Henschke, Cornelia: Langzeitkultur von humanen Langerhanszellen: Phänotypische Eigenschaften und Apoptose

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Zeitverlauf der Viabilität der Langerhanszellen in der Kultur:

Die nach Isolierung und Anreicherung erhaltenen Zellsuspensionen enthielten 91,5±6,5% CD1a-positive Zellen. Bei den Zählungen zu den verschiedenen Zeitpunkten wurde die Zahl der lebenden Zellen bestimmt und der prozentuale Anteil zu der am Tag 0 der Kultur in den einzelnen Ansatz pipettierten Zellzahl errechnet. Der Verlauf der Vitalität ist in Diagramm 1 dargestellt. Es zeigte sich, daß die Zahl der viablen Zellen innerhalb der ersten zwei Tage der Kultur um mehr als die Hälfte sank. Während der folgenden Tage der Kultur nahm die Zahl der lebenden Zellen weiter ab, jedoch langsamer als zu Beginn, von im Mittel 39% am Tag 2 auf ca. 20% um Tag 10.

<A NAME=@Seite31@></A><HR><P CLASS=@PAGENUMBER@ ALIGN=RIGHT>31</P>

Es wurde zusätzlich bei der Zählung mit der Neubauer-Kammer die Zahl der viablen Zellen (d.h. die Zellen, die das Trypanblau ausschlossen) zu der gesamten Anzahl der zu diesem Zeitpunkt zu zählenden Zellen (d.h. die gefärbten und die ungefärbten Zellen) in Verhältnis gesetzt. Dabei konnte festgestellt werden, daß zwischen 65% vitale Zellen zu Beginn und ca. 40-60% vitale Zellen zu späteren Zeitpunkten in der Lösung waren.

Der prozentuale Anteil der toten Langerhanszellen in der Lösung stieg nicht an, da die toten Zellen bei den alle fünf Tage erfolgten Medienwechseln entfernt wurden.

3.2 Qualitativer Nachweis der Apoptose durch Elektronenmikroskopie

3.2.1 Beschreibung der Bilder

Ultrastrukturell weist die Langerhanszelle einen unregelmäßig eingefalteten Kern auf, sie enthält keine Tonofilamente. Man kann Lysosomen, Mitochondrien und rauhes endoplasmatisches Retikulum erkennen. Zeichen der Aktivierung einer Langerhanszelle sind eine Vergrößerung der Zelle und des Nucleus, eine Zunahme von regulären Mitochondrien, Golgiapparaten und endoplasmatischen Membranen (Kolde, G. et al; 1987).

Bild A zeigt eine migrierte Langerhanszelle mit Zeichen der Aktivierung. Die Zelle besitzt einen großen, angeschwollenen Kern. Im Cytoplasma der Zelle sind Birbeck-


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Granula zu erkennen. Die Zelle besitzt dendritische Ausstülpungen der Plasmamembran.

Abbildung B zeigt eine Langerhanszelle nach mehrtägiger Kulturdauer. Die Zelle ist insgesamt kleiner und ihre dendritischen Ausstülpungen sind ausgeprägter geworden. Es lassen sich aber immer noch Birbeck-Granula erkennen.

Diese Veränderungen sind auch in Bild C sichtbar: es zeigen sich große Anteile an Mitochondrien. Ebenfalls sind große Anteile von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum zu erkennen. Im Cytoplasma sind Birbeck-Granula zu erkennen.

Histologisch zeigt eine apoptotische Zelle ein charakteristisches Cytosol und Chromatinkondensation mit Schrumpfung der gesamten Zelle (Kolde, G. et al; 1993). In der Ultrastruktur ist eine frühzeitig beginnende Chromatinkondensation mit einer Randständigkeit des Chromatin sichtbar.

Nach 7 Kulturtagen waren die Langerhanszellen kleiner und ausgeprägter dendritisch geformt als frisch isolierte Zellen. Der Nucleus zeigte auffallende Eindellungen und die Anzahl der cytoplasmatischen Organellen und Birbeck-Granulas war gesunken. Hingegen war die Zahl der Lysosomen angestiegen. Es konnte während der Kultur keine Langerhanszelle in Mitose gezeigt werden.

Bild D zeigt eine apoptotische Langerhanszelle. Die Zelle besitzt einen großen, abgeschnürten Kern, in dem sich das Chromatin verdichtet hat. Dies ist eine Aufnahme von einer Langerhanszelle in fortgeschrittener Apoptose.

Unter dem Elektronenmikroskop zeigten diese Zellen die typische Schrumpfung der Zellmembran, Kondensation des Cytoplasmas und der Organellen, Absonderung des


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zusammengedrängten Chromatins, sowie letztendlich die Abschnürung dieser zu Apoptosekörpern. Auf Bild E ist ein apoptotisches Fragment einer Langerhanszelle mit abgeschnürten Apoptosekörpern zu sehen. Es waren einzelne Birbeck-Granula zwischen den Apoptosekörpern zu erkennen, durch die diese Zellen als Langerhanszellen identifiziert werden konnten.


