Henklein, Petra: N-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese

Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Nalpha-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt Universität zu Berlin

von Diplom-Chemikerin Petra Henklein,
geb. am 17.08.1968 in Berlin

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. Michael Bienert
2. Prof. Dr. Jürgen Liebscher
3. Prof. Dr. Klaus Neubert

eingereicht: 19.04.2000

Datum der Promotion: 24.07.2000

Zusammenfassung

Obwohl die methodische Entwicklung der Peptidsynthese gewöhnlich eine automatisierte Herstellung erlaubt, sind für die Herstellung einer Reihe von Peptiden auch gegenwärtig Grenzen gesetzt. Einerseits kann eine im Verlauf der Kettenverlängerung auftretende Bildung intra- und /oder intermolekularer Wasserstoffbrücken zu einer begrenzten Solvatation und damit Zugänglichkeit der zu acylierenden Aminokomponente am Syntheseharz führen, andererseits kommt es beim Einbau sterisch anspruchsvoller Aminosäuren zu ungenügenden Acylierungsausbeuten. Urethangeschützte Aminosäurefluoride haben sich für den Einbau von alpha, alpha-Dialkylaminosäuren als geeignet erwiesen. Die reaktiveren urethangeschützten Aminosäurechloride sind zwar herstellbar, besitzen aber in Gegenwart einer Hilfsbase, die zum Abfangen der während ihrer Reaktion gebildeten HCl notwendig ist, eine zu geringe Stabilität (Oxazolonbildung, Abspaltung der Schutzgruppen). Erst die Verwendung von N(alpha)-Schutzgruppen, die keinen reaktionsfähigen Carbonylkohlenstoff enthalten, wie Arensulfonyl- Schutzgruppen, ermöglichen die volle Ausschöpfung der hohen Reaktivität der Aminosäurechloride. Mit Hilfe dieser Schutzgruppen gelang ein erster Vergleich der Reaktivität der Aminosäurechloride und -fluoride. Bei den durchgeführten Reaktionen wurde keine Stereomutation beobachtet. Unter Verwendung von Arensulfonylschutzgruppen war es erstmals möglich, zwei aufeinanderfolgende N-Alkyl-alpha, alpha-dialkylaminosäuren in Peptide einzubauen. Weiterhin konnten wir zeigen, daß derart geschützte Aminosäuren sich für in situ Aktivierungen mit Thionylchlorid eignen. Als Fänger für überschüssiges Aktivierungsreagenz wurden tertiäre Alkohole bzw. Amine eingesetzt. Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride haben wir darüber hinaus erfolgreich in der Festphasenpeptidsynthese verwendet. In Kombination von Arensylfonyl-Schutz mit der Standard-Fmoc-Strategie gelang die Synthese eines biologisch aktiven Analogen des CRF, eines 41-mer Peptides mit einer eingefügten Tetrapeptidsequenz -Ala-MeAib-MeAib-Aib-.

Schlagwörter:
Aminosäurefluorid, Aminosäurechlorid, Arensulfonyl-Schutzgruppen, N-Alkyl-alpha, alpha-dialkylaminosäuren, Oxazolonbildung, Peptidsynthese, SPPS, CRF

