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1  Einleitung

1.1 Die Tropenparasitose Schistosomiasis

Die Schistosomiasis ist eine seit dem Altertum bekannte Tropenparasitose (Farooq, 1973), die nach der Erstbeschreibung durch den deutschen Arzt Theodor Bilharz auch als Bilharziose bezeichnet wurde. Sie wird hervorgerufen durch Trematoden der Gattung Schistosoma. Die vier wichtigsten humanpathogenen Arten dieser Gattung sind S. mansoni, S. japonicum, S. haematobium und S. intercalatum. Die Hauptverbreitungsgebiete von S. mansoni, der Gegenstand dieser Arbeit ist, liegen in Afrika, der Karibik und der südamerikanischen Ostküste (Abb. 1.1). Diese Verbreitung ist durch den Zwischenwirt, eine Wasserlungenschnecke der Gattung Biomphalaria, bestimmt, zu der eine strenge Wirtsspezifität besteht. Diese Schnecke benötigt Wassertemperaturen oberhalb von 24°C, wodurch die Schistosomiasis mit 250-300 Millionen infizierten Menschen ausschließlich in den Tropen und Subtropen verbreitet ist. Heutzutage tritt sie in 76 Ländern auf, weltweit leben 600 Millionen Menschen in den Endemiegebieten. Obwohl sich das Verbreitungsgebiet der Schistosomiasis in den letzten 50 Jahren durch Programme der WHO zur Gesundheitserziehung und Medikamentenbehandlung verändert hat, konnten diese hohen Zahlen an unmittelbar von der Schistosomiais betroffenen Personen in den Endemiegebieten und an Infizierten nicht verringert werden (Berquist, 2002; Zhou et al., 2002; Berquist und Colley, 1998). 10 % der Erkrankten weisen schwere Krankheitssymptome auf. Pro Jahr sterben 0,3 bis 0,5 Millionen Menschen an den direkten Folgen der Schistosomiasis (Chlichlia et al., 2002). Die Schistosomiasis ist damit nach der Malaria die Tropenparasitose mit den zweitgrößten ökonomischen und sozialen Folgen weltweit. Unter den durch parasitische Helminthen verursachten Krankheiten ist sie die wichtigste (Engels et al., 2002; Chitsulo et al., 2000; Crompton, 1999). Die Infektion des Menschen erfolgt durch die im kontaminierten Wasser freischwimmenden Schistosomenlarven, die aktiv durch die Haut eindringen. Die Bewirtschaftung von Reisanbaugebieten sowie der Bau von Bewässerungssystemen, Staudämmen und Kanalsystemen und der falsche Umgang mit Abwässern stellen daher ernstzunehmende Infektionsquellen für den Menschen dar (Magnussen, 2003; Patz et al., 2000).


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1.2  Der Lebenszyklus von Schistosoma mansoni

Schistosomen gehören zur Familie der getrenntgeschlechtlichen
Pärchenegel (Schistosomatidae). Der heteroxene Entwicklungszyklus (Abb. 1.1) schließt zwei freischwimmende Larvenstadien ein, die aktiv in den Zwischenwirt und den Endwirt eindringen. Er ist gekennzeichnet von einer geschlechtlichen Vermehrung in dem Vertebraten-Endwirt und einer ungeschlechtlichen



Abb. 1.1: Lebenszyklus und Verbreitung von S. mansoni


Massenvermehrung im Gastropoden-Zwischenwirt. Wichtigster Zwischenwirt von Schistosoma mansoni innerhalb der Gattung Biomphalaria ist die Art Biomphalaria glabrata (Knight et al., 2000); Endwirt im natürlichen Lebenslauf ist der Mensch. Im Laborzyklus wird der natürliche Endwirt durch die Maus (Mus musculus) oder die Wüstenrennmaus (Meriones unguiculatus) ersetzt.


