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1  Einleitung

Leishmaniosen sind parasitäre Erkrankungen, verursacht durch protozoische Flagellaten, die von Sandmücken der Genera Phlebotomus (Alte Welt) und Lutzomyia (Neue Welt) übertragen werden (Killick-Kendrick 1990). In 88 Ländern finden sich Endemiegebiete. Etwa 350 Millionen Menschen, vor allem in unterentwickelten Ländern, sind durch die Krankheit bedroht, wobei mit 1,5 bis 2 Millionen Neuinfektionen pro Jahr gerechnet wird (Herwaldt 1999). Leishmanien sind dimorphe Protozoen, die sich in zwei unterschiedlichen morphologischen Stadien präsentieren: Die Promastigote ist spindelförmig mit zentralem Nukleus, einem Kinetoplasten sowie einem anterioren Flagellum; sie kommen im Intestinaltrakt des Vektors und in der Kultur vor. Die obligat intrazelluläre Amastigote ist rund bis oval und ohne externes Flagellum; sie vermehrt sich in den Makrophagen und Monozyten des Säugetierwirtes (Ashford 2000, Wiese 2003).

In Abhängigkeit von Immunkompetenz und genetischer Disposition des Wirtes sowie Spezies und Virulenz des Parasiten kommt es zu sehr unterschiedlichen klinischen Bildern, von der selbstlimitierenden lokalen kutanen Leishmaniose (Orientbeule, CL) über disseminierte (DCL) oder mukokutane Formen (Espundia, MCL) bis hin zur viszeralen Leishmaniose (Kalar Azar, VL), die unbehandelt in aller Regel fatal verläuft, sowie deren Spätform, der Post-Kalar Azar-dermalen Leishmaniose (PKDL) (Karplus 2002).

Leishmania gehört zur Ordnung Kinetoplastida und zur Familie Trypanosomatidae. Man unterscheidet die zwei Untergattungen Leishmania und Viannia sowie Komplexe, die verschiedene Spezies zusammenfassen (Abb. 1). Zur Zeit sind 30 Spezies bekannt, von denen 21 Erkrankungen beim Menschen verursachen (Ashford 2000). Man unterteilt grob in viszerotrope (L. donovani-Komplex) und dermatotrope Leishmaniaspezies (alle übrigen)(Ashford 2000). Infektionen mit dermatotropen Stämmen gehen meist mit lokalen kutanen Läsionen (CL) einher. Einige Spezies wie L. aethiopica, L. amazonensis und L. mexicana führen unter speziellen immunologischen Voraussetzungen von Seiten des Wirts zu disseminierter kutaner Leishmaniose (DCL)(Velasco 1989). Eine


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Abb. 1: Taxonomie von Leishmania


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Absiedelung der Erreger in die nasopharyngealen Schleimhäute nach vorangegangener lokalisierter kutaner Läsion (MCL) ist für L. braziliensis und seltener für L. panamensis beschrieben (Corredor 1990). Es gibt zahlreiche Ausnahmen zu dieser Einteilung, insbesondere seit der Ausbreitung des HI-Virus in Leishmaniose-Endemiegebieten (Pratlong 1995). So treten bei Patienten mit HIV/Leishmania-Koinfektion selten kutane Läsionen auf. Hier kommen vor allem disseminierte Formen vor, die durch L. infantum (Jimenez 1991), L. major (Gillis 1995) und L. braziliensis (Rodrigues Coura 1987) hervorgerufen werden. In der Regel führt eine Infektion mit dermatotropen Spezies beim Immunsuprimierten gleich zu einer VL ohne vorheriger kutaner Läsion (Pratlong 1995).

Das äthiologische Agens der viszeralen Leishmaniose wird als Gruppe von Spezies im Leishmania donovani-Komplex zusammengefasst. Dieser besteht aus L. donovani Ross 1903, L. infantum Nicolle 1908, L. chagasi Cunha, Chagas 1937 und L. archibaldi Castellani, Chalmers 1919. Taxonomische Untersuchungen haben die Differenzierung zwischen L. infantum und L. donovani mit Hilfe der Isoenzymelektrophorese bestätigt (Rioux 1990). Im Gegensatz dazu ließ sich mit keiner Methode der taxonomischen Diskriminierung ein Unterschied zwischen L. infantum und L. chagasi finden, weswegen diese Spezies als identisch betrachtet werden, und deren Unterteilungnach rein geografischen Gesichtpunkten vorgenommen wird (L. chagasi: ‚Neue Welt’ (Lateinamerika); L. infantum: ‚Alte Welt’) (Mauricio 2000). Die Existenz einer dritten Spezies innerhalb des L. donovani-Komplexes, L. archibaldi, ist umstritten. Ebenfalls unklar ist das Verhältnis afrikanischer L. donovani-Arten zu denen aus Indien. Prinzipiell finden sich innerhalb der Spezies L. donovani sensu stricto sehr viel mehr genetische Unterschiede als innerhalb der Spezies L. d. infantum; es zeichneten sich in der Vergangenheit mehrere genotypische Subspezies von L. d. donovani ab, die offensichtlich in ihrer Taxonomie weitgehend ihrer geografischen Verbreitung entsprechen (Eisenberger 1999, Mauricio 2001, El Tai 2001).

