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2  Ergebnisse

2.1 Herstellung von Vektoren zur Expression von EGFP und β-Galaktosidase unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren

2.1.1 Isolation des CAL-, des GST28- und des HSP70-Promotors aus genomischer DNA

Der CAL-, der GST28- und der HSP70-Promotor sind die einzigen schistosomalen Promotoren, für die Promotorstudien durchgeführt worden sind. Um sie aus genomischer DNA zu isolieren, wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als präparative Methode eingesetzt (Tab. 2.1).

Tab. 2.1: Polymerase-Kettenreaktion zur Isolation schistosomaler Promotoren aus genomischer DNA

Promotor

Primer

Größe des erwarteten Fragmentes

Zugangs-nummer

Referenz

CAL

Cal-for; Cal-rev

623 bp

L24159

Khalife et al.,1993

GST28

Gst-for; Gst-rev

337 bp

M98271

McNair et al.,1993

HSP70

Hsp-for; Hsp-rev

532 bp

L02415

Neumann et al., 1992


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Die eingesetzten Primer ermöglichten jeweils die
Amplifikation der gesamten Sequenzen der 5’-UTRs. Die amplifizierten
Fragmente wiesen die richtigen Größen auf (Abb. 2.1)



Abb. 2.1: Isolation der schistosomalen Promotoren aus genomischer DNA. Spur 1 und 2: Amplifikation der 623 bp umfassenden 5’-UTR des Cal-Gens mit den Primern Cal-for und Cal-rev. Spur 3 und 4: Amplifikation der 337 bp umfassenden 5’-UTR des GST28-Gens mit den Primern GST-for und GST-rev. Spur 5 und 6: Amplifikation der 532 bp umfassenden 5’-UTR des HSP70-Gens mit den Primern HSP-for und HSP-rev. M ist der Marker.

2.1.2 Subklonierung der Promotoren und Sequenzierung

Zur Subklonierung in das Plasmid pBluescript SK+ (pBSK) war mit den Vorwärtsprimern Cal-for und GST-for am 5’-Ende der entsprechenden Amplikons eine Restriktionsschnittstelle für EcoR I eingefügt worden. HSP-for amplifiziert eine am 5’-Ende vorhandene endogene EcoR I-Schnittstelle. Die Rückwärtsprimer Cal-Rev, GST-rev und HSP-rev fügten am 3‘-Ende der PCR-Produkte eine Hind III-Schnittstelle ein. Nach Aufreinigung der Promotorfragmente und Restriktion mit EcoR I und Hind III wurden sie in den entsprechend geschnittenen pBSK ligiert. Die Sequenzananalyse der in pBSK subklonierten Promotorsequenzen ergab für den Cal-Promotor ein zusätzliches T in Position 116, einen Basenaustausch von G gegen [Seite 27↓]A in Position 307 und einen Basenaustausch von G gegen A in Position 410. Der klonierte GST-Promotor wies eine Deletion von C in Position 69 auf und der HSP-Promotor zeigte keine Unterschiede zu der veröffentlichten Sequenz. Diese Mutationen liegen alle außerhalb der regulatorischen Bereiche der Promotoren (siehe Anhang I).

2.1.3 Herstellung von promotorlosen Kontrollplasmiden

Um die Aktivität der Promotoren eindeutig nachweisen zu können,
wurden Kontrollplasmide, die kodierende Sequenzen für die Reportergene
EGFP und β-Galaktosidase, aber keinen Promotor zu ihrer Expression enthielten, hergestellt. Der Reporter EGFP lag in dem Plasmid pEGFP-N1 vor. Dieser
Vektor ermöglicht die Expression von EGFP unter dem Cytomegalievirus-Promotor (CMV-Promotor). Zur Eliminierung des Promotors wurde pEGFP-N1 mit den Restriktionsendonukleasen Ase I und Xho I verdaut, der Restriktionsansatz
auf einem Agarosegel aufgetrennt und das Plasmidgerüst ohne den CMV-Promotor aufgereinigt. Durch Auffüllen der überhängenden 5’-Enden mit
dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und anschließende Ligation wurde das promotorlose Plasmid pEGFP-oP mit EGFP kodierender Sequenz hergestellt.
Das Fehlen des Promotors wurde durch Sequenzierung nachgewiesen (siehe Anhang I). Um ein promotorloses Plasmid mit β-Galaktosidase kodierender Sequenz herzustellen, wurde die kodierende Sequenz für EGFP aus pEGFP-oP
mit den Restriktionsendonukleasen Sma I und Not I ausgeschnitten und gegen die kodierende Sequenz für die β-Galaktosidase ausgetauscht, das Plasmid wurde pβ-Gal-oP genannt.

2.1.4 Herstellung von Plasmiden zur Expression von EGFP und β-Galaktosidase

Die in pBSK subklonierten schistosomalen Promotoren wurden durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und Kpn I, Auftrennung auf einem Agarosegel und anschließender Aufreinigung gewonnen und in das entsprechend geschnittene Plasmid pEGFP-oP ligiert (Tab. 2.2) (siehe Anhang II).

Die Herstellung von Plasmiden zur Expression von β-Galaktosidase unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren erfolgte durch Austausch der EGFP- kodierenden Sequenz gegen die β-Galaktosidase-kodierende Sequenz (siehe 2.1.3).


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Tab. 2.2: Übersicht 1 über die hergestellten Plasmide zur Expression von Reportern unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren und die Kontrollplasmide.

Plasmid

Reporter

Promotor

pEGFP-oP

EGFP

ohne

pEGFP-C

EGFP

CAL

pEGFP-G

EGFP

GST28

pEGFP-H

EGFP

HSP70

pβ-Gal-CMV

β-Galaktosidase

CMV

pβ-Gal-oP

β-Galaktosidase

ohne

pβ-Gal-C

β-Galaktosidase

CAL

pβ-Gal-G

β-Galaktosidase

GST28

pβ-Gal-H

β-Galaktosidase

HSP70


Als Positivkontrolle zur Überprüfung der EGFP-Expression wurde das Ursprungsplasmid pEGFP-N1 eingesetzt. Ein entsprechendes Plasmid zur Überprüfung der β-Galaktosidase-Aktivität wurde durch Austausch der EGFP kodierenden Sequenz in pEGFP-N1 gegen die β-Galaktosidase kodierende Sequenz hergestellt (siehe 2.1.3), das gewonnene Plasmid pβ-Gal-CMV exprimiert β-Galaktosidase unter der Kontrolle des CMV-Promotors.

2.1.5 Überprüfung der Expression von EGFP und β-Galaktosidase in cos7-Zellen

Die Funktionalität der hergestellten Plasmide wurde in cos7-Zellen nachgewiesen (Levy-Holtzmann et al., 1995). 48 h nach der Transfektion durch Elektroporation wurde die EGFP-Expression fluoreszenzmikroskopisch in lebenden Zellen untersucht. Die Negativkontrolle wurde durch Zellen repräsentiert, die mit dem promotorlosen Plasmid pEGFP-oP transfiziert wurden. Sie wiesen keine Fluoreszenz auf. Als Positivkontrolle dienten mit pEGFP-N1 transfizierte Zellen, hier wiesen 2,5 % der Zellen grüne EGFP-Fluoreszenz auf (Abb. 2.2 a) Auch der Cal-Promotor (Abb. 2.2 b), der GST28-Promotor (Abb. 2.2 c) und der HSP70-Promotor (Abb. 2.2 d) exprimierten EGFP in cos7 -Zellen, hier betrug der Anteil an grün fluoreszierenden Zellen 0,25-0,5 % ; die Fluoreszenz war deutlich schwächer als bei der Positivkontrolle; zur Induktion des HSP70-Promotors war kein Hitzeschock nötig.


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Die β-Galaktosidase-Expression wurde 48 h nach der Transfektion in Paraformaldeyd-fixierten Zellen mit Hilfe einer Farbreaktion nachgewiesen. In mit dem promotorlosen Plasmid pβ-Gal-oP transfizierten Zellen konnte keine Färbung beobachtet werden, im Unterschied dazu wiesen 3 % der Zellen der Positivkontrolle, die mit pβ-Gal-CMV transfiziert waren, eine starke Färbung auf (Abb. 2.3 a). Die Expression unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren war wiederum deutlich schwächer, hier lag die Transfektionsrate bei 0,5 %, β-Galaktosidase wurde unter der Kontrolle des Cal-Promotors (Abb. 2.3 b), des GST28-Promotors (Abb. 2.3 c) und des HSP70-Promotors (Abb. 2.3 d) in cos7-Zellen nachgewiesen.


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Abb. 2.2: EGFP-Expression in cos7-Zellen unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: Positivkontrolle: mit pEGFP-N1 transfizierte Zellen; a’: zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme. b: mit pEGFP-C transfizierte Zellen; b’ zu b korrespondierende Durchlichtaufnahme. c: mit pEGFP-G transfizierte Zellen; c’ zu c korrespondierende Durchlichtaufnahme. d mit pEGFP-H transfizierte Zellen; d’ zu d korrespondierende Durchlichtaufnahme. Größenbalken 50 μm.


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Abb. 2.3: β -Galaktosidase-Expression in cos7 -Zellen unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: Positivkontrolle: mit pβ-Gal-CMV transfizierte Zellen. b: mit pβ-Gal-C transfizierte Zellen. c: mit pβ-Gal-G transfizierte Zellen. d: mit pβ-Gal-H transfizierte Zellen. Größenbalken 150 μm.