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Die adulten Würmer leben in den Mesenterialvenen des Endwirtes. Die Weibchen, die nach der Paarung zeitlebens in einer Dauerkopula in der Bauchfalte der Männchen liegen, legen dort täglich 100-300 Eier ab. Die Weibchen nehmen stündlich bis zu 300000 Erythrozyten auf (Lawrence, 1973). Die Aminosäuren, die sie durch Abbau des Hämoglobins gewinnen, werden für Wachstum und Eiproduktion benötigt. Die mit einem Seitenstachel und lytischen Enzymen (Sturrock, 1993) ausgestatteten reifen Eier gelangen durch Entzündungsprozesse in das Darmlumen und werden mit dem Fäzes ausgeschieden. Durch veränderte Licht- und Osmoseverhältnisse angeregt schlüpfen die sich in den Eiern entwickelnden Mirazidien, die dann aktiv den Zwischenwirt aufsuchen. Mit Hilfe von Sekreten aus einer Apikaldrüse heftet sich das Mirazidium an die Zwischenwirtsschnecke und dringt unter Abstreifen des Wimpernepithels ein. An der Eintrittsstelle erfolgt die Transformation zur Primärsporozyste (Muttersporozyste). Die Muttersporozyste ist angefüllt mit Keimballen, in denen undifferenzierte, diploide Zellen liegen. Aus diesen undifferenzierten Zellen entwickeln sich innerhalb von 8 Tagen die Sekundärsporozysten (Tochtersporozysten) (Sturrock et al., 1993), die beweglich sind und die Mitteldarmdrüse der Schnecke aufsuchen. Aus den Keimballenzellen in den Tochtersporozysten können weitere Tochtersporozysten oder aber zahlreiche Zerkarien entstehen. Die für den Endwirt infektiösen Gabelschwanzzerkarien verlassen die Schnecke aktiv und suchen chemotaktisch angelockt den Endwirt auf (Haas et al., 1997). Unter Abwerfen des Gabelschwanzes und mit Hilfe von sekretierten proteolytischen Enzymen wie zum Beispiel Elastasen (McKerrow et al., 1985) dringt die Zerkarie in die Haut des Endwirtes ein und wandelt sich in ein Schistosomulum um. Nach einer Körperwanderung im venösen Blutkreislauf über Lunge und linke Herzkammer und nach einer Längenzunahme werden die getrennt geschlechtlichen Tiere in die Pfortadern geschwemmt, wo die Paarung stattfindet. Letztlich erfolgt die endgültige Ansiedelung der Wurmpaare in den Mesenterialvenen des Darms, in denen die Eiablage durch taktile und chemische Reize ausgelöst wird.

1.3 Krankheitsverlauf und Kontrolle der Schistosomiasis

Die Schistosomiasis ist in erster Linie eine chronische Erkrankung, die durch die in das Blutgefäßsystem abgelegten Eier hervorgerufen wird. Erste Krankheitssymptome werden durch die Invasion des Parasiten hervorgerufen (Ross et al., 2002). Daran [Seite 17↓]schließt sich eine akute Phase der Schistosomiasis an, die bei einer starken Infektion mit S. japonicum von Fieber gekennzeichnet ist (Katayama-Fieber) (Doherty et al., 1996). Diese akute Phase geht schließlich in die chronische Schistosomiasis über (Lambertucci et al., 2000). Typische Merkmale einer starken chronischen Infektion sind Hepatosplenomegalie, Ascites und Varizen (de Jesus et al., 2002; Lambertucci et al., 2000; Lambertucci, 1993). Weitere Komplikationen ergeben sich bei Koinfektionen mit Staphylococcen, Hepatitis B und C und Salmonellen (Ross et al., 2002; Gad et al, 2001; Lambertucci et al., 2000). Bei der Neuroschistosomiasis kommt es in Folge von Infektionen im Kindesalter zu geistiger Retardierung und Wachstumsstörumgen (Lambertucci et al, 2000; Doehring, 1988). Die intestinale Schistosomiasis verläuft in 1 % der Fälle tödlich. Bei der Todesursache spielen innere Blutungen durch aufplatzende Varizen und die indirekte Beteiligung am Auftreten von Darmkarzinomen bei S. mansoniund von Blasenkarzinomen bei S. haematobiumeine Rolle (Ross et al., 2002).

