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2 .Material und Methoden

2.1 Präparation der DNS

Zur Präparation der parasitären DNS wurden die frischen Zellen aus der Kultur bei 3000 rpm für 30 min abzentrifugiert und das Pellet in 1 ml Lysispuffer (50 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8, 50 mM Tris-HCl pH 7,4) aufgenommen. Nach Zugabe von 25 µl 20% SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde leicht geschüttelt, bis die Lösung viskös wurde. Dann wurden 10 µl RNAse (10 mg/ml, Sigma) zugegeben und bei 60°C 30 min inkubiert. Nach Zugeben von 5,5 µl Proteinase K (20 mg/µl, Merk) wurde erneut bei 60°C über Nacht inkubiert.

Am nächsten Tag wurde 1 ml gepuffertes Phenol (Roth) zugesetzt, 5 min geschwenkt und 10 min bei 13 200 rpm zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt. Zu dieser wurden 500 µl Phenol und 500 µl Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 (Roth) gegeben, erneut 5 min geschwenkt, 10 min zentrifugiert und die wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt. Diese Schritte wiederholten sich nochmals nach Zugabe von 1 ml Chloroform (Roth), wobei beim Abpipettieren der wässrigen Phase deren Volumen bestimmt wurde.

Es wurden 0,1 Vol 3 M Na Acetat und 1 Vol Isopropanol zugegeben und zur Fällung der DNS bei 4°C für 1 h inkubiert. Nach 30 min Zentrifugation bei 13 200 rpm wurde die Flüssigkeit abgegossen und das Pellet in 70% Ethanol gewaschen. Darauf wurde erneut 15 min zentrifugiert, der Alkohol entfernt und das DNS-Pellet im Speed Vac für 8 min bei 30°C getrocknet. Abschließend wurde mit 200 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) resuspendiert. Die so erhaltene DNS wurde bei 4°C gelagert. Die Konzentration sowie die Reinheit der DNS wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers bei λ1=260 und λ2=280 bestimmt. Dabei wurden 5 µl der Probe mit 95 µl BDH verdünnt.


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2.2  Erstellen einer mit Mikrosatelliten angereicherten Genbibliothek

Die Konstruktion der Bibliothek basierte auf einem Protokoll von Bloor et al. (2001). Die DNS des ausgewählten Leishmanienstammes (MHOM/ES/93/PM1, MON-1) wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 verdaut und ein Adaptor, bestehend aus zwei Oligonukleotiden Oligo A (21 Bp) und Oligo B (25 Bp), an die beiden Enden der dabei entstandenen Fragmente ligiert. Der gesamte Ansatz wurde neben einer 1kB-Leiter auf ein Agarosegel aufgetragen. Der Bereich zwischen 400 und 1000 Bp wurde ausgeschnitten und aufgereinigt. Eine Anreicherungsprozedur mit biotinylierten Oligonukleotiden, gebunden an M-280 Dynabeads, wurde durchgeführt, und die so erhaltenen Fragmente durch anschließende PCR mit Oligo A als Primer amplifiziert. Nach Aufreinigung wurden die Produkte in einen Vektor ligiert und anschließend in kompetente Zellen transformiert. Die Zellsuspension wurde auf mit X-gal, IPTG und Ampicillin präparierte LB-Agar-Platten ausplatiert und im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die positiven Klone wurden auf Ampicillin enthaltenden LB-Platten überführt.

2.2.1 Präparation des Adaptors

Ein Gemisch von je 10 µl von 200 µM Lösung der Oligonukleotide Oligo A (5’ GGC CAG AGA CCC CAA GCT TCG 3’) und Oligo B (5’ PO4 - GAT CCG AAG CTT GGG GTC TCT GGC C 3’), dessen 5’-Ende der spezifischen Sau3A1-Restriktionsschnittstelle entspricht (Abb. 3), (Refseth 1997) wurde bei 80°C für 5 min denaturiert und anschließend 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurden mit 60 µl BDH aufgefüllt (entspricht einer Endkonzentration von 25 pmol/µl), Aliquots hergestellt und diese bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.

