, 1133 cm^-1

IR (KBr):

(C=O): 1808 cm^-1, (SO₂): 1319, 1126 cm^-1

¹H-NMR:

(ppm CDCl₃), delta 1.41 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.47 (s, 6, Me₂), 2.11, 2.48, 2.56 3× (s, 3, Ar-Me), 2.97 (s, 2, CH₂)

¹H-NMR:

(ppm, CDCl₃), delta 1.48 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.61 (s, 6, AS-Me₂), 2.11, 2.49, 2.55 3× (s, 3, Ar-Me), 2.89 (s, 3, N-Me), 2,97 (s, 2, CH₂)

¹³C-NMR:

(ppm, CDCl₃) delta 13.00, 18.38, 19.79 3× (1, Ar-Me), 25.49 (2, Aib-Me₂), 28.99 (2, Pbf-Me₂), 43.58 (1, Pbf-CH₂), 66.51 (1, C- alpha ), 87.47 (1, Pbf-CMe₂), 118.66, 125.83, 130.86, 133.87, 139.46, 160.42 (6, Ar-C), 178.24 (C=O)

¹³C-NMR:

(ppm, CDCl₃) delta 13.18, 18.09, 19.98 3×(1, Ar-Me), 24.89 (2, AS-Me₂), 29.24 (2, Pbf-Me₂), 34.30 (1, N-Me), 43.86 (1, Pbf-CH₂), 72.85 (1, C- alpha ), 87.66 (1, Pbf-CMe₂), 118.84, 126.03, 130.74, 135.12, 141.03, 160.72 (6, Ar-C), 177.59 (1, C=O)

o-NBS-Aib-Cl:

o-NBS-MeAib-Cl:

Hellbrauner Feststoff

Hellbrauner Feststoff

Ausbeute:

58,8%

Ausbeute:

82,6%

Fp.:

103-105°C

Fp.:

119-122°C

IR (KBr):

(C=O) 1805 cm^-1; (SO₂) 1330, 1159 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1808 cm^-1; (SO₂) 1341, 1149 cm^-1

¹H-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 1.64 (s, 6, Me₂), 5.97 (s, 1, N-H), 7.78 (d, 2, Ar-H), 7.95, 8.14 2× (dd, 1, Ar-H)

¹H-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 1.64 (s, 6, Me₂), 3.03 (s, 1, N-Me), 7.66, 8.14 2× (dd, 1, Ar-H), 7.71 (d, 2, Ar-H)

¹³C-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 26.82 (2, Me₂), 67.67 (1, C-Me), 126.25, 130.88, 133.96, 134.48, 136.20, 148.16 (6, Ar-C), 177.05 (C=O)

¹³C-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 25.85 (2, Me₂), 33.89 (1, N-Me), 71.63 (1, C-Me), 125.06, 130.69, 132.73, 134.56, 134.68, 149.08 (6, Ar-C), 176.61 (C=O)

p-NBS-MeAib-Cl:

DNBS-Val-Cl:

Hellbrauner Feststoff

Hellgelbe Kristalle

Ausbeute:

70,7%

Ausbeute:

91,2%

Fp.:

116-121°C

Fp.:

78-80°C

IR (KBr):

(C=O) 1802 cm^-1; (SO₂) 1347, 1164 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1797 cm^-1; (SO₂) 1348, 1171 cm^-1

DNBS-Aib-Cl:

DNBS\|--\|MeAib-Cl:

Hellgelbe Kristalle

Hellgelbe Kristalle

Ausbeute:

99,1%

Ausbeute:

100%

IR (KBr):

(C=O) 1791 cm^-1; (SO₂) 1350, 1168 cm^-1

IR (KBr):

(C=O) 1791 cm^-1; (SO₂) 1345, 1146 cm^-1

¹H-NMR:

(ppm, CH₂Cl₂): delta 1.65 (s, 6, Me₂), 8.35, 8.40 (d, 1, Ar-H), 8.60, 8.65 (d, 1, Ar-H), 8.70 (s, 1, Ar(NO₂)-H)

¹³C-NMR:

(ppm, CH₂Cl₂): delta 26.22 (2, CH₃), 67.81 (1, CMe₂), 121.33, 128.03, 132.34, 140.58, 148.00, 150.25 (6, Ar-C), 177.1 (C=O)

5.4 Kupplungen der Arensulfonylaminosäurehalogenide

5.4.1 RSO₂-Aib/MeAib-X an Aib-OMe

0,1 mmol Aib-OMe×HCl in 600 µl DCM wurde unter Rühren mit 0,2 mmol Base versetzt. Anschließend wurde zu der so erhaltenen Lösung 0,1 mmol RSO₂-Aminosäurehalogenid gegeben und noch 15 Minuten gerührt ( Tab. 10 ).

Tab. 10: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO₂-Aib/MeAib-X an Aib-OMe

AS-X

NH-R

LM

Base

Ausbeute

Tos-Aib-F;
0,1 mmol = 25,9 mg

Aib-OMe;
0,1 mmol = 15,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,3 mmol = 51,3 µl

88%

Tos-Aib-F;
0,1 mmol = 25,9 mg

Aib-OMe;
0,1 mmol = 15,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

88%

Tos-Aib-Cl;
0,1 mmol = 27,5 mg

Aib-OMe;
0,1 mmol = 15,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,3 mmol = 51,3 µl

81%

Tos-Aib-Cl;
0,1 mmol = 27,5 mg

Aib-OMe;
0,1 mmol = 15,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

95%

Tos-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,7 mg

Aib-OMe;
0,05 mmol = 7,6mg

DCM
300 µl

BSA;
0,1 mmol = 24,4 µl

84%

AS-X

NH-R

LM

Base

Ausbeute

Pbf-Aib-F;
0,1 mmol = 35,7 mg

Aib-OMe;
0,1mol = 5,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

83%

Pbf-MeAib-F;
0,1 mmol = 37,1 mg

Aib-OMe;
0,1mol = 5,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

81%

Pbf-Aib-Cl;
0,1 mmol = 37,3 mg

Aib-OMe;
0,1mol = 5,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

90%

Pbf-Aib-Cl;
0,05 mmol = 18,7 mg

Aib-OMe;
0,1mol = 5,2 mg

DCM
300 µl

BSA;
0,1 mmol = 24,4 µl

83%

Pbf-MeAib-Cl;
0,1 mmol = 38,7 mg

Aib-OMe;
0,1mol = 5,2 mg

DCM
600 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

94%

Pbf-MeAib-Aib-OMe:

Weißer Feststoff

IR (KBr):

(C-OMe) 1746 cm^-1, (N-CO) 1683 cm^-1, (SO₂) 1306, 1152 cm^-1

MS:

[M+H] 469, ber.:468

5.4.2 RSO₂-Aib/MeAib-X an MeAib-OMe

MeAib-OMe×HCl wurde in Toluen gelöst. Die Freisetzung des Hydrochlorides erfolgte unter Zugabe von 1eq. DIEA. Die Lösung wurde kurz gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde dann unter Rühren zu RSO₂-Aib-Cl ( Tab. 11 ) bzw. RSO₂-MeAib-Cl ( Tab. 12 ) gegeben. Die Reaktionszeit betrug 15 Minuten bzw. 3h.

In einigen Fällen wurde für die Kupplung der freie Ester eingesetzt. Dieser wurde durch Versetzen mit festem K₂CO₃ und anschließender Extraktion mit trockenem Ether gewonnen. Der Ether wurde bei Raumtemperatur abrotiert. (Vorsicht: der freie Ester ist sehr flüchtig!) Man erhält MeAib-OMe als ein Öl.