1.1 Methoden zur Differenzierung von Spezies und Subspezies

Während die Differenzierung von Spezies oder Spezieskomplexen für Fragen der Diagnose, Prognose und Therapie meist ausreicht, erfordern populationsgenetische und epidemiologische Fragestellungen eine weitere Unterteilung in Subspezies. Weder [Seite 4↓]die Mikroskopie mit Giemsafärbung noch die Kultivierung von Promastigoten trägt zur Speziesbestimmung bei, da sich die verschiedenen Leishmanienspezies morphologisch nicht voneinander unterscheiden lassen (Herwaldt 1999). Lumsden schlug hierzu eine Unterteilung zwischen extrinsischen und intrinsischen Kriterien vor: Extrinsische Kriterien beinhalten das klinische Bild, die geografische Verteilung und das Verhalten des Erregers in Kultur, im Vektor und in Versuchstieren; intrinsische Kriterien umfassen immunologische, biochemische und molekularbiologische Aspekte (Lumsden 1974). Bis vor kurzer Zeit wurde für medizinische Zwecke eine Klassifizierung der Erreger hauptsächlich an extrinsischen Kriterien festgemacht. Durch zunehmenden Reiseverkehr und klimatische Veränderungen treten Erkrankungen mehr und mehr in Nichtendemiegebieten auf (Yoshida 1990, Ashford 2000). Zum Teil identische Krankheitsbilder durch unterschiedliche Leishmanienkomplexe macht die Speziesdifferenzierung an Hand dieser Kriterien ebenso schwierig wie die atypischen Verläufe bei Immunsuppression des Wirts (Pratlong 1995). Des weiteren sind Regionen beschrieben, in denen mehr als eine Leishmanienspezies endemisch ist, was eine eindeutige Zuordnung zumindest geografisch unmöglich macht. So finden sich in Nordafrika sowohl L. infantum als auch L. major und L. tropica. Im östlichen Afrika wie auch im Mittleren Osten werden Regionen beschrieben, in denen diese drei Spezies zusammen mit L. donovani auftreten können (Desjeux 2001, Oskam 1998).

Zur Differenzierung zwischen wie auch innerhalb verschiedener Leishmanienspezies sind eine ganze Reihe mehr oder minder effizienter Methoden entwickelt worden. Diese umfassen unter anderem die Analyse von Isoenzymmustern (Rioux 1985), serologische Analysemethoden mittels monoklonaler Antikörper (Grimaldi 1987), chromosomale Polymorphismen (Dujardin 1995 a), die PCR-Amplifikation von Kinetoplasten-Minicircle-DNS (de Bruijn 1992), das sogenannte ‚PCR-Fingerprinting’ (Schönian 1996), die Untersuchung von spezifischen PCR-Amplifikaten unter anderem durch die Analyse von Fragmentlänge (‚Amplified fragment length polymorphism’, AFLP), Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) oder ‚Single-strand conformation polymorphism’ (SSCP) (Orita 1989) verschiedener ‚Multi-copy’-Zielsequenzen (Mini-Exon(spliced leader-RNS)-Gen (Fernandes 1994, Harris 1998), gp63-Region (Mauricio 2001), ssu-rRNS-Region (van Eys 1992), Cysteinproteinase B (Dujardin, in Press) und ‚Internal transcribed spacer’(ITS)-Region (Cupolillo 1995)) und die Analyse von Mikrosatellitenlängenpolymorphismen (Rossi 1994, Russel 1999, Bulle 2002).