Abstract

Despite its wide field of application automatic peptide synthesis is still limited in certain cases. One of the limiting factors is the possibility of intra- or intermolecular hydrogen bond formation during the elongation of the peptide chain. This causes decreased solvation and thus reduced accessibility to the resin-bound amino component. Another limitation is the incorporation of sterically hindered amino acids that usually give rise to insufficient yields of acylation. Urethane protected amino acid fluorides have been shown suitable for the incorporation of alpha,alpha-dialkyl amino acids. Though the more reactive urethane protected amino acid chlorides can be readily synthesized, they do not possess the necessary stability in the presence of an auxiliary base that must be used for trapping of the hydrochloric acid formed during the reaction. Formation of oxazolons and deprotection of formerly protected functional groups would occur. Only the advent of protecting groups for the amino acid N-alpha that do not have a reactive carbonyl function - like arene sulfonyl groups - allowed to take full advantage of the high reactivity of the amino acid chlorides. These protecting groups enabled us to compare the reactivities of amino acid chlorides and fluorides for the first time. We didn't observe any stereo mutation in our experiments. The use of arene sulfonyl protecting groups permitted the consecutive incorporation of two N-alkyl-alpha,alpha-dialkyl amino acids into a peptide for the first time. Furthermore we could show, that amino acids protected in this way, are suitable for in situ activation with thionyl chloride. Tertiary alcohols and amines were used as scavenger for excessive activating reagent. Arene sulfonyl protected amino acids were also successfully used in solid phase peptide synthesis. By combining this protecting concept with the standard Fmoc approach we were able to synthesize a biologically active analogue of CRF, a peptide containing 41 residues into which we inserted the tetrapeptide Ala-MeAib-MeAib-Aib.

Keywords:
amino acid fluorid, amino acid chlorid, arene sulfonyl protecting group, N-alkyl-alpha, alpha-dialkyl amino acids, oxazolon, peptide synthesis, solid phase peptide synthesis, CRF


