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4  Diskussion

Zum ersten mal wurde mit 15 Primerpaaren ein für populationsgenetische oder epidemiologische Untersuchungen angemessener Satz von Mikrosatellitenmarkern für L. d. infantum entwickelt. Lediglich drei dieser Marker verhalten sich innerhalb von L. d. infantum monomorph (mit Ausnahme von LEM3472, dessen Stellung innerhalb des L. donovani-Komplexes umstritten ist), sind aber in der Lage, andere Spezies und Subspezies des L. donovani-Komplexes zu diskriminieren. Während bis jetzt lediglich drei unabhängige Mikrosatellitenmarker für L. infantum publiziert sind, die innerhalb von MON-1 differenzieren (Rossi 1994, Bulle 2002), trifft dies für fünf der hier vorgestellten Marker zu.

Verschiedene Mutationsmechanismen werden für die Entstehung eines Mikrosatelliten verantwortlich gemacht: Während zunächst eine Sequenz mit einigen wenigen repetitiven Elementen durch Punktmutationen erzeugt wird, führen fehlerhafte Anlagerungen der Polymerase bei der Replikation zu einer Verlängerung dieses Mikrosatelliten (Messier 1996). Ist eine gewisse Repeatlänge erreicht, stabilisieren Punktmutationen den Mikrosatelliten, indem sie die Bildung von Frameshift-Intermediaten verhindern oder diese so verändern, dass sie leichter erkannt und repariert werden können (Bichara 1995). Im Weiteren kommt es zur Deletion von ganzen Repeatverbänden, bis der Mikrosatellit als solcher kaum noch zu erkennen ist (Taylor 1999). Daher lassen sich bei unterschiedlichen Isolaten trotz großer genetischer Distanz Mikrosatelliten identischer Länge finden. Während sich bei einem Stamm die analysierte Sequenz in der Phase des Repeatzugewinns befinden kann, ist die andere möglicherweise in der Phase der Involution. Die zufällig identische Länge der Mikrosatelliten nennt man Homoplasie (Winter 1998). Dieses Phänomen verzerrt die auf Mikrosatellitenanalyse basierenden taxonomischen Verhältnisse und macht für populationsgenetische und taxonomische Studien die Verwendung von mindestens zehn unabhängigen Markern notwendig (Ruzzante 1998).


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Es wird angenommen, dass die Größe des haploiden Gesamtgenoms von Leishmania in einem Bereich von 30 - 35 mio Bp anzusiedeln ist (Ivens 1998). Russel fand 1999 bei der Untersuchung von 3000 Viannia-Fragmenten im Größenbereich von 1000 bis 1500 Bp ohne vorherige Anreicherung lediglich 9 verschiedene (CA/GT)-Mikrosatelliten. Im günstigsten Falle wurden nach obiger Rechnung 5 - 10% des Gesamtgenoms untersucht. Man kann also annehmen, dass mindestens 90, wahrscheinlich aber sehr viel mehr (AC/GT)-Loci existieren (Russel 1999).

Geht man davon aus, dass die repetitiven Sequenzen bei L. infantum ähnlich verteilt sind, müsste bei einer Fragmentgröße von 400 - 1000 Bp im Schnitt etwa jede 600. Kolonie zuzüglich Redundanzen einen Mikrosatelliten enthalten. Daraus lässt sich annähernd auf die Effizienz der in dieser Arbeit vorgenommenen Anreicherung von Mikrosatellitensequenzen schließen: Während es im ersten und zweiten Durchgang (Thyb=60°C, Artefakte durch freies 3’-Ende des (GT)10-Oligonukleotids) zu einer Anreicherung um das 60- beziehungsweise 85fache kam, war in Durchgang 3 bei gleicher Hybridisierungstemperatur (Thyb=60°C, blockiertes 3’-Ende des (GT)10-Oligonukleotids) nur eine Anreicherung um Faktor 3,5 zu beobachten. Die Effizienz der Methode ließ sich durch die Absenkung von Thyb um 5°C auf 55°C auf eine ca 190fache Anreicherung mit einem Anteil von über 30% positiven Kolonien signifikant steigern. Die Ergebnisse der ersten beiden Durchgängen lassen sich durch die Tendenz der Ligase erklären, bevorzugt kleinere Fragmente in den Vektor zu ligieren. Bei den dabei beobachteten Artefakten wurden nur Fragmente von 31 bis maximal 203 Bp gefunden statt der zu erwartenden durchschnittlichen Fragmentlänge von 350 Bp zuzüglich Adaptorsequenz.

