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Anhang A. Anhang: Materialiensammlung

A.1 Geräte

• Gefäße, 1 ml (von Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
• Reagenzröhrchen 10 ml und 20 ml (von Falcon/Becton Dickinson, New Jersey, USA)
• Einwegpipetten: 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml (von Falcon, s.o.)
• Pipettierhilfe Pipetboy acu (von Integra Biosciences)
• Eppendorfpipetten (10 µl, 20 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl) (von Eppendorf, s.o.)
• Pipettenspitzen (von Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)
• sterilisierte Scheren, Pinzetten (im Sterilisator für mind. 4h bei 150°)
• Petrischalen für 20 ml Medium (von Falcon, s.o.)
• Gewebeplatten mit sechs Vertiefungen (von Falcon, s.o.)
• Zellfilter aus Nylon 100 µm (steril/ gamma irradiated) (von Falcon, s.o.)
• Aminosilan-beschichtete Objektträger (Objektträger von Menzel-Gläser, Deutschland)
• Neubauer-Zählkammer (von Optik Labor)
• Zell-Zähler Casy 1 Model TT (von Schärfe System, Reutlingen, Deutschland)
• Zentrifuge Centrifuge 5415 C für Eppendorfgefäße von 1 ml (von Eppendorf, s.o.)

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• Zentrifuge Varifuge RF für Röhrchen von 10 ml bzw. 50 ml Volumen (von Heraeus, Hanau, Deutschland)
• Laborwaage Modell analytic (von Sartorius, Göttingen, Deutschland)
• Lichtmikroskop „Axioskop“ mit einschaltbaren Fluoreszinfiltersystem (von Zeiss, Oberkochen, Deutschland)
• Elektronenmikroskop von Zeiss (EM 906, Oberkochen, Deutschland)
• Ultramikrotom Om U3 (von C. Reichert, Austria)
• sterile Werkbank mit Absaugvorrichtung (von Karl Bleymehl, Reinraumtechnik, Inden-Pier, Deutschland)
• Brutschrank (von Heraeus, Hanau, Deutschland)
• Sterilisator (von Memmert, Schwalbach, Deutschland)

A.2 Medien

• Transportmedium: RPMI 1640 Medium (von Seromed/Biochrom, Berlin, Deutschland) mit 2,0 g/l NaHCO₃ , ohne L-Glutamin mit Zusatz von 25 µl Gentamycin (von Biochrom, s.o.) und 5 ml Penicillin/Streptomycin (von Biochrom, s.o.) zu 500 ml
• Kulturmedium: RPMI⁺⁺: RPMI 1640 Medium (von Seromed/Biochrom, s.o.) mit 2,0 g/l NaHCO₃, ohne L-Glutamin; mit Zusatz von 50 ml Fetales-Kälber-Serum (von Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) 2,5 ml Glutamin (von Biochrom, s.o.), 25 µl Choleratoxin (von Sigma, München, Deutschland), 5 ml

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  Penicillin/Streptomycin (von Biochrom, s.o.), 5 ml Hydrocortison (von Sigma, s.o.), 1,25 mg Amphotericin B (von Sigma, s.o.)
• Dulbecco‘s PBS (von GibcoBRL/Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) ohne Calcium, Magnesium, Sodium und Bikarbonat mit Zusatz von 5 ml Fetales-Kälber-Serum (von Life Technologies, s.o.) und 5 ml Penicillin/Streptomycin (von Sigma, s.o.) zu 500 ml
• Dulbecco‘s PBS (von GibcoBRL/ Life Technologies, s.o.) ohne Calcium, Magnesium, Sodium und Bikarbonat, als Waschflüssigkeit
• Dispase I (Neutrale Protease): 5 mg Lyophilisat (von Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)
• BSA= bovines Serumalbumin (von Sigma, s.o.), die verwandte PBS+BSA-Lösung war 1%
• 2% Paraformaldehyd (von Serva Feinbiochemica GmbH&Co, KG, Heidelberg, Deutschland)
• Aceton (von Merck, Darmstadt, Deutschland)

A.3 Cell Death Detection ELISA (CDDE)-Kit (Boehringer Mannheim)

Inhalt

• Anti-Histon: aus Lyophilisat in 1 ml bidest. Wasser rekonstituiert.
• Anti-DNA-Peroxidase:aus Lyophilisat in 1 ml bidest. Wasser rekonstituiert.
• Beschichtungslösung: das Beschichtungspufferkonzentrat wird 1:100 verdünnt
• Waschlösung: das Waschpuffer-Konzentrat wird 1:10 verdünnt.