2.2.2 Verdau und Adaptorligation

In einem Digestionsansatz von 90 µl wurden 9 µl 10 x Restriktionsenzym-Puffer (New England BioLabs), 4 µl DNS (2368 ng/µl, entspricht 9,472 µg), 0,9 µl bovines Serum-[Seite 13↓]

Abb. 3: Sau3A1-spezifischer Adaptor und seine Bestandteile

albumin x 100 (New England BioLabs) und 10 µl Sau3A1 (4000 U/ml, New England BioLabs) 2 h bei 37°C inkubiert. Das Restriktionsenzym wurde danach durch Erwärmung auf 65°C für 10 min inaktiviert.

Für die Ligation des Adaptors an die so entstandenen Fragmente wurden 20 µl 10 x Ligasepuffer, 10 µl T4-DNA-Ligase (400 U/µl, New England BioLabs) und 50 pmol Adaptor beigefügt und mit BDH auf 200 µl aufgefüllt. Der Ligationsansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, die Ligase danach durch Erwärmung auf 65°C für 10 min inaktiviert.

2.2.3 Größenselektion der Fragmente und Probe-PCR

Der 200 µl Ligationsansatz wurden zusammen mit 40 µl Ladepuffer x 6 (50% Glycerin, 0,1 g/100 ml Bromphenolblau, 0,1 M EDTA pH 8, 10 mM Tris-HCl pH 8) neben 10 µl einer 1kb-Leiter (Invitrogen) auf ein Agarosegel (1,5 g/100 ml 1 x TBE-Puffer (Sambrook 1989)) aufgetragen. Nach ca 1 h bei 80 V wurde das Gel für 10 min in Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml) gefärbt. Die Größenfraktion zwischen 400 und 1000 Bp wurde unter UV-Transillumination bei λ=312 nm mit einem Skalpell aus der Agarose exzidiert, in Stücke zu maximal 400 µg aufgeteilt und in vorher abgewogene Eppendorfgefäße [Seite 14↓]überführt. Zur Aufreinigung der DNS-Fragmente wurde der QIAquick Gelextraktionskit (Qiagen) gemäß dem beiliegenden Standardprotokoll verwendet. Eluiert wurde mit 30 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). Die so erhaltenen Eluate (5 x ca 28 µl) wurden zusammen auf eine Microcon YM-50 spin column (Millipore) aufgetragen, bei 13 000 rpm für 4 min zentrifugiert, der Durchfluss verworfen und die DNS von der umgedrehten spin column durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 1 min in ein neues Eppendorfgefäß überführt, was etwa 13 µl DNS-Konzentrat ergab.

Die erfolgreiche Ligation an den Adaptor sowie die Größenselektion wurden mit einer Test-PCR überprüft: Ein mit Mineralöl (Sigma) überschichteter Reaktionsansatz von 25 µl mit 2,5 µl 10 x Puffer (Roche), 200 µM je dNTP (Amersham Biosciences), 2 mM MgCl2, 25 pmol Oligo A, 0,2 µl Taq-polymerase (Amplitaq, 5 U/µl, Roche) und 0,5 µl konzentrierten DNS-Fragmenten wurde nach 10 min Denaturierung bei 95°C in 35 Zyklen von je 95°C für 30 s, TA=56°C für 30 s und 72°C für 1 min amplifiziert. Nach einer terminalen Elongation bei 72°C für 6 min wurde das Amplifikat auf 4°C heruntergekühlt. 10 µl PCR-Produkt wurden dann neben einer 1kb-Leiter (10 µl) auf ein Agarosegel (1,2 g/100 ml 1 x TBE-Puffer) aufgetragen (Abb. 4).