Durch die Spezifität des Restriktionsenzyms und die vorgenommene Größenselektion wurden große Teile des Genoms bei der Suche nach Mikrosatelliten nicht berücksichtigt. Das betrifft in diesem Fall schätzungsweise 60% des genetischen Materials. Um die Anzahl der Redundanzen zu verringern und größere Anteile des Genoms in eine genetische Bibliothek einzubinden, wäre eine Spaltung mit unterschiedlichen Enzymen (Hamilton 1999) und die Verwendung anderer, nicht Sau3A1-spezifischer Adaptoren notwendig (Jamjoom 2002 b).

Der hohe Anteil an Artefakten in den ersten beiden Durchgängen zeigt, dass von einer Verwendung von Oligonukleotiden mit freiem 3’-Ende dringend abzuraten ist. Bei Vektoren, die durch ein Restriktionsenzym geöffnet werden und die eine entsprechende Erkennungssequenz in den Adaptoren voraussetzen, ist das Phänomen der Artefakt­[Seite 37↓]bildung gering, weil ein Fragmentende, das repetitive Elemente statt der Adaptorsequenz mit Restriktionsschnittstelle aufweist, nicht in den Vektor eingebaut werden kann (Hamilton 1999). Anders bei dem hier verwendeten offenen Vektorsystem mit U-Überhang: Hier wird jedes PCR-Produkt mit gleicher Effizienz ligiert; der Anteil an Artefakten im Ligationsansatz findet sich in vollem Umfang, wenn nicht sogar, bedingt durch die geringere Fragmentgröße, überrepräsentiert in der Bibliothek wieder.

Es empfiehlt sich, wie im Methodenteil beschrieben, das Verfahren des vierten Durchganges mit einer Biotinylierung am 3’-Ende zu verwenden und die Hybridisierungstemperatur zu optimieren.

Während die meisten der untersuchten Stämme in der Regel nur ein Allel pro Marker aufwiesen (ca 88% der Fälle), fanden sich bei sechs Stämmen Loci mit zwei Allelen. Dies kann mehrere Ursachen haben: Zunächst besteht die Möglichkeit eines Mischisolats, was sich nur durch das Klonieren des Stammes sicher ausschließen lässt. Ebenfalls denkbar ist, dass der analysierte Mikrosatellit zu einer ‚Multi-copy’-Gensequenz gehört. Für Leishmania ist bekannt, dass kodierende Sequenzen mitunter tandemartig wiederholt werden, diese repetitiven Gene aber untereinander genetische Varianten (Isogene) aufweisen (Britto 1998). Dieses Phänomen kann ebenso Ursache der verschiedenen Allele sein wie das Vorliegen von Heterozygotie. Während bei heterozygoten Stämmen ein oder zwei Allele gefunden werden, sind bei Mikrosatelliten innerhalb von Isogenen auch mehr Allele pro Locus denkbar (Victoir 2002), was aber bei den hier untersuchten Stämmen nicht beobachtet wurde.

Zwei Allele an einem Locus finden sich in ca 12% der Fällen und ausschließlich in der spanischen Subgruppe (LEM175, LEM373, LEM935) sowie bei Stämmen aus dem nordöstlichen Afrika (Sudan, Äthiopien). Die Tatsache, dass hauptsächlich eine einzelne Bande beobachtet wird, spricht für Homozygotie in diesen Loci. Dieses wie auch die Korrelation zwischen voneinander unabhängigen genetischen Markern (Tibayrenc 1990) bestätigt die allgemein anerkannte These der asexuellen Fortpflanzung bei Leishmania. Dabei wird von einem selektiven Vorteil bei Fortpflanzung durch mitotische Rekombination ausgegangen, wobei zur Gewährleistung genetischer Vielseitigkeit Isogene angehäuft werden (Victoir 2002). Die Annahme, es handele sich bei MON-1 um einen ubiquitären, geographisch weit verbreiteten Genotypen (Tibayrenc 1990), ein weiteres Argument für die klonale Fortpflanzung von Leishmania, hat sich speziell durch Mikrosatellitenanalysen in dieser wie auch in anderen Arbeiten (Rossi 1994, Bulle 2002) [Seite 38↓]als nicht richtig erwiesen. Dass Leishmania einen Weg gefunden hat, die sexuelle Reproduktion zu umgehen, wurde durch Beobachtungen an wilden Populationen gezeigt (Dujardin 1995). Es ist bisher auch nicht gelungen, verschiedene Leishmaniastämme experimentell zu kreuzen, und die Häufigkeit sexueller Rekombination, sofern diese überhaupt auftritt, wird als sehr gering eingeschätzt (Panton 1991). Dagegen bemerkte Ashford (1992), dass L. archibaldi (MON-82) möglicherweise eine Heterozygote aus L. infantum, MON-30, und L. donovani, MON-18, darstellt und sich mit den Stämmen die-ser Zymodeme bei einem Ausbruch im Sudan wie eine einzige Population verhielt. Die in dieser Studie gefundene Heterozygotie für L. archibaldi unterstützt diese Hypothese.