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Goldstandard für Leishmaniendifferenzierung in Spezies und Subspezies, in sogenannte ‚Zymodeme’, ist derzeit die Isoenzymanalyse (‚Multilocus isoenzyme electrophoresis’ (MLEE)). Sie setzt die erfolgreiche Kultivierung des Erregers voraus und ist nur in Speziallabors durchführbar. Der enorme Arbeits- und Zeitaufwand macht eine Analyse großer Probenzahlen unmöglich. Ein weiteres Problem ist auch, dass die MLEE einen Phänotyp charakterisiert. So bleiben Substitutionen einzelner Basenpaare, sofern sich die kodierte Aminosäure nicht ändert (sogenannte ‚synonymous sites’), unbemerkt; des weiteren werden Veränderungen nicht exprimierter Strukturen ebenso wenig erkannt wie Mutationen in nicht kodierenden Bereichen. Posttranslationale Modifikationen dagegen können, zum Beispiel durch veränderte Umweltbedingungen, während der Kultivierung die Elektrophoresemobilität eines Enzyms trotz identischen Genotyps verändern. Nur Mutationen, die auf die Aminosäuresequenz der kodierten Enzyme Einfluss nehmen (‚nonsynonymous sites’), unterliegen der Selektion, was die Eignung der MLEE zu taxonomischen Untersuchungen einschränkt. So korreliert die Zymodemeinteilung nicht mit genotypisch vorgenommenen Differenzierungen von Subspezies (Oskam 1998, Schönian 2001). Eine Alternative hierzu ist die PCR-RFLP-Analyse der ITS-Region (Cupolillo 1995), mit der auf einfache Weise die Speziesbestimmung vorgenommen werden kann. Eine Unterteilung in Subspezies ist aber nur sehr eingeschränkt möglich. Weder die Karyotypisierung noch die äußerst sensitiven PCR-Methoden zur Amplifikation von Minicircle-kDNS, mit der Stämme sogenannten ‚Schizodemen’ zugeordnet werden, können zuverlässig zur Differenzierung innerhalb einer Spezies beitragen, da sie schlecht reproduzierbare Ergebnisse liefern (Kebede 1999, Guerbouj 2001, Noyes 1998). Verfahren zur Differenzierung des Genotyps auf Basis einer Amplifikation von Parasiten-DNS direkt aus dem Gesamtgenom haben den entscheidenden Vorteil, dass eine Kultivierung der Parasiten nicht notwendig ist. Ausnahme bildet das PCR-Fingerprinting, das mit unspezifischen Einzelprimern durchgeführt wird, denn diese amplifizieren auch die DNS anderer Herkunft wie beispielsweise humane DNS. So überlagern die Banden eventueller DNS-Kontaminationen das spezifische Muster der Leishmanien-DNS, was dazu führt, dass dieses nicht zu interpretieren ist (Noyes 1996).
Die MLEE hat gezeigt, dass im mediterranen Becken das Zymodem MON-1 über 80 Prozent der L. infantum-Stämme ausmacht (Moreno 1986, Pratlong 1995), was populationsgenetische wie auch epidemiologische Untersuchungen unmöglich macht (Bulle [Seite 6↓]2002). Durch Amplifikation und anschließende SSCP- oder RFLP-Analyse verschiedener ‚Multi-copy’-Gene, wie Cysteinproteinase B-Gen (Quispe, in Press), Mini-Exon-Gen (Harris 1998) und gp63-Region (Mauricio 2001), ist einer Differenzierung innerhalb dieses Zymodems möglich. Die Analyse variabler Mikrosatellitensequenzen stellt eine vielversprechende Alternative zu dieser Methode dar (Russel 1999, Jamjoom 2002 b).

1.2 Variable Mikrosatellitensequenzen als epidemiologische Marker

Mikrosatelliten (‚short tandem repeats’, STR) sind kurze, repetitive Sequenzmotive von ein bis sechs Basenpaaren Länge, die ubiquitär in prokaryontischen und eukaryontischen Genomen selbst sehr primitiver Organismen verteilt sind (Field 1996). Sie weisen eine überdurchschnittlich hohe Mutationsrate im Bezug auf die Anzahl der Wiederholungen des repetitiven Elements und somit Längenpolymorphismen auf (Ellegren 2000 a). Während die Mutationsrate der eukaryotischen DNS-Sequenz mit ungefähr 1:109 Bp pro Generation angegeben wird (Crow 1993), ist diese Rate bei Mikrosatelliten im Bereich von 1:103-104 Bp pro Generation anzusiedeln (Weber 1993). Man geht davon aus, dass sich dieses Phänomen auf eine Dissoziation und versetzte Rehybridisierung der DNS-Polymerase an den Templatestrang innerhalb des Mikrosatellits zurückführen lässt. Dies hat zur Folge, dass sich ein ‚Frameshift’-Intermediat bildet, das je nach Richtung des Fehlanlagerns der Polymerase entweder auf Primer- oder auf Templateseite einen extrahelikalen Anteil mit dem repetitiven Element aufweist (Abb. 2). Wird dieser bis zur nächsten Replikation nicht entweder durch die 3’-5’ Exonukleaseaktivität der Polymerase, deren Effektivität mit zunehmender Repeatzahl kontinuierlich abnimmt (Kroutil 1996), oder durch das zelluläre ‚Missmatch repair’-System (MMR) korrigiert, kommt es zu einer fixierten Veränderung in der Anzahl der Wiederholungen und somit der Länge des Mikrosatelliten (Gragg 2002).