Für die Behandlung der Schistosomiasis steht seit den 70er Jahren das gut verträgliche Chemotherapeutikum Praziquantel zur Verfügung (Cioli und Pica-Mattoccia, 2003). Die Chemotherapie ist für den einzelnen Patienten erfolgreich, stellt aber keine wirksame Lösung für die Bekämpfung der Schistosomiasis dar. Durch die hohe Reinfektionsrate in den Endemiegebieten ist zur vollständigen Eliminierung der Schistosomen die Durchführung von Massenbehandlungen mit Praziquantel bis zu alle drei Monate notwendig (WHO, 1996). Zudem besitzt es eine sehr kurze Halbwertszeit im menschlichen Körper und tötet nicht die juvenilen Würmer ab (Ross et al., 2002). Ein weiteres Problem ist das Auftreten von Schistosomenstämmen, die resistent gegenüber der Behandlung durch Praziquantel sind (Doenhoff et al., 2002; William et al., 2001; King et al., 2000; Ismail et al., 1999). Die Eindämmung der Schistosomiasis durch Bekämpfung der Zwischenwirte mit Molluskiziden ist kostenaufwendig und die ökologischen Folgen sind nicht abschätzbar (Ross et al., 2002; Morgan et al., 2001; Cioli et al., 1995). Eine Alternative zur Bekämpfung der Schistosomiasis wäre eine Vakzine, die derzeit noch nicht auf dem Markt ist (Ross et al., 2002; Capron et al., 2001).

Parallel zu diesen konventionellen Ansätzen, die bis in die Gegenwart zur Bekämpfung der Schistosomiasis eingesetzt werden, besteht ein neuer Ansatz darin, [Seite 18↓]die Biologie der Schistosomen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Dadurch sollen neue Angriffspunkte im Stoffwechsel des Parasiten gefunden werden und die Entwicklung von neuen Medikamenten und Vakzinen und einer verbesserten Diagnostik ermöglicht werden, um eine wirksame Langzeitstrategie zur Bekämpfung der Schistosomiasis zu entwickeln (Engels et al., 2002; Colley et al., 2001; Franco et al., 2000). Diese Strategie weist erste Erfolge auf: Es wurde nachgewiesen, dass eine Erhöhung der Expression der Untereinheit I der Cytochrom C-Oxidase möglicherweise eine Praziquantel-Resistenz bewirkt (Pereira et al., 1998). Der molekularbiologische Ansatz trägt auch zur Untersuchung der Interaktionen zwischen S. mansoni und der Zwischenwirtsschnecke B. glabrata bei (Raghavan et al., 2003; Jones et al., 2001; Knight et al., 1999).

1.4 Das schistosomale Genom

Um die Sequenzierung von Schistosomen zu koordinieren, wurde 1992 das Schistosoma Genome Network als internationales Konsortium von
der WHO mit dem Ziel gegründet, expressed sequence tags (ESTs) aus den verschiedenen Stadien einschließlich männlicher und weiblicher adulter Würmer, Zerkarien, Mirazidien, Sporozysten und Schistosomula zu sequenzieren (Dias-Neto et al., 2000; Franco et al., 1995). Außerdem wurde eine bacterial artificial chromosome (BAC)-Bank von S. mansoni angelegt und es wurde begonnen, genomische Sequenzen zu analysieren (Le Paslier et al., 2000).

