Henschke, Cornelia: Langzeitkultur von humanen Langerhanszellen: Phänotypische Eigenschaften und Apoptose

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Kapitel 2. Versuchsdurchführungen

Bewahrt man Haut in einem Kulturmedium auf, wandern Langerhanszellen aus der Epidermis in das Kulturmedium (Larsen, C. et al; 1990). Dieses Verhalten der Langerhanszellen kann genutzt werden, um sie für Versuche von anderen Zellen aus der Haut zu trennen.

Epidermis wurde durch Dispase von der Dermis getrennt und in Kulturmedium (RPMI++) gegeben. Die aus der Epidermis in das Medium gewanderten Zellen wurden -gesammelt.

Auf diese Weise migrierte Langerhanszellen verhalten sich phänotypisch in gleicher Weise wie Langerhanszellen in vivo nach Kontaktallergie (Rambukkana, A. et al; 1995). Das Migrationsmodell eignet sich deshalb, die Immunpathologie von Langerhanszellen nach Kontaktallergie zu untersuchen. Aufgrund dieses gleichen Entwicklungsverhaltens wird postuliert, daß sich Langerhanszellen in vitro auch auf dieselbe Weise eliminieren wie in vivo.


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2.1 Isolierung und Anreicherung von Langerhanszellen

2.1.1 Versuchsprinzip

Langerhanszellen sind antigenpräsentierende Zellen in der Epidermis. Bei Antigenkontakt binden sich die Langerhanszellen an das Antigen und wandern zusammen mit diesem zu einem Lymphknoten, wo sie den dortigen T-Lymphozyten das Antigen präsentieren (Kripke, M. et al, 1990; Romani, N. et al; 1992c).

Auch in vitro wandern Langerhanszellen aus der Epidermis aus, wenn man diese in flüssigem Medium aufbewahrt (Lenz, A. et al, 1993). Da Langerhanszellen die einzigen HLA Klasse II-positiven Zellen in der Epidermis sind (Romani, N. et al; 1992a), können sie mit Dynabeads (von Dynal, s. Anhang) über positive Selektion angereichert werden. Dabei binden die magnetischen Dynabeads an HLA Klasse II-positive Zellen. So können die gebundenen Zellen mit einem Magneten von der Lösung getrennt werden. Anschließend werden die Dynabeads mit Detachabeads von den Zellen getrennt und wiederum mit einem Magneten entfernt, so daß man eine Lösung erhält, in der nur HLA Klasse II-positive Zellen enthalten sind (Morris, J., et al; 1994).

2.1.2 Versuchsdurchführung

Die Isolierung der Langerhanszellen erfolgte aus Vollhaut, welche bei Mammareduktionen entfernt wurde. Diese erhielten wir dankenswerterweise von den


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Stationen der Plastischen Chirurgie der Berliner Krankenhäuser Prenzlauer Berg, dem Urban-Krankenhaus und dem Krankenhaus Waldfriede . Die Versuche wurden von der Ethik-Kommission der Charité Standort Rudolf-Virchow-Klinikums am 20.2.1996 genehmigt.

Alle Arbeiten, das Präparieren der Haut und die Experimentdurchführung, wurden unter sterilen Bedingungen an der sterilen Arbeitsbank durchgeführt, um eine Kontamination der Kultur mit Keimen zu vermeiden. Die Versuche dauerten jeweils 4 Tage.

2.1.2.1 Versuchstag 1

Die oben erwähnten Krankenhäuser erhielten Eppendorfgefäße mit dem Transportmedium, so daß die Haut noch im Operationssaal in das Medium gegeben werden konnte. Die zur Verfügung gestellte Haut wurde aus den Kliniken am Tage der Operation abgeholt.

Anschließend wurde die Haut präpariert:

  1. das Fett wurde mit einer Schere entfernt,
  2. die Haut wurde in ca. 5×40 mm große Streifen geschnitten,
  3. gewogen,
  4. in Dispase 5 mg/5 ml PBS gelegt
  5. über Nacht bei 4°C inkubiert.

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2.1.2.2 Versuchstag 2 und 3

Die Epidermis wurde mit einer Pinzette abgezogen und

  1. auf Petrischalen mit je 20 ml RPMI++ verteilt.
  2. Schließlich wurde die Epidermis im Brutschrank bei 37°C für zwei Tage aufbewahrt.