Andere Hypothesen zu möglichen Mechanismen, die zu einer Änderung der Mikrosatellitenlänge führen könnten, haben sich bisher nicht bestätigen lassen. So ist es theoretisch möglich, dass Längenpolymorphismen durch interchromosomalen Austausch im Sinne von ungleichem ‚Crossing-over’ verursacht sein könnten. Es zeigte sich aber kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit von Mutationen an Mikrosatelliten zwischen hemizygoten Chromosomen und Chromosomenpaaren (Autosomen), was darauf


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Abb. 2: angenommener Mutationsmechanismus bei Mikrosatelliten

schließen lässt, dass zu einer Veränderung in der Mikrosatellitenlänge kein Kontakt zwischen homologen Chromosomen notwendig ist (Heyer 1997).

Untersuchungen zu Mutationsraten bei Modifikationen im zellulären MMR-System (Gragg 2002) wie auch die Tatsache, dass beim Menschen Mutationen in diesem Enzymsystem eine Kanzerogenese durch Mikrosatelliteninstabilität begünstigen (Ho 2000, Lawes 2003), sprechen ebenfalls dagegen, dass der Mechanismus des interchromosomalen Austausches bei Mutationen an Mikrosatelliten eine wichtige Rolle spielt.

Da sich die flankierenden Regionen von Mikrosatelliten in ihrer Sequenz als stabil erwiesen haben, eignen sich Primerpaare, die eine repetitive Sequenz umspannen, ausgezeichnet für taxonomische und populargenetische PCR-Marker. Eine Sequenzierung der amplifizierten Fragmente ist nicht erforderlich, da sich die Allele vor allem [Seite 8↓]durch Längenpolymorphismen unterscheiden, also allein durch Gelelektrophorese oder Fragmentanalyse differenziert werden können.

Entscheidender Nachteil der Einteilung von Leishmaniaspezies in Mikrodeme ist der enorme Aufwand, den das Design von Primerpaaren mit sich bringt. Es hat sich gezeigt, dass Marker, die für eine Spezies entwickelt wurden, nicht ohne weiteres auf eine andere übertragbar sind (Jamjoom 2002 a). Entweder wird dann kein PCR-Produkt erhalten, oder die amplifizierten Mikrosatelliten sind monomorph und viel kürzer als die der Ursprungsspezies und eignen sich somit nicht für taxonomische Untersuchungen.

So wurden an Hand des sequenzierten L. major-Genoms 13 für L. major polymorphe Mikrosatellitenmarker entwickelt, von denen aber nur zwei auch für L. donovani polymorph waren (Jamjoom 2002 a). Für L. donovani und L. infantum sind zwei polymorphe Marker beschrieben (Rossi 1994), für Viannia-Spezies drei (Russel 1999). Primerpaare für drei weitere unabhängige Regionen mit insgesamt fünf Mikrosatelliten wurden basierend auf publizierte L. major-Sequenzen beziehungsweise der ITS-Region für L. infantum entwickelt (Bulle 2002). Allerdings sind mit solch kleinen Markersätzen wegen dem Phänomen der Homoplasie nur sehr eingeschränkt taxonomische oder populationsgenetische Studien innerhalb einer Spezies möglich (Winter 1998); wünschenswert wären hierzu zehn bis 20 unabhängige Primerpaare je Spezies (Ruzzante 1998).

Dementsprechend wurden kürzlich 20 polymorphe Marker für L. donovani entwickelt (Jamjoom 2002 b). Für L. infantum liegen im Moment nicht ausreichend polymorphe Marker vor; das Potential der Mikrosatellitenanalyse wurde aber auch für diese Spezies gezeigt (Bulle 2002).