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2.1.6  Endogene β-Galaktosidase-Aktivität in S. mansoni

Um zu überprüfen, ob sich die β-Galaktosidase als Reporter in transgenen Schistosomen eignet, wurde ihre endogene Aktivität in unbehandelten Würmern überprüft. Die Bestimmung der β-Galaktosidase erfolgte colorimetrisch, wobei gleiche Proteinmengen eines Proteingesamtextraktes weiblicher und männlicher Würmer eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle diente eine E.coli-Kultur, die β-Galaktosidase exprimiert, als Negativkontrolle diente eine E.coli-Kultur, die β-Galaktosidase nicht exprimiert. Es stellte sich heraus, dass adulte Würmer eine endogene β-Galaktosidase-Aktivität aufweisen, wobei die gemessene endogene β-Galaktosidase in weiblichen Würmern bei gleichen Proteinmengen doppelt
so stark wie in männlichen Würmern (Abb. 2.4) war. Da eine hohe endogene
Aktivität die Verwendbarkeit der β-Galaktosidase als Reporter in
Transfektionsversuchen einschränkt, wurden in den
Transfektionsversuchen mit β-Galaktosidase nur Männchen eingesetzt.



Abb. 2.4: Endogene β -Galaktosidase-Aktivität in adulten S. mansoni . Es wurden keine Werte
für die spezifische Aktivität bestimmt: Dennoch zeigt sich, dass die Weibchen
eine stärkere endogene β-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die Männchen.
Dargestellt sind die Werte für die Extinktion bei 570 nm, für die Messung wurden gleiche Proteinmengen eingesetzt.




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2.1.7  Ermittlung der Promotorstärke in der Zellkultur

Bisher wurde gezeigt, dass die hergestellten Plasmide EGFP und β-Galaktosidase in cos7-Zellen exprimieren. Um die Stärke der Expression durch die verschiedenen Promotoren zu quantifizieren, wurde die β-Galaktosidase-Aktivität in transient transfizierten Zellpopulationen mit Hilfe eines kommerziellen Tests 48 h nach der Transfektion colorimetrisch bestimmt und daraus die spezifische β-Galaktosidase-Aktivität nach Angaben des Herstellers ermittelt (Abb. 2.5). Als Negativkontrolle wurden Zellen mit dem promotorlosen Plasmid pβ-Gal-oP transfiziert, hier lag die spezifische Aktivität der β—Galaktosidase bei 0,35 U/mg Gesamtprotein. Die Aktivität der β-Galaktosidase bei der Expression der β-Galaktosidase unter der Kontrolle des CAL-Promotors betrug 0,49 U/mg Gesamtprotein, das entspricht einer Steigerung von 40 % gegenüber der Negativkontrolle (p<0,0001).

Abb. 2.5: Ermittlung der Stärke schistosomaler Promotoren durch Messung der
spezifischen
β -Galaktosidase-Aktivität in cos7 -Zellen. Als Negativkontrolle diente eine Zellpopulation, die mit dem promotorlosen Plasmid transfiziert wurde, Positivkontrolle ist eine Zellpopulation, in der β-Galaktosidase unter dem CMV-Promotor exprimiert wird. Der GST28-Promotor erwies sich in der Zellkultur als stärkster Promotor. Ein Hitzeschock hat keinen Einfluss auf die Expression unter der Kontrolle des HSP70-Promotors in dem Plasmid pβ-Gal-H (HSP70+ mit Hitzeschock; HSP70- ohne Hitzeschock). Dargestellt sind die Mittelwerte inkl. Standardabweichung, die aus den Vierfachbestimmungen berechnet wurden.



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Um den Einfluss eines Hitzeschocks auf die Expression von β-Galaktosidase unter der Kontrolle des HSP70-Promotors zu untersuchen, wurden mit dem Plasmid pβ-Gal-H transfizierte Zellen mit und ohne Hitzeschock kultiviert (siehe 5.1.4.1.4). Der Hitzeschock führte zu keiner Erhöhung der Expression an β-Galaktosidase durch das Plasmid pβ-Gal-H. Die Aktivität der β-Galaktosidase in nicht hitzegeschockten Zellen betrug 0,49 U/mg Gesamtprotein, was einer Steigerung 40,0 % gegenüber der Negativkontrolle entspricht (p<0,0001), in den hitzegeschockten Zellen betrug die spezifische Aktivität 0,44 U/mg Gesamtprotein, was eine Steigerung von 25,7 % gegenüber der Negativkontrolle bedeutet (p=0,04). Der stärkste schistosomale Promotor in der Zellkultur war der GST28-Promotor mit einer spezifischen Aktivität von 0,8 U/mg Gesamtprotein, die Aktivität der β-Galaktosidase war in mit dem Plasmid pβ-Gal-G transfizierten Zellen um 128,6 % gegenüber der Negativkontrolle gesteigert (p<0,0001). Die spezifische β-Galaktosidase-Aktivität in der Positivkontrolle betrug 1,39 U/mg Gesamtprotein und war damit um 297,1 % gegenüber der Negativkontrolle gesteigert (p<0,0001).

2.1.8 Herstellung eines durch Hitzeschock aktivierbaren Plasmids zur Expression von EGFP

Weil sich die Plasmide pEGFP-H und pβ-Gal-H, die beide den HSP70-Promotor enthalten, nicht durch einen Hitzeschock induzieren ließen (siehe 2.1.5 und 2.1.7), wurde ein weiteres Plasmid zur transienten Expression von EGFP auf Grundlage der in der Genbank unter der Zugangsnummer L02415 veröffentlichten Sequenz des schistosomalen HSP70-Gens hergestellt.

Zur Isolation der 5’-UTR und der 3’-UTR des HSP70-Gens aus genomischer DNA wurde wiederum die PCR als präparative Methode eingesetzt. Die EGFP kodierende Sequenz wurde aus pEGFP-N1 ausgeschnitten und über ein Agarosegel aufgereinigt (Tab. 2.3).


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Tab. 2.3: Fragmente zur Herstellung eines Konstruktes zur Expression von EGFP unter den nativen Bedingungen des HSP70-Gens

Fragment

Primer

Größe des erwarteten Fragmentes

Restriktionsschnittstellen

HSP70-5’-UTR

HSP-for; HSP-revBamHI

532 bp

EcoR I; BamH I

HSP70-3’-UTR

HSP3’-for; HSP3’-rev

760 bp

Xba I; Hind III

EGFP

keine

720 bp

BamH I; Xba I


Die drei Fragmente wurden nacheinander in den entsprechend geschnittenen Vektor pUC19 kloniert. Das hergestellte Plasmid pH-EGFP-H exprimiert EGFP unter den natürlichen Bedingungen des HSP70-Gens von S. mansoni.

Die Funktionalität dieses neuen Plasmids pH-EGFP-H wurde wiederum in cos7-Zellen getestet. Als Negativkontrolle diente das promotorlose Plasmid pEGFP-oP, als Positivkontrolle pEGFP-N1. Mit dem Plasmid pH-EGFP-H transfizierte Zellen wurden mit und ohne Hitzeschock kultiviert (siehe 5.1.4.1.4). Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung wurde keine EGFP-Fluoreszenz in der nicht hitzegeschockten Zellpopulation festgestellt. Demgegenüber fluoreszierten

0,5 % der hitzegeschockten Zellen (Abb. 2.17 a, S. 58).

2.2 Entwicklung eines Systems zur genetischen Transfektion von S. mansoni

Um DNA in die Schistosomen einzubringen, wurden verschiedene Transfektionsmethoden getestet. Entscheidend für die Eignung der Methode war die Möglichkeit ein Stadium zu transfizieren, das in den Lebenszyklus integriert werden kann. Deswegen bezogen sich Transfektionsversuche zunächst auf ein larvales Stadium, die Muttersporozyste, die sich in vitro in großen Mengen gewinnen lässt und die durch Implantation in die Zwischenwirtsschnecke in den Zyklus integriert werden sollte.

2.2.1 Mikroinjektion

Mit Hilfe der Mikroinjektion wurde versucht, DNA direkt in die Keimballen der Muttersporozysten zu injizieren.

Die Mikroinjektion wurde für die Transfektion von Sporozysten angepasst. Die wichtigsten Ansätze zur Optimierung waren die Reduktion des Durchmessers der [Seite 36↓]Haltenadel auf einen Innendurchmesser von 5-10 μm, um eine große Auflagenfläche für die Sporozysten zu erhalten, und der Einsatz von Sporozysten, die nach 48 h Kultur in vitro weniger beweglich waren als Sporozysten direkt nach ihrer Transformation aus Mirazidien.

In Vorversuchen gelang es 0,1 μl Mikroinjektionspuffer in die Sporozysten zu injizieren (Abb. 2.6). Sporozysten wurden durch die Mikroinjektion zwar beschädigt, konnten aber dennoch bis zu einer Woche in Kultur gehalten werden. Der Injektionserfolg wurde auch durch die Injektion von Trypan-Blau mikroskopisch nachgewiesen.


Abb. 2.6: Vorgang der Mikroinjektion einer Muttersporozyste. Die Sporozyste (S) wird von der Haltenadel (H) fixiert, sodass ein Keimballen (Pfeil) in der Öffnung der Haltenadel liegt (a). Mit der Injektionsnadel (I) wird Plasmid-DNA direkt in den Keimballen injiziert (b). Größenbalken 200 μm.



Nach diesen Vorversuchen wurden Sporozysten mit promotorlosem pEGFP-oP und mit pEGFP-G mikroinjiziert. Als weitere Negativkontrolle wurden unbehandelte [Seite 37↓]Sporozysten kultiviert. Nach 48 h wurde der Transfektionserfolg unter dem Mikroskop untersucht. Beide Gruppen von mikroinjizierten Sporozysten wiesen eine sehr starke endogene Fluoreszenz auf, sodass EGFP-Fluoreszenz nicht zu detektieren war.