Tab. 11: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO₂-Aib-X an MeAib-OMe

AS-X

NH-R

LM

Base

Ausbeute

Tos-Aib-F;
0,1 mmol = 25,9 mg

MeAib-OMe;
0,1mol

DCM
600 µl

______

2%

Tos-Aib-Cl;
0,1 mmol = 27,5 mg

MeAib-OMe;
0,1mol

DCM
600 µl

______

45%

Tos-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
600 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl

20%

Tos-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl

66%

AS-X

NH-R

LM

Base

Ausbeute

Tos-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

DCM;
300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl

18%

Tos-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,2 mmol = 33,4 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

71%

Pbf-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,2 mmol = 33,4 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

60%

Pbf-Aib-Cl;
0,05 mmol = 13,8 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl
BSA;
0,05 mmol = 12,2 µl

56%

o-NBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 15,3 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen*300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl
BSA;
0,05 mmol = 12,2 µl

32%

o-NBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 15,3 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

DIEA; 0,1 mmol = 17,1 µl
BSA; 0,05 mmol = 12,2 µl

51%

DNBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 17,6 mg

MeAib-OMe;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

BSA;
0,15 mmol = 36,7 µl

36%

DNBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 17,6 mg

MeAib-OMe;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl

2%

DNBS-Aib-Cl;
0,1 mmol = 35,1 mg

MeAib-OMe;
0,3 mmol = 50 mg

Toluen;
600 µl

____________

66%

DNBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 17,6 mg

MeAib-OMe;
0,1 mmol = 13,1 mg

Toluen;
300 µl

____________

55%

DNBS-Aib-Cl;
0,05 mmol = 17,6 mg

MeAib-OMe;
0,05 mmol = 6,6 mg

Toluen;
300 µl

BSA;
0,05 mmol = 12,1 µl

54%

Tos-Aib-MeAib-OMe:

Pbf-Aib-MeAib-OMe:

Weißer Feststoff

Weißer Feststoff

IR (KBr):

(C=O): 1740 cm^-1, (CO-N): 1612 cm^-1, (SO₂): 1328, 1157 cm^-1

IR (KBr):

(C=O):1717 cm^-1,
(CO-N): 1632 cm^-1, (SO₂): 1322, 1135 cm^-1

MS:

[M+H]: 371; ber.:370

MS:

[M+H]: 469; ber.:468

Elementaranalyse für C₂₃H₃₆N₂O₆S:

ber.:

C: 58,97; H: 7,69; N: 5,98

gef.:

C: 58,90; H: 7,47; N: 5,99

74

¹H-NMR:

(ppm, CD₂Cl₂): delta 1.31 (s, 6, MeAib-Me₂), 1.39 (s, 6, Aib-Me₂), 1.46 (s, 6, Pbf-Me₂), 2.1, 2.43, 2.52 3× (s, 3, Me-Ar), 2.98 (s, 2, CH₂), 3.23 (s, 3, N-Me), 3.58 (s, 3, O-Me)

o-NBS-Aib-MeAib-OMe:

DNBS-Aib-MeAib-OMe:

Weißer Feststoff

Weißer Feststoff

Ausbeute laut HPLC:

52%

MS:

[M+H]: 402; ber.: 401

MS:

[M+H]: 447; ber.: 446

Tab. 12: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO₂-MeAib-X an MeAib-OMe

AS-X

NH-R

LM

Base

Ausbeute

Pbf-MeAib-Cl;
0,05 mmol = 19,4 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,2 mmol = 33,4 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,2 mmol = 34,2 µl

51%

Pbf-MeAib-Cl;
0,15 mmol = 58,1 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,6 mmol = 100,2 mg

Toluen;
900 µl

DIEA;
0,6 mmol = 77,6 µl

63%

Pbf-MeAib-Cl;
0,05 mmol = 19,4 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,7 mg

Toluen;
300 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl
BSA;
0,05 mmol = 12,2 µl

51%

o-NBS-MeAib-Cl;
0,1 mmol = 32,0 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,3 mmol = 50,1 mg

Toluen;
600 µl

DIEA;
0,3 mmol = 51,3 µl

38%
(1d=64%)

o-NBS-MeAib-Cl;
0,05 mmol = 16,0 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,1 mg

Toluen*
250 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl
BSA;
0,05 mmol = 12,2 µl

83%

p-NBS-MeAib-Cl;
0,05 mmol = 16,0 mg

MeAib-OMe×HCl;
0,1 mmol = 16,1 mg

Toluen*
250 µl

DIEA;
0,1 mmol = 17,1 µl
BSA;
0,05 mmol = 12,2 µl

80%

* Das Aminosäurechlorid wurde vor Zugabe zur Aminokomponente in 50 µl DCM gelöst.

Pbf-MeAib-MeAib-OMe:

o-NBS-MeAib-MeAib-OMe:

Weißer Feststoff

Weißer Feststoff

Ausbeute:

63%

Ausbeute laut HPLC:

86%

Fp.:

170°-172°C

IR (KBr):

(C-OMe)1741 cm^-1;
(N-CO) 1642 cm^-1;
(SO₂) 1306, 1132 cm^-1

MS:

[M+H]: 483; ber.: 482

MS:

[M+H]: 416; ber.: 415

Elementaranalyse für C₂₄H₃₈N₂O₆S:

ber.:

C: 59,75%; H: 7,88%; N: 5,8%

gef.:

C: 59,33%; H: 7,66%; N:5,81%

¹H-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 1.39, 1.48 2× (s, 6, Me₂), 1.6 (s, 6, Pbf-Me₂), 2.1, 2.5, 2.54 3× (s, 3, Me-Ar), 2.77 (s, 3, N-Me), 2.97 (s, 2, CH₂), 3.25 (s, 3, N-Me), 3.65 (s, 3, O-Me)

p-NBS-MeAib-MeAib-OMe

¹³C-NMR:

(ppm, CDCl₃): delta 12.7, 18.2, 19.9 3× (1, Ar-Me), 22.8, 23.6 2× (2, MeAib-Me), 28.8 (2, Pbf-Me), 30.6, 34.1 2×(1, N-Me), 43.5 (1, Pbf-CH₂), 52.2 (1, O-Me), 62.1, 67.2 2× (1, C- alpha ), 87.66 (1, Pbf-CMe₂), 118.5, 125.7, 129.8, 135.1, 140.5, 160.2 (6, Ar-C), 171.9 (1, C=O), 171.9 (1, C=O)

Ausbeute laut HPLC:

80%

5.4.3 Synthese von DNBS-Val-Val-OMe

Zu einer Lösung von 0,05 mmol Val-OEt×HCl (9,05 mg) in 300 µl Lösungsmittel wurde unter Rühren 0,05 mmol DIEA (8,56 µl) zum Freisetzen des Hydrochlorides gegeben. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 0,05 mmol DNBS-Val-Cl (18,25 mg) und 0,05 mmol Base versetzt. Die Reaktion wurde nach 15 Minuten abgebrochen ( Tab. 13 ).

Tab. 13: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für DNBS-Val-Cl + Val-OMe

LM

HCl-Fänger

Ausbeute [%]

Toluen

BSA

75

DIEA

81

DMF

BSA

79

DIEA

82

LM

HCl-Fänger

Ausbeute [%]

DCM

BSA

93

DIEA

97

DNBS-Val-Val-OMe:

Weißer Feststoff

IR (KBr):

(C=O): 1737 cm^-1, (CO-N): 1649 cm^-1, (SO₂): 1352, 1168 cm^-1

MS:

[M+H]: 475; ber.: 474

5.5 Abspaltung der Arensulfonylschutzgruppe

5.5.1 Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe

TFA/TMSO

Zu 0.002 mmol Peptid (1 mg) wurden 100 µl TFA und 28,2 µl TMSO gegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit Ether versetzt. Das Rohpeptid konnte durch Zentrifugation von der Reaktionslösung abgetrennt werden.

TFA/TFMSA

Zu einer Lösung von 0,002 mmol Peptid (1 mg) in 100 µl TFA wurden 4,5 µl TFMSA und 5,3 µl Thioanisol gegeben. Anschließend wurde 1,5h bei Raumtemperatur gerührt. Das Peptid wurde durch Fällung mit Ether und anschließender Zentrifugation des Reaktionsgemisches erhalten.