1.3 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Leishmania infantum/chagasi gilt alseine ausgesprochen uniforme Leishmanienart, im Gegensatz zu L. major oder besonders L. tropica, die sich sowohl mit phänotypischen als auch mit genotypischen Methoden als weit heterogener darstellen. Bei L. infantum wurden zwar auch unterschiedliche Enzymmuster bestimmt, die auch zum Teil mit der Klinik der Erkrankung korrelieren, weltweit dominieren jedoch Stämme des Zymodems MON-1 in allen endemischen Gebieten vom östlichen Mittelmeerraum bis nach Süd[Seite 9↓]­amerika (Minodier 1997). Diese MON-1 Stämme verursachen sowohl kutane als auch viszerale Leishmaniose (Guerbouj 2001) und sind auch bei HIV-Koinfektionen beteiligt. Atypische Verläufe bei Patienten mit HIV/Leishmaniose-Koinfektion wie auch das Auftreten von nicht endemischen Stämmen in diesem Patientengut nehmen speziell im südlichen Europa zu (Pratlong 1995). Bei Hunden, die als Reservoir für L. infantum bekannt sind und eine wichtige Rolle bei der Übertragung dieser Parasiten spielen, wurden bisher fast ausschließlich Stämme des Zymodems MON-1 isoliert (Pratlong 1995). Wie die Transmission der nicht-MON-1 Stämme erfolgt und welche Reservoirwirte daran beteiligt sind, ist bisher noch völlig offen. Bei drogenabhängigen HIV-Patienten wird auch eine anthroponotische Übertragung diskutiert (Alvar 1994). Ob Leishmanioseerkrankungen bei Immunsupprimierten auf die Reaktivierung einer latenten Infektion oder aber auf eine Neuinfektion zurückzuführen sind, ist bisher unbekannt. So wurde auch bei gesunden Blutspendern Leishmanien im Blut nachgewiesen (le Fichoux 1999). Für die Klärung dieser und anderer epidemiologischer Fragen sind besser diskriminierende und einfacher durchzuführende Methoden dringend notwendig. Die Isoenzymanalyse ist zu zeit- und arbeitsintensiv und bietet nur eine unzureichende Stammdifferenzierung. Verschiedene molekulare Techniken, wie PCR-Fingerprinting (Kokozidou 2002) oder PCR-SSCP von anonymen Markern (El Fari, persönliche Mitteilung), konnten Stämme von L. infantum ebenfalls nicht ausreichend diskriminieren. Bulle et al. (2002) konnten jedoch zeigen, dass eine hohe Auflösung unterschiedlicher L. infantum- Stämme mit Hilfe polymorpher Mikrosatellitensequenzen erreicht werden kann. Allerdings war die Anzahl von Sequenzen, die von diesen Autoren untersucht wurde, sehr gering und auch nicht alle dieser Marker waren unabhängig voneinander. Da bei Mikrosatellitenmarkern auf Grund ihrer speziellen Evolution die Gefahr von Homoplasie besonders groß ist, sind statistisch gesicherte Werte erst bei Verwendung von 10 - 20 voneinander unabhängiger, nicht gekoppelter Marker zu erwarten (Ruzzante1998).

Ziel dieser Arbeit war es, für Leishmania d. infantum einen für epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen ausreichend großen Satz von Mikrosatellitenmarkern zu entwickeln. Aus der Literatur (Jamjoom 2002 a) und Vorarbeiten der Forschungsgruppe (Schönian, persönliche Mitteilung) war bekannt, dass dafür die im Leishmania major-Genomprojekt publizierten Sequenzen nur im Ausnahmefall nutzbar waren. Mikrosatellitensequenzen, die bei L. major polymorph waren, ließen sich bei Stämmen von L. infantum entweder gar nicht amplifizieren oder waren monomorph und [Seite 10↓]wesentlich kürzer. Aus diesem Grund sollte für die Identifizierung variabler Mikrosatelliten bei L. infantum zunächst eine angereicherte genetische Bibliothek erstellt werden. Ein publiziertes Protokoll (Bloor 2001) sollte für einen Stamm des Zymodems MON-1 aus dem mediterranen Becken adaptiert werden. Mikrosatellitenenthaltende Klone sollten sequenziert und anhand der angrenzenden Sequenzen spezifische Primerpaare entwickelt werden. Unterschiede in der Anzahl der Mikrosatelliten sollten dann in der Polyacrylamidgelelektrophorese anhand ausgewählter Zymodeme des L. donovani-Komplexes, insbesondere von L. infantum, nachgewiesen werden. Ein besonderes Ziel war es dabei, Marker zu entwickeln, die Stämme innerhalb des Zymodems MON-1 unterscheiden können. Weiterhin sollte das Protokoll für angereicherte Mikrosatellitenbibliotheken so standardisiert werden, dass es leicht auf andere Parasiten- und Wirtsarten übertragen werden kann.


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01.02.2005