Die unbehandelten Sporozysten wiesen im Unterschied dazu geringere Eigenfluoreszenz auf. Offensichtlich wird die endogene unspezifische Fluoreszenz durch den Stress, dem die Sporozysten bei der Mikroinjektion ausgesetzt sind, verstärkt. Insgesamt konnte außerdem nur eine geringe Anzahl von Sporozysten pro Tag mikroinjiziert werden, sodass nicht ausreichend biologisches Material für weitere biochemische und genetische Analysen erzeugt werden konnte.

Die Mikroinjektion wurde daher zur Transfektion von Sporozysten in weiteren Versuchen nicht eingesetzt.

2.2.2 Elektroporation

Die Methode der Elektroporation wird erfolgreich zum Einbringen von DNA und RNA in Bakterien, einzellige Protozoen aber auch multizelluläre Organismen wie Drosophila-Embryonen, Zebrafisch-Embryonen oder Hühner-Embryonen eingesetzt (Gehl, 2003).

Zunächst wurden Sporozysten ohne DNA in Anlehnung an diese Protokolle elektroporiert. Die Überlebensrate bei einer Elektroporation mit der Feldstärke von 660 V/cm mit zwei Pulsen von 250 μs lag bei 80 %; bei der Elektroporation bei einer Feldstärke von 910 V/cm mit einem Puls von 250 μs lag die Überlebensrate bei 50 %. Auffallend war eine Formveränderung der Sporozysten. Die normalerweise zylinderförmigen Organismen kugelten sich ab. Ihre Vitalität wurde mikroskopisch anhand peristaltischer Bewegungen und schlagender Wimpernzellen in den Protonephridien nachgewiesen. Die unmittelbar nach der Elektroporation zu beobachtenden morphologischen Veränderungen der Sporozysten waren reversibel. Nach 24 h ließen sich elektroporierte Sporozysten nicht mehr von unbehandelten Sporozysten unterscheiden. Die Formveränderungen waren ein Hinweis darauf, dass sich Membraneigenschaften durch das Anlegen des elektrischen Feldes bei der Elektroporation veränderten.

Um die Elektropermeabilisierung der Sporozystenmembran nachzuweisen, wurden Sporozysten in Anwesenheit von Propidiumiodid elektroporiert (Gabriel und Teissie, [Seite 38↓]1997; Sersa et al., 1995). Sporozysten, die mit Propidiumiodid elektroporiert wurden, wiesen im Unterschied zu Sporozysten, die ohne diesen Farbstoff elektroporiert wurden, oder zu Sporozysten, die mit dem Farbstoff ohne anschließende Elektroporation inkubiert wurden, eine deutliche orange-rote Fluoreszenz in der Oberfläche bei der Anregung mit Licht der Wellenlänge 546 nm (Grünlicht) unter dem Epifluoreszenzmikroskop auf. Da Propidiumiodid nicht durch eine intakte Membran diffundieren kann, ist die Fluoreszenz in den Sporozysten, die nach der Elektroporation zu beobachten ist, ein eindeutiger Hinweis darauf, dass die Sporozystenmembran elektropermeabilisiert wurde.

Für die genetische Transformation wurden Muttersporozysten in Anwesenheit von Plasmid-DNA (pEGFP-H oder pEGFP-G) in einer Konzentration von 20 bis 100 ng /μl elektroporiert. Sporozysten wiesen nach der Elektroporation starke endogene Fluoreszenz auf, wie sie zuvor bei der Mikroinjektion beobachtet worden war (siehe 2.2.1). Diese Eigenfluoreszenz war in unbehandelten Sporozysten nicht zu beobachten, sie trat aber auch auf, wenn Sporozysten ohne DNA elektroporiert wurden. Das bedeutet, dass der Stress, dem die Sporozysten bei der Elektroporation ausgesetzt sind, die endogene Fluoreszenz verstärkt. Auf Grund der Eigenfluoreszenz konnte keine EGFP-Fluoreszenz detektiert werden. Um die EGFP-Fluoreszenz zu verstärken, wurde versucht, das Eindringen von DNA bei der Elektroporation zu erhöhen. Aber auch bei der Elektroporation in Anwesenheit von DEAE/DEXTRAN (Neumann et al., 1996), konnte mikroskopisch keine EGFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden.

Außerdem erwies sich die Langzeitkultur elektroporierter Sporozysten im Vergleich zu nicht elektroporierten Sporozysten als problematisch. Obgleich 50-80 % der Sporozysten 24 h nach der Elektroporation vital waren und sich nicht von unbehandelten Sporozysten unterschieden, ließen sich elektroporierte Sporozysten maximal 96 h in vitro kultivieren. Unbehandelte Sporozysten dagegen waren unter den gleichen Kulturbedingungen bis zu 10 Tagen vital.


[Seite 39↓]


Abb. 2.7: Nachweis der EGFP-Expression in elektroporierten Sporozysten. Spur 1: pEGFP-H: Elektroporation bei 660V/cm und 2 Pulsen; Spur 2: pEGFP-H: Elektroporation bei 910V/cm und 1 Puls; Spur 3: pEGFP-G: Elektroporation bei 660V/cm und 2 Pulsen; Spur 4: Negativkontrolle pEGFP-oP: Elektroporation bei 660 V/cm und 2 Pulsen.


Um die Expression von EGFP molekularbiologisch nachzuweisen, wurde 3 Tage nach der Elektroporation aus elektroporierten Sporozysten die Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und auf EGFP-Transkripte untersucht. In mit pEGFP-H und pEGFP-G transfizierten Sporozysten wurden EGFP-Transkripte mit der Größe von 720 bp nachgewiesen (Abb. 2.7).

Die Expression von β-Galaktosidase in fixierten und histologisch gefärbten Sporozysten konnte nicht nachgewiesen werden. Ein Nachweis der β-Galaktosidase durch RT-PCR war auf Grund der endogenen Aktivität dieses Enzyms auch nicht möglich.

Die Ergebnisse zur Transfektion von Sporozysten durch die Elektroporation zeigten, dass die zuvor in Zellkulturzellen in vitro getesteten Plasmide (siehe 2.1.5), die EGFP unter der Kontrolle des HSP70 und des GST28-Promotors exprimieren, auch in den Sporozysten EGFP-Expression ermöglichen. Insgesamt aber erwies sich die Elektroporation zur Transfektion von Sporozysten als ungeeignet, da eine Kultur der [Seite 40↓]elektroporierten Sporozysten, die Voraussetzung für eine Integration in den Zyklus ist, nicht möglich war. Die Elektroporation wurde daher in weiteren Versuchen nicht zur Transfektion von Sporozysten eingesetzt.

2.2.3 Mikroprojektilbeschuss

Der Mikroprojektilbeschuss wird sowohl zur stabilen als auch zur transienten Transfektion in pflanzlichen und tierischen Geweben eingesetzt (Taylor und Fauquet, 2002; Davidson et al., 2000). Bei dieser Methode wird die DNA an Goldpartikel präzipitiert, die dann in den Organismus hineingeschossen werden.

In Vorversuchen wurde nachgewiesen, dass Sporozysten und adulte Würmer nach einer kurzen Inkubation in einem Vakuum von 15 mm Quecksilbersäule, das für den Mikroprojektilbeschuss angelegt werden muss, vital waren. Auch das Entfernen des Kulturmediums und das damit verbundene Trockenfallen der Parasiten für eine kurze Zeit, schränkte ihre Vitalität nicht ein.

Um die Bedingungen zur Transfektion von Sporozysten zu optimieren,
wurden anstelle von DNA mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)
gelabelte Oligonukleotide eingesetzt. FITC fluoresziert bei der Anregung mit Licht
der Wellenlänge 490 nm (Blaulicht) gelb-grün bei einer Wellenlänge von 507 nm. Die Spektren für die Absorption und Emission ähneln damit denen des EGFP.
Im Unterschied zu EGFP kann die Fluoreszenz direkt beobachtet werden, ohne
auf eine Expression warten zu müssen. Zudem verhalten sich die
Oligonukleotide beim Beladen der Goldpartikel wie DNA. Die FITC-Fluoreszenz verhält sich daher proportional zu der übertragenen DNA-Menge und der Transfektionsrate. Die FITC-Intensität wird durch einen hohen Heliumdruck beim Beschuss, mit dem tiefere Gewebeschichten in den Sporozysten erreicht werden, durch eine erhöhte Goldmenge, mit der mehr DNA transportiert wird und durch eine größere Oligonukleotid-Menge gesteigert. Die Überlebensrate verhält sich gegenläufig. Um eine hohe Überlebensrate bei einer hohen Transfektionsrate zu ermitteln, wurden Drücke zwischen 900 und 1800 Psi, Goldmengen zwischen 0,6 und 1,2 mg und Oligonukleotid-Mengen zwischen 1 und 10 μg für den Beschuss von Sporozysten eingesetzt. Standardmäßig wurden Goldpartikel mit einer Größe von 1 μm eingesetzt. Die höchste Transfektionseffizienz mit einer Überlebensrate von 80 % [Seite 41↓]der Muttersporozysten wurde durch den Einsatz von 0,6 mg Gold, 5 μg DNA und einem Druck von 900 Psi für den Beschuss erzielt. Beschossene Sporozysten konnten in vitro bis zu 10 Tagen kultiviert werden. Die adulten Würmer erwiesen sich als widerstandsfähiger gegenüber dem Mikroprojektilbeschuss. Um zu gewährleisten, dass möglichst viel DNA in die Würmer übertragen wird, wurden sie bei 1800 Psi zweimal kurz hintereinander mit jeweils 0,6 mg Gold und 5 μg DNA beschossen.