TFA/DMS

0,004 mmol Peptid (2 mg) wurden mit 180 µl TFA und 20 µl DMS versetzt und 1h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit Ether versetzt und der entstehende Niederschlag durch Zentrifugation vom Lösungsmittel abgetrennt.

50%TFA/DMS

Zu 1,3×10^-4 mmol Peptid (0,6 mg) wurden 50 µl einer Lösung bestehend aus 25 µl 50% TFA und 25 µl DMS gegeben. Der Ansatz wurde mehrere Stunden gerührt, die Reaktion chromatographisch verfolgt.

MeAib-MeAib-OMe:

weißer Feststoff

Ausbeute:

80%

IR (KBr):

(C=O) 1740 cm^-1, (C(O)-N) 1642 cm^-1, (SO₂) 1306, 1157 cm^-1

MS

[M+H]: 231; ber.: 230

5.5.2 Abspaltung der NBS-Schutzgruppe

Die Abspaltung der o-NBS-Schutzgruppe wurde mit einer 0,5M Lösung von beta -Mercaptoethanol/DBU in DMF durchgeführt.

Dazu wurden 4,98×10^-3 mmol o-NBS-Aib-MeAib-OMe (2 mg) mit 10 Äquivalenten beta -Mercaptoethanol (3,5 µl) und 5 Äquivalente DBU (3,8 µl) in 100µl DMF versetzt und die Reaktion chromatographisch verfolgt.

5.5.3 Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe

Thiophenol/K₂CO₃

0,017 mmol DNBS-Val-Val-OEt (8,3 mg) wurden mit 70 µl einer 5 %igen Thiophenolatlösung versetzt. Das für die Abspaltung der Schutzgruppe notwendige Phenolat wurde dabei durch Schütteln mit 2 Äquivalenten K₂CO₃ in DMF und anschließender Filtration der Lösung erhalten (0,034 mmol Thiophenol (3,5 µl) und 0,068 mmol K₂CO₃ (9,4 mg) in 70µl DMF). Die verwendete Abspaltlösung ist sehr oxydationsempfindlich und in ihrer zeitlichen Anwendung begrenzt.

beta -Mercaptoethanol/DBU

Zu 0,028 mmol DNBS-Val-OH (10 mg) wurden unter Rühren bei Raumtemperatur beta -Mercaptoethanol/DBU jeweils (1:2) in DMF, (1:1) und (2:1) in DCM gegeben. Die Konzentration der Lösung war 0,3M. Es wurde jeweils 1 Äquivalent beta -Mercaptoethanol verwendet. Die Reaktionen wurde über mehrere Stunden verfolgt.

beta -Mercaptoethanol/ Triethylamin

Zu 0,0288 mmol DNBS-Aminosäure wurde eine 0,3M beta -Mercaptoethanolatlösung gegeben. Dafür wurde ein 10facher Überschuß beta -Mercaptoethanol (0,288 mmol = 20,1 µl) in 860 µl Lösungsmittel (DCM, DMF) gegeben und mit 2 Äquivalenten Triethylamin (0,576 mmol = 80,33 µl) versetzt.

5.6 Kupplungen mit in situ gebildeten Aminosäurechloriden

5.6.1 In situ Aktivierung am Essigsäuremodell

Von 6 ml einer 0,1 M SOCl₂ (43,76 µl SOCl₂ in 6 ml DCM) wurde 1 ml für IR-spektroskopische Untersuchungen verwendet. In die restlichen 5 ml wurden 0,5 mmol HAc (28,6 µl) gegeben. Für spektroskopische Untersuchungen wurde wiederum 1 ml entnommen. Die verbleibenden 4 ml wurden geteilt und mit jeweils 0.1, 0.25, 0.5 und 1 Äquivalenten Base (Collidin, Pyridin und DIEA) versetzt. Die IR-Spektren wurden jeweils für 2, 5 und 10 Minuten Reaktionszeit aufgenommen.

5.6.2 In situ Aktivierung von DNBS-Val-OH

Zu DNBS-Val-OH wurde eine Lösung von SOCl₂ in DCM, sowie unter Rühren Pyridin gegeben. Die Reaktion wurde sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 45°C durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle wurden 10 µl Probe in 20 µl einer 5 %igen Pyridin/MeOH-Lösung gegeben und nach 10 Minuten mit 50 % AN/H₂O/0.1 %TFA verdünnt. In Tab. 14 sind die Daten der über in situ Aktivierung erhaltenen Aminosäurechloride dargestellt.

Tab. 14: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der in situ Aktivierung von DNBS-Val-Cl

µl LM

SOCl₂ [mmol]

Pyridin [mmol]

Temperatur

Ausbeute [%]

160µl DCM^~

0,05 (1 eq.)

0,05 (1 eq.)

T_Raum

46

160µl DCM^~

0,05 (1 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°-45°C

30,5

160µl DCM^~

0,05 (1 eq.)

0,025 (0,5 eq.)

T_Raum

36,7

160µl DCM^~

0,05 (1 eq.)

0,025 (0,5 eq.)

40°- 45°C

47,8

160µl DCM

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

T_Raum

58,4

160µl DCM

0,075 (1,5 eq.)

0,025 (0,5 eq.)

T_Raum

47,2

160µl DCM

0,1 (2 eq.)

0,05 (1 eq.)

T_Raum

72,4

160µl DCM

0,075 (1,5 eq.)

0,075 (1,5 eq.)

40°- 45°C

60,5

160µl DCM

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

61,3

160µl DCM

0,1 (2 eq.)

0,075 (1,5 eq.)

40°- 45°C

64,5

160µl DCM

0,1 (2 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

76,5

80 µl DCM*

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

71°

80 µl DCM*

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

76°

60µl DCM*

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°-45°C

71,5°

60µl DCM

0,075 (1,5 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

80,1°

60µl DCM*

0,1 (2 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

74,9°

60µl DCM

0,1 (2 eq.)

0,05 (1 eq.)

40°- 45°C

86,0°

~ Das Lösungsmittel enthielt zusätzlich THF. Die Zusammensetzung war DCM/THF = 3:1.
* Zusätzlich wurden zu der Lösung noch 2µl DMF als Katalysator gegeben.
° Umsätze nach 30 Minuten.

5.6.3 IR-Untersuchungen zum Abfangen von SOCl₂ mit t-BuOH

Von einer 0,1M Lösung SOCl₂ (21,88 µl SOCl₂ in 3 ml DCM) wurde 1 ml für die Nullwert-Bestimmung abgenommen. Die verbleibenden 2 ml wurden geteilt und mit je 0,1 mmol und 0,2 mmol t-BuOH versetzt. Die Lösungen wurden IR-spektroskopisch vermessen.

Um zu überprüfen, daß die zum Abfangen des SOCl₂ genutzten Reaktionsbedingungen die Stabilität des Aminosäurechlorides nicht beeinflussen, wurden 0,2 mmol DNBS-Val-Cl in 2 ml DCM gelöst. Für die Messung des Aminosäurechlorides wurde 1 ml verwendet. Die restliche Lösung wurde geteilt und mit jeweils 3 (0.15 mmol = 14,4 µl) bzw. 12 Äquivalenten t-BuOH (0,6 mmol = 57,6 µl) versetzt. Die so erhaltenen Lösungen wurden ebenfalls IR-spektroskopisch vermessen.

5.6.4 Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl

Für die Kupplung mit in situ hergestellten Aminosäurechloriden wurde DNBS-Val-OH mit 2 Äquivalenten SOCl₂ und 1 Äquivalent Pyridin für 30 Minuten bei 40-45°C in DCM umgesetzt. Anschließend wurde die Aminosäurechloridlösung mit t-Butanol zum Abfangen des SOCl₂ versetzt und 2 Minuten gerührt. Zu der so erhaltenen Lösung wurde unter Rühren die mit einem Äquivalent DIEA freigesetzte Aminokomponente und Base gegeben. In der folgenden Tab. 15 sind die Daten für die Umsetzungen zum Dipeptid dargestellt.