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteN-Arensulfonyl-Aminosäurechloride - Kupplung sterisch stark gehinderter Komponenten in der Peptidsynthese
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Bedeutung und Entwicklungstand der Peptidsynthese
1.2Aminosäurehalogenide in der Peptidchemie
1.2.1Fmoc-Aminosäurefluoride
1.2.2Aminosäurechloride
1.3Ziele der eigenen Arbeiten
2 Ergebnisse und Diskussion
2.1Vergleich der Reaktivität von Fmoc-Aminosäurefluorid und -chlorid
2.2Eigenschaften Arensulfonyl-geschützter Aminosäurehalogenide
2.2.1Tosyl-geschützte Aminosäuren
2.2.2Pbf-geschützte Aminosäuren
2.2.3- und 4-Nitrobenzensulfonylaminosäuren
2.2.4Dinitrobenzensulfonylaminosäuren
2.2.5Synthese Arensulfonyl-geschützter Aminosäuren und ihrer Halogenide
2.3Kupplungen mit Arensulfonyl-geschützten Aminosäurehalogeniden
2.3.1Tosylaminosäurehalogenide
2.3.2Pbf-Aminosäurehalogenide
2.3.3NBS-Aminosäurehalogenide
2.3.4DNBS-Aminosäurehalogenide
2.3.5Nebenreaktionen bei Synthesen mit Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloriden
2.4Abspaltung der Arensulfonylschutzgruppen
2.4.1Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe
2.4.2Abspaltung der NBS-Schutzgruppe
2.4.3Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe
2.5Synthesen mit in situ gebildeten Arensulfonyl-geschützten Aminosäurehalogeniden
2.5.1Modelluntersuchungen zur in situ Säurechloridbildung
2.5.2In situ Aktivierung von DNBS-Aminosäuren
2.5.3Kupplung von in situ gebildetem DNBS-Val-Cl
2.5.4Synthesen mit in situ gebildeten sterisch gehinderten DNBS-Aminosäurehalogeniden
2.6Anwendung der Arensulfonyl-geschützten Aminosäurechloride in der Festphasensynthese
2.6.1Synthesen mit o-NBS-MeAib-Cl
2.6.2Beladungsbestimmungen
2.6.3Synthese eines Urocortin-Analogons
2.6.3.1CD-spektroskopische Untersuchungen
2.6.3.2Untersuchungen zur biologischen Aktivität
2.6.4Nebenreaktionen Arensulfonyl-geschützter Aminosäurehalogenide im Verlauf der SPPS
2.7Untersuchungen zur Stereomutation von DNBS-Aminosäurehalogeniden
2.7.1Einfluß der Abspaltbedingungen auf die Stereomutation
2.7.2Untersuchungen zur Stereomutation bei der Kupplung von DNBS-Val-Cl
3 Zusammenfassung
4 Ausblick
5 Experimenteller Teil
5.1Geräte
5.2Chemikalien
5.3Synthesen der Aminosäurederivate
5.3.1Synthese der Aminosäuremethylester
5.3.2Synthese von Referenzsubstanzen
5.3.3Tosyl- und Pbf-Aminosäuren nach dem Schotten-Baumann-Verfahren
5.3.4NBS- und DNBS-Aminosäuren
5.3.5Arensulfonyl-geschützte Aminosäurefluoride
5.3.6Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride
5.4Kupplungen der Arensulfonylaminosäurehalogenide
5.4.1RSO2-Aib/MeAib-X an Aib-OMe
5.4.2RSO2-Aib/MeAib-X an MeAib-OMe
5.4.3Synthese von DNBS-Val-Val-OMe
5.5Abspaltung der Arensulfonylschutzgruppe
5.5.1Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe
5.5.2Abspaltung der NBS-Schutzgruppe
5.5.3Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe
5.6Kupplungen mit in situ gebildeten Aminosäurechloriden
5.6.1In situ Aktivierung am Essigsäuremodell
5.6.2In situ Aktivierung von DNBS-Val-OH
5.6.3IR-Untersuchungen zum Abfangen von SOCl2 mit t-BuOH
5.6.4Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl
5.6.5Acylierungen mit in situ gebildeten, sterisch gehinderten Aminosäurechloriden
5.7Festphasensynthesen
5.7.1Harzsynthese von MeAib-Aib-Phe-Phe
5.7.2Synthese eines Urocortin-Analoga
5.7.3Harzkupplungen mit in situ gebildeten Aminosäurechloriden
5.7.4Untersuchungen mit DNBS-Val-Cl/OH (Siehe Nebenreaktionen SPPS)
5.8Untersuchungen zum Auftreten von Stereomutation
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Beispiele zur Chemosynthese von langkettigen Peptiden bzw. Proteinen
Tab. 2: Vergleich der mit verschiedenen Methoden erzielten Ausbeuten für die Synthese von SG-Aib-Aib-OR
Tab. 3: Überblick über die während der Arbeit synthetisierten Arensulfonyl-geschützten Aminosäuren
Tab. 4: Ausbeuten von Acylierungen mit in situ gebildeten bzw. preformierten Aminosäurechloriden
Tab. 5: Darstellung der für die CD-Untersuchungen verwendeten Peptide
Tab. 6: Durch LC-MS-Untersuchungen gefundene Nebenprodukte bei der Harzsynthese
Tab. 7: Ergebnisse der Untersuchungen zum Auftreten von Stereomutation bei Abspaltung der DNBS-Gruppe
Tab. 8: Stereomutation für die Kupplung von DNBS-Val-Cl an Ala-NA
Tab. 9: Reaktionsbedingungen für die Herstellung der Tosyl- und Pbf-Aminosäuren
Tab. 10: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO2-Aib/MeAib-X an Aib-OMe
Tab. 11: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO2-Aib-X an MeAib-OMe
Tab. 12: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der Kupplung von RSO2-MeAib-X an MeAib-OMe
Tab. 13: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für DNBS-Val-Cl + Val-OMe
Tab. 14: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten der in situ Aktivierung von DNBS-Val-Cl
Tab. 15: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl
Tab. 16: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit in situ gebildetem DNBS-Aib/MeAib-Cl
Tab. 17: Chemische Verschiebungen [ppm] für die Tetrapeptide Aib/MeAib-MeAib-Aib-Ala-NA
Tab. 18: Reaktionsbedingungen für die Synthese des UEK-Analogons
Tab. 19: Harzkupplung mit in situ gebildetem DNBS-Val-Cl am Harz
Tab. 20: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit DNBS-Val-Cl
Tab. 21: Reaktionsbedingungen und Ausbeuten für die Kupplung mit DNBS-Val
Tab. 22: Reaktionsbedingungen für die Untersuchungen zur Stereomutation