2.1.2.3 Versuchstag 4

Das Medium mit den spontan aus der Epidermis migrierten Zellen wurde abpipettiert, filtriert und zentrifugiert.

Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und die Zellen in PBS resuspendiert und gewaschen (auch diese Arbeitsschritte erfolgten an der sterilen Werkbank).

Für die anschließende Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen nach dem Waschen in 40 ml PBS resuspendiert und die Zellzahl auf zwei Arten bestimmt: mit Hilfe der Neubauer-Kammer und mit dem Zell-Zähler (Beschreibung siehe „ Kultur der Langerhanszellen “ ab S. 15#LINKCONTENT#16#/LINKCONTENT#). Aus den 40 ml Zellösung wurden insgesamt 30 µl für die Zählung entnommen.
Die Anreicherung erfolgte wiederum an der sterilen Werkbank.

Die Langerhanszellen wurden mit Hilfe von anti-HLA-DR-beschichteten magnetischen Kügelchen (Dynabeads von Dynal, s. Anhang) über positive Selektion angereichert. Dieses Prinzip wurde erstmals von Jenny Morris (Morris, J. et al 1992)


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vorgestellt. Es wurde nach einer Arbeitsanweisung für die Trennung von Langerhanszellen von Jenny Morris (Morris, J. 1994) gearbeitet, die in 3 Schritten erfolgt:

  1. Nach erneutem Zentrifugieren und der Entfernung des Überstandes wurden die Zellen mit so viel PBS+BSA resuspendiert, daß die Zellratio 5*107 Zellen/ml PBS+BSA betrug (BSA wurde für diesen Schritt hinzugegeben, da auch die Dynabeads in der kommerziellen Lösung BSA enthielten und so die Medien ähnlicher waren.). Dieser Zellsuspension wurden 125 µl Dynabeads /ml hinzugegeben. Die Zellen wurden anschließend in Eis auf einem Schüttler für 30 min. inkubiert.
  2. Die Zellen wurden 10mal mit PBS gewaschen. Auf die Zellen wurden jeweils 8 ml PBS gegeben und gut geschüttelt. Anschließend wurde das Röhrchen in den Magneten gestellt. Nachdem sich die mit Dynabeads gebundenen Zellen an den Magneten angelagert hatten, wurde der Überstand abgegossen. Nach dem 10. Mal wurden 25 µl Detachabeads auf die Zellen gegeben und für 45 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert.
  3. Im Anschluß daran wurden 8 ml PBS hinzugeben und das Röhrchen in den Magneten gestellt. Die von den Langerhanszellen abgelösten Dynabeads sammelten sich an der dem Magneten zugewandten Seite. Im Überstand, der gesammelt wurde, befanden sich die HLA-DR-positiven Langerhanszellen. Dieser Überstand wurde in ein weiteres Reagenzglas überführt, welches wieder in den Magneten gestellt wurde, um alle Dynabeads möglichst vollständig zu entfernen. Nach Überführen in ein anderes Reagenzglas wurde der Überstand wieder in den Magneten gestellt. Dieser Schritt 3

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    wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Der gesamte Überstand wurde gesammelt und zentrifugiert.

Bei dieser erneuten Zentrifugation sammelte sich ein Zellpellet mit den angereicherten Zellen am Boden. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen in 5 ml PBS resuspendiert.

Im Anschluß wurde erneut die Zellzahl auf zwei Arten bestimmt:

Für die Zählungen wurden den Zentrifugaten insgesamt 30 µl entnommen. Die Langerhanszellen wurden in PBS gewaschen und je nach Anforderung, d.h. für die Zeitkinetiken bzw. für den CDDE, weiterverarbeitet.

2.2 Kultur der Langerhanszellen

Der gesamte Versuch erstreckte sich vom Erhalt der Haut (Tag 1) und die Anreicherung mit Dynabeads (Tag 4) über einen Zeitraum von insgesamt bis zu 17 Tagen.

Der Tag der Anreicherung wurde als Tag 0 der Kultur definiert. Für die Untersuchungen der Langerhanszellen wurde wie folgt vorgegangen:

Die angereicherten Langerhanszellen wurden in PBS gewaschen und anschließend in RPMI++ resuspendiert und auf 6-Loch-Gewebekulturplatten verteilt. Jede Vertiefung wurde hierbei mit 3 ml der Zellösung gefüllt. Die Proben wurden im Brutschrank bei 37°C aufbewahrt. Das Medium wurde alle 4-5 Tage gewechselt.