Tab. 15: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl

DNBS-Val

LM

t-BuOH

Base

Val-OR

Ausbeute [%]

0.05mmol

DCM

______

0,05mmol DIEA

0,05 mmol

13,1

0.05mmol

DCM

0,15mmol

0,05mmol DIEA

0,05 mmol

51,7

0.05mmol

DCM

0,15mmol

0,075mmol DIEA

0,05 mmol

86,5

0.05mmol

DCM

0,15mmol

0,10mmol DIEA

0,05 mmol

95,8

0.05mmol

DCM/DMF

0,15mmol

0,05mmol DIEA

0,05 mmol

62,9

0.05mmol

DCM/DMF

0,15mmol

0,05mmol DIEA,
0,05mmol Collidin

0,05 mmol

60,4

0.05mmol

DCM/DMF

0,15mmol

0,10mmol Collidin

0,05 mmol*

79,9

0.05mmol

DCM

0,15mmol

0,075mmol DIEA

0,05 mmol*

93,1

* Hier wurde die Aminokomponente separat durch Extraktion mit einer NaHCO₃-Lösung freigesetzt.

5.6.5 Acylierungen mit in situ gebildeten, sterisch gehinderten Aminosäurechloriden

RSO₂-Aminosäure in DCM wurde mit 2 eq. SOCl₂ und 1 eq. Pyridin versetzt und 30 Minuten bei 45°C gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit einem SOCl₂-Fänger versetzt und noch 2 Minuten gerührt. Dann wurden 2-4 eq. Aminokomponente zur Reaktionslösung gegeben und weitere 30 Minuten bis 3h gerührt ( Tab. 16 ).

Tab. 16: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Aib/MeAib-Cl

Aminosäure/in situ-Ansatz

%

HCl-Fänger

Base

Aminokomp.

Umsatz

DNBS-Aib 0,15mmol
SOCl₂ 0,3 mmol;
Pyridin 0,15mmol, 316µl DCM

93,7

t-BuOH,
0,45 mmol

Collidin
0,3 mmol

Ala-NA
0,15 mmol

82%,

DNBS-Aib 0,3mmol
SOCl₂ 0,6 mmol;
Pyridin 0,3mmol, 320µl DCM

90,4

t-BuOH,
0,9 mmol

Collidin
0,6 mmol

Ala-NA
0,2 mmol

85%

Aminosäure/in situ-Ansatz

%

HCl-Fänger

Base

Aminokomp.

Umsatz

DNBS-Aib 0,3 mmol
SOCl₂ 0,6 mmol;
Pyridin 0,3 mmol, 320 µl DCM

92

t-BuOH,
0,9 mmol

DIEA
0,6 mmol

Ala-NA
0,2 mmol

82,3%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

91,3

t-BuOH,
0,15 mmol

DIEA
0,1 mmol

Ala-NA
0,025 mmol

58%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

98

t-BuOH,
0,15 mmol

DIEA
0,15mmol

Ala-NA
0,025 mmol

96,8%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

99

3eq. t-BuOH,
0,15 mmol

BSA
0,15mmol

Ala-NA
0,025 mmol

61%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

83,8

t-Butylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,15mmol

Ala-NA
0,025 mmol

62%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

78

t-Butylamin,
0,15 mmol, in 10µl DCM

DIEA
0,1 mmol

Ala-NA
0,025 mmol

98%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

84,6

t-Butylamin,
0,1 mmol

DIEA
0,1 mmol

Ala-NA
0,025 mmol

65,9%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

85

t-Butylamin,
0,05 mmol

DIEA
0,1 mmol

Ala-NA
0,025 mmol

23,7%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

81,6

t-Butylamin,
0,1 mmol

DIEA
0,15mmol

Ala-NA
0,025 mmol

11,2%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

81,6

t-Butylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,05mmol

Ala-NA
0,025 mmol

10,6%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

t-Butylamin,
0,25 mmol

_______

Ala-NA
0,025 mmol

87%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

84,6

t-Butylamin,
0,3 mmol

_______

Ala-NA
0,025 mmol

71%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

84,3

t-Butylamin,
0,5 mmol

_______

Ala-NA
0,025 mmol

10,5%

81

Aminosäure/in situ-Ansatz

%

HCl-Fänger

Base

Aminokomp.

Umsatz

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

84,7

Trityl-MeOH,
0,15 mmol

DIEA
0,1 mmol

Ala-NA
0,025 mmol

70,1%

DNBS-MeAib 0,05mmol
SOCl₂ 0.1mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

81,2

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,15mmol

Ala-NA
0,025 mmol

100%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

75,3

Trityl-MeOH
0,15 mmol

DIEA
0,1 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

_____%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0;1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

72,1

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,1 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

65%(3h)

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

80,3

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,15mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

76%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60µl DCM

89,9

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,2 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

10%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

82,3

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,16mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

90,8%

DNBS-NMeAib 0,05mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

77,4

Tritylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,17mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

84,1%

DNBS-MeAib 0,05 mmol
SOCl₂ 0,1 mmol;
Pyridin 0,05mmol, 60 µl DCM

69,5

t-Butylamin,
0,15 mmol

DIEA
0,1 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

29,9%

DNBS-MeAib 0,031 mmol
SOCl₂ 0,05 mmol;
Pyridin 0,025 mmol, 30 µl DCM

54,6

t-Butylamin,
0,094 mmol

DIEA
0,094 mmol

MeAib-Ala-NA
5 mg

_____

DNBS-MeAib 0,031 mmol
SOCl₂ 0,05 mmol;
Pyridin 0,025 mmol, 30 µl DCM

46,0

t-Butylamin,
0,094 mmol

DIEA
0,094 mmol

MeAib-Ala-NA
5 mg

_____

DNBS-MeAib 0,03 mmol
SOCl₂ 0,06mmol;
Pyridin 0,03mmol35 µl DCM

83,8

Tritylamin,
0,09 mmol

DIEA
0,096 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

48,5%

DNBS-MeAib 0,03 mmol SOCl₂ 0,06mmol; Pyridin 0,03mmol35 µl DCM

87,3

Tritylamin,
0,09 mmol

DIEA
0,099 mmol

Aib-Ala-NA
0,025 mmol

55%

Aib-MeAib-Aib-Ala-NA:

MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA:

Weißer Feststoff

Weißer Feststoff

MS:

[M+H]: 484; ber.: 483

MS:

[M+H]: 498; ber.:497

Tab. 17: Chemische Verschiebungen [ppm] für die Tetrapeptide Aib/MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA

Aib

MeAib

Aib

Ala

NA

H₍₂₎N

7,982

N-Me 3,115

6,933

7,376 (d)

9,403

H alpha

4,309 (qui)

8,459; 7,886
7,813; 2×7,802
7,45; 7,392

H beta

1,638

1,464

1,427

1,489

H beta ’

1,795

1,411

1,416

128,48; 132,79; 140,75; 139,90; 140,00; 138,80; 137,21; 142,90; 146,30; 149,20

C’

184,5

186,9

186,8

185,0

C alpha

71,85

76,41

69,30

63,17

C beta

34,98

35,80

38,06

29,46

NH/NCH₃

34,60

33,04

35,58

MeAib

MeAib

Aib

Ala

NA

H₍₂₎N

1,618

1,43

1,43

7,33

9,414

H alpha

4,34

8,46; 7,88; 7,87; 7,82; 7,81; 7,46; 7.33

H beta

1,767

1,46

1,44

1,52

NH/NCH₃

2,589

3,12

6,91

5.7 Festphasensynthesen

5.7.1 Harzsynthese von MeAib-Aib-Phe-Phe

Das Tripeptid Aib-Phe-Phe-OH wurde manuell am Cl-Trt-Harz synthetisiert (300 mg, 1,5 mmol/g). Dazu wurden die Aminosäuren (2 eq.) unter Verwendung von TBTU und DIEA in DMF gekuppelt. Die Konzentration der Reaktionslösung war 0,45M, die Kupplungszeit betrug 30 Minuten. MeAib wurde als o-NBS-geschütztes Aminosäurechlorid eingeführt. Dazu wurden zuerst 3,3 Äquivalente (1,5 mmol) o-NBS-MeAib-Cl fest aufs Harz gegeben, anschließend je 1 ml DCM und Toluen. Zum Abfangen des Hydrochlorides wurden 1,5 mmol BSA benutzt. Die Kupplungszeit betrug hierbei eine Stunde. Die Abspaltung der o-NBS-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung einer Lösung von beta -Mercaptoethanol und DBU in DMF (1,6M, 3,21 mmol ME, 1,6 mmol DBU). Die Abspaltdauer betrug 30 Minuten, die erfolgreiche Abspaltung der Schutzgruppe war an einer Goldfärbung der Lösung zu sehen.

Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Essigsäure/Trifluorethanol/DCM 1/1/8 für 30 Minuten. Das Rohpeptid wurde mit Ether aus Methanol gefällt und anschließend präparativ gereinigt.

MeAib-Aib-Phe-Phe-OH:

Weißer Feststoff

Ausbeute:

32,7%

MS:

[M+H]: 497; ber.:496

5.7.2 Synthese eines Urocortin-Analoga

Die Sequenz Aib-UEK(32-40) (sie entspricht DDPPLSIDLTFHLLRTLLEI) wurde an einem 433A Synthesizer der Firma Perkin Elmer synthetisiert. Es wurde Tentagel S RAM-Harz der Firma RAPP Polymere Tübingen genutzt. Der Aufbau der Peptide erfolgte mittels Doppelkupplung (30min, 2eq. AS, 2eq. TBTU, 4eq. DIEA, DMF). An das so erhaltene Peptid wurden 2 MeAib-Reste und ein Alaninrest mittels Säurechloridaktivierung gekuppelt ( Tab. 18 ). Als Lösungsmittel wurde DCM genutzt.

Tab. 18: Reaktionsbedingungen für die Synthese des UEK-Analogons

DNBS-N-MeAib

DNBS-N-MeAib

o-NBS-Ala

Menge

3eq. DNBS-N-MeAib-Cl

4eq. DNBS-N-MeAib-Cl

4eq.

Base

3,4eq. DIEA

4,4eq. DIEA

4,4eq. DIEA

Zeit

2×2h

3×4h

3×4h

Abspaltung der SG

1×45min; ME/Piperidin

1×45min; ME/Piperidin; 40°C

0,5M Thiophenol/K₂CO₃ in DMF; 2×30min

Anschließend wurde das Peptid unter Verwendung der Fmoc-Strategie verlängert. Mit Standardmethoden (TBTU, DIEA, DMF) wurden durch Einfachkupplungen UEK-(1-20)-(QNRKLLDEV) an das bereits vorhandene Peptid synthetisiert.

CD-spektroskopische Untersuchungen

Für die CD-spektroskopischen Untersuchungen wurde das Peptid in Wasser gelöst und bei einem Wellenlängenbereich von 250 bis 200nm vermessen. Die vermessenen Lösungen waren dabei 10^-4M.

Aktivitätsuntersuchungen

Die Untersuchungen der biologischen Aktivität des hergestellten Peptides wurden an Leydigzellen der Maus vorgenommen /104/.

5.7.3 Harzkupplungen mit in situ gebildeten Aminosäurechloriden

Die in situ gebildeten Aminosäurechloridlösungen für die Kupplungen am Harz wurden wie beschrieben hergestellt. Die Kupplungsdauer betrug 15 Minuten, es wurden 2 Äquivalente DNBS-Val verwendet ( Tab. 19 ). Als erste Aminosäure wurden Lysin bzw. Alanin als Fmoc-Aminosäuren ans Harz geknüpft. Zur Vermeidung eventuell auftretender Diketopiperazinbildung wurde in einigen Fällen noch eine zweite Aminosäure mit DIPCDI und HOBt ans Harz gekuppelt.

Tab. 19: Harzkupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl am Harz

Harz

Kupplung an:

Base

LM

Ausbeute [%]

500mg SRAM-

Lys-_

1eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

_____

300mg SRAM

Val-Lys-_

1,1eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

10,1

150mg Cl-Trt.

Val-Lys-_

1eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

15

150mg Cl-Trt.

Lys-_

1,1eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

28

250mg SRAM

Ala-Ala-_

1,5eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

6,6

250mg SRAM

Ala-Ala-_

1,75eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

19,2

250mg SRAM

Ala-Ala-_

2eq. DIEA

DCM/DMF 1:1

18,3

250mg SRAM

Ala-Ala-_

2eq. Collidin

DCM/DMF 1:1

7,5

300mg SRAM

Ala-Ala-_

1,75eq. DIEA

DCM

37,8

300mg SRAM

Ala-_

2eq. DIEA

DCM

39,5

300mg SRAM

Ala-_

2eq. DIEA

DCM

100*

300mg SRAM

Ala-_

3eq. DIEA

DCM

37,8

300mg SRAM

Ala-_

1,35eq.+2,7eq. DIEA

DCM

60,8

100mg SRAM

Ala-_

2eq. DIEA

DCM

55,6

100mg SRAM

Ala-_

2,5eq. DIEA

DCM

72,6

100mg SRAM

Ala-Ala-_

3eq. DIEA

DCM

93,4

100mg SRAM

Ala-Ala-_

3,2eq. DIEA

DCM

86,5

100mg SRAM

Ala-Ala-_

3,3eq. DIEA

DCM

91,3

* Die Kupplung wurde zum Vergleich mit preformiertem Säurechlorid durchgeführt.
** Die Beladungsbestimmung lieferte trotz leicht grünem Kaisertest das gleiche Ergebnis wie für 4eq. DIEA, obwohl dort ein negativer Kaisertest erhalten wurde.

Das Harz darf vor Durchführung der Kupplung mit in situ gebildeten DNBS-Aminosäurechloriden nicht vollständig „trocken“ gesaugt werden, da es beim „Trockensaugen“ des Harzes zu einer Bindung von Luftfeuchtigkeit durch das Harz

kommen kann [114] . Das so gebundene Wasser führt zu einer teilweisen Hydrolyse des Aminosäurechlorides bei der Reaktion am Harz und so zu Umsatzeinbußen.

5.7.4 Untersuchungen mit DNBS-Val-Cl/OH (Siehe Nebenreaktionen SPPS)

Die Kupplungseffizienz der DNBS-Aminosäurechloride wurde an verschiedenen Harzen getestet und anhand der Beladung bestimmt ( Tab. 20 , Tab. 21 ). Als erste Aminosäuren wurden jeweils Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Val-OH mittels HOBt und DIPCDI in DCM/DMF ans Harz gekuppelt. Dabei wurden die Aminosäuren vor der Kupplung 2 Minuten voraktiviert.

Tab. 20: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit DNBS-Val-Cl

Harz

AS-Derivat

Reagenzien

Zeit

Kaiser-Test

Beladung

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,2eq. DIEA;
2,2eq. DIEA;

30min
15min
15min
15min

Negativ
negativ

0,23
0,23
0,22
0,15

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,3eq. DIEA;
2,3eq. DIEA;

30min
15min
15min
15min

Negativ
negativ

0,22
0,22
0,27
0,18

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,3eq. Collidin;
2,3eq. Collidin;

30min
15min
15min
15min

Negativ
negativ

0,23
0,23
0,22
0,21

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,2eq. DIEA;

30min
15min
15min

negativ

0,23
0,23
0,18

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,3eq. DIEA; 15min
2,3eq. DIEA; 15min

30min
15min
15min
15min

Negativ
negativ

0,23
0,24
0,23
0,13

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,3eq. DIEA;

30min
15min
15min

negativ

0,25
0,24
0,18

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val-Cl

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2,3eq. DIEA;