Innerhalb der untersuchten Stämme zeichnen sich taxomonisch zwei große Gruppen ab, die nicht immer mit der auf Isoenzymmuster basierenden Unterteilung in L. donovani und L. infantum übereinstimmen. Speziell die Untergruppe der Stämme aus Nordostafrika, die sowohl den L. infantum-Stamm LEM3472 als auch die Stämme LEM3463 und GEBRE1, die beide auf Grund von den Ergebnissen der MLEE als L. archibaldi-Stämme geführt werden, beinhaltet, war bereits in der Vergangenheit problematisch hinsichtlich der korrekten taxonomischen Einordnung. Bei der Isoenzymanalyse hat sich eine sehr enge Verwandtschaft zwischen den Stämmen der Sudangruppe gezeigt, welche die Zymodeme MON-18 (L. donovani), MON-30 (L. infantum) und MON-82 (L. archibaldi) und verwandte Stämme umfasst (Rioux 1990, Pratlong 2001). Bei genotypischen Analyseverfahren verhalten sich die Stämme aus Nordostafrika unabhängig ihrer Spezieszuordnung durch die MLEE weitgehend als homogene Gruppe, die sich sowohl von den indischen L. donovani-Stämmen als auch von den L. infantum-Stämmen des mediterranen Beckensunterscheidet (Mauricio 2001, Ibrahim 2001, Oskam 1998). Während bei viszeraler Leishmaniose in Indien in 20% der Fälle mit einer Post-Kala Azar-dermalen Leishmaniose gerechnet werden muss (Thakur 1992), tritt diese bei L. infantum praktisch nicht auf (Guerbouj 2001, Cascio 2002, Minodier 2003). Hier bildet die Sudangruppe eine Ausnahme, denn hier wurde PKDL auch in Verbindung mit zu L. archibaldi eng verwandten L. infantum-Stämmen beobachtet (Zijlstra 1994, Pratlong 2001). Deshalb wurde von verschiedenen Autoren gefordert, die Zymodeme MON-30 (L. infantum) und MON-82 (L. archibaldi) entweder L. donovani sensu stricto zuzuordnen (Oskam 1998) oder zusammen mit MON-18 (L. donovani s. s.) in der Subspezies L. d. archibaldi zusammenzufassen (Mauricio 2001). Die Dreiteilung des L. donovani-Komplexes in anthroponotische L. donovani in Indien, L. donovani der Sudangruppe, [Seite 39↓]für die ein tierisches Reservoir vermutet wird, und L. infantum mit dem Reservoir Hund (Ibrahim 2001) lässt sich auch bei der Mikrosatellitenanalyse nachvollziehen. Mit den hier entwickelten Markern wurden in fast der Hälfte der Loci spezifische Allele für die Stämme aus der Sudangruppe nachgewiesen, die so eindeutig von allen übrigen Stämmen diskriminiert werden konnten. Innerhalb der L. infantum-Stämme aus Südeuropa, Tunesien und China zeichnet sich unabhängig von den verschiedenen Zymodemen bei der Mikrosatellitenanalyse eine enge Verwandtschaft ab. Dies entspricht den Ergebnissen früherer Analysen mit Mikrosatelliten (Jamjoom 2002 b) und ‚Sequence-confirmed amplified region’ (SCAR)-Markern (Lewin 2002). Dennoch bleibt zu zeigen, ob sich eine so nahe Verwandtschaft zwischen chinesischen und europäischen Stämmen auch bei einer aussagekräftigen Anzahl von Isolaten nachweisen lässt. Abgesehen von der Subgruppe der drei spanischen Stämme, die an einigen Loci Doppelbanden aufweisen, finden sich keine signifikanten Sprünge in der genetischen Distanz bei dieser Gruppe.

Es hat sich in der Vergangenheit gezeigt, dass Mikrosatellitenmarker, die für eine Leishmanienspezies entwickelt wurden, nur begrenzt für andere einsetzbar sind. Mikrosatellitenloci, die bei L. major einen hohen Polymorphiegrad aufweisen, sind bei L. donovani in der Regel viel kürzer und häufig monomorph, sofern sie überhaupt zu einem Amplifikat führen (Jamjoom 2002 a). Umgekehrt zeigte sich in dieser Studie zumindest beim Vergleich mit den Sequenzen von L. major Friedlin aus der Datenbank, dass bei L. infantum Mikrosatelliten existieren, die bei L. major an entsprechender Stelle nicht oder nur als sehr kurze, imperfekte Repetitionen zu finden sind.