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3.2.2 Elektronenmikroskopische Bilder

Bild A: Frisch migrierte Langerhanszelle Vergrößerung: 6969×


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Bild B: Überlebende Langerhanszelle in längerer Kultur Vergrößerung: 9000×


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Bild C: Initiale Apoptose bei einer Langerhanszelle Vergrößerung: 11625×


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Bild D: Fortgeschrittene Apoptose bei einer Langerhanszelle Vergrößerung: 11625×


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Bild E: Apoptotisches Fragment einer Langerhanszelle Vergrößerung: 25050×


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3.3 Nachweis und quantitative Bestimmung der Apoptose von Langerhanszellen

Bei den Apoptoseuntersuchungen mittels CDDE zeigten die kultivierten Langerhanszellen die biochemischen Eigenschaften des Zelltodes durch Apoptose. Bei der Apoptose findet biochemisch eine Spaltung der DNA durch endogene Nucleasen in charakteristische Bruchstücke von bis zu 185 Basenpaaren statt. Diese Bruchstücke können mittels CDDE nachgewiesen werden. Anhand des CDDE-Versuches konnte auch die Menge des Untergangs von Zellen durch Apoptose quantifiziert werden, da sich der CDDE sowohl für den qualitativen als auch den quantitativen Nachweis von Apoptose eignet.


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Im CDDE konnte eine Zunahme von spontaner DNA-Fragmentation nach zwei bis drei Tagen der Zellkultur beobachtet werden. Die Anzahl der DNA-Fragmentationen war zu späteren Zeitpunkten der Kultur wieder geringer. Somit konnte ein großer Anteil an Zellen beobachtet werden, der zu Beginn der Kultur durch Apoptose gestorben ist, während dann die Zahl der Zellen langsamer abnahm (siehe dazu Diagramm 2).

3.4 Immuncytologische Untersuchungen

Die Mittelwerte der Auszählungen der APAAP-Färbungen und die qualitative Schätzung der Stärke der Färbung (Expression) der Cytos von Tag 0, dem Tag der Anreicherung, von Tag 5 und Tag 10 der Kultur sind in Tabelle 1 dargestellt:

Antikörper

Tag 0
MW/%


Abw./%


Expr.


n

Tag 5
MW/%


Abw./%


Expr.


n

Tag 10
MW/
%


Abw./%


Exp


n

CD 1a

91, 5

±6, 5

+++

14

81, 5

±9, 8

++

10

82, 0

±9, 0

+

5

HLA-DR

85, 4

±13, 3

+++

7

94, 0

±7, 8

++

6

88, 3

±11, 0

++

4

CD 80

68, 3

±20, 1

+

7

17, 5

±13, 9

(+)

6

10, 2

±6, 3

(+)

6

CD 86

59, 1

±19, 3

+/++

8

41, 3

±17, 1

+++

7

26, 5

±18, 1

+

4

CD 95

41, 9

±25, 7

++

17

19, 0

±27, 3

+

8

11, 7

±11, 6

(+)

4

CD 95-L

45, 7

±32, 3

+

7

27, 3

±23, 6

(+)/+

4

8, 5

±2, 1

(+)

2

bcl-2

49, 6

±31, 8

+

8

22, 0

±10, 3

(+)/+

6

10, 3

±7, 8

+

3

bcl-xl

77, 6

±18, 6

++

5

39, 3

±21, 4

+/++

7

35, 7

±16, 3

(+)

3

Bax

78, 6

±12, 6

++

5

43, 0

±21, 9

+/++

7

59, 8

±7, 8

+

4

Tabelle 1

n=Anzahl der in der Auswertung benutzten Versuche

-

= keine

++

= starke

(+)

= schwache

+++

= sehr starke Anfärbung

+

= leichte

 

 


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Die Standardabweichung berechnet sich nach der Formel:

Frisch isolierte Langerhanszellen zeigten eine starke HLA-DR-Expression, die auch im Verlauf der Kultur stark blieb. Bei der semiquantitativen Beurteilung der Expression zeigte sich, daß die HLA-DR-Expression zu Beginn sehr stark war und dann im Verlauf etwas schwächer wurde. Die Expression insgesamt blieb aber stark.

Im Vergleich der Expressionen, die durch die Stärke der Anfärbung semiquantitativ beurteilt wurden, zeigten sich die der Kostimulationsmoleküle CD 80 und CD 86 nur mäßig stark. Diese wurde im Verlauf der Kultur noch schwächer. Bei diesem Vergleich zeigte sich beim CD 80 nur schwache bis gerade noch erkennbare Anfärbung. Die Expression von CD 86 war unterschiedlich stark, jedoch durchweg stärker als die von CD 80.

Die Apoptose-Marker CD 95 und der dazugehörige Ligand CD 95-L zeigten zunächst mittelstarke und dann abfallende Expression. Dies traf auch für die semiquantitative Beurteilung zu: die Expression war zu Beginn leicht bzw. stark (CD 95) und nahmen dann im Verlauf der Kultur ab.