30min
15min
15min

negativ

0,24
0,24
0,18

Tab. 21: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit DNBS-Val

Harz

AS-Derivat

Reagenzien

Zeit

Kaiser-Test

Beladung

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

30 min
15 min
15 min
15 min
15 min

Negativ
negativ
negativ

0,24
0,24
0,27
0,22
0,18

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

30 min
15 min
15 min

Negativ
negativ

0,24
0,23
0,20

SRAM

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

30 min
15 min
15 min

Negativ
negativ

0,24
0,24
0,19

Cl-Trityl

2eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val

4eq. DIEA;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

1h
15 min
15 min
15 min
15 min

Negativ
negativ
negativ

0,8
0,78
0,89
0,75
0,63

MBHA

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

ü. N.
15 min
15 min
15 min
15 min

Negativ
negativ
negativ

0,58
0,56
0,69
__
0,47

MBHA

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. DNBS-Val
2eq. Fmoc-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

ü. N.
15 min
15 min
15 min
15 min
15 min

Negativ
negativ
negativ
negativ

0,59
0,56
0,59
0,49
0,41
0,45

MBHA
100 mg

3eq. Fmoc-Lys(Boc)
2eq. Fmoc-Val
2eq. o-NBS-Val
2eq. o-NBS-Val
2eq. o-NBS-Val
2eq. Fmoc-Val

3eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;
2eq HOBt/DIPCDI;

ü. N.
15 min
15 min
15 min
15 min
15 min

Negativ
negativ
negativ
negativ

0,58
0,59

0,28

5.8 Untersuchungen zum Auftreten von Stereomutation

Für die Untersuchungen wurde das Dipeptid DNBS-Val-Lys(Boc)-NH₂ genutzt. Es wurde am Tentagel S Ram Harz mittels Standardmethoden (HOBt, DIPCDI) synthetisiert. Danach wurde die DNBS-Schutzgruppe mit verschiedenen Konzentrationen an Abspaltlösung entfernt. Verwendet wurden eine 2 und 5%ige Lösung von TP/K₂CO₃ in DMF sowie 6, 10 bzw. 20 eq. ME/TEA in DCM. Anschließend wurden die Peptide mit TFA vom Harz gespalten (3h) ( Tab. 22 ).

Um die aufgetretene Stereomutation zu bestimmen, wurden 1-3 mg der vom Harz

abgespaltenen Rohpeptide in 6N DCl/D₂O über 24h bei 110°C hydrolysiert und die Aminosäuren mit iso-Propanol/HCl und Trifluoressigsäureanhydrid in die entsprechenden N-Trifluoracetylisopropylester überführt. Die derivatisierten Proben wurden unter Verwendung von Helium als Trägergas auf einer Chirasil-VAL-Säule chromatographiert. Die Injektionstemperatur betrug 190°C und die Temperatur der Ionenquelle 180°C. Die Anfangstemperatur betrug 50°C und wurde mit einem Temperaturgradienten von 2°C/min auf 81°C erhitzt. Diese Temperatur wurde 2min gehalten und anschließend wurde mit 20°C/min auf 190°C erhitzt. Die Aufnahme der Massenspektren erfolgte im „Selective-Ion-Modus“ (SIM).

Für die Untersuchungen der chiralen Integrität bei der in situ Kupplung von DNBS-Val mit Ala-NA wurden jeweils 0,05 mmol DNBS-Val mit 0,1mmol SOCl₂ und 0,05 mmol Pyridin in 60 µl DCM umgesetzt. Zu dieser Lösung wurden 0,05 mmol Ala-naphthylamid und Base gegeben. Die in situ Kupplungen wurden in DCM bzw. DCM/DMF durchgeführt. Die Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe erfolgte mit einer Lösung von 0,5 mmol ME (34,9 µl) und 1 mmol TEA (139,4 µl) in 1,5 ml DCM.

Tab. 22: Reaktionsbedingungen für die Untersuchungen zur Stereomutation

Art der Kupplung

Base

LM

%Racemisierung*

DNBS-Val; 17,35 mg

DIEA; 0,1 mmol, 17,1 µl

DCM

nicht detektierbar

DNBS-Val; 17,35 mg

Collidin; 0,1 mmol, 13,3µl

DCM

0,42^#

DNBS-Val; 17,35 mg

DIEA; 0,02 mmol, 34,2 µl

DCM

nicht detektierbar

DNBS-Val; 17,35 mg

Collidin; 0,2 mmol, 26,5µl

DCM

nicht detektierbar

DNBS-Val; 17,35 mg

DIEA; 0,1 mmol, 17,1 µl

DCM/DMF

nicht detektierbar

DNBS-Val; 17,35 mg

Collidin; 0,1 mmol, 13,3µl

DCM/DMF

nicht detektierbar

DNBS-Val-Cl; 18,25 mg

DIEA; 0,05 mol,8,6 µl

DCM

nicht detektierbar

DNBS-Val-Cl; 18,25 mg

Collidin; 0,05 mmol, 6,6µl

DCM

nicht detektierbar

*Die Werte wurden nach Abspaltung der DNBS-Gruppe erhalten.
^# Die Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe erfolgte ohne vorheriges Entfernen der überschüssigen Base.

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Mon Sep 16 13:41:08 2002

Fluka:	Piperidin, DIEA, Cyanurfluorid, (Diethylamino)schwefeltrifluorid (DAST), n-Hexan, DMF, Pyridin (getrocknet über Molekularsieb Baker 3A), Collidin, SOCl₂, TFE, BSA, Mercaptopropionsäure, Trityl-MeOH, Tritylamin, DNBS-Cl
Baker:	DCM (Destillation über P₄O₁₀ und Na₂CO₃), Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäure, Ethanol, Methanol (getrocknet durch Reaktion mit Magnesium und anschließender Destillation), Diethylether, Chloroform (getrocknet über Molekularsieb Baker 3A), Toluen, Acetonitril
Novabiochem:	o-Cl-Tritylharz; TMSO, H-Val-OBzl, TFMSA
Merck:	Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kieselgel 60, 0,04-0,06 µm Korngröße
Bachem:	MeAib-OH, -Ala-Naphthylamid
Aldrich:	o- und p-NBS-Cl, AIB-OH, Dimethoxybenzaldehyd
Ferak Berlin:	-Mercaptoethanol

HCl×Aib-OMe:		HCl×MeAib-OMe:
weißer Feststoff		weißer Feststoff
Ausbeute:	88,78%	Ausbeute:	71,2%
Fp.:	188-190°C	Fp.:	Zersetzung zwischen 130-150°C
IR (KBr):	(C=O): 1754 cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1746 cm^-1
		MS:	[M+H]: 132; ber.: 131

Tosylamid:		o-NBS-Amid:
weißer Feststoff		gelber Feststoff
Ausbeute:	74%	Ausbeute:	62%
Fp.:	132°C	Fp.:	182-185°C
IR (KBr):	(NH₂-SO₂) 1576 cm^-1; (SO₂) 1332, 1159 cm^-1	IR (KBr):	(NH₂-SO₂) 1542 cm^-1; (SO₂) 1338, 1161 cm^-1
MS:	[M+H]: 172; ber.:171

DNBS-Aib-Anhydrid:		DNBS-MeAib-Anhydrid:
weißer Feststoff		weißer Feststoff
Ausbeute:	61%	Ausbeute:	43%
IR (KBr):	(C-O-C) 1825, 1729 cm^-1, (SO₂) 1350, 1173 cm^-1	IR (KBr):	(C-O-C) 1821, 1751 cm^-1, (SO₂) 1348, 1147 cm^-1
Pbf-MeAib-Anhydrid:
weißer Feststoff
Ausbeute:	65%
Fp.:	91-95°C

IR (KBr):	(C-O-C) 1820, 1751 cm^-1, (SO₂) 1318, 1136 cm^-1
MS:	[M+H]: 721; ber.: 720

	Menge	Base	org. LM	T_Reakt.	Reinigung
Tosyl-AS	0,01 mol	20 ml 1N NaOH	Ether	3-4 h	Umkristallisation aus 60% EtOH
Pbf-AS	0,018 mol	20 ml 4,5M Na₂CO₃	Dioxan	12 h	Flash-Chromatographie; Kieselgel 60, EE/n-Hexan/HAc 95/5/1

