„Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern für populationsgenetische Untersuchungen bei Leishmania infantum“ Sebastian Hertweck 112876#49231.14561.27616#48181.39102112.12.2122.2.12.2.213613#2862.2.314231#2932.2.415162.2.52.2.6172.2.72.3182.4192.5202.6212.7223233.12425605#51926367#2813.22728603#1553.329468#234468#3453031323.43334626#78143536373839404154243 Literatur4445464748495051525354Erklärung an Eides stattAbkürzungendeInhaltsverzeichnisHilfeAus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION„Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern für populationsgenetische Untersuchungen bei <em>Leishmania infantum</em>“Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlinvon
Sebastian Hertweck
aus Karlsruhe Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen,
Prof. Dr. med. Martin Paul Prof. Dr. Wolfgang Presber Prof. Dr. Heidrun Moll Prof. Dr. Christian Bogdan Datum der Promotion: 19. 7. 2004 Abstract

Leishmania infantum ist für einen beträchtlichen Teil der viszeralen Leishmaniosen weltweit verantwortlich. Die allgemein anerkannte Methode zu Klassifizierung wie auch zur Identifizierung von Leishmanien ist die Isoenzymanalyse. Speziell für L. infantum reicht das Auflösungsvermögen dieser Methodik allerdings nicht aus, da mehr als 80 % der analysierten Stämme dem prädominanten Zymodem MON-1 angehören. In dieser Arbeit wurden Primerpaare für die Amplifikation von 15 unabhängigen Mikrosatelliten entwickelt. Das verwendete Protokoll zur Erstellung einer angereicherten genetischen Bibliothek ist leicht für andere Leishmanienspezies adaptierbar. Die Marker wurden an 13 Stämmen des L. donovani-Komplexes getested mit Schwerpunkt auf L. infantum MON-1. Die berechneten Dendrogramme entsprachen weitestgehend den Ergebnissen früherer, auf genotypischen Methoden basierenden phylogenetischen Studien. In Abhängigkeit von Zymodem und Spezies wurden unterschiedlich hohe Anteile heterogener Allele beobachtet.

Das ist der erste Satz von unabhängigen Mikrosatellitenmarkern entwickelt speziell für L. infantum, der groß genug für phylogenetische Anwendungen ist. Für jedem untersuchten Stamm wurde ein eigener Multilocus-Genotyp beobachtet, was diese Methode zu einem wichtigen Werkzeug für epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen macht.

 Leishmania donovani-Komplex Leishmania infantum Mikrosatellit Populationsgenetik Abstract

Leishmania infantum is responsible for a large proportion of visceral leishmaniasis all over the world. The universally accepted standard method for characterizing and identification of Leishmania is the isoenzyme analysis. Especially for L. infantum, this procedure lacks of discriminative power because the predominant zymodeme MON-1 is represented by more than 80 % of the analysed isolates. In this study, PCR assays amplifying 15 independent microsatellites were developed using a method to create highly enriched libraries that can easily be adapted for other species of Leishmania. The panel of markers was tested for 13 strains of the L. donovani complex with main emphasis on L. infantum MON-1. The calculated dendrograms corresponded to the results of former phylogenetic investigations based on genotypic methods. Depending of zymodeme and species, different degrees of allelic heterozygosity were observed.

This is the first set of independent microsatellite markers especially developed for L. infantum, which is large enough for phylogenetic applications. An unique multi locus genotype is produced for each analysed isolate what makes this approach to a powerful tool for epidemiological and population genetic investigations.

Leishmania donovani complex Leishmania infatum microsatellite population genetics Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1 Methoden zur Differenzierung von Spezies und Subspezies

    • 1.2 Variable Mikrosatellitensequenzen als epidemiologische Marker

    • 1.3 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

  • 2 .Material und Methoden

    • 2.1 Präparation der DNS

    • 2.2  Erstellen einer mit Mikrosatelliten angereicherten Genbibliothek

      • 2.2.1 Präparation des Adaptors

      • 2.2.2 Verdau und Adaptorligation

      • 2.2.3 Größenselektion der Fragmente und Probe-PCR

      • 2.2.4  Anreicherung von Mikrosatelliten enthaltenden Fragmenten

      • 2.2.5 PCR, Testelektrophorese und Ligation in p-Drive-Vector

      • 2.2.6  Präparation der Agarplatten

      • 2.2.7 Transformation in kompetente E. coli-Bakterien

    • 2.3  Screening der Kolonien nach (GT)10-positiven Klonen und Aufbereitung zur Sequenzierung

    • 2.4  Design von Primern für die Amplifizierung spezifischer Mikrosatellitenmarker

    • 2.5 Optimierung der PCR-Bedinungen für die ermittelten Primerpaare

    • 2.6 Testung der Mikrosatellitenmarker auf Längenpolymorphismen

    • 2.7  Geräte und Dienstleistungen

  • 3  Ergebnisse

    • 3.1 Erstellung einer CA/GT-Mikrosatelliten-Bibliothek

    • 3.2 Sequenzauswertung und Primerdesign

    • 3.3 Nachweis von Polymorphismen in den Mikrosatellitenregionen

    • 3.4  Bestimmung der genetischen Verwandtschaft basierend auf der Analyse der Mikrosatellitenvariationen

  • 4  Diskussion

  • 5 .Zusammenfassung

  • Literatur

  • Erklärung an Eides statt

  • Abkürzungen

Tabellen

  • Tab. 1: Stämme des L. donovani-Komplexes, die in dieser Arbeit verwendet wurden (* Speziesbezeichnungen nach MLEE (Pratlong 2001))

  • Tab. 2: Anteil an positiven Kolonien und Redundanzen (* davon Artefakte)

  • Tab. 3: Mikrosatellitenprimerpaare (TA: Annealingtemperatur; unter Repeats findet sich Art und Länge der Repeats beim klonierten Stamm PM1 sowie Längenbereich bei allen untersuchten Stämmen; bei Lokalisation ist die Spezies der Vergleichssequenz angege-ben; * zu Li71-41 siehe Abb. 7)

  • Tab. 4: Polymorphe Mikrosatellitenmarker für die untersuchten Stämme des L. donovani-Komplex; dargestellt ist die Größe des jeweiligen Markers in Bp

  • Tab. 5: Polymorphe Mikrosatellitenmarker für die untersuchten Stämme des L. donovani-Komplexes; dargestellt ist die Anzahl der repetitiven Elemente.

Bilder

  • Abb. 1: Taxonomie von Leishmania

  • Abb. 2: angenommener Mutationsmechanismus bei Mikrosatelliten

  • Abb. 3: Sau3A1-spezifischer Adaptor und seine Bestandteile

  • Abb. 4: Ein Schmier im Bereich von 400 bis 1000 Bp spricht für erfolgreiche Adaptorligation und Größenselektion.

  • Abb. 5: Fließschema: Anlegen der angereicherten genetischen Bibliothek

  • Abb. 6: die positive Kolonie (41-19) zeichnet sich durch deutliche Doppelbande aus

  • Abb. 7: Deletion und Punktmutation an Locus Li71-41

  • Abb. 8: Polyacrylamidgelelektrophorese (Locus 72-23, IPT1 nicht aufgetragen)

  • Abb. 9: Gelelektrophorese mit MethaPhor-Agarose (Locus Li72-20)

  • Abb. 10: Dendrogramme erstellt mit UPGMA nach Berechnung von Ds (Nei 1972) und Ddm (Goldstein 1995 a)