2.2.3.1 Nachweis der Reportergenaktivität in adulten Würmern und Sporozysten

Die Transfektion von Sporozysten durch Mikroprojektilbeschuss wurde zunächst mit 0,6 mg Gold und 5 μg bei einem Druck von 1500 Psi durchgeführt. In diesen Versuchen lag die Überlebensrate der Sporozysten bei 10 %. Die Sporozysten wurden nach dem Beschuss bei 28°C kultiviert und nach 48 h epifluoreszenzmikroskopisch, d.h. mit Auflichtfluoreszenz, untersucht. In Sporozysten, in denen EGFP unter der Kontrolle des GST28-Promotors durch das Plasmid pEGFP-G exprimiert wurde, war nach dem Quenchen der Eigenfluoreszenz durch Trypan-Blau (Loike und Silverstein,1983) in einzelnen Zellen bei einer Anregungswellenlänge von 450-490 nm (Blaulicht) grüne EGFP-Fluoreszenz detektierbar (Abb. 2.8 a). Um nachzuprüfen, ob die beobachtete Fluoreszenz spezifisch für EGFP war, wurde die Fluoreszenz der Sporozysten vergleichend bei Anregung mit einer Wellenlänge von 546 nm (Grünlicht) untersucht. EGFP-Fluoreszenz konnte nicht mehr beobachtet werden (Abb. 2.8 a’). Die beobachtete grüne Fluoreszenz beruht also auf der Expression von EGFP in einzelnen Zellen der Sporozysten. In der Durchlichtaufnahme (Abb. 2.8 a’’) ist zu sehen, dass Trypan-Blau, mit dem die endogene Fluoreszenz gequencht wurde, in die Sporozysten eingedrungen war. Trypan-Blau diffundiert nicht durch eine intakte Membran. Die Sporozysten wurden offensichtlich bei dem Beschuss stark beschädigt. Dennoch konnte ihre Vitalität zum Zeitpunkt der mikroskopischen Untersuchung anhand peristaltischer Bewegungen und schlagender Wimpernzellen in den Protonephridien nachgewiesen werden. Einen weiteren Hinweis auf ihre Vitalität liefert die beobachtete Expression des EGFP. Die Negativkontrolle wurde repräsentiert durch Sporozysten, die mit dem promotorlosen Plasmid pEGFP-oP transfiziert worden waren. Grüne EGFP-Fluoreszenz wurde hier nicht detektiert.
[Seite 42↓]In mit pβ-Gal-G transfizierten Sporozysten, das die β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des GST28-Promotors ermöglicht, wurde 48 h nach dem Mikroprojektilbeschuss die Expression von β-Galaktosidase nachgewiesen. In der entsprechenden Negativkontrolle, die durch Sporozysten repräsentiert wurde, die mit dem promotorlosen Plasmid pβ-Gal-oP transfiziert worden waren, konnte keine β-Galaktosidase-Expression festgestellt werden (Tab. 2.4).

In Sporozysten, die mit dem Plasmid pEGFP-H transfiziert wurden, das eine Expression von EGFP unter der Kontrolle des HSP70-Promotors ermöglicht, wurde keine EGFP-Fluoreszenz detektiert. Die Transkription von EGFP durch das Plasmid pH-EGFP-H, in dem die SV40-Polyadenylierungsstelle gegen den endogenen nicht translatierten HSP70-3’-Bereich ausgetauscht war, ließ sich durch eine RT-PCR nachweisen (Tab 2.4). Die Expression von EGFP unter der Kontrolle des CAL-Promotors mit dem Plasmid pEGFP-C konnte nicht gezeigt werden.

Durch Absenken des Druckes auf 900 Psi wurde die Überlebensrate der Sporozysten auf 80 % gesteigert. 48 h nach der Transfektion konnte EGFP-Fluoreszenz in intakten Sporozysten nicht nachgewiesen werden. Mit pEGFP-G transfizierte intakte Sporozysten wiesen unter dem Epifluoreszenzmikroskop punktförmige fluoreszierende Bereiche auf (Abb. 2.8 b) und unterschieden sich nicht von der Negativkontrolle (Abb. 2.8 c), die durch Sporozysten repräsentiert wurde, die mit dem promotorlosen Plasmid transfiziert worden waren. Das Quenchen der Eigenfluoreszenz war in den unversehrten Sporozysten nicht möglich, da Trypan-Blau nicht durch eine intakte Membran diffundieren kann. Auch die Expression von EGFP unter der Kontrolle des HSP70-Promotors mit den Plasmiden pEGFP-H und pH-EGFP-H oder unter der Kontrolle des CAL-Promotors mit dem Plasmid pEGFP-C führte zu keiner detektierbaren Fluoreszenz in intakten Sporozysten.

Da die Würmer widerstandsfähiger gegenüber dem Mikroprojektilbeschuss waren, wurden sie für die Optimierung der Transfektion anstelle von Sporozysten eingesetzt. Adulte Würmer wurden im Unterschied zu den Sporozysten bei einem Druck von 1800 Psi zweimal innerhalb weniger Minuten beschossen. Nach einer 24-stündigen Kultur bei 37°C wurden sie für 4 h bei 42°C hitzegeschockt und dann weitere 24 h bei 37°C kultiviert, bevor sie mikroskopisch untersucht wurden. Auf diese Weise kultivierte mit pH-EGFP-H transfizierte adulte Würmer wiesen bei der [Seite 43↓]epifluoreszenzmikroskopischen Untersuchung keine sichtbare EGFP-Fluoreszenz (Abb. 2.9 a) im Vergleich zu der Negativkontrolle (Abb. 2.9 b) auf, die durch mit dem promotorlosen Plasmid beschossene Würmer repräsentiert wurde. In der zu
Abb. 2.9 a korrespondierenden Durchlichtaufnahme a’ sind zahlreiche Goldpartikel zu erkennen. Diese Goldpartikel ließen sich in unterschiedlichen fokalen Ebenen nachweisen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass sie in das Gewebe eingedrungen waren. Eine sichtbare Expression von EGFP war mit den Plasmiden pEGFP-H und pEGFP-G allerdings nicht möglich. Um dennoch die Transkription von EGFP molekularbiologisch nachzuweisen, wurde 2 Tage nach der Transfektion aus beschossenen Würmern die Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und auf EGFP-Transkripte untersucht. Sowohl in mit pH-EGFP-H als auch in pEGFP-G transfizierten adulten Würmern wurden EGFP-Transkripte mit EGFP-spezifischen Primern nachgewiesen (Abb. 2.9 c). Der Nachweis von EGFP-Transkripten gelang auch in mit pEGFP-H transfizierten Würmern (Tab 2.4). Mit pEGFP-C transfizierte Würmer wiesen keine EGFP-Fluoreszenz auf. Eine Untersuchung auf EGFP-Transkripte wurde hier nicht durchgeführt.

Da die Detektion von EGFP epifluoreszenzmikroskopisch nicht möglich war, aber durch den Nachweis von EGFP-Transkripten die Transkription gezeigt worden war, wurde die Detektion von EGFP durch den Einsatz eines Laserscanning-Mikroskopes optimiert. Durch die Verbesserung der Detektion wurde EGFP bei der Expression unter der Kontrolle des HSP70-Promotors in adulten Würmern nachgewiesen. Ca.
5 % der mit pH-EGFP-H transfizierten Würmer wiesen EGFP-Fluoreszenz auf, die mit einzelnen Goldpartikeln kolokalisierte (Abb. 2.10 a). Diese EGFP-Fluoreszenz war nur unter Blaulicht-Anregung (Abb. 2.10 a), nicht aber unter Grünlicht-Anregung sichtbar (Abb. 2.10 a’). Durch die Überlagerung beider Bilder konnte unspezifische Fluoreszenz, die durch Verletzung des Gewebes auftrat, von spezifischer EGFP-Fluoreszenz unterschieden werden (Abb. 2.10 a’’) werden. Die Negativkontrolle wurde durch unbeschossene Würmer, durch Würmer, die mit pH-EGFP-H transfiziert, aber ohne Hitzeschock kultiviert worden waren und durch Würmer, die mit promotorlosem Plasmid pEGFP-oP transfiziert waren, repräsentiert. Hier wurde keine EGFP-Fluoreszenz detektiert. EGFP-Fluoreszenz wurde auch nicht in mit pEGFP-H transfizierten Würmern festgestellt. Eine Expression unter der Kontrolle [Seite 44↓]des GST28-Promotors durch das Plasmid pEGFP-G oder unter der Kontrolle des CAL-Promotors durch das Plasmid pEGFP-C konnte fluoreszenzmikroskopisch auch nicht durch Einsatz eines Laserscanning-Mikroskopes nachgewiesen werden. In 3 der ca. 300 untersuchten Würmern, die mit pH-EGFP-H beschossen worden waren, kolokalisierte EGFP-Fluoreszenz nicht mit einzelnen Goldpartikeln, sondern trat großflächig auf. Die auftretende EGFP-Fluoreszenz zeigte sich verstärkt im Saugnapf und im posterialen Ende (Abb. 2.10 b). In dem Proteingesamtextrakt aus Würmern, die mit dem gleichen Konstrukt beschossen worden waren, konnte durch Western-Blot-Analyse EGFP dagegen nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis von EGFP in intakten Sporozysten war auch durch den Einsatz eines Laserscanning-Mikroskopes nicht möglich.

