Henschke, Cornelia: Langzeitkultur von humanen Langerhanszellen: Phänotypische Eigenschaften und Apoptose

Aus der
Klinik für Dermatologie und Venerologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Langzeitkultur von humanen Langerhanszellen:
Phänotypische Eigenschaften und Apoptose

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Cornelia Henschkeaus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. G. Kolde
Prof. Dr. J. Knop
Prof. Dr. Ch. Neumann

Datum der Promotion: 23. Februar 2001

Abstrakt

Die Arbeit beschreibt das phänotypische Verhalten von kultivierten Langerhanszellen, antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, sowie die Art und Weise ihrer Elimination.

Hierfür wurden Zellkulturen von Langerhanszellen durch Migration aus normaler menschlicher Haut gewonnen. Die Langerhanszellen durchlaufen dabei die gleiche funktionelle Entwicklung, wie nach Antigenpräsentation in situ.

Ziel der Untersuchung war es, die funktionellen und zellulären Eigenschaften und die Elimination von Langerhanszellen in der Zellkultur zu ermitteln. Die Anzahl viabler Zellen wurde mittels Trypanblauausschluß zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur ermittelt. Außerdem wurden die Zellen mittels Elektronenmikroskopie und Immuncytochemie untersucht. Die Befunde zeigen, daß die Zellen in der Kultur eine Veränderung ihres Phänotyps sowie funktionelle Änderungen im Sinne einer Ausreifung zu antigenpräsentierenden, T-Zell stimulierenden Zellen erfahren. Das in-vitro-Verhalten entspricht dem von Langerhanszellen in vivo nach Kontaktsensibilisierung.

Mit Hilfe von eines für Apoptose spezifischen ELISA (= Enzyme-linked immunosorbent assay: eine Nachweisreaktion für Antigene bzw. Antikörper mithilfe von Enzymen) und Elektronenmikroskopie wurde nachgewiesen, daß die Zellen in unseren Kulturen durch Apoptose starben. Es gibt keinen Anhaltspunkt dafür, daß sich die Zellen nicht auch in vivo apoptotisch eliminieren. Die Verlauf der Funktionsmarker weist darauf hin, daß vorwiegend die maturierten Zellen von Apoptose betroffen waren, und die Apoptose über das CD 95/CD 95 L- System gesteuert wurde.

Die Versuche zeigten insgesamt, daß Langerhanszellen durch Apoptose aus der Kultur eliminiert werden. Da sich die Zellen nach Migration in vitro wie Langerhanszellen nach Antigenpräsentation in vivo verhalten, scheint die Apoptose ein biologisches Regulativ für die Elimination von funktionell ausgereiften Langerhanszellen darzustellen.

Schlagwörter:
APAAP-Färbung, Apoptose, Bax, Bcl-xl, Bcl-2, CD 1a, CD 80, CD 86, CD 95, CD 95-L, CDDE, Elektronenmikroskopie, HLR-DR, Langzeitkultur, Programmierter Zelltod, Zellkultur

Abstract

This work describes the phenotypic behavior of cultivated Langerhans-cells, epidermal cells presenting antigenes and how they are eliminated .

Therefore cultures of Langerhans-cells won by migration from normal human skin were used. The migrated Langerhans-cells have the same phenotypic features as Langerhans-cells after presentation of antigenes in situ.

The aim of this work was to show the functional and cellular features of Langerhans-cells in culture and the way of their elimination.

The cells still alive were count at distinct times using the Trypan-blue-exclusion-method.

Additionally the cells were examined by electron microscopy and immuncytochemical methods.

The findings show, that the cells in culture have the same characteristics of the phenotype and change of their function in the direction of developing to antigen-presenting, T-cell-stimulating cells. The in vitro behaviour is the same as of Langerhans-cells in vivo after contact-sensitization.

With the help of an elisa (=Enzyme-linked immunosorbent assay) specific for apoptosis ( Cell Death Detection Elisa = CDDE) and with electron microscopy was shown, that the cultivated cells died by apoptosis. There is no reference point, that the cells do not do the same in vivo. The process of the functional markers shows, that predominantly the matured cells die by apoptosis and that it was controled by the CD 95/CD 95-L -system

The investigations showed, that the Langerhans-cells were eliminated by apoptosis of the culture.