Anders verhält es sich innerhalb des L. donovani-Komplexes, also zwischen L. donovani und L. infantum. Hier wurde mehrfach gezeigt, dass Mikrosatellitenmarker ohne Probleme für die Analyse der beiden Spezies benutzt werden können (Jamjoom 2002 a, Jamjoom 2002 b). Auch in dieser Studie waren alle für L. infantum entwickelten Mikrosatellitenmarker auch bei L. donovani amplifizierbar. Innerhalb der untersuchten L. donovani-Stämme waren meist größere Differenzen in der Fragmentlänge der einzelnen Repeats zu beobachten als bei den L. infantum-Stämmen. Das lässt sich darauf zurückführen, dass L. donovani sensu stricto mehrere taxonomische Subgruppen umfasst, also genetisch sehr viel heterogener ist als L. infantum.

Es konnte keinerlei signifikante Rangkorrelation zwischen G/C-Gehalt und Länge oder Variabilität des Mikrosatelliten festgestellt werden wie beispielsweise bei Glenn (1996) für (GT/AC)-Repeats beschrieben. Die prinzipielle Annahme einer negativen Korrelation [Seite 40↓]zwischen diesen Größen, auch speziell bei diesem repetitiven Element, ist also nicht zulässig, vor allem da auch in anderen Studien hier keine Signifikanzen nachgewiesen werden konnten (Balloux 1998, Ellegren 2000 a). Die Analyse der die Mikrosatelliten flankierenden Sequenzen (200 - 300 Bp) ergab, dass der G/C-Gehalt um die hier untersuchten Loci immer unter dem bei Leishmania gefundenen Durchschnittswert liegt (Leishmania Genome Network, Ravel 1998).

Über den Anteil an Mikrosatelliten mit ‚multi-step changes’ (genereller Zugewinn oder Verlust von 2 - 5 repetitiven Elementen statt einem einzelnen, Ellegren 2000 a) konnte auf Grund zu weniger untersuchter Stämme keine Aussage gemacht werden.

Für Aussagen zur Taxonomie ist die Untersuchung einer weit größeren Anzahl von Stämmen notwendig. Nur so ist zu entscheiden, ob die hier entwickelten Mikrosatellitenmarker für solche Analysen ausreichend sind. Insbesondere bei Stämmen des Zymodems MON-1 ist eine höhere Probenzahl erforderlich, um zu klären, ob noch weitere Mikrosatellitenmarker entwickelt werden müssen. Denkbar wäre in diesem Zusammenhang auch die Testung der für L. donovani publizierten Mikrosatellitenmarker (Jamjoom 2002 b).

Die Mikrosatellitenanalyse hat gegenüber anderen genotypischen Verfahren zur taxonomischen Differenzierung eindeutige Vorteile: Sie ist in der Lage, Stämme der gleichen Spezies sehr viel feiner zu diskriminieren als jede andere bisher beschriebene Methode. Bei einer ausreichend großen Anzahl von Markern spiegelt sie die tatsächliche Verwandtschaft wieder. Eine Automatisierung der Fragmentlängenanalyse mittels Sequenzierer ist bereits für L. tropica -Mikrosatellitenmarker etabliert (Schwenkenbecher, persönliche Mitteilung), was die Untersuchung von großen Probenzahlen ermöglicht. Erste Untersuchungen haben gezeigt, dass Mikrosatellitensequenzen direkt aus klinischen Proben ohne vorherige Kultivierung des Erregers amplifiziert werden können, was von großem Vorteil für umfangreiche epidemiologische Studien wäre.

Ein Problem ist sicherlich, dass die Marker speziesspezifisch sind, und deshalb die vom Leishmania major-Genomprojekt publizierten Sequenzen nicht für andere Leishmanienarten genutzt werden können. Das in dieser Arbeit beschriebene optimierte Verfahren zur Etablierung von angereicherten Mikrosatellitenbibliotheken hilft jedoch, den Entwicklungsaufwand der Marker entscheidend zu verringern.


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Mit dem hier entwickelten Satz von Markern könnte es gelingen, eine gänzlich neue Einteilung innerhalb von L. infantum auf Grundlage des Genotyps vorzunehmen, im Sinne von ‚Mikrodemen’ als Äquivalent zu den Zymodemen (Isoenzymanalyse) oder Serodemen (Monoklonale Antikörper), wie unter anderem von Russel (1999) gefordert.


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