S. mansonihat ein sehr großes und komplexes Genom. Das haploide Genom besitzt eine Größe von 270 Mb (Simpson et al., 1982) und ist damit 2,7 mal größer als das Genom von Caenorhabditis elegans (C. elegans Sequencing Consortium, 1998) bzw. 2,3 größer als das Genom von Drosophila melanogaster (Adams et al., 2000). Es ist organisiert in 7 Paaren Autosomen und einem Paar Geschlechtschromosomen, wobei Männchen homozygot (ZZ) und die Weibchen heterozygot (ZW) sind (Hirai et al., 2000; Grossman et al., 1981 a und b). Das Genom besteht zu 65 % aus den Nukleotiden A und T und enthält 60 % repetitive Sequenzen, die in 100-1000000 Kopien vorliegen (Simpson et al., 1984; Simpson et al., 1982). Es gibt ca. 20000 exprimierte Gene (Franco et al., 2000). Durch Sequenzierung von ESTs wurden bisher 15-20 % der schistosomalen Gene katalogisiert (Johnston et al., 1999). Die Expression vieler Gene ist stadienspezifisch. [Seite 19↓]Für die Entwicklung einer Diagnose, Chemotherapie oder Immunoprophylaxe sind konstitutiv in mehreren Stadien exprimierte Gene geeignet (Fan et al., 1998; Franco et al., 1997). 30-60 % der ESTs stellen neue schistosomale Gene dar. Weil 80 % dieser Gene keine Homologien zu den Genen anderer Organismen, die in den Datenbanken veröffentlicht sind, zeigen (Shabaan et al., 2003; Merrick et al., 2003; Santos et al., 1999; Franco et al., 1995) und sogar in einem häufig vorkommenenden Transkript aus S. mansoni Homologien zu bekannten Genen fehlen (Meira et al., 1998), ist es schwierig die Funktionen dieser Gene allein aus der Sequenz herzuleiten.

1.5 Versuche zur Transfektion von S. mansoni

Die molekulare Funktion und die biochemische Aktivität eines Gens können in vitro analysiert werden (Franco et al., 2000). Um die biologische Funktion, die ein Protein in dem Organismus erfüllt, zu analysieren, sind in vivo Analysen notwendig. Ein großes Hindernis in dieser Hinsicht stellt bei Schistosomen das Fehlen von knockout Techniken dar. Transgene Würmer, in denen auf Grund von Überexpression oder Ausschalten von Genen Phänotypen auftreten, die einen Rückschluss auf die Funktion des ausgeschalteten oder überexprimierten Gens zuließen, könnten insbesondere einen wichtigen Beitrag bei der Aufklärung der Funktion von Genen leisten, die keine Homologie zu anderen Genen in Datenbanken besitzen (Franco et al., 2000). Technisch wurden diese Probleme bislang für Schistosomen durch den Einsatz von Hefen für Genfunktionsstudien, für die die Technik zum Ausschalten von Genen zur Verfügung steht (Winzeler et al., 1999), gelöst. Es wurde nachgewiesen, dass die Ca2+-ATPase aus Schistosomen in transgenen Hefen, in denen dieses Gen ausgeschaltet wurde, die Funktion der hefeeigenen ATPase ersetzen kann (Talla et al., 1998). Durch RNA interference (RNAi) (Fire et al., 1998) wurde eine vorübergehende Blockierung der Genexpression eines Glukose-Transporters und der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Skelly et al., 2003) und des Cathepsin B (Boyle et al., 2003) in S. manson i erreicht.

In diesen Studien wird die Expression schistosomaler Gene in vitro bzw. nur in einzelnen Stadien untersucht. Eine Aussage darüber, welche Bedeutung diese Gene im gesamten Lebenszyklus spielen, lässt sich daher durch diese Untersuchungen nicht machen (Fan et al., 1998; Franco et al., 1997). Deswegen ist die Entwicklung [Seite 20↓]eines Transfektionssystems, mit dem transgene Wurmlinien hergestellt werden können, notwendig. Die Entwicklung eines solchen Transfektionssystems ist auf Grund des komplexen Lebenszyklus schwierig (Franco et al., 2000).

Für Schistosomen gibt es keine kontinuierliche Zelllinie. Bislang ist die primäre Zellkultur von schistosomalen Zellen, die aus Sporozysten (Bayne et al., 1994) und aus adulten Würmern (Hobbs et al., 1993) isoliert wurden, beschrieben.

Adulte Würmer produzieren in vitro infertile Eier (Basch, 1981). Für die Kultur von S. japonicum sind die Aminosäuren Arginin und Glutamin notwendig (Kawanaka et al., 1986). Um die in den Schnecken lebenden Stadien kontinuierlich zu halten, wird eine Schneckenzelllinie aus Biomphalaria-Embryonen (Bge-Zelllinie) benötigt (Hansen et al., 1974). In Kokultur mit Bge-Zellen gelingt die Kultur von Tochtersporozysten, die sich in vitro aus Muttersporozysten (Coustau und Yoshino, 2000; Coustau et al., 1997; Hansen et al., 1975) entwickeln. Die Entwicklung von Zerkarien aus Muttersporozysten dauert in vitro mehrere Monate und ist als Standardmethode zur Produktion von Zerkarien nicht geeignet (Ivanchenko et al., 1999). Die axenische Kultur von Sporozysten unter geringen Sauerstoffkonzentrationen ist bislang nur in einem Labor gelungen (Bixler et al., 2001). Durch die eingeschränkten Kulturmöglichkeiten von S. mansoni kann nicht jedes Stadiums transfiziert werden und die Beschaffung von biologischem Material ist eingeschränkt (Franco et al., 2000).