Der Einsatz von β-Galaktosidase als Reporter führte zu keiner Verbesserung der Transfektionsergebnisse. In mit pβ-Gal -G transfizierten adulten Würmern (Abb. 2.11 a) wurden vergleichbare Regionen unspezifisch angefärbt wie in der Negativkontrolle (Abb. 2.11 b). Goldpartikel und histologische Färbung kolokalisierten nicht.

Zur Überprüfung der Methode, wurden cos7-Zellen durch Mikroprojektilbeschuss transfiziert. In mit pH-EGFP-H transfizierten cos7-Zellen wurde nach der Induktion des HSP70-Promotors durch einen Hitzeschock EGFP-Fluoreszenz in 3 % der Zellen detektiert. Damit war sicher gestellt, dass tatsächlich DNA beim Mikroprojektilbeschuss übertragen wurde.

Um die Transfektion eines multizellulären Organismus zu überprüfen, wurde C.elegans unter den gleichen Bedingungen wie die adulten Schistosomen durch Mikroprojektilbeschuss transfiziert. Für die Transfektion wurde das Plasmid pPD118-20 (Fire-Lab, 1997) eingesetzt. Dieses Plasmid ermöglicht die Expression
eines für C. elegans optimierten GFPs unter der Kontrolle eines
Myosin-Promotors. Nach 48 h konnte GFP in 5 % der Würmer in einzelnen Muskelzellen epifluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden (Abb. 2.12).


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Tab.2.4: Übersicht über die Nachweisbarkeit von EGFP und β—Galaktosidase in Sporozysten und adulten Würmern nach der Transfektion mit Konstrukten, die den GST28 - oder den HSP70-Promotor enthalten. Unter der Kontrolle des CAL-Promotors konnte keine Reportergen-expression nachgewiesen werden.

Konstrukt

Reporter

Promotor

Polyadenylierung

Stadium

Nachweis

pEGFP-H

EGFP

HSP70

SV40

Sporozyste

RT-PCR

pEGFP-H

EGFP

HSP70

SV40

Adulter Wurm

RT-PCR

pEGFP-G

EGFP

GST28

SV40

Sporozyste

Fluoreszenz

RT-PCR

pEGFP-G

EGFP

GST28

SV40

Adulter Wurm

RT-PCR

pβ—Gal-H

β—Gal

HSP70

SV40

Sporozyste

nicht nachweisbar

pβ—Gal-H

β—Gal

HSP70

SV40

Adulter Wurm

nicht nachweisbar

pβ—Gal-G

β—Gal

GST28

SV40

Sporozyste

spezifische Färbung

pβ—Gal-G

β—Gal

GST28

SV40

Adulter Wurm

nicht nachweisbar

pH-EGFP-H

EGFP

HSP70

HSP70

Sporozyste

RT-PCR

pH-EGFP-H

EGFP

HSP70

HSP70

Adulter Wurm

Fluoreszenz

RT-PCR

pEGFP-oP

EGFP

ohne Promotor

SV40

Adulter Wurm /

Sporozyste

nicht nachweisbar

pβ—Gal-oP

β—Gal

ohne Promotor

SV40

Adulter Wurm /

Sporozyste

nicht nachweisbar


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Abb. 2.8: Epifluoreszenzmikrokopische EGFP-Detektion in Sporozysten. a: bei einem Druck von 1500 Psi mit pEGFP-G beschossene Sporozyste 48 h nach der Transfektion. EGFP ist unter Blaulichtanregung detektierbar (Pfeil); a’ zu a korrespondierende Fluoreszenzaufnahme bei Grünlichtanregung; EGFP-Fluoreszenz ist nicht zu erkennen; a’’ zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme: Die Sporozysten wurde durch den Mikroprojektilbeschuss verletzt, sodass Trypan-Blau eindringen konnte. b: Fluoreszenzaufnahme einer intakten mit pEGFP-G bei einem Druck von 900 Psi beschossenen Sporozyste. c: Negativkontrolle zu b: mit pEGFP-oP transfizierte Sporozyste: Es ist kein Unterschied zu der Sporozyste in b zu erkennen. Bei der auftretenden punktförmigen Fluoreszenz handelt es sich daher um unspezifischen Hintergrund.


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Abb. 2.9: EGFP-Expression in adulten Würmern. a: Epifluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines mit pH-EGFP-H transfizierten Wurms. a’: zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme: Goldpartikel sind in unterschiedlichen fokalen Ebenen nachzuweisen. b: Negativkontrolle: mit pEGFP-oP transfizierte Würmer: Es ist kein Unterschied zu dem Wurm in a zu erkennen. c: Nachweis der Transkription von EGFP: Nach der Isolation der Gesamt-RNA und dem Umschreiben in cDNA wurde eine PCR mit EGFP-spezifischen Primern durchgeführt. Sowohl in mit pH-EGFP-H (Spur 1) als auch in mit pEGFP-G (Spur 2) transfizierten Würmern wurde EGFP-mRNA detektiert. In der Negativkontrolle (mit pEGFP-oP transfizierte Würmer) konnte keine EGFP-mRNA detektiert werden (Spur 3).



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Abb. 2.10: EGFP-Detektion mit dem Laserscanningmikroskop in adulten Würmern. a: Fluoreszenzaufnahme bei Blaulichtanregung: EGFP-Fluoreszenz kolokalisiert mit einzelnen Goldpartikeln (weiße Pfeile); a’: zu a korrespondierende Fluoreszenzaufnahme bei Grünlichtanregung: EGFP Fluoreszenz ist nicht detektierbar; a’’: Überlagerung von a und a’: Die unspezifische Fluoreszenz auf Grund der Läsion der Oberfläche erscheint gelb (gelber Pfeil); die EGFP-Fluoreszenz setzt sich als grüne Fluoreszenz ab. b: Großflächige EGFP-Fluoreszenz im Saugnapf eines mit pH-EGFP-H transfizierten Wurms.


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Abb. 2.11: β -Galaktosidase Expression in adulten Würmern. a: mit pβ-Gal-G transfizierter adulter Wurm: Auf der Oberfläche sind Goldpartikel zu erkennen (weiße Pfeile). Ein Bereich im Bereich des Pharynx ist blau angefärbt (roter Pfeil). b: Negativkontrolle: unbeschossener Wurm, der entsprechende Bereich weist die gleiche Färbung auf.


2.3 Versuche zur Optimierung der Expression von Reportergenen in S. mansoni

Die hergestellten Vektoren für die Transfektion von S. mansoni ermöglichen nur eine schwache Reportergenexpression. Damit ein Reporter die Funktion eines Transfektionsmarkers erfüllt, muss er leicht zu detektieren sein, wie die Transfektion von C. elegans in einem Kontrollexperiment zeigte (siehe Abb. 2.12). Eine Optimierung der Expression sollte durch den Einsatz weiterer Promotoren und eines weiteren Reportergens erreicht werden.


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2.3.1  Klonierung der 5’-UTR des Cathepsin D-Gens

Die Aspartylprotease Cathepsin D ist entscheidend an der Energiegewinnung adulter S. mansonibeteiligt (Brindley et al., 2001). Der die Expression regulierende Promotor ist daher vermutlich stark und deshalb potentiell zur Expression eines Reporters in adulten Würmern geeignet. Aus diesem Grund wurde die nicht translatierte 5‘-UTR des Cathepsin D-Gens als potentieller Promotor mit Hilfe der inversen PCR kloniert.

Grundlage für das Design der Primer Aspinvers1 und Aspinvers2 zur Amplifikation von 3‘ und 5‘-Bereich der kodierenden Sequenz war die unter der Zugangsnummer U60995 in der Genbank publizierten Sequenzdaten für die cDNA des Cathepsin D (Wong et al., 1997). Der Primer Aspinvers1 zur Amplifikation des 5‘-Bereiches hybridisiert mit den Basen 1 bis 17 und der Primer Aspinvers2 zur Amplifikation des 3‘-Bereiches hybridisiert mit den Basen 29 bis 44 der bekannten Sequenz.

Die genomische DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, deren Erkennungssequenzen außerhalb der gewählten Primer und außerhalb der von den Primern umschlossenen Sequenz lagen. Nach der Hitzeinaktivierung der Restriktionsendonukleasen wurde die DNA mit Hilfe von T4-Ligase zirkularisiert und die entstehenden DNA-Ringe als Matrize für eine PCR eingesetzt. Als Kontrolle für die PCR wurde neben zirkularisierter DNA geschnittene und ungeschnittene genomische DNA eingesetzt. Durch Erhöhen der Annealing-Temperatur innerhalb des PCR-Zyklus wurde eine 951 bp-Bande bei der mit XbaI geschnittenen und anschließend zirkularisierten DNA isoliert, die zur Sequenzierung in den 3’-T-overhang Vektor pGEM-T easy kloniert wurde (Abb. 2.13). Die Sequenzierung verschiedener Klone zeigte, dass ein 821 bp Abschnitt oberhalb des Startkodons kloniert worden war (Abb. 2.14). Weil genomische DNA Grundlage für die inverse PCR war, konnte der Transkriptionsstartpunkt nicht bestimmt werden, deswegen wurde der Translationsstartpunkt als Position 1 in der ermittelten Sequenz bezeichnet.


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Abb. 2.13: Inverse PCR zur Klonierung der 5’-UTR des Cathepsin D. Spur 1: Amplifikation eines 951 bp-Fragmentes aus mit XbaI verdauter und ligierter schistosomaler DNA. Spur 2: Negativkontrolle: mit XbaI verdaute genomische DNA. Spur 3: Negativkontrolle: genomische DNA. M ist der Marker.

