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5 .Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, Mikrosatellitenmarker für epidemiologische, phylogenetische und populationsgenetische Untersuchungen bei Leishmania d. infantum zu entwickeln und die zu Grunde liegende Methodik so zu etablieren, dass sie problemlos für andere Parasiten- und auch Wirtspezies angewandt werden kann.

Zur Erstellung einer angereicherten Mikrosatellitenbibliothek wurde ein publiziertes Protokoll für einen mediterranen L. infantum-Stamm adaptiert. Die Anreicherung erfolgte mittels magnetischer Dynabeads und biotinylierter Mikrosatellitensonden. Bei der Durchsuchung der Bibliothek auf positive Klone konnte auf eine Hybridisierung verzichtet werden; statt dessen wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt, bei der zusätzlich zu dem spezifischen Primerpaar ein der Mikrosatellitensequenz entsprechendes Oligonukleotid zugesetzt wurde. Bei Mikrosatelliten enthaltenden Kolonien zeigte sich in der anschließenden Elektrophorese eine Doppelbande. Die positiven Klone wurden sequenziert und an Hand der erhaltenen Sequenz Primerpaare entwickelt. Die PCR-Bedingungen wurden mit der DNS des ursprünglich klonierten Stammes optimiert.

Polymorphismen in den Mikrosatellitenloci wurden bei 13 Stämmen des L. donovani-Komplexes nach Amplifizierung und Bestimmung der Größe des Mikrosatellitenmarkers nachgewiesen. Insgesamt wurden 15 polymorphe Marker entwickelt, von denen fünf auch bei L. infantum-Stämmen des Zymodems MON-1 Unterschiede aufwiesen. In den meisten früheren Studien konnte keine Differenzierung innerhalb der MON-1-Gruppe erreicht werden; bisher sind lediglich drei Marker publiziert, die bei diesen Stämmen polymorph sind.

Bei der Untersuchung der genetischen Verwandtschaft von 13 Stämmen des L. donovani-Komplexes war eine grundlegende Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der Mikrosatellitenanalyse und anderen genotypischen Verfahren der taxonomischen Diskriminierung sowie der Isoenzymanalyse zu beobachten: Die Spezies L. infantum und L. donovani waren weitgehend von einander abgrenzbar. Es ließ sich aber klar eine Untergruppe differenzieren, welche die Stämme aus dem Sudan und Äthiopien zusammenfasst, und zwar unabhängig davon, ob sie von der Isoenzymanalyse als L. donova­ [Seite 43↓] ni, L. infantum oder L. archibaldi indentifiziert worden waren; die Stämme aus Kenia und Indien wiesen Unterschiede zu dieser Gruppe auf. Dieser Befund muss jedoch durch die Untersuchung weiterer Stämme aus diesen Regionen geprüft werden.

Es ist gelungen, ein Verfahren zu etablieren, mit dem in kurzer Zeit mit relativ geringem Aufwand eine mit Mikrosatelliten hoch angereicherte Genbibliothek für jede beliebige Spezies erstellt und auf positive Klone durchsucht werden kann.

Mit den in dieser Studie entwickelten Markern steht erstmalig ein für populationsgenetische Studien bei L. infantum ausreichend großer Satz an Mikrosatellitenmarkern zur Verfügung. In Kombination mit anderen, früher entwickelten Markern sollte die Einteilung von L. d. infantum, aber auch die des gesamten L. donovani-Komplexes in Mikrodeme nun möglich sein. Damit wird einerseits die Möglichkeit für epidemiologische Studien bei L. infantum verbessert und andererseits ein Mittel zur Revision der Taxonomie des L. donovani-Komplexes geschaffen.


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01.02.2005