Abb. 4: Ein Schmier im Bereich von 400 bis 1000 Bp spricht für erfolgreiche Adaptorligation und Größenselektion.


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2.2.4  Anreicherung von Mikrosatelliten enthaltenden Fragmenten

In einem 1,5 ml-Eppendorfgefäß wurden 100 µl mit Streptavidin beschichtete M-280 Dynabeads (10 mg/ml, Dynal) zweimal in 100 µl 1 x Washing/Binding(W/B)-Puffer (1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5) gewaschen. Waschen soll im Weiteren bedeuten, dass das Reaktionsgefäß in einem magnetischen Ständer platziert wird, so dass die Beads sich an der dem Magneten zugewandten Seite des Gefäßes ansammeln. Daraufhin wird, ohne mit der Pipettenspitze die Beads zu berühren, der gesamte Überstand abgenommen. Das Gefäß wird vom Magneten entfernt und anschließend die Dynabeads mit dem jeweiligen Puffer resuspendiert.

Nach dem zweiten Waschschritt wurde in 200 µl 2 x W/B-Puffer (2 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5) resuspendiert, 2 µl 3’-biotinyliertes Oligonukleotid (GT)10 (100 pmol/µl) zugegeben und mit BDH auf 400 µl aufgefüllt (Ansatz 1). Das Reaktionsgefäß wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 10 min leicht geschüttelt wurde.

In einem PCR-Reaktionsgefäß wurden währenddessen 15 µl 20 x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat), 10 µl konzentrierte DNS-Fragmente und 20 pmol Oligo A in einem Ansatz von 50 µl vorbereitet (Ansatz 2).

Daraufhin wurde Ansatz 1 einmal mit 400 µl 1 x W/B-Puffer und zweimal mit 400 µl 6 x SSC gewaschen und mit 50 µl 6 x SSC resuspendiert. Der Ansatz wurde in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und bei Thyb =55°C inkubiert.

Im Thermocycler wurde folgendes Programm für Ansatz 2 eingegeben: 95°C für 10 min, Thyb=55°C für 30 min und 70°C für 2 h. Sobald das Thermocyclerprogramm auf die Hybridisierungstemperatur Thyb herunterkühlte, wurde der ebenfalls auf dieser Temperatur gehaltene Ansatz 1 aufgeschüttelt und vollständig dazugegeben, um ein Anlagern der einzelsträngigen DNS an die vorher an die Avidin-Beads gebundenen biontinylierten (GT)10-Oligonukleotide zu ermöglichen. Während des weiteren Programms wurde regelmäßig das Gefäß leicht geschüttelt, um ein Absetzen der Dynabeads zu verhindern.

Nach 2 h Inkubation bei 70°C wurden die Dynabeads mit dem Magneten separiert, zügig vom Überstand befreit, in 100 µl 2 x SSC resuspendiert und das Gemisch in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt. Es folgten 4 Waschschritte mit 2 x SSC und 4 Waschschritte mit 1 x SSC. Hierbei wurde jeweils 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor der Magnet angelegt und der Überstand abgenommen wurde.


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Nach Resuspension in 100 µl 1 x SSC wurde der Ansatz in vier Aliquots zu je 25 µl aufgeteilt und zu jedem 250 µl 1 x SSC hinzugefügt. Nach 10 min Inkubation bei Hybridisierungstemperatur Thyb=55°C wurden die Beads mit dem Magneten separiert, rasch vom Überstand befreit und 30 s mit 400 µl 1 x TE sowie 30 s mit 400 µl 50 mM NaCl gespült. Nach abschließender Resuspension mit BDH sollte die Beadkonzentration 5 µg/µl betragen. Diese Suspension diente in der darauf folgenden PCR als Template.