Bei der Analyse mit dem Analyseprogramm Matinspector (Quandt et al., 1995) wurden promotortypische Erkennungssequenzen für DNA-bindende Proteine gefunden (Abb. 2.14). Dargestellt sind die Konsensus-Elemente (NF-Y, AP1, TATA-Box), die in den bisher veröffentlichten Promotorstudien für schistosomale Promotoren als regulatorische Elemente identifiziert worden sind.


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Abb. 2.14: Konsensussequenz der bei der inversen PCR erhaltenen Klone mit dem 5’-flankierenden Bereich des Cathepsin D. Die Primer zur Amplifikation von 5’ - und 3’ Bereich des Cathepsin D wurden unterstrichen; Mit +1 wurde das Desoxyadenosinmonophosphat im Startkodon (fett gedruckt) bezeichnet. Ein kurzes Intron (nt +50) (kursiv gedruckt) unterbricht die kodierende Sequenz; die Sequenz der 821 bp im nicht translatierten Bereich weist promotortypische Strukturen auf: Eine T/A-reiche Region (nt -45, hellgrau unterlegt) mit einer potentiellen TATA-Box; zwei inverse NF-Y-Konsensusequenzen (nt -95 und -408, dunkelgrau unterlegt, doppelt gerahmt) und zwei NF-Y-Konsensussequenzen (nt -629 und nt –221, dunkelgrau unterlegt); die zweite NF-Y-Konsensussequenz befindet sich unmittelbar unterhalb einer AP1-Bindungsstelle mit der Erkennungssequnz TGAGTCA (nt –234, hellgrau unterlegt). Die Sequenz wird umschlossen von zwei Xba I-Schnittstellen (umrahmt).

2.3.2 Klonierung der 5’-UTR eines Aktin-Gens

Aktin ist ein multifunktionelles und ubiquitär in eukaryotischen Zellen im cytoplasmatischen Kompartiment vorkommendes Protein. Da keine Information über die Regulation der schistosomalen Aktingenfamilie vorliegt, wurde die 5’-UTR der verfügbaren Sequenz eines schistosomalen Aktins kloniert. Diese 5’-UTR sollte als potentiell konstitutiv exprimierender Promotor für die Transfektion eingesetzt werden. Grundlage für das Primerdesign war die unter der Zugangsnummer M80334 veröffentlichte Sequenz eines Aktins von S.mansoni Stamm LE Brasilien. Die [Seite 53↓]dargestellte Sequenz beginnt 158 bp oberhalb des Startkodons für die Translation. In diesem Bereich wurden bereits eine CAAT-, eine CArG, eine TATA und eine E-Box nachgewiesen (Oliveira und Kemp, 1995). Für die Isolation des 5’-UTRs des entsprechenden Aktin-Gens aus der genomischen DNA von S. mansoni Stamm Puerto Rico wurde die inverse PCR eingesetzt.

Der Primer Aktinrev zur Amplifikation der 5‘-UTR hybridisiert mit den Basen 141 bis 158 und der Primer zur Amplifikation der 3‘-UTR hybridisiert mit den Basen 734 bis 751 der bekannten Sequenz. Bei der mit Hind III geschnittenen und religierten DNA wurde ein 464 bp Fragment amplifiziert, das zur Sequenzierung in pGEM-T easy kloniert wurde (Abb. 2.15).


Abb. 2.15: Inverse PCR zur Klonierung der 5’-UTR des Aktin-Gens. Spur 1: Negativkontrolle: ungeschnittene DNA; Nach dem Verdau genomischer DNA mit Hind III (Spur 2), EcoRI (Spur 3), XbaI (Spur 4) oder PstI (Spur 5) und der anschließenden Ligation wurden die DNA-Ringe als Matrize für eine PCR eingesetzt. In dem mit Hind III verdauten und anschließend ligierten Ansatz (Spur 2) wurde ein 464 bp bp-Fragment amplifiziert. M ist der Marker.

Die Sequenzierung verschiedener Klone zeigte, dass ein 388 bp Abschnitte oberhalb des Startkodons amplifiziert worden war. Auch hier wurde der Translationsstartpunkt [Seite 54↓]des Startkodonsals Position 1 in der ermittelten Sequenz bezeichnet. In dem größeren Bereich der 5’-UTR wurden neben den bereits beschriebenen Erkennungssequenzen zusätzliche Konsensussequenzen für DNA bindende Proteine gefunden (Abb. 2.16). 5 % der Nukleotide der 5’-UTR des Aktingens aus dem Stamm Puerto Rico unterscheiden sich von dem entsprechenden 5’-UTR aus dem Stamm LE Brasilien (Abb. 2.16).



[Seite 55↓]

2.3.3  Einsatz von DsRed als Reporter

DsRed, das rot fluoreszierende Protein aus Discosoma, wurde aus zwei Gründen für die Transfektionsversuche eingesetzt. In Vorversuchen wurde festgestellt, dass Schistosomen unter Grünlichtanregung, mit der DsRed angeregt wird, nur eine geringe Eigenfluoreszenz aufweisen. Bei dem Einsatz von DsRed als Reporter wird die Reporter-Fluoreszenz daher nicht von der endogenen Fluoreszenz überlagert, wie das für die Fluoreszenz von EGFP beobachtet wurde (siehe 2.2.3.1). DsRed besitzt außerdem eine andere Primärstruktur als EGFP und wird deswegen möglicherweise besser exprimiert (Yarbrough et. al, 2001). Die kodierende Sequenz für das DsRed lag in dem Plasmid pDsRed vor und wurde für die Klonierung mit dem 5’-Primer DsRed-for, der eine Sma I-Restriktionsschnittstelle einführt, und dem 3’-Primer DsRed-rev (siehe 5.2.6), der eine Not I-Schnittstelle einführt, amplifiziert. Für die Klonierung wurde das aufgereinigte PCR-Fragment mit Sma I und Not I verdaut.

2.3.4 Herstellung von Plasmiden unter Einsatz der 5’-UTRs des Cathepsin D- und des Aktin-Gens und von DsRed als Reportergen

Zur Herstellung von Plasmiden zur Expression von DsRed unter GST28 - oder HSP70-Promotor wurde die für EGFP kodierende Sequenz in den Plasmiden pEGFP-G und pEGFP-H gegen die für DsRed kodierende Sequenz ausgetauscht (siehe auch 3.1.3 und 3.1.4).

Zur Herstellung von Plasmiden zur Expression unter dem schistosomalen Promotor für das Aktin wurde der nicht translatierte 5’-Bereich durch PCR mit den Primern Aktin-for und Aktin-rev aus genomischer DNA isoliert. Das bei der Amplifikation zu erwartende 388 bp-Fragment umfasst den gesamten neu klonierten nicht translatierten Bereich bis zum Startkodon. Aktin-for führt eine HindIII-Restriktionsschnittstelle ein, Aktin-rev führt eine EcoR I-Schnittstelle ein. Die Promotorfragmente wurden aufgereinigt und mit Hind III und EcoR I verdaut. Zur Herstellung des Zwischenkonstruktes pEGFP-N1-A wurde der Aktinpromotor in das entsprechend geschnittene Plasmid pEGFP-N1 ligiert. Ein den Aktin-Promotor, das EGFP und den SV40-Polyadenylierungsbereich umfassendes 1,4 kb-Fragment wurde mit SacI und AflII aus pEGFP-N1-A ausgeschnitten und über ein Agarosegel gewonnen. Das Fragment wurde nachfolgend in das Klonierungsplasmid [Seite 56↓]pSLfa1180fa ligiert. Das hergestellte Plasmid wurde pEGFP-A genannt und ermöglicht die Expression von EGFP unter der Kontrolle des Aktin-Promotors (siehe Anhang II).

Zur Expression von DsRed unter dem Aktin-Promotor wurde die kodierende Sequenz für das EGFP gegen die für DsRed in pEGFP-N1-A ausgetauscht (siehe 3.1.3 und 3.3.3). Das entstehende Zwischenkonstrukt wurde pDsRed-N1-A genannt. Anschließend erfolgte das Umsetzen des Fragmentes aus Aktinpromotor, DsRed und Polyadenylierungsbereich aus pDsRed-N1-A in pSLfa1180fa. Das hergestellte Plasmid wurde pDsRed-A genannt und ermöglicht die Expression von DsRed unter der Kontrolle des Aktin-Promotors.

Die Herstellung eines Plasmids zur Expression von EGFP unter der Kontrolle des Cathepsin D-Promotors wurde analog durchgeführt. Nach Amplifikation des 821-bp umfassenden nicht translatierten 5’-Bereiches des Cathepsin D mit den Primern Asp-for und Asp-rev, die Restriktionsschnittstellen für Hind III und EcoR I einführten, wurden die Promotorfragmente aufgereinigt, verdaut und in pEGFP-N1 ligiert, das Zwischenkonstrukt wurde mit pEGFP-N1-CD bezeichnet. Die gesamte 1,8 kb-Kassette aus Cathepsin D-Promotor, EGFP und SV40-Polyadenylierungsbereich wurde in pSLfa1180fa umgesetzt. Das hergestellte Plasmid pEGFP-CD ermöglicht die Expression von EGFP unter dem Cathepsin D-Promotor (siehe Anhang II).