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Beispiel für antibakteriell wirksame, alpha, alpha-Dialkylaminosäuren enthaltende Peptide; Aib=Aminoisobuttersäure, Api= 4-Aminopiperidin-4-carbonsäure
Abb. 2: Syntheseschema für geschützte Aminosäurefluoride
Abb. 3: Vergleich der Umsätze sterisch gehinderter Fmoc-Aminosäurefluoride an Aib-OMe [50] , [51]
Abb. 4: Base-katalysierte Fmoc-Abspaltung
Abb. 5: Kupplung von Fmoc-MeAib-F an Aib-OMe in DMF bei Einsatz verschiedener HCl-Fänger
Abb. 6: Zerfall Z-geschützter Aminosäurechloride
Abb. 7: Verlust der chiralen Integrität durch Oxazolonbildung
Abb. 8: Geminaler Dialkyleffekt
Abb. 9: Fragmentierung von Tosylaminosäurechloriden im wäßrig-alkalischen Milieu
Abb. 10: Kupplung von a) Fmoc-Aib-X an Aib-OMe und b) Fmoc-Ala-X an MeAib-OMe in DCM mit BSA als HCl-Fänger
Abb. 11: Im Rahmen der Arbeiten verwendete Arensulfonylschutzgruppen
Abb. 12: Verschiedene Arensulfonylschutzgruppen
Abb. 13: Schema der Schutzgruppenabspaltung durch nucleophile Substitution
Abb. 14: Abspaltung der DNBS-Schutzgruppe
Abb. 15: Arensulfonyl-geschützte Aminosäurefluoride am Beispiel von Tos-Aib-F a) IR-Spektrum; b) HPLC-Profil
Abb. 16: Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride am Beispiel von Tos-Aib-Cl a) IR-Spektrum; b) HPLC-Profil
Abb. 17: Kupplungseffizienz von Tos-Aib-X an a) Aib-OMe (DCM) und b) MeAib-OMe (Toluen); unter Verwendung von DIEA
Abb. 18: Massenspektrum des Rohpeptides Tos-Aib-MeAib-OMe
Abb. 19: Kupplungseffizienz von RSO2-Aib-X an a) Aib-OMe (DCM) und b) MeAib-OMe (Toluen); als Base wurde DIEA verwendet
Abb. 20: Vergleich der Kupplungsausbeuten für das Dipeptid Fmoc/Pbf-MeAib-Aib-OMe in DCM mit BSA (Fmoc) bzw. DIEA (Pbf) als HCl-Fänger
Abb. 21: Vergleich des Raumbedarfes von Ala-Ala-OH und MeAib-MeAib-OH
Abb. 22: Pbf-MeAib-MeAib-OMe a) 1H-NMR-Spektrum b) HPLC-Profil des gereinigten Peptides
Abb. 23: Kupplungslösung o-NBS-MeAib-Cl + MeAib-OMe nach 2h
Abb. 24: Kupplung von o-NBS-MeAib-Cl an MeAib-OMe in Abhängigkeit vom jeweiligen HCl-Fänger in DCM/Toluen
Abb. 25: Einfluß der Nalpha-Schutzgruppe auf die Reaktion von RSO2-MeAib-Cl mit MeAib-OMe; die Reaktionen wurden in Toluen bzw. Toluen/DCM mit DIEA durchgeführt
Abb. 26: Kupplungsausbeuten für das Dipeptid DNBS-Val-Val-OR a) mit BSA und b) mit DIEA
Abb. 27: Vergleich der Umsätze für die Synthese von RSO2-Aib-MeAib-OMe mit DIEA (Tos) bzw. mit BSA (Pbf, o-NBS, DNBS) in Toluen
Abb. 28: Kupplungseffizienz von RSO2-MeAib-Cl an MeAib-SGC mit der o-/p-NBS-Gruppe und der DNBS-Gruppe