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Der Anteil an lebenden Langerhanszellen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit Hilfe derTrypanblau-Ausschlußmethode ermittelt. Hierfür wurden die Zellen nach der Ernte zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen einmal in PBS gewaschen. Zum Waschen wurden die Zellen in PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Wiederum wurde der Überstand entfernt und die Zellen in PBS resuspendiert.

Aus dieser Zellösung wurden zwei Mal 10 µl entnommen und in ein Eppendorfgefäß pipettiert. Durch Zugabe von 90 µl Trypanblau wurde eine Verdünnung von 1:10 hergestellt. Diese Verdünnung wurde jeweils auf die oberen bzw. unteren 4x4 Quadrate der Neubauer-Kammer gegeben und die Zellen unter dem Mikroskop gezählt.

Die vitalen Zellen schlossen das Trypanblau aus, da ihre Zellmembran noch intakt war und funktionierte. Die toten Zellen waren blaugefärbt, da ihre Zellmembran nicht mehr funktionstüchtig war und deshalb das Trypanblau in die Zellen eindringen konnte. Für die Ermittlung der Zellzahlen des jeweiligen Tages wurden nur die vitalen Zellen verwandt. Die Zahl der Zellen wurde berechnet nach der Formel:

ZZ=g.v.Z.* 104* Verd.* VZL

ZZ : Zellzahl
g.v.Z.: gezählte, vitale Zellen
Verd.: Verdünnung, hier = 10
VZL : Volumen der Zellösung, aus der 2x 10 µl entnommen wurden

Zusätzlich wurde die Zellzahl mit dem Zell-Zähler "Casy 1" bestimmt. Auch hierfür wurden aus der Lösung nach dem Waschen 10 µl entnommen, diese wurden mit 10 ml PBS aufgefüllt und im Zell-Zähler gezählt.


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Am Tag der Anreicherung (= Kulturtag 0) und an späteren Tagen wurden Cytos angefertigt. Die Herstellung erfolgte, indem die Zellen in PBS gewaschen und resuspendiert wurden und anschließend pro Objektträger zwei Tropfen zu je 20 µl aufgetragen wurden. Nach dem Verdunsten der PBS wurden die Proben im Kühlschrank bei -20°C gelagert.

Diese Cytos wurden für die APAAP- Färbung benutzt. Am Tag der Färbung wurden die Cytos für 10 min. in kaltem Aceton bzw. für die bcl-Gruppe der APAAP-Färbung in 2%-iger Paraformaldehydlösung fixiert.

2.3 Elektronenmikroskopie

2.3.1 Herstellung der Präparate für die Elektronenmikroskopie

Die Langerhanszellen werden zunächst fixiert und anschließend entwässert, da sie im Elektronenmikroskop einem Hochvakuum ausgesetzt sind und verbleibendes Wasser die Zellen im Vakuum zerstört hätte.

2.3.2 Fixierung der Langerhanszellen

Die Langerhanszellen wurden nach den entsprechenden Tagen Kulturdauer geerntet.


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Dabei wurde der entsprechende Ansatz mitsamt dem Medium in ein Eppendorfgefäß pipettiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen in 2 ml PBS resuspendiert. Auf diese Weise wurde noch zwei Mal gewaschen.

Ein Aliquot wurde abgenommen und die Zellzahl mit Hilfe der Trypanblaumethode und des Zell-Zählers bestimmt.

Nach dem zweiten Waschvorgang wurde das Zellpellet in 2 ml Karnovski-Lösung wieder aufgenommen und somit fixiert. Die Proben konnten nun bis zur weiteren Verarbeitung im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt werden.

Die Karnovski-Lösung setzte sich zusammen aus:

2.3.3 Entwässerung der Langerhanszellen

Die Eppendorfgefäße mit den in der Karnovski-Lösung enthaltenen Zellen wurden mit PBS 0,1 molar aufgefüllt und in der Zentrifuge bei 1400 U/min 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, wieder mit 2 ml PBS aufgefüllt und erneut zentrifugiert. Auf diese Weise wurden die Zellen drei Mal gewaschen und anschließend wieder über Nacht in PBS im Kühlschrank aufbewahrt.


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Am nächsten Tag wurde noch einmal das PBS gewechselt. Dann wurde nach erneuter Zentrifugation und Abgießen das Zellpellet in 2%iger Osmiumsäure aufgenommen.