In zwei Experimenten wurde ein zusätzlicher Arbeitsschritt durchgeführt, in dem die so angereicherte DNS nach der Hitzedenaturierung eluiert und anschließend mit Hilfe des QIAquick PCR-Reinigungskits (Qiagen) nochmals aufgereinigt wurde, um zu verhindern, dass bei der anschließenden PCR die (GT)10-Oligonukleotide störend einwirken könnten. Dabei wurde die Beadsuspension 5 min bei 90°C inkubiert und zügig vom Überstand befreit. Dieser Vorgang wurde nach Resuspension mit 50 µl BDH wiederholt (Refseth 1997). Die insgesamt 100 µl DNS-Suspension wurden mittels PCR-Reinigungskit von Oligonukleotidresten befreit (eluiert wurde mit 50 µl BDH). In diesem Falle dienten 10 µl dieses Eluats als Template für die nachfolgende PCR.

2.2.5 PCR, Testelektrophorese und Ligation in p-Drive-Vector

Für die Amplifikation der angereicherten Fragmente wurde ein Reaktionsansatz von 50 µl mit 5 µl 10 x Puffer, 200 µM je dNTP, 2 mM MgCl2, 30 pmol Oligo A, 0,2 µl Taq-polymerase und 8 µl Beadsuspension nach 10 min Denaturierung bei 95°C in 35 Zyklen von je 95°C für 30 s, TA=56°C für 30 s und 72°C für 1 min amplifiziert. Nach einer terminalen Elongation bei 72°C für 30 min wurde das Amplificat auf 4°C heruntergekühlt. 10 µl des PCR-Produkts wurden zur Kontrolle neben einer 1 kb-Leiter (10 µl) aufgetragen. Das übrige PCR-Produkt wurde mit einem MinElute PCR-Reinigungskit (Qiagen) aufgereinigt (Elution mit 10 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5). Zur Ligation wurden 1 µl p-Drive-Vector (Qiagen), 4 µl eluierte PCR-Produkte und 5 µl 2 x Ligationsmastermix (Qiagen) 2 h bei 4°C inkubiert und danach bei –20°C gelagert.
Es ist unbedingt notwendig, die Ligation in den Vektor möglichst bald nach der PCR durchzuführen, da der Vektor einen U-Überhang aufweist, der zur suffizienten Ligation einen A-Überhang von Seiten des Amplifikates voraussetzt. Dieser wird von der Taq-Polymerase erzeugt, ist aber instabil.


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2.2.6  Präparation der Agarplatten

Es wurden ampicillinhaltige LB-Agarplatten sowohl mit als auch ohne X-gal und IPTG hergestellt. Für 1 l (ca 40 Platten) wurden 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Yeast und 10 g NaCl eingewogen und mit BDH auf 1 l aufgefüllt. Nach Zusatz von 15 g Bacto-Agar wurde autoklaviert, das Gemisch auf 50°C abgekühlt und 100 mg Ampicillin (Roth) sowie eventuell 80 mg X-Gal (80 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galactosidase gelöst in 1600 µl N,N’-dimethyl-Formamid) und 0,5 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, Roth) zugegeben. Nach dem Gießen wurden die Platten mindestens 30 min bei Raumtemperatur zur Aushärtung stehen gelassen und danach bis zum Gebrauch bei 4°C gelagert.

Für LB-Medium wurden lediglich Bacto-Trypton (10 g), Bacto-Yeast (5 g) und NaCl (10 g) mit H2O auf 1 l aufgefüllt und autoklaviert.

2.2.7 Transformation in kompetente E. coli-Bakterien

50 µl kompetente Zellen (EZ-Competent Cells, Qiagen) wurden auf Eis aufgetaut und mit 2 µl des Ligationsansatzes versetzt. Das Gefäß wurde 5 min auf Eis, 30 s bei 42°C und danach erneut 2 min auf Eis gehalten. Nach Zugabe von 250 µl SOC-Medium (Qiagen) bei Raumtemperatur wurden je 50 µl der Zellsuspension zusammen mit 50 µl LB-Medium auf mit Ampicillin, X-Gal und IPTG präparierten Platten ausgestrichen. Diese wurden 18 h bei 37°C inkubiert.