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• Probenlösung: die Probenlösungen werden so eingestellt, daß jeweils Äquivalente von 2*104 Zellen verwendet werden.
• Konjugatlösung: Anti-DNA-Peroxidaselösung wird in Inkubationspuffer 1:10 verdünnt
• Substratlösung: die ABTS (2,2‘ Azino-di[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat(6)])-Tablette wird im gesamten Volumen des Substratpuffers aufgelöst.
• Mikrotiterplattenmodule, Rahmen, selbstklebende Abdeckfolie

A.4 Immuncytochemie

A.4.1 Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP)

• Trisgepufferte Saline (TBS; 0,05 M)
  (aus 4,50 g Tris-Base, 34,25 g Tris-HCl, 43,90 g NaCl (alle Sigma, München, Deutschland) ad 5 l aqua dest)
• Verdünnungsmedium für den Primärantikörper
  (aus 2,5 ml RPMI 1640 (von Biochrom, s.o.) 22,5 ml aqua dest, 2,5 ml Rinderserum (von Biochrom, s.o.){inaktiviert bei 56°C für 30 min.})
• Verdünnungsmedium für Brückenantikörper und APAAP-Komplex
  (5,0 ml Human-AB-Serum (von Biotest AG, Dreieich, Deutschland){inaktiviert bei 56°C für 30 min.}, 25,0 ml RPMI 1640)

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• Hexazotierte Astraneufuchsin-Entwicklungslösung
  aus drei Lösungen:

1. 175,0 ml Trispuffer{aus 0, 98 g Tris-base, 0,30 g Tris-HCl, 1,74 g NaCl (alles von Sigma, s.o.) ad 200 ml aquadest}, 62,5 ml Propandiol-Lösung (Propandiol-Stammlösung 0,2 M: 21,0 g 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (von Merck, Darmstadt, Deutschland), 100,0 mg Levamisole (Sigma, s.o.)
2. 125,0 mg Naphtol AS-BI Phosphat (Sigma, s.o.) in 1,5 ml N, N-Dimethylformamid (DMF, von Merck, s.o.)
3. 50,0 mg Na-Nitrit (von Sigma, s.o.), 1250 µl aqua dest, 500 µl Neufuchsin (von Merck, s.o.)
   Lösung c) wird zu a) gegeben, dann Lösung b) dazu, der ph-Wert mit 2N-HCl auf 8,8 eingestellt und die Lösung filtriert.

• Mayers Hämalaun
  (aus 1,0 g Hämatoxilin (von Merck, s.o.), 0,2 g Natriumjodat (von Merck, s.o.), 50,0 g Kalialaun (von Merck, s.o.){in 1l aqua dest}, 50,0 g Chloralhydrat (von Merck, s.o.),
  1,0 g Citronensäure (von Merck, s.o.); Lösung.muß vor der Verwendung filtriert werden)
• Mausimmunoglobulin (von DAKO, Hamburg, Deutschland)
• APAAP-Komplex: APAAP Maus Monoklonal (von DAKO, s.o.)
  Clone: AP7/6/7
  Isotyp: IgG1 (kappa)
• Kaisers Glyceringelatine (von Merck, s.o.)

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A.5 Zellanreicherung

• Dynabeads M-450 Pan Human HLA Class II (von Dynal, Hamburg, Deutschland)
• Detachabeads (for use with Dynabeads M-450) (von Dynal, s.o.)
• Magnet mit Halterung für Reagenzröhrchen MPC 1 (Magnetic Particle Concentrator von Dynal, Oslo, Norwegen)

A.6 Elektronenmikroskopie

• Karnovsky-Lösung (2,5% Glutaraldehyd (von Serva Feinbiochemica, s.o.), 2% Paraformaldehyd(von Serva Feinbiochemica, s.o.), 0,1 M Cacodylatpuffer, ph 7,4 {aus 42,9g Cacodylsäure (von PLANO, W. Plannet GmbH, Marburg, Deutschland) in 1000 ml aqua bidest})
• 1,33% Osmiumtetroxid (0,05M Phosphatpuffer, ph 7,4, von Fluka, Buchs, Schweiz)
• Äthanol (von Merck, Darmstadt, Deutschland)
• Araldit (von Poersch, Frankfurt, Deutschland)
• Uranyl-Citrat-Bleiacetat (von Leica, Benzheim, Deutschland)
• Propylenoxid (von Serva Feinbiochemica, s.o.)
• Agarose (von BIOzym, Hameln, Deutschland)
• BEEM-Kapseln (von PLANO, s.o.)
• Grids (von PLANO, s.o.)

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