Die Osmiumsäure wirkte 45 min bei Raumtemperatur ein. Danach wurden die Zellen drei Mal mit aqua dest. gewaschen.

Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Zellen in zuvor angesetzter 2%iger Agarose aufgenommen. Die verwandte Agarose ist bei 37°C flüssig. Zum Verarbeiten wurde sie im Wasserbad bei 37°C aufbewahrt. Die Agarose wurde in einem Mischungsverhältnis von 1:1 Agarose zur Zellsuspension gegeben.

Das in Agarose aufgenommene Zellpellet wurde für 20 s bei 10000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in der Agarose auf Eis gelegt, um das Präparat hart werden zu lassen. Das Präparat wurde nun entwässert. Dafür wurde es nacheinander in Pufferwaschlösungen nach dem folgenden Schema gelegt:

Pufferwaschlösung

Zeit [min]

 

50% Ethanol

10

2x

70% Ethanol

10

2x

90% Ethanol

10

2x

96% Ethanol

10

3x

100% Ethanol

10

3x

Gemisch 1:1 Ethanol/Propylenoxid

15

2x

Gemisch 1:1 Propylenoxid/Araldit

15

1x

Die Zellen wurden anschließend in reinem Araldit bei Raumtemperatur über Nacht aufbewahrt.


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2.3.4 Einbettung

Am nächsten Tag erfolgte die Einbettung der Langerhanszellen. Dazu wurde das Zellpellet aus dem Araldit entnommen, in eine BEEM-Kapsel getan und diese mit Araldit aufgefüllt. Das Präparat wurde nun in der Wärme bei 60°C für drei Tage gehärtet.

2.3.5 Schneiden der Präparate

Die BEEM-Kapseln wurden in das Ultramikrotom eingespannt, und es wurden zunächst Semidünnschnitte von 150-190 nm Dicke angefertigt. Danach wurden Ultradünnschnitte von 70-80 nm hergestellt.

Die Schnitte wurden auf Grids aufgefangen und anschließend mit Uranylacetat für 15 min kontrastiert.

Es wurde mit aqua dest. gespült und erneut mit Bleicitrat für 5 min. kontrastiert. Im Anschluß daran wurden die Schnitte wieder mit aqua dest. gespült.


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2.4 Immuncytochemie unter Verwendung der APAAP-Technik

2.4.1 Versuchsprinzip

Die Färbung mit der Methode „Alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase“ (APAAP) wird für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Oberflächenmarkern benutzt. Hierbei wird mittels Antikörpern, die sich aneinander binden, eine Struktur geschaffen, die anfärbbar ist. Durch dieses Verfahren kann die Anwesenheit spezifischer Oberflächenmarker nachgewiesen werden.

In unseren Versuchen arbeiteten wir mit monoklonalen Antikörpern von der Maus , die sich spezifisch an bestimmte Oberflächenmarker binden, z.B. anti-CD 1a von der Maus an das CD 1a der Langerhanszellen (Die Liste der untersuchten Antikörper ist auf Seite 24f).

Anschließend wurde dieser gebundene Maus-Antikörper mit einer Anti-Maus-Kalb-Brücke an eine intestinale Phosphatase des Kalbes und an diese wiederum die anti-alkalische-Phosphatase der Maus gebunden werden. Durch diese Aneinanderbindung von alkalischer-Phosphatase-anti-alkalische Phosphatase entsteht, wenn Oberflächenmarker vorhanden sind, eine anfärbbare Struktur (Cordell, J. et al; 1984). Es wurde in drei Inkubationszyklen gearbeitet.

  1. Im ersten Schritt wurde zunächst der primäre monoklonale Antikörper an den Oberflächenmarker gebunden.

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  2. Im zweiten Schritt wurde Anti-Maus-Ig an den Antikörper gebunden, an welches sich im dritten Schritt der APAAP-Komplex band. Die derart markierten Zellen konnten nun mit hexazotierter Astraneufuchsin-Entwicklungslösung visualisiert werden.
  3. Abschließend wurde mit Mayers-saurer-Hämalaunlösung gegengefärbt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der APAAP-Technik


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Abbildung 2: Schematisches Diagramm der amplifizierten APAAP-Technik

Abbildungen aus: C. Wesendahl, Arbeitsanweisung für den APAAP

2.4.2 Versuchsdurchführung

Die im Tiefkühler gelagerten Cytos wurden zur Fixation für 10 min in kaltes Aceton getaucht. Für die Inkubation mit bcl-2 vorgesehene Cytos wurden für 10 min in Paraformaldehydlösung fixiert.