Viele Standardmethoden zur Transfektion von Parasiten sind bislang für einzellige Apikomplexa entwickelt worden (Okuno et al., 2003; Kocken et al., 2002; Adamson et al., 2001). Im Gegensatz dazu gibt es erst wenige Ansätze Helminthen zu transfizieren. Lediglich der nicht-parasitische frei lebende Nematode C. elegans wird bislang standardmäßig zur Herstellung von transgenen Linien transfiziert (Brooks und Isaac, 2002; Hashmi et al., 2001; Praitis et al., 2001). Bis 2000, dem Beginn dieser Arbeit, gab es nur eine Studie zur Transfektion von parasitischen Trematoden (Davis et al., 1999). In einer neuen Studie, die parallel zu dieser Arbeit durchgeführt wurde, konnte eine transiente GFP-Expression in adulten und larvalen Schistosomen nachgewiesen werden. Bei diesen Versuchen wurde ein für die Expression in Pflanzen optimiertes GFP unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren für das 70 kDa-Hitzeschockprotein (HSP70) (Wippersteg et al., 2002 a und 2002 b) und das [Seite 21↓]Calcineurin (Rossi et al., 2003) eingesetzt. Die transiente Expression in den Schistosomen erwies sich als schwach, daher konnte großflächige GFP-Fluoreszenz nur durch Einsatz eines Laserscanningmikroskopes in 1 % der adulten Würmer nachgewiesen werden (persönliche Mitteilung Wippersteg).

Um dagegen eine stabile Transfektion von S. mansoni zu erreichen, ist es notwendig totipotente Zellen des Parasiten zu transfizieren. Dazu eignen sich Mirazidien oder Sporozyten, die im Inneren mit Keimballen aus undifferenzierten, diploiden Zellen angefüllt sind. Zudem muss der Lebenszyklus mit einem transgenen Stadium komplettiert werden, um von dem in vitro-Ansatz ausgehend die heterologe Expression vonGenen in vivo untersuchen zu können. Bislang ist die Implantation von Tochtersporozysten in die Zwischenwirtsschnecke beschrieben worden (Jourdane et al., 1985), außerdem wurden adulte Würmer in das Pfortadersystem von Mäusen implantiert (Cheever et al., 1994; Basch und Humbert, 1981). Von den zu transfizierenden Zellen hängt schließlich auch die Methode ab, mit der die DNA oder RNA eingebracht wird: Für die Untersuchung zur RNAi wurden Mirazidien und Zerkarien durch Baden in einer Lösung mit doppelsträngiger RNA transfiziert (Skelly et al., 2003; Boyle et al., 2003). In den bereits erwähnten Studien zur transienten Transfektion von Schistosomen wurde Plasmid-DNA durch Mikroprojektilbeschuss eingebracht (Rossi et al., 2003; Wippersteg et al., 2002 a und 2002 b; Davis et al., 1999). Bei dieser Methode werden Nukleinsäuren auf Goldpartikel präzipitiert und in den Zielorganismus durch Heliumdruck hineingeschossen (Taylor und Fauquet, 2002; Davidson, 2000). Eine weitere Möglichkeit zur Transfektion ist der Einsatz der Elektroporation. Durch Elektroporation werden einzellige Organismen wie Bakterien und Protozoen, aber auch Drosophila-, Zebrafisch- und Hühnerembryonen erfolgreich transfiziert (Gehl et al., 2003; Ogura, 2002). Die Mikroinjektion wird vor allem zur Transfektion von größeren vielzelligen Organismen eingesetzt, z.B. von Xenopus -und Zebrafischembryonen (Lohr und Yost, 2000), von Drosophila -Embryonen (O’Connor und Chia, 2002) und von C. elegans (Brooks und Isaac, 2002; Hashmi et al., 2001), weil DNA gezielt in einzelne Zellen injiziert werden kann.