Tos-Ala:		Tos-Aib:
weißer Feststoff		weißer Feststoff
Ausbeute:	47%	Ausbeute:	31%
Fp.:	130-133°C	Fp.:	145-147°C
IR (KBr):	(C=O): 1712 cm^-1, (SO₂): 1343, 1150 cm^-1	IR(KBr):	(C=O): 1710 cm^-1, (SO₂): 1323, 1152 cm^-1
MS:	[M-H]: 242; ber.: 243	MS:	[M-H]: 256; ber.: 257
Pbf-Aib-OH:		Pbf-MeAib-OH:
weiße Kristalle		weiße Kristalle
Ausbeute:	30%	Ausbeute:	31,7%
Fp.:	195-200°C	Fp.:	140-143°C
IR (KBr):	(C=O): 1707 cm^-1, (SO₂): 1312, 1128 cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1709 cm^-1, (SO2): 1318, 1126 cm^-1

MS:	[M-H]: 354; ber.: 355	MS:	[M+H]: 370; [M-H]: 368; ber. 369
Elementaranalyse für C₁₇H₂₅NO₅S:		Elementaranalyse für C₁₈H₂₇NO₅S:
ber.:	C: 57,46%; H: 7,04%; N: 3,94%	ber.:	C: 58, 45%; H: 7,32%; N: 3,79%
gef.:	C: 55,97%; H: 6,82%; N: 3,80%	gef.:	C: 58,53%; H: 7,14%; N: 3,60%
1H-NMR:	(ppm, MeOD), 1.31 (s,6,AS-Me₂), 1.49 (s,6,Pbf-Me₂), 2.09, 2.47, 2.56 3× (s, 3, Ar-Me), 3.01 (s, 2, CH₂)	¹H-NMR:	(ppm, MeOD), 1.48 (s,6,AS-Me₂), 1.49 (s,6,Pbf-Me₂), 2.1, 2.49, 2.55 3× (s, 3, Ar-Me), 2.82 (s, 3, N-Me), 3.03 (s, 2, CH₂)

o-NBS-Ala-OH:		o-NBS-Val-OH:
Hellgelber Feststoff		Hellgelber Feststoff
Ausbeute:	91,2%	Ausbeute:	88.5%
Fp.:	153-159°C	Fp.:	112-114°C
IR (KBr):	(C=O) 1720 cm^-1; (SO₂) 1350, 1172 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1714 cm^-1; (SO₂) 1360, 1167 cm^-1
MS:	[M-H]: 272; ber.: 273	MS:	[M-H]: 301; ber.: 302
Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:
ber.:	C: 39,42%; H: 3,65%; N: 10,2%
gef.:	C: 39,60%; H: 3,57%; N: 9,99%
o-NBS-Aib-OH:		o-NBS-MeAib-OH:
Hellgelber Feststoff		Hellgelber Feststoff

Ausbeute:	93,6%	Ausbeute:	73%
Fp.:	175-178°C	Fp.:	145-148°C
IR (KBr):	(C=O) 1706 cm^-1; (SO₂) 1332, 1164 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1728 cm-1; (SO₂) 1341, 1167 cm^-1
MS:	[M-H]: 287; ber.: 288	MS:	[M-H]: 301; ber.: 302
Elementaranalyse für C₁₀H₁₂N₂O₆S:		Elementaranalyse für C₁₁H₁₄N₂O₆S:
ber.:	C: 41,66%; H: 4,16%; N: 9,7%	ber.:	C: 43,7%; H: 4,63%; N: 9,27%
gef.:	C: 41,53%; H: 4,07%; N: 9,33%	gef.:	C: 43,69%; H: 4,54%; N: 8,98%
p-NBS-Aib-OH:		p-NBS-MeAib-OH:
Hellgelber Feststoff		Hellgelber Feststoff
Ausbeute:	93%	Ausbeute:	58%
Fp.:	166-169°C	Fp.:	180-184°C
IR (KBr):	(C=O) 1711 cm^-1; (SO₂) 1338, 1169 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1715 cm^-1; (SO₂) 1353, 1144 cm^-1
MS:	[M-H]: 287; ber.: 288	MS:	[M-H]: 301; ber.: 302
DNBS-Val-OH:		DNBS-Aib-OH:
Gelber Feststoff		Hellgelber Feststoff
Ausbeute:	93,6%	Ausbeute:	89,7%
Fp.:	139-142°C	Fp.:	183-185°C
IR (KBr):	(C=O) 1723 cm^-1; (SO₂) 1354, 1172 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1711 cm^-1; (SO₂) 1357, 1169 cm^-1
MS:	[M-H]: 346; ber.: 347	MS:	[M-H]: 332; ber.: 333
¹H-NMR:	(ppm, CD₃OD): 0.91, 0.94; 0.99, 1.02 2× (d, 3, CH₃), 2.2 (qqd, 1, C-H), 4.08, 4.11 (d, 1, N-CH), 8.38, 8.40; 8.55, 8.61 2× (d, 1, Ar-H), 8.70 (s, 1, Ar(NO₂)-H)	¹H-NMR:	(ppm, CD₃OD), 1.82 (s, 6, Me₂), 8.32, 8.36 (d, 1, Ar-H), 8.56, 8.60 (d, 1, Ar-H), 8.71 (s, 1, Ar(NO₂)-H)
¹³C-NMR:	(ppm, CD₃OD), 18.1 (1, CH₃), 20.0 (2, CH₃), 32.4 (1, CH), 63.7 (1, CHR), 121.4, 128.0, 133.8, 140.6, 149.6, 151.6 (6, Ar-C), 174.1 (C=O)	¹³C-NMR:	(ppm, CD₃OD), 27.1 (2, CH₃), 63.7 (1, CMe₂), 121.6, 128.1, 133.3, 142.7, 149.5, 151.4 (6, Ar-C), 177.2 (C=O)
		Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:
		ber.:	C: 36,03%; H: 3,3%; N: 12,61%

		gef.:	C: 38,13%; H: 3,49%; N:11,80%
DNBS-MeAib-OH:
Hellgelber Feststoff
Ausbeute:	50,6%
Fp.:	178-185°C
IR (KBr):	(C=O) 1709 cm^-1; (SO₂) 1349, 1169 cm^-1
MS:	[M-H]: 346; ber.: 347
¹H-NMR:	(ppm, CD₃OD), 1.5 (s, 6, Me₂), 3.00 (s, 3, N-CH₃), 8.32, 8.36; 8.56, 8.60 2× (d, 1, Ar-H), 8.71 (s, 1, Ar(NO₂)-H)
¹³C-NMR:	(ppm, CD₃OD): 26.7 (2, CH₃), 33.4 (3, N-CH₃), 66.2 (1, CMe₂), 121.3, 127.8, 133.3, 141.2, 150.2, 151.5 (6, Ar-C), 177.1 (C=O)
Elementaranalyse für C₉H₁₀N₂O₆S:
ber.:	C: 38,04%; H: 3,74%; N: 12,1%
gef.:	C: 38,51%; H: 3,78%; N:11,62%

Tos-Ala-F:		Tos-Aib-F:
Hellroter Feststoff		Hellroter Feststoff
Ausbeute:	81,6%	Ausbeute:	74,4%

Fp.:	85°C	Fp.:	118°C
IR (KBr):	(C=O): 1845 cm^-1, (SO₂): 1339, 1156 cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1846 cm^-1, (SO₂): 1319, 1147 cm^-1
Pbf- Aib-F:		Pbf-MeAib-F:
Weiße Kristalle		Weiße Kristalle
Ausbeute:	40%	Ausbeute:	46%
IR (KBr):	(C=O): 1841cm^-1, (SO₂): 1313, 1132cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1830cm^-1, (SO₂): 1302, 1133cm^-1
		¹H-NMR:	(CDCl₃) 1.47 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.57 (s, 6, AS-Me₂), 2.11, 2.47, 2.52 3× (s, 3, Me-Ar), 2.72 (s, 3, N-Me), 3.04 (s, 2, CH₂)