Die entsprechenden Verdünnungen der Primärantikörper wurden mit dem Verdünnungsmedium (I) hergestellt und auf die Cytos pipettiert. In der feuchten Kammer wurde nun für 30 min. inkubiert.


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Danach wurde mit TBS mehrmals gewaschen.

Es erfolgte nun die Inkubation mit Mausimmunoglobulin als Brückenantikörper für 30 min. Das Mausimmunoglobulin wurde mit dem Verdünnungsmedium (II) 1:40 verdünnt.

Es wurde wieder mehrmals in TBS gespült.

Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem APAAP-Komplex. Dieser wurde in einer Verdünnung von 1:40 mit dem Verdünnungsmedium (II) aufgetragen und für 30 min in der feuchten Kammer inkubiert.

Es erfolgte eine jeweils zehnminütige Wiederholung der letzten beiden Schritte. Nach jedem Schritt wurden die Objektträger in TBS gespült.

Anschließend wurden die Proben mit hexazotierter Astraneufuchsinlösung entwickelt. Die Lösung wurde frisch hergestellt, danach wurden die Objektträger in der Lösung für 30 min auf einen Schüttler gestellt.

Die Proben wurden wieder mit TBS gespült, dann erfolgte für 10 min eine Gegenfärbung mit Mayers-saurem-Hämalaun. Nach Spülung in TBS wurden die Objektträger bis zur Eindeckelung mit Kaisers Glyceringelatine in Leitungswasser aufbewahrt.

Liste der Antikörper (die verwendeten Verdünnungen wurden zuvor durch Austitration ermittelt):


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Antikörper

Klon

Isotyp

Verdünnung

Hersteller

Expression

CD 1a

NA 1/34

IgG2a, kappa

1:100

DAKO,
Hamburg,
Deutschland

kortikale Thymozyten, Langerhanszellen,
dendritische Zellen

HLA-DR

DK 22

IgG2a, kappa

1:100

DAKO
Hamburg
Deutschland

Haupthistokompati-bilitätskomplex auf menschlichen Zellen

CD 95
(Fas)

DX 2

IgG1, kappa

1:2500

PharMingen,
Hamburg,
Deutschland

Apoptosemarker auf vielen Zellreihen

CD 95-L
(Fas Ligand)

NOK-1

Maus IgG1

1:20

PharMingen,
Hamburg,
Deutschland

bindet an CD 95 und sorgt damit für die Aktivierung

CD 80
(B7-1)

BB 1

Maus IgM

1:500

Calbiochem,
San Diego,
USA

B-Zellen und Unterarten, agiert als Kostimulant von CD 28 und CTLA-4

CD 86
(B70/B7-2)

IT2.2

Maus IgG2b, kappa

1:500

PharMingen,
Hamburg,
Deutschland

Monocyten, aktiv.B-Zellen, dendr. Zellen;

zweiter Ligand für CD 28 und
CTLA-4

bcl-2

100/D5

IgG1, kappa

1:20

ZYMED,
San Francisco
USA

funktioniert als Inhibitor von Apoptose

Bcl-xl(Ab-1)

k.A.=

keine Angabe

Kaninchen IgG

1:20

Calbiochem

mit bcl-2 verwandt, funktioniert als Regulator von Apoptose

Bax(Ab-1)

k.A.

polyklonales Kaninchen IgG

1:10

Oncogene

bindet an bcl-2 und fördert Apoptose

Die APAAP-Färbungen wurden quantitativ und qualitativ ausgewertet. Für die quantitative Auswertung wurden jeweils drei Mal 100 Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt und der prozentuale Anteil an gefärbten Zellen bestimmt. Dabei wurde gleichzeitig für die Expressionsstärke folgende semiquantitative Einteilung benutzt:

-

= keine

++

= starke

(+)

= schwache

+++

= sehr starke Anfärbung.

+

= leichte

 

 

Diese Einteilung gibt über die Stärke der Antigenexpression Auskunft.