Abb. 29: Pbf-Amid
Abb. 30: IR-Spektrum des bei der Reaktion gebildeten Nebenproduktes (NP) im Vergleich zu o-NBS-Amid
Abb. 31: IR-Spektrum des bei der Synthese von Pbf-MeAib-MeAib-OMe isolierten symmetr. Anhydrides
Abb. 32: Massenspektrum des Dipeptides MeAib-MeAib-OMe
Abb. 33: Spaltung von Pbf-Aib-MeAib-OMe durch TFA
Abb. 34: HPLC-Profile a) TFA + Pbf-Aib-MeAib-OMe sofort vermessen; RT (Pbf-Aib-O-TFA): 11,7min b) TFA + Pbf-Aib-MeAib-OMe, 24h in AN/H2O gelagert; RT (Pbf-Aib): 13,8min
Abb. 35: In situ Herstellung von Essigsäurchlorid; 1eq. HAc+1eq. SOCl2+xeq. DIEA; 0.1M in DCM
Abb. 36: In situ Herstellung von Essigsäurechlorid; 1eq. HAc + 1eq. SOCl2 + 0,5eq. Base, 0,1M in DCM; t=10’
Abb. 37: In situ Aktivierung von DNBS-Val-Cl
Abb. 38: Säurechloridbildung mit 1eq. SOCl2, 30min
Abb. 39: Ausbeuten der Säurechloridbildung mit Xeq. SOCl2, 10min, 45°C
Abb. 40: : IR-spektroskopische Untersuchung der Reaktion von SOCl2 mit t-BuOH
Abb. 41: Schematische Darstellung der Synthese von DNBS-Val-Val-OR durch in situ Aktivierung
Abb. 42: Vergleich der Ausbeuten für die Synthese von DNBS-Val-Val-OR in DCM bzw. DCM/DMF, t=10min, c=0.3M
Abb. 43: Allgemeines Syntheseschema für die Kupplung in situ gebildeter, sterisch anspruchsvoller Aminosäureschloride
Abb. 44: Kupplungseffizienz von in situ gebildeten und preformierten DNBS-MeAib-Cl bzw. DNBS-Aib-Cl an Ala-NA
Abb. 45: Umsatzvergleich für die Kupplung von DNBS-MeAib-Cl an Ala-NA mit X eq. Base
Abb. 46: Kupplung von in situ gebildeten DBS-MeAib-Cl an Ala-NA, Aib-Ala-NA (30 min) bzw. an MeAib-Aib-Ala-NA (t = 4h)
Abb. 47: Syntheseschema des Tetrapeptides
Abb. 48: HPLC-Profil des gereinigten Tetrapeptides
Abb. 49: Syntheseschema des Urocortinanalogons
Abb. 50: CD-Spektren der untersuchten Peptide
Abb. 51: Darstellung der biologischen Aktivität anhand der gemessenen EC50-Werte der Testosteronproduktion
Abb. 52: Nebenreaktion während der Acetylierung; R = Aminosäureseitenkettenrest, R’ = Restpeptid am Harz
Abb. 53: Abnahme der Beladung für die DNBS-Valin-Kupplung an verschiedenen Harzen
Abb. 54: Austausch einer Nitrogruppe durch das angreifende Nucleophil
Abb. 55: HPLC-Profil des vom Harz abgespaltenen Rohpeptides NH2-(Val)5-Lys-NH2
Abb. 56: HPLC-Profil des Rohpeptides NH2-(Val)4-Lys-OH, synthetisiert mit o-NBS-Val-Cl
Abb. 57: HPLC-Profile von a) DNBS-D,L-Val-Ala-NA und b) D, L-Val-Ala-NA

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Mon Sep 16 13:41:08 2002