Positive (weiße) Kolonien wurden mit sterilen 200 µl-Pipettenspitzen oder autoklavierten Zahnstochern auf ampicillinhaltige Platten überführt, ebenfalls 18 h bei 37°C inkubiert und mit Nummern versehen. Danach wurden die Platten bei 4°C gelagert.


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2.3  Screening der Kolonien nach (GT)10-positiven Klonen und Aufbereitung zur Sequenzierung

Zur Identifizierung (GT)10-positiver Klone wurde in einem Reaktionsansatz von 25 µl eine Kolonie-PCR durchgeführt, wobei intakte E. coli-Bakterien aus den positiven Kolonien mit Zahnstochern oder Pipettenspitzen von der Platte in die Reaktionsgefäße überführt wurden. Zusätzlich zu den Standardprimern M13R (5’ AAC AGC TAT GAC CAT G 3’) und M13F (5’ GTT TTC CCA GTC ACG AC 3’) wurde ein Oligonukleotid mit repetitiver Sequenz (5’ ACA CAC ACA CAC ACA CAC AC 3’) als Primer zugegeben (Jamjoom 2002 b). Der 25 µl-Ansatz mit 2,5 µl 10 x Puffer, 200 µM je dNTP, je 5 pmol M13F, M13R und (AC)10, 0,1 µl Taq-Polymerase und Template wurde nach 10 min Denaturierung bei 95°C in 35 Zyklen von je 95°C für 30 s, TA=52°C für 30 s und 72°C für 1 min amplifiziert. Nach einer terminalen Elongation bei 72°C für 10 min wurde das Amplifikat auf 4°C heruntergekühlt und eine Elektrophorese wie bereits beschrieben durchgeführt.

Die durch Doppelbande als positiv identifizierten Klone wurden auf den Ampicillin-Platten erneut aufgesucht und die klonierte Sequenz mit folgender Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer SEQ_fw24 (5’ ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG 3’) und SEQ_rev23 (5’ TTC ACA CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’) amplifiziert: In einem 50 µl-Ansatz mit 5 µl 10 x Puffer, 200 µM je dNTP, je 10 pmol SEQ_fw24 und SEQ_rev23, 0,2 µl Taq-Polymerase und Template wurde nach 10 min Denaturierung bei 95°C in 35 Zyklen von je 95°C für 30 s, TA=55°C für 30 s und 72°C für 1 min amplifiziert. Nach einer terminalen Elongation bei 72°C für 10 min wurde der Ansatz auf 4°C heruntergekühlt.

Die PCR-Produkte wurden mit einem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen) aufgereinigt (Elution mit 100 µl 10 mM Tris-HCl pH 8,5). Je 5 µl wurden zur Konzentrationsbestimmung auf einem Agarosegel (1,2 g/100 ml 1 x TBE-Puffer) neben 10 µl SmartLeiter (Eurogentec) aufgetragen und für die Sequenzierung verdünnt. Kolonien, die bei dieser PCR in der Elektrophorese Doppelbanden zeigten, wurden unter der Annahme aussortiert, dass es sich um eine Mischkolonie aus zwei oder mehr Klonen handelte. Die Sequenzierung erfolgte kommerziell.


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2.4  Design von Primern für die Amplifizierung spezifischer Mikrosatellitenmarker

Für Klone, die Mikrosatelliten enthielten, wurde, sofern die flankierenden Sequenzen ausreichende Länge aufwiesen, mittels der Primer3-Software (Rozen 1998) Primer für Fragmente mit einer Gesamtlänge von ca 100 Bp entwickelt.