Kontrollplasmide auf der Basis des pEGFP-N1 wurden durch Austausch der EGFP kodierenden Sequenz in pEGFP-oP gegen die DsRed kodierende Sequenz (DsRed-oP) hergestellt. Durch Ligation verkürzter Fragmente ohne Promotor aus den Zwischenkonstrukten pEGFP-N1-A in pSLfa1180fa (pEGFP-oP-pSL) und DsRed-N1-A in pSLfa1180fa (pDsRed-oP-pSL) wurden Kontrollplasmide auf der Basis von pSLfa1180fa hergestellt. Das Umsetzen erfolgte mit EcoR I und Afl II.


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Tab. 2.5: Übersicht über die hergestellten Plasmide zur Optimierung der Expression durch Einsatz von DsRed und den Promotoren für das Cathepsin D und ein Aktin.

Plasmid

Reporter

Promotor

pDsRed-G

DsRed

GST28

pDsRed-H

DsRed

HSP70

pEGFP-CD

EGFP

Cathepsin D

pDsRed-A

DsRed

Aktin

pEGFP-A

EGFP

Aktin

pDsRed-oP

DsRed

ohne Promotor

pDsRed-oP-pSL

DsRed

ohne Promotor

pEGFP-oP-pSL

EGFP

ohne Promotor

2.3.5 Überprüfung der Plasmide in der Zellkultur

Die Funktionalität der hergestellten Plasmide wurde wiederum in der Zellkultur nachgewiesen (siehe 2.1.5). Die Negativkontrolle wurde repräsentiert durch mit entsprechenden promotorlosen Plasmiden transfizierte Zellen (siehe Tab. 2.5). Hier konnten 48 h nach der Transfektion keine fluoreszierenden Zellen beobachtet werden. DsRed wurde unter der Kontrolle des HSP70 - und des GST28-Promotors in cos7-Zellen exprimiert, die Transfektionsrate betrug 0,5 %. Die Expression von EGFP unter der Kontrolle des Cathepsin D-Promotors wurde epifluoreszenz-mikroskopisch in HeLa-Zellen nachgewiesen (Abb. 2.17 b), in cos7-Zellen zeigte der Promotor keine Aktivität. Die Transfektionsrate war mit 0,1 % fluoreszierender Zellen kleiner als bei den anderen Konstrukten. Der Aktinpromotor exprimierte EGFP und DsRed (Abb. 2.17 d) in cos7-Zellen, die Transfektionsrate betrug 0,5 %.


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Abb. 2.17: EGFP und DsRed-Expression in cos7 -Zellen (a, d) und HeLa -Zellen (b, c) unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: mit pH-EGFP-H transfizierte Zellen nach Hitzeschock; a’ zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.1.8). b: mit pEGFP-CD transfizierte Zellen; b’ zu b korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.3.3). c: mit pEGFP-LTR transfizierte Zellen; c’ zu c korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.5.2). d mit pDsRed-A transfizierte Zellen; d’ zu d korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.3.3). Größenbalken 50 μm.


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2.3.6  Transfektion von S.mansonimit den DsRed-Konstrukten und den Aktin und Cathepsin D-Promotorkonstrukten

Durch die Transfektion adulter Würmer und Sporozysten mit den Konstrukten pDsRed-G, pDsRed-H, pEGFP-A, pDsRed-A und pEGFP-CD durch Mikroprojektilbeschuss (siehe 2.2.3.1), sollte eine epifluoreszenzmikroskopische Detektion des Reporters ermöglicht werden, wie sie bei der Transfektion von C. elegans beobachtet wurde (siehe Abb. 2.12 S. 49).

Epifluoreszenzmikroskopisch konnte weder EGFP noch DsRed-Expression unter der Kontrolle des Cathepsin D-Promotors oder des Aktin-Promotors nachgewiesen werden. Auch der epifluoreszenzmikroskopische Nachweis der DsRed-Expression unter der Kontrolle des GST28- und des HSP70-Promotors gelang nicht. Dies bedeutet, dass durch den Einsatz dieser neuen Konstrukte die Expression eines Reporters für die transiente Transfektion gegenüber den zuerst eingesetzten Konstrukten (siehe 2.2.3.1) nicht verbessert werden konnte. Deswegen wurden weitere Analysen der Expression am Laserscanningmikroskop nicht durchgeführt. Die Transkription von DsRed durch RT-PCR wurde nicht überprüft.

2.4 Versuche zum Einschleusen von transgenen Mirazidien in den Lebenszyklus

Für die Herstellung transgener Wurmlinien ist es notwendig, ein transgenes Stadium in den Lebenszyklus einzuschleusen. Mirazidien infizieren auf natürliche Weise die Zwischenwirtsschnecke. Deswegen wurde untersucht, ob Mirazidien durch Mikroprojektilbeschuss transfiziert und anschließend in den Lebenszyklus eingeschleust werden können.

2.4.1 Überprüfung des Mikroprojektilbeschusses in vitro

In Vorversuchen wurde nachgewiesen, dass Mirazidien nach einer kurzen Inkubation in einem Vakuum von 15 mm Quecksilbersäule vital waren. Das Austrocknen wurde durch das Aufbringen auf eine Polycarbonatmembran während des Mikroprojektilbeschusses verhindert. Ca. 500 Mirazidien wurden unter den gleichen Bedingungen beschossen wie Sporozysten (siehe 3.2.3). Der Beschuss wurde zunächst nur mit 0,6 mg Gold durchgeführt. Die Überlebensrate der Mirazidien betrug 40 - 60 %. Nach dem Beschuss wurden überlebende Mirazidien für die Umwandlung in Muttersporozysten über Nacht bei 28°C in Sporozystenkulturmedium [Seite 60↓](MEMSE-J) kultiviert. In 15 % der Muttersporozysten konnten bei der mikroskopischen Untersuchung Goldpartikel nachgewiesen werden. Anhand peristaltischer Bewegungen und schlagender Wimpernzellen in den Protonephridien wurde ihre Vitalität bestätigt. Bis auf die Goldpartikel unterschieden sie sich nicht von Muttersporozysten, die sich aus unbeschossenen Mirazidien entwickelt hatten. Die eingedrungenen Goldpartikel ließen sich in unterschiedlichen fokalen Ebenen nachweisen, was bedeutet, dass auch tiefere Gewebeschichten beim Mikroprojektilbeschuss erreicht worden waren (Abb. 2.18).


Abb. 2.18: In vitro generierte Muttersporozyste, die sich aus einem beschossenen Mirazidium entwickelt hat. Die Muttersporozyste ist in drei verschiedenen mikroskopischen Bildebenen dargestellt, in denen sich Goldaggregate (schwarze Pfeile) nachweisen lassen. Die Sporozyste weist ein intaktes Protonephridialsystem (gelber Pfeil) auf. Größenbalken 100 μm.

2.4.2 Überprüfung des Mikroprojektilbeschusses in vivo

Um den Infektionsverlauf beschossener Mirazidien zu untersuchen, wurden Zwischenwirtsschnecken mit einem maximalen Durchmesser von 0,5 cm mit 250 beschossenen Mirazidien infiziert. Durch die starke Infektion sollte ein Wiederauffinden der Muttersporozysten im Zwischenwirt erleichtert werden. Der Vorgang des Eindringens wurde mikroskopisch verfolgt und war nach 3 h abgeschlossen. Mikroskopisch konnten keine Unterschiede zum Infektionsverlauf einer Schnecke mit unbeschossenen Mirazidien beobachtet werden. Nach 10 Tagen wurden die infizierten Schnecken histologisch untersucht. Nicht infizierte Schnecken wurden mit infizierten Schnecken, die mit beschossenen und unbeschossenen Mirazidien infiziert worden waren, verglichen. Muttersporozysten wurden in der [Seite 61↓]Nierenregion der Zwischenwirtsschnecke gefunden. Muttersporozysten, die sich aus beschossenen Mirazidien entwickelt hatten, unterschieden sich von den Muttersporozysten, die sich aus nicht beschossenen Mirazidien entwickelt hatten, durch 1-2 μm große Goldpartikel, die als optisch dichte Strukturen zu erkennen waren. Durch den Nachweis von Goldpartikeln in unterschiedlichen fokalen Ebenen wurde gezeigt, dass unterschiedliche Gewebe innerhalb der Sporozyste durch den Mikroprojektilbeschuss erreicht worden waren. Einige Goldpartikel kolokalisierten mit den Keimballenzellen innerhalb der Keimballen (Abb. 2.19). Die Nukleoli der Keimballenzellen waren heller und größer. Die Integrität der Muttersporozysten nach ihrer Entwicklung aus beschossenen Mirazidien in vivo, konnte auch durch ihr Wachstum nachgewiesen werden: Ihre Keimballen unterschieden sich in der Entwicklung und Größe nicht von den Muttersporozysten, die sich aus unbeschossenen Mirazidien entwickelten. Vakuolen innerhalb der Nukleoli der Keimballenzellen, die als hellere Bereiche zu erkennen waren, wiesen auf eine starke rRNA-Synthese und eine damit verbundene starke Proteinsynthese hin. Das Heterochromatin in den Keimballenzellen ist ein weiterer Hinweis auf eine starke Stoffwechselaktivität der Muttersporozysten. Die Kolokalisation von Goldpartikeln mit den Keimballen und die Integrität und Aktivität der Sporozysten in den Schnecken ist der Nachweis, dass beschossene Mirazidien in der Lage sind, Zwischenwirtsschnecken zu infizieren und sich als Sporozysten zu etablieren. Auch ihr weiteres Wachstum wird durch den Mikroprojektilbeschuss nicht beeinflusst.