Der Apoptose-Gegenspieler bcl-2 zeigt im Zeitverlauf eine abfallende Kurve. Die Stärke der Expression ist während des gesamten Verlaufes nur leicht.

Der Anteil der Zellen, die die zur bcl-2-Gruppe gehörenden Oberflächenmarker bcl-xl und bax besitzen, ist zu Beginn recht groß und nimmt dann ab. Die Expression dieser beiden Oberflächenmarker ist zu Beginn relativ stark und im Zeitverlauf abnehmend.


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3.4.1 APAAP-Färbungen-Bilder

3.4.1.1 Durchführung der Fotografien

APAAP-Färbungen der Zellen von Tag 1, Tag 7 und Tag 12 der Kultur wurden mit dem Lichtmikroskop fotografiert. Es wurde eine Kamera benutzt, die auf das Zeiss-Lichtmikroskop aufgesetzt wurde. Desweiteren wurde ein T 64 Kodak Kunstlichtfilm verwendet. Es wurden Aufnahmen bei 1000facher Vergrößerung gemacht.

3.4.1.2 Beschreibung der Bilder

Zu den verschiedenen Zeitpunkten ist die Färbbarkeit mit den ausgewählten Oberflächenmarkern dargestellt. Bei Anwesenheit der Oberflächenmarker färben sich die Zellen bei der APAAP-Färbung mit den entsprechenden Antikörpern in einem leuchtenden purpur- bis bräunlichrotem Ton. Es wurden Färbungen mit Antikörpern gegen CD 1a, HLA-DR, CD 95, CD 95-L, CD 86, CD80, bcl-2, bcl-xl und bax durchgeführt.

Zum Vergleich zu den nachfolgenden Färbungen zeigt Bild 1 den Tag 1 eines Leerversuches. Die Zellkerne sind dunkelblau gefärbt durch die Färbung mit Mayer‘s-Hämalaun, aber das Zytosol zeigt nicht die typische starke rosa-bräunliche Verfärbung, wie bei einer positiven APAAP-Färbung. Auf Bild 2 ist die stark positive Färbung bei Anwesenheit des HLA-DR-Oberflächenmoleküls zu sehen.

Bild 3 zeigt CD 1a -positive Zellen am ersten Tag der Kultur. Die Zellen sind stark angefärbt, in der qualitativen Auswertung ist dies +++ = sehr starke Anfärbung (vgl. S. 36). Die Zellen besitzen einen Kern und runde Form. Zarte, schleierhafte dendritische Ausläufer der Zellen sind erkennbar. Im Vergleich dazu erscheinen die CD 1a-positiven


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Zellen an Tag 7 auf Bild 4 nicht ganz so kräftig angefärbt. Die dendritische Form der Zellen hat zugenommen, die Zellen wirken wie ausgefranst. Auf Bild 5, CD 1a-positive Zellen nach zwölf Kulturtagen, ist nur bei einer Zelle ein Zellkern angeschnitten. Der Rand der Zellen ist eingezogen und in einigen Teilen der Zellen wirkt das Zytoplasma dichter als in den übrigen. Die Zellen erscheinen nach zwölftägiger Kulturdauer insgesamt etwas kleiner als auf den Bildern an Tag 1 und 7.

Bei den folgenden Bildern wurden die Zellen nach Tag 1 der Kultur geerntet und die Färbungen durchgeführt. Bild 6 und Bild 7 zeigen, daß die Zellen CD 80 und CD 86 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Ebenso sind die Zellen positiv für bcl-2 (Bild 8), bcl-xl (Bild 9) und bax (Bild 10). Die Zellen erscheinen bei allen Färbungen im Laufe der Kulturdauer kleiner als zu Beginn. Auf dem Bild nach 12 Tagen Kulturdauer sind mehr Zellen sichtbar, bei denen der Zellkern nicht angeschnitten wurde.

Deutlich positiv sind auch die Färbungen von CD 95 und CD 95-L, den Apoptosemarkern. Die CD 95-Färbung am 1. Tag (Bild 11 ), 7. Tag (Bild 12) und 12. Tag (Bild 13) zeigen zu allen Zeitpunkten von der Intensität der Farbe eine qualitativ gleich starke Färbung. Eine kräftige Färbung zeigt sich auch für CD 95-L, wie hier an Tag 1 auf Bild 14 (5/27) gezeigt.


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3.4.1.3 Fotografien

Bild 1 Leerversuch Tag 1 Vergr. 1000×

Bild 2 HLA-DR Tag 1 Vergr. 1000×


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Bild 3 CD 1a Tag 1 Vergr. 1000×

Bild 4 CD 1a Tag 7 Vergr. 1000×

Bild 5 CD 1a Tag 12 Vergr. 1000×


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Bild 6 CD 80 Tag 1

Bild 7 CD 86 Tag 1


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Bild 8 bcl-2 Tag 1

Bild 9 bcl-xl Tag 1

Bild 10 bax Tag 1


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Bild 11 CD 95 Tag 1

Bild 12 CD 95 Tag 7

Bild 13 CD 95 Tag 12


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Bild 14 CD 95-L Tag 1


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