Tos-Ala-Cl:		Tos-Aib-Cl:
Hellgelbe Kristalle		Hellgelbe Kristalle
Ausbeute:	88,6%	Ausbeute:	87,8%
Fp.:	103°C	Fp:	115°C
IR (KBr):	(C=O): 1785 cm^-1, (SO₂): 1329, 1152 cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1803 cm^-1, (SO₂): 1325, 1149 cm^-1
Pbf-Aib-Cl:		Pbf-MeAib-Cl:
Hellbraune Kristalle		Hellbraune Kristalle
Ausbeute:	74,5%	Ausbeute:	72,1%
Fp.:	115-120°C

IR (KBr):	(C=O): 1801 cm^-1, (SO₂): 1314, 1133 cm^-1	IR (KBr):	(C=O): 1808 cm^-1, (SO₂): 1319, 1126 cm^-1
¹H-NMR:	(ppm CDCl₃), 1.41 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.47 (s, 6, Me₂), 2.11, 2.48, 2.56 3× (s, 3, Ar-Me), 2.97 (s, 2, CH₂)	¹H-NMR:	(ppm, CDCl₃), 1.48 (s, 6, Pbf-Me₂), 1.61 (s, 6, AS-Me₂), 2.11, 2.49, 2.55 3× (s, 3, Ar-Me), 2.89 (s, 3, N-Me), 2,97 (s, 2, CH₂)
¹³C-NMR:	(ppm, CDCl₃) 13.00, 18.38, 19.79 3× (1, Ar-Me), 25.49 (2, Aib-Me₂), 28.99 (2, Pbf-Me₂), 43.58 (1, Pbf-CH₂), 66.51 (1, C-), 87.47 (1, Pbf-CMe₂), 118.66, 125.83, 130.86, 133.87, 139.46, 160.42 (6, Ar-C), 178.24 (C=O)	¹³C-NMR:	(ppm, CDCl₃) 13.18, 18.09, 19.98 3×(1, Ar-Me), 24.89 (2, AS-Me₂), 29.24 (2, Pbf-Me₂), 34.30 (1, N-Me), 43.86 (1, Pbf-CH₂), 72.85 (1, C-), 87.66 (1, Pbf-CMe₂), 118.84, 126.03, 130.74, 135.12, 141.03, 160.72 (6, Ar-C), 177.59 (1, C=O)
o-NBS-Aib-Cl:		o-NBS-MeAib-Cl:
Hellbrauner Feststoff		Hellbrauner Feststoff
Ausbeute:	58,8%	Ausbeute:	82,6%
Fp.:	103-105°C	Fp.:	119-122°C
IR (KBr):	(C=O) 1805 cm^-1; (SO₂) 1330, 1159 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1808 cm^-1; (SO₂) 1341, 1149 cm^-1
¹H-NMR:	(ppm, CDCl₃): 1.64 (s, 6, Me₂), 5.97 (s, 1, N-H), 7.78 (d, 2, Ar-H), 7.95, 8.14 2× (dd, 1, Ar-H)	¹H-NMR:	(ppm, CDCl₃): 1.64 (s, 6, Me₂), 3.03 (s, 1, N-Me), 7.66, 8.14 2× (dd, 1, Ar-H), 7.71 (d, 2, Ar-H)
¹³C-NMR:	(ppm, CDCl₃): 26.82 (2, Me₂), 67.67 (1, C-Me), 126.25, 130.88, 133.96, 134.48, 136.20, 148.16 (6, Ar-C), 177.05 (C=O)	¹³C-NMR:	(ppm, CDCl₃): 25.85 (2, Me₂), 33.89 (1, N-Me), 71.63 (1, C-Me), 125.06, 130.69, 132.73, 134.56, 134.68, 149.08 (6, Ar-C), 176.61 (C=O)
p-NBS-MeAib-Cl:		DNBS-Val-Cl:
Hellbrauner Feststoff		Hellgelbe Kristalle
Ausbeute:	70,7%	Ausbeute:	91,2%
Fp.:	116-121°C	Fp.:	78-80°C
IR (KBr):	(C=O) 1802 cm^-1; (SO₂) 1347, 1164 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1797 cm^-1; (SO₂) 1348, 1171 cm^-1

DNBS-Aib-Cl:		DNBS\\|--\\|MeAib-Cl:
Hellgelbe Kristalle		Hellgelbe Kristalle
Ausbeute:	99,1%	Ausbeute:	100%
IR (KBr):	(C=O) 1791 cm^-1; (SO₂) 1350, 1168 cm^-1	IR (KBr):	(C=O) 1791 cm^-1; (SO₂) 1345, 1146 cm^-1
¹H-NMR:	(ppm, CH₂Cl₂): 1.65 (s, 6, Me₂), 8.35, 8.40 (d, 1, Ar-H), 8.60, 8.65 (d, 1, Ar-H), 8.70 (s, 1, Ar(NO₂)-H)
¹³C-NMR:	(ppm, CH₂Cl₂): 26.22 (2, CH₃), 67.81 (1, CMe₂), 121.33, 128.03, 132.34, 140.58, 148.00, 150.25 (6, Ar-C), 177.1 (C=O)

AS-X	NH-R	LM	Base	Ausbeute
Tos-Aib-F; 0,1 mmol = 25,9 mg	Aib-OMe; 0,1 mmol = 15,2 mg	DCM 600 µl	DIEA; 0,3 mmol = 51,3 µl	88%
Tos-Aib-F; 0,1 mmol = 25,9 mg	Aib-OMe; 0,1 mmol = 15,2 mg	DCM 600 µl	DIEA; 0,2 mmol = 34,2 µl	88%
Tos-Aib-Cl; 0,1 mmol = 27,5 mg	Aib-OMe; 0,1 mmol = 15,2 mg	DCM 600 µl	DIEA; 0,3 mmol = 51,3 µl	81%
Tos-Aib-Cl; 0,1 mmol = 27,5 mg	Aib-OMe; 0,1 mmol = 15,2 mg	DCM 600 µl	DIEA; 0,2 mmol = 34,2 µl	95%
Tos-Aib-Cl; 0,05 mmol = 13,7 mg	Aib-OMe; 0,05 mmol = 7,6mg	DCM 300 µl	BSA; 0,1 mmol = 24,4 µl	84%

Pbf-MeAib-Aib-OMe:
Weißer Feststoff
IR (KBr):	(C-OMe) 1746 cm^-1, (N-CO) 1683 cm^-1, (SO₂) 1306, 1152 cm^-1
MS:	[M+H] 469, ber.:468

Tos-Aib-MeAib-OMe:		Pbf-Aib-MeAib-OMe:
Weißer Feststoff		Weißer Feststoff
IR (KBr):	(C=O): 1740 cm^-1, (CO-N): 1612 cm^-1, (SO₂): 1328, 1157 cm^-1	IR (KBr):	(C=O):1717 cm^-1, (CO-N): 1632 cm^-1, (SO₂): 1322, 1135 cm^-1
MS:	[M+H]: 371; ber.:370	MS:	[M+H]: 469; ber.:468
		Elementaranalyse für C₂₃H₃₆N₂O₆S:
		ber.:	C: 58,97; H: 7,69; N: 5,98
		gef.:	C: 58,90; H: 7,47; N: 5,99

		¹H-NMR:	(ppm, CD₂Cl₂): 1.31 (s, 6, MeAib-Me₂), 1.39 (s, 6, Aib-Me₂), 1.46 (s, 6, Pbf-Me₂), 2.1, 2.43, 2.52 3× (s, 3, Me-Ar), 2.98 (s, 2, CH₂), 3.23 (s, 3, N-Me), 3.58 (s, 3, O-Me)
o-NBS-Aib-MeAib-OMe:		DNBS-Aib-MeAib-OMe:
Weißer Feststoff		Weißer Feststoff
Ausbeute laut HPLC:	52%
MS:	[M+H]: 402; ber.: 401	MS:	[M+H]: 447; ber.: 446