The cells after migration in vitro behave in the same manner as after presentation of antigen in vivo. This indicates apoptosis to be the biologic regulation for the elimination of functional matured Langerhans-cells.

Keywords:
Apoptosis, Bax, Bcl-xl, Bcl-2, CD 1a, CD 80, CD 86, CD 95, CD 95-L, Cellculture, Cell Death Detection ELIZA, Electron microscopy, HLA-DR, Langerhans cell, Long-term culture P, Programmed cell death


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteLangzeitkultur von humanen Langerhanszellen: Phänotypische Eigenschaften und Apoptose
1 Einleitung
2 Versuchsdurchführungen
2.1Isolierung und Anreicherung von Langerhanszellen
2.1.1Versuchsprinzip
2.1.2Versuchsdurchführung
2.1.2.1Versuchstag 1
2.1.2.2Versuchstag 2 und 3
2.1.2.3Versuchstag 4
2.2Kultur der Langerhanszellen
2.3Elektronenmikroskopie
2.3.1Herstellung der Präparate für die Elektronenmikroskopie
2.3.2Fixierung der Langerhanszellen
2.3.3Entwässerung der Langerhanszellen
2.3.4Einbettung
2.3.5Schneiden der Präparate
2.4Immuncytochemie unter Verwendung der APAAP-Technik
2.4.1Versuchsprinzip
2.4.2Versuchsdurchführung
2.5Cell Death Detection ELISA (CDDE)
2.5.1Versuchsprinzip
2.5.2Probenvorbereitung
2.5.3Versuchsdurchführung
2.5.3.1Versuchstag 1
2.5.3.2Versuchstag 2
3 Ergebnisse
3.1Zeitverlauf der Viabilität der Langerhanszellen in der Kultur:
3.2Qualitativer Nachweis der Apoptose durch Elektronenmikroskopie
3.2.1Beschreibung der Bilder
3.2.2Elektronenmikroskopische Bilder
3.3Nachweis und quantitative Bestimmung der Apoptose von Langerhanszellen
3.4Immuncytologische Untersuchungen
3.4.1APAAP-Färbungen-Bilder
3.4.1.1Durchführung der Fotografien
3.4.1.2Beschreibung der Bilder
3.4.1.3Fotografien
4 Diskussion
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Anhang: Materialiensammlung
A.1Geräte
A.2Medien
A.3Cell Death Detection ELISA (CDDE)-Kit (Boehringer Mannheim)
A.4Immuncytochemie
A.4.1Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP)
A.5Zellanreicherung
A.6Elektronenmikroskopie
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung der APAAP-Technik
Abbildung 2: Schematisches Diagramm der amplifizierten APAAP-Technik
Bild A: Frisch migrierte Langerhanszelle Vergrößerung: 6969×
Bild B: Überlebende Langerhanszelle in längerer Kultur Vergrößerung: 9000×
Bild C: Initiale Apoptose bei einer Langerhanszelle Vergrößerung: 11625×
Bild D: Fortgeschrittene Apoptose bei einer Langerhanszelle Vergrößerung: 11625×
Bild E: Apoptotisches Fragment einer Langerhanszelle Vergrößerung: 25050×
Bild 1 Leerversuch Tag 1 Vergr. 1000×
Bild 2 HLA-DR Tag 1 Vergr. 1000×
Bild 3 CD 1a Tag 1 Vergr. 1000×
Bild 4 CD 1a Tag 7 Vergr. 1000×
Bild 5 CD 1a Tag 12 Vergr. 1000×
Bild 6 CD 80 Tag 1
Bild 7 CD 86 Tag 1
Bild 8 bcl-2 Tag 1
Bild 9 bcl-xl Tag 1
Bild 10 bax Tag 1
Bild 11 CD 95 Tag 1
Bild 12 CD 95 Tag 7
Bild 13 CD 95 Tag 12
Bild 14 CD 95-L Tag 1

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Sep 14 13:13:48 2001