Bei den Sequenzen ohne ausreichend flankierende Regionen wurde eine BLAST (‚Basic local alignment search tool’)-Suche gegen die Datenbank des ‚National Center for Biotechnology Information’ (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) durchgeführt. Bei Suchtreffern in den Genomen anderer Leishmaniaspezies mit repetitiver Sequenz an gleicher Position wurde eine Hybridsequenz aus klonierter auf der einen und gefundener Sequenz auf der anderen Seite des Mikrosatellits gebildet und diese zum Primerdesign genutzt.

2.5 Optimierung der PCR-Bedinungen für die ermittelten Primerpaare

Mit einem Temperaturgradienten von TA=44 – 58°C wurde für jedes Primerpaar die optimale Anealingtemperatur TA mit einem standardisierten Mikrosatelliten-PCR-Programm bestimmt. Dieses beinhaltete einen 50 µl-Ansatz mit 5 µl 10 x Puffer, 200 µM je dNTP, 10 pmol je Primer, 40 ng Leishmanien-DNS und Taq-Polymerase und ein Programm mit anfänglicher Denaturierung von 95°C für 5 min, 35 Zyklen mit 95°C für 30 s, TA für 30 s und Elongation bei 72°C für 1 min sowie einer terminalen Elongationszeit von 10 min bei 72°C gefolgt von Kühlung bei 4°C. Es wurde DNS des klonierten Stammes MHOM/ES/93/PM1 als Template eingesetzt.
Nach Bestimmung von TA wurde für jedes Primerpaar unter den selben Bedingungen die PCR mit DNS-Proben der in Tab. 1 aufgeführten Stämmen durchgeführt. 5 µl der PCR-Produkte wurde zur Kontrolle neben einer 1 kb-Leiter aufgetragen. Die Primerpaare, die bei diesen Stämmen nicht immer zu einem Amplifikat führten, wurden nicht weiter ausgetestet.


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Tab. 1: Stämme des L. donovani-Komplexes, die in dieser Arbeit verwendet wurden (* Speziesbezeichnungen nach MLEE (Pratlong 2001))

 

WHO-Code

Zymodem

Herkunft

Spezies*

1

MHOM/TN/80/IPT1

MON-1

Tunesien

L. infantum

2

MHOM/ES/93/PM1

MON-1

Spanien

L. infantum

3

MHOM/FR/95/LPN114

MON-1

Frankreich

L. infantum

4

MCAN/FR/87/RM1

MON-108

Frankreich

L. infantum

5

MHOM/ES/88/LEM175

MON-198

Spanien

L. infantum

6

MHOM/ES/92/LEM373

MON-199

Spanien

L. infantum

7

MCAN/ES/86/LEM935

MON-77

Spanien

L. infantum

8

MHOM/CN/78/D2

LON-49

China

L. infantum

9

MHOM/SD/97/LEM3472

MON-267

Sudan

L. infantum

10

MHOM/ET/72/GEBRE1

MON-82

Äthiopien

L. archibaldi

11

MHOM/SD/97/LEM3463

MON-258

Sudan

L. archibaldi

12

MHOM/IN/80/DD8

MON-2

Indien

L. donovani

13

MHOM/KE/83/NLB189

-

Kenia

L. donovani

Mit den Sequenzen aller verwendeten Mikrosatellitenmarker wurde eine BLAST-Suche gegen die Datenbank des ‚National Center for Biotechnology Information’ (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/) durchgeführt, um die Lokalisation der amplifizierten Mikrosatelliten innerhalb des Leishmaniengenoms an Hand bereits analysierter Daten anderer Leishmanienspezies festzustellen.