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2.5 Cell Death Detection ELISA (CDDE)

2.5.1 Versuchsprinzip

Bei der Apoptose wird der DNA-Strang durch eine spezifische Endonuclease gespalten. Diese Ca2+- und Mg2+- abhängige Endonuclease spaltet den DNA-Doppelstrang in den leicht zugänglichen Linker-Regionen zwischen den Nucleosomen in Mono- und Oligonucleosome. Die DNA in den Nucleosomen hingegen ist mit den Core-Histonen H2A, H2B, H3 und H4 eng assoziiert und dadurch vor der Spaltung durch die Endonuclease geschützt. Aus diesem Grund ist nach Extraktion und Separation der DNA die für die Apoptose typische „DNA-Leiter“ im Agarose-Gel zu erkennen. Es spalten sich hierbei Stücke in diese spezifischen DNA-Fragmente und können nachgewiesen werden. Das quantitative Sandwich-Enzym-Immunoassay-Prinzip unter Verwendung von zwei monoklonalen Maus-Antikörpern gegen DNA und Histon (H2A, H2B, H3 und H4) dient als Basis für den CDDE. Es ermöglicht den spezifischen Nachweis von Mono- und Oligonucleosomen in der cytoplasmatischen Fraktion von Zellysaten.

Der Test beinhaltete drei Inkubationsschritte:

  1. Zunächst wurde Anti-Histon adsorptiv an die Wand der Mikrotitermodule fixiert und anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Wand mit Inkubationspuffer, der hierbei als Blockierungslösung fungiert, abgesättigt.

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  2. Die in der Probe enthaltenen Nucleosome wurden im zweiten Inkubationsschritt über ihren Histon-Anteil von dem an der Wand immobilisierten Anti-Histon gebunden.
  3. Im dritten Inkubationsschritt band Anti-DNA-Peroxidase an den DNA-Anteil der Nucleosome. Das nichtgebundene Peroxidase-Konjugat wurde ausgewaschen und der Anteil der im Immunkomplex fixierten Peroxidase mit 2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat(6)] (=ABTS)
    als Substrat photometrisch bestimmt.

2.5.2 Probenvorbereitung

Die Proben wurden entnommen, für 8 min bei 2500 U/min zentrifugiert und einmal in PBS gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation für 8 min bei 2500 U/min wurde das Zellpellet in 300 µl Inkubationspuffer resuspendiert und für 30 min bei 4°C inkubiert. Danach wurde für 10 min bei 14000 U/min zentrifugiert. Vom Überstand wurden 200 µl entnommen und bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C eingefroren.

Die Proben wurden bei der Weiterverarbeitung im CDDE so aliquotiert, daß die Proben jeweils auf 2*104 Zellen eingestellt waren.

2.5.3 Versuchsdurchführung

Die Versuchsdurchführung dauerte zwei Tage.


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2.5.3.1 Versuchstag 1

Für die Vorbeschichtung wurde jede Vertiefung des Mikrotiterplattenmoduls mit 100 µl Beschichtungslösung gefüllt. Das Mikrotiterplattenmodul wurde mit der Abdeckfolie dicht abgedeckt und bei 4°C über Nacht inkubiert.

2.5.3.2 Versuchstag 2

Die Beschichtungslösung wurde durch Ausklopfen sorgfältig entfernt. Als Nachbeschichtung wurde jeweils 200 µl Inkubationspuffer in die Vertiefungen der Mikrotiterplattenmodule pipettiert, die Module abgedeckt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch Ausklopfen entfernt und die Vertiefungen dreimal mit 250 µl Waschlösung gespült.

Schließlich wurden jeweils 100 µl der Probelösungen in die Vertiefungen pipettiert. Zur Bestimmung eines Leerwertes wurden in einige Vertiefungen 100 µl Inkubationspuffer gegeben. Nach Abdeckung mit Folie wurde nun für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Vertiefungen wieder ausgeklopft und dreimal mit Waschlösung gewaschen.

Im nun folgenden Schritt wurden für die Inkubation mit der Anti-DNA-Peroxidase 100 µl der Konjugatlösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplattenmodule pipettiert, die nicht zur Leerwertbestimmung diente. Die Module wurden abgedeckt und für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Vertiefungen wie oben ausgeklopft und gewaschen.


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Danach wurde die Substratreaktion durchgeführt. Dazu wurden jeweils 100 µl der Substratlösung in die Vertiefungen pipettiert und bis zur ausreichenden Farbentwicklung für eine fotometrische Messung inkubiert. Die Messung wurde nach 20 min durchgeführt.

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Fri Sep 14 13:13:48 2001