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Abb. 2.19: Paraffinschnitt von Biomphalaria glabrata zwei Wochen nach der Infektion mit beschossenen Mirazidien (Färbung Haema-toxylin/Eosin). a: Überblick über den Schnitt durch Maul, Mittelkörper, Kopf und Fuß der Schnecke. Die Box markiert die Nierenregion, die mit Sporozysten infiziert ist. b: Vergrößerung des Ausschnittes in a: Die Box markiert die Region, in der Sporozysten in der Nierenregion der Schnecke liegen; links oberhalb ist die Radula der Schnecke zu erkennen. c: Vergrößerung des Ausschnittes in b mit einer Nahaufnahme einer Sporozyste. Die schwarzen Pfeile markieren Goldpartikel, die in unmittelbarer Nähe von Keimballenzellen liegen. Der gelbe Pfeil markiert im Vergleich den Nukleolus einer Keimballenzelle.


Abb. 2.20: Immunhistochemischer Nachweis von Sporozysten in einem Gefrierschnitt von Biomphalaria glabrata 10 Tage nach der Infektion mit unbehandelten Mirazidien (primärer Antikörper: Maus-Infektionsserum gegen S. mansoni ; sekundärer Antikörper IgG-Ziege-Anti-Maus, Peroxidase-gekoppelt). Die Struktur schlechter erhalten als in den Paraffinschnitten, dennoch ist der Nachweis von drei Sporozysten (Pfeile) möglich.

2.4.3 Nachweis der Reportergenaktivität in der Zwischenwirtsschnecke

Mit dem Plasmid pH-EGFP-H durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Mirazidien wurden für die Infektion von Schnecken eingesetzt, um die Expression von EGFP im Zwischenwirt nachzuweisen.

Zehn Tage nach der Infektion wurden Kryoschnitte von den infizierten Schnecken angefertigt. Als Negativkontrolle dienten Schnecken, die mit unbehandelten Mirazidien infiziert worden waren.


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Bei der mikroskopischen Untersuchung der Gefrierschnitte am Epifluoreszenzmikroskop und am Laserscanningmikroskop wurde keine EGFP-Fluoreszenz detektiert. Kryoschnitte wurden außerdem immunhistochemisch mit einem anti-EGFP Antikörper, der zuvor erfolgreich in einem Western-Blot zur Detektion von EGFP getestet worden war, angefärbt. EGFP konnte auf diese Weise in den Schnecken nicht nachgewiesen werden, obwohl es möglich war in einem Kontrollversuch Sporozysten mit Infektionsserum nachzuweisen (Abb. 2.20). Auch durch Western-Blot-Analyse konnte in der Nierenregion von Schnecken, die mit transfizierten Mirazidien infiziert worden waren, kein EGFP nachgewiesen werden.

Um die Transkription von EGFP nachzuweisen, wurde daher in zwei unabhängigen Infektionsversuchen die gesamte RNA aus einer Schnecke isoliert und in cDNA umgeschrieben. Durch eine nested PCR konnte die Transkription von EGFP in der Zwischenwirtsschnecke nachgewiesen werden (Abb. 2.21).


Abb. 2.21 EGFP-Transkription im Gewebe einer Schnecke, die mit Mirazidien infiziert worden war, die zuvor mit H-PEGFP-H transfiziert worden waren. Spur 1 und 3: Nested PCR mit EGFP-spezifischen Primern; Spur 2 und 4: Negativkontrolle: Gesamt-RNA vor der Umschreibreaktion; Spur 5: Negativkontrolle: Nested PCR mit EGFP-spezifischen Primern und genomischer DNA aus nicht infizierten Schnecken als Matrize; Spur 6: Positivkontrolle: PCR mit EGFP-spezifischen Primern und Plasmid-DNA als Matrize. M ist der Marker. Die Spuren 1/2 und 3/4 zeigen Daten aus unabhängigen Versuchen.

Da der Nachweis von EGFP nur auf der Ebene der Transkription möglich war, wurde versucht, β—Galaktosidase als Reporter in den Schnecken nachzuweisen.

Mit dem Plasmid β—Gal-G, das eine Expression von β—Galaktosidase unter der Kontrolle des GST28-Promotors ermöglicht, wurden Mirazidien transfiziert und für die [Seite 64↓]Infektion von Schnecken eingesetzt. Nach 10 Tagen wurden die Schnecken fixiert und die β—Galaktosidase in den fixierten Geweben histologisch nachgewiesen. Die Schnitte von Schnecken, die mit transfizierten Mirazidien infiziert waren, unterschieden sich nicht von Schnitten der Schnecken, die als Negativkontrolle mit unbehandelten Mirazidien infiziert worden waren. Große Bereiche im Schneckengewebe waren angefärbt, eine eindeutige Kolokalisation von Sporozysten mit Goldpartikeln und einer spezifischen Färbung konnte nicht festgestellt werden.

Um zu testen, ob sich β-Galaktosidase im Gesamtproteinextrakt messen lässt, wurde die endogene Aktivität in mit unbehandelten Mirazidien infizierten und in nicht infizierten Schnecken untersucht (Abb. 2.22). Für die Infektion wurden Schnecken, die unter gleichen Bedingungen gehalten wurden und die eine gleiche Größe besaßen, eingesetzt. Die Infektion mit 250 Mirazidien lag zum Zeitpunkt des Tests 10 Tage zurück.


Abb. 2.22: Ermittlung der endogenen β -Galaktosidaseaktivität in nicht infizierten und infizierten Zwischenwirtsschnecken Die Schnecken, aus denen der Gesamtproteinextrakt, gewonnen wurde, wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten. Die Schnecken waren zu dem Zeitpunkt
der Proteinextraktion gleich groß, die Infektion war 10 Tage zuvor
erfolgt. Dargestellt sind die Mittelwerte inkl. Standardabweichung, die aus den
Dreifachbestimmungen berechnet wurden.


In infizierten Schnecken betrug die endogene β-Galaktosidaseaktivität 0,75 Einheiten/mg Gesamtprotein, das entspricht einer Steigerung von 66,7 % gegenüber den nicht infizierten Schnecken (p=0,003), die eine β-Galaktosidaseaktivität von 0,45 [Seite 65↓]U/mg Gesamtprotein aufwiesen (Abb. 23). Das bedeutet, dass sich allein durch die Infektion mit unbehandelten Mirazidien die endogene β-Galaktosidase-Aktivität in den Schnecken erhöht. Weil dieser Anstieg an endogener β-Galaktosidaseaktivität möglicherweise die Expression von β-Galaktosidase in transfizierten Mirazidien überlagert, wurden keine weiteren Versuche mit transfizierten Mirazidien durchgeführt. Die β-Galaktosidase erwies sich als nicht ausreichend sensitiver Reporter, um die Expression eines Reporters auch auf Proteinebene nachzuweisen.

2.4.4 Überprüfung der Transfektion von Keimballenzellen

Der Nachweis einer Transfektion der Keimballen wird durch den Nachweis von Reporter-Transkripten in Zerkarien, die sich aus transfizierten Mirazidien entwickelt haben eindeutig geführt, weil die ungeschlechtliche Vermehrung innerhalb der Schnecke von Muttersporozysten über Tochtersporozysten zu den Zerkarien durch Teilung der Keimballenzellen erfolgt. Um die Transfektion dieser Zellen zu überprüfen, wurde daher die gesamte RNA aus Zerkarien, die sich aus mit pH-EGFH-H transfizierten Mirazidien entwickelten, isoliert. Auch durch eine nested PCR mit EGFP-spezifischen Primern war der Nachweis von EGFP-Transkripten in den Zerkarien in zwei unabhängigen Versuchen nicht möglich.

2.5 Versuche zur Charakterisierung des endogenen Retrotransposons Boudicca

Im BAC-Klon 53-J-5 mit genomischer DNA aus S. mansoni (Le Paslier et al., 2000), wurde die Kopie eines endogenen long terminal repeats (LTR) Retrotransposon gefunden, das Boudicca genannt wurde. Im haploiden schistosomalen Genom liegen 1000 bis 10000 Kopien dieses Retrotransposons vor. Bei der Sequenzierung der vorliegenden Kopie wurden zwar die typischen Domänen LTR, gag-Gen und pol-Gen eines LTR-Retrotransposons gefunden, allerdings weisen Mutationen darauf hin, dass diese Kopie inaktiv ist. In dem gag-Gen entsteht durch eine Punktmutation ein TGA-Stoppkodon bei nt 999. Das pol-Gen, das in aktiven Retrotransposons in einem durchgehenden Leserahmen kodiert wird, wird in der vorliegenden Kopie durch zwei Leserahmen kodiert: Durch die Integration einer Base bei nt 3577 wird der einheitliche Leserahmen verschoben, sodass zwei offene Leserahmen ORF 2a und ORF 2b entstehen. Die Integrase-Domäne wird zusätzlich durch einen 225 bp-[Seite 66↓]Abschnitt nicht kodierender Sequenz unterbrochen. ORF 3 kodiert möglicherweise für ein envelope-Glykoprotein (Copeland et al., 2003) (siehe Abb. 2.25 S. 58).

Die auf RT-PCR basierenden Untersuchungen zur Aktivität von Boudicca im schistosomalen Genom innerhalb der Publikation von Copeland et al. (2003) wurden im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, eine Boudicca-Kopie aus mRNA-Transkripten zu klonieren, die keine Mutationen enthielt. Durch Vergleich mit der degenerierten Kopie sollte eine Konsensussequenz erhalten werden, die als Grundlage für die Reaktivierung der degenerierten Boudicca-Kopie durch Mutagenese dienen kann.

2.5.1 Nachweis von Boudicca-Transkription in adulten Würmern, Zerkarien und Sporozysten

Nach der Isolation der Gesamt-RNA aus adulten Würmern, Sporozysten
und Zerkarien und dem Umschreiben