2.6 Testung der Mikrosatellitenmarker auf Längenpolymorphismen

Für die Fragmentlängenanalyse mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurden die PCR-Produkte vom Mineralöl befreit und mittels Speed Vac auf ein Volumen von etwa 20 µl aufkonzentriert. Zur Herstellung des Polyacrylamidgels (12%) von 0,8 mm Dicke wurden beide Platten mit BDH und Alkohol (96%) gereinigt und die Ohrenplatte mit Acrylease (Stratagene) behandelt. Für 150 ml Gel wurden 45 ml gasstabilisiertes Acrylamid Bis-Acrylamid 29:1, 40% (Rothiphorese Gel 29, Roth), 15 ml [Seite 21↓]10 x TBE und 90 ml BDH gemischt. Die Polymerisierung wurde durch die Zugabe von 750 µl APS 10% (Amoniumperoxodisulfat, Merk) und 75 µl Temed (N,N,N’,N’,-Tetramethylethylendiamin, Serva) gestartet. Die Gelplatten wurde in ein vertikales Elektrophoresesystem eingespannt, obere und untere Pufferkammer mit 0,5 x TBE gefüllt und ein Vorlauf bei 10 W für 30 min gestartet. Dann wurden je 8 µl der konzentrierten PCR-Produkten zusammen mit 2 µl Ladepuffer neben 8 µl 10 Bp-Leiter (das entspricht 5,2 µl TE-Puffer pH 8, 1,6 µl Ladepuffer, 1,2 µl 10 Bp-Leiter Stocksolution Standard, Invitrogen) aufgetragen.

Nach 18 h Elektrophorese bei 10 W wurde das Polyacrylamidgel 10 min in Salpetersäure (1%) fixiert und 25 min in Silbernitratlösung (0,2%) gefärbt. Die Gele wurden in 0,28 M Natriumcarbonatlösung, der unmittelbar vor Gebrauch 500 µl mit Methanol stabilisiertes Formalin 37% (500 µl/l, Merk) zugesetzt wurde, entwickelt und in 10% Essigsäure fixiert. Die Gele wurden auf Filterpapier gelegt, im Geltrockner bei 80°C 2 h getrocknet und anschließend eingescant. Die Größe der amplifizierten Mikrosatellitenfragmente wurde mit Hilfe der Bionumerics-Software V 2.5 (Applied Maths BVBA) ermittelt.

Anstelle der aufwendigen PAGE-Analyse in zukünftigen Studien mit Mikrosatellitenmarkern wurde die halbquantitative Analyse der Fragmentlänge mittels Gelelektrophorese in MetaPhor-Agarosegelen (4 g/100 ml TBE, BioWittaker Molecular Applications) für einige Marker erprobt. Hierbei wurde die Agarose langsam in zuvor auf 4°C gekühlten TBE-Puffer unter Rühren zugegeben und 15 min zum Quellen auf 4°C gestellt. Anschließend wurde die Agaroselösung 1 min in der Mikrowelle bei mittlerer Energie erwärmt, erneut 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und schließlich gekocht. Um den Wasserverlust, der durch das lange Kochen bis zur vollständigen Homogenisierung entsteht, exakt ausgleichen zu können, wurde das Gefäß vor und nach dem Erhitzen gewogen. Nach dem Gießen wurde 30 min bei 4°C ausgehärtet.

Es wurden die gleichen Mengen PCR-Produkt und 10 kb-Leiter wie bei der Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetragen und mit 6 V/cm Elektrodenabstand in der Elektrophoresekammer für 3,5 h getrennt. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, die Mikrosatellitenfragmente mittels Eagle Eye-System visualisiert und mit der Bionumerics-Software ausgewertet.


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2.7  Geräte und Dienstleistungen

Folgende Geräte wurden verwendet:

Centrifuge 5415 D

Eppendorf

Concentrator 5301

Eppendorf

Ultrospec III

Pharmacia

Transilluminator TFX

Vilber/Lourmat

Eagle Eye II

Stratagene

RoboCycler Gradient 40

Stratagene

Gene Amp PCR System 9600

Perkin/Elmer

Thermocycler 60

Geltrockner Maxidry D 64

Bio-med

Biometra

Die Synthese sowie die Modifikation von Oligonukleotiden geschah durch die Firma Tib Molbiol, Berlin. Alle Sequenzierungen wurden durch die Firma Meixner DLMBC, Berlin ausgeführt.


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01.02.2005