Für die Expression der Reporter, die als Transfektionsmarker eingesetzt werden, sind gewebespezifische stark exprimierende Promotoren notwendig (Ogura et al., 2002). Diese Voraussetzung ist bei Schistosomen nicht einfach zu erfüllen, da es auf [Seite 22↓]Grund des komplexen Lebenszyklus außer einer gewebespezifischen Regulation z.B. von Proteasen (Brindley et al., 1997), eine geschlechtsspezifische Regulation (Prugnolle et al., 2003; Prugnolle et al., 2002; Hoffmann et al., 2002) und eine stadienspezifische Regulation (Franco et al., 1997; Fan et al., 1998) gibt. Da sich die Untersuchung des Genoms der Schistosomen bislang hauptsächlich auf ESTs beschränkt (Dias-Neto et al., 2000), sind nur die schistosomalen Promotoren für das Calreticulin (CAL) (Khalife et al., 1995), die 28 kDa-Glutathion-S-Transferase (GST28) (Serra et al., 1997 und 1996; Zemzoumi et al., 1995) und das 70 kDa-Hitzeschockprotein (HSP70) (Levy-Holtzman und Schechter, 1995 und 1996) in Promotorstudien genau charakterisiert worden. Der spliced leader (SL) RNA- Promotor wurde von Davis et al. (1999) zur Transfektion von adulten Würmern eingesetzt.

Luciferase eignet sich als sensitiver Marker in einem Proteingesamtextrakt, ermöglicht aber keinen Nachweis im lebendigen Organismus. Ein geeigneter Reporter für in vivo Untersuchungen ist GFP, das für die Ausbildung des Fluorophors keine Kofaktoren benötigt. Seine Ausbildung ist daher nicht auf die Zellen von Cnidariern beschränkt, aus denen es ursprünglich isoliert wurde (Prasher et al., 1995). Die Notwendigkeit von Sauerstoff für die Ausbildung des Fluorophors beschränkt den Einsatz von GFP auf aerobe Organismen (Ormö et al., 1996; Yang et al., 1996; Cubitt et al., 1995). Als Reportergen, das auch anaerob exprimiert wird, eignet sich β-Galaktosidase, die sich im Unterschied zu Luciferase auch histologisch in Geweben nachweisen lässt (Jackstadt et al., 1999; Fire, 1992).

1.6 Stabile Transfektion mit Hilfe von mobilen genetischen Elementen

Die mobilen genetischen Elemente (MGEs) werden in zwei Hauptkategorien zusammengefasst: MGEs der Klasse I transponieren über ein RNA-Intermediat, wohingegen MGEs der Klasse II direkt als DNA im Genom aktiv sind (Brindley et al., 2003). MGEs spielen eine wichtige Rolle in der Evolution eukaryotischer Genome (Malik und Eickbush, 2001; Charlesworth et al., 1994; Smit, 1993) und beeinflussen die Genomgröße (Petrov et al., 2000). Das schistosomale Genom enthält 60 % an repetitiven Elementen (Simpson et al., 1984). Im schistosomalen Genom wurden short inspersed nuclear elements (SINE) ähnliche Retrotransposons (Drew und Brindley, 1995; Spotila et al. 1989) und zwei Familien an Nicht-LTR [Seite 23↓]Retrotransposons (Laha et al., 2002 a und 2002 b) beschrieben. Im Genom von S. japonicum wurde das LTR-Retrotransposon Gulliver entdeckt (Laha et al., 2001). Ivanchenko et al. (1999) wiesen mRNA-Transkripte einer reversen Transkriptase und einer Endonuklease in Schistosomen nach, was bedeutet, dass möglicherweise einige MGEs im schistosomalen Genom aktiv sind (Copeland et al., 2003). Für ein nicht-LTR Retrotransposon und für Gulliver in S. japonicum wurde eine Transkription tatsächlich nachgewiesen (Laha et al. 2002 a; Laha et al., 2001). Auch in dem Plathelminthen Clonorchis sinensis wurde die Transkription eines LTR-Retrotransposons beschrieben (Bae et al., 2001). Boudicca ist das erste LTR-Retrotransposon aus S. mansoni, das vollständig sequenziert wurde (Copeland et al., 2003). Es ist im Aufbau dem Retrotransposon gypsiähnlich (Pantazidis et al., 1999). DNA-Transposons wurden in Schistosomen bislang nicht nachgewiesen. Lediglich in anderen Plathelminthen findet man DNA-Transposons (Arkhipova und Meselson, 2000; Robertson, 1997). In Dugesia wurde ein mariner-Transposon entdeckt (Garcia-Fernandez et al., 1995).

MGEs können für die genetische Transformation eingesetzt werden (Brindley et al., 2003; O’Brochta und Atkinson, 1996). Insbesondere Transposons (MGEs der Gruppe II) der mariner/TC1-Superfamilie bewegen sich weitgehend unabhängig von Wirtszellfaktoren und sind daher in den Genomen sehr verschiedener Spezies aktiv (Plasterk et al., 1999). Das Transposon mariner/mos1 aus Drosophila mauritana wurde zur Transfektion von Leishmania (Gueiros-Filho und Beverley, 1997), von Plasmodium (Mamoun et al., 2000), von Aedes (Coates et al., 1998), Bombyx (Wang et al., 2000) und C. elegans (Bessereau et al., 2001) eingesetzt. Es wurde zwar bislang kein DNA-Transposons in Schistosomen gefunden, der Nachweis eines mariner-Transposons in dem Plathelminthen Dugesia (Garcia-Fernandez et al., 1995) ist aber ein Hinweis darauf, dass mariner-Transposons möglicherweise auch im Genom von Schistosomen aktiv sind und daher für eine stabile Transfektion dieses Parasiten eingesetzt werden könnten (Brindley et al., 2003).

Aber auch MGEs der Gruppe I werden für Transfektionen eingesetzt (Miller und Rosman, 1989). Retroviren und Retroelemente besitzen eine stärkere Wirtsspezifität als DNA-Transposons, deswegen ist der Einsatz eines endogenen Retroelementes für die stabile Transfektion besonders interessant, obgleich die Wirtsspezifität durch [Seite 24↓]Pseudotypisierung mit dem envelope-Glykoprotein des vesicular stomatitis-Virus (Burns et al., 1993) erweitert werden kann. Sogar die gerichtete Integration in bestimmte Gene ist möglich (Sandmeyer, 2003). Die vorliegende Boudicca-Sequenz enthält Mutationen (Copeland et al., 2003). Damit Boudicca als molekularbiologisches Werkzeug zur Transfektion eingesetzt werden kann, müsste dieses Retroelement aus S. mansoni durch Mutagenese reaktiviert werden. Inaktive DNA-Transposons wurden bereits durch Mutagenese reaktiviert (Plasterk et al., 1999; Robertson und Lampe, 1995).

1.7 Ziele dieser Arbeit

  1. Herstellung von Plasmiden zur transienten Transfektion von S. mansoniunter Verwendung des CAL-, des GST28- und des HSP70-Promotors und unter Verwendung von EGFP und β-Galaktosidase als Reporter
  2. Überprüfung der Funktionalität und Quantifizierung der Promotorstärke in der Zellkultur
  3. Entwicklung eines Transfektionsystems für S. mansoni unter Verwendung von Mikroinjektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss
  4. Nachweis der Reportergenaktivität in S. mansoni
  5. Klonierung der nicht translatierten 5’-Regionen (5’-UTRs) des Cathepsin D und eines Aktins als potentielle Promotoren für die Transfektion
  6. Einschleusen eines transgenen Stadiums in den Zyklus
  7. Charakterisierung des endogenen Retroelementes Boudicca für
    eine stabile Transfektion von S. mansoni: Untersuchungen seiner Transkription in den verschiedenen Stadien und Rekonstruktion
    der vollständigen Kopie durch Klonierung eines vollständigen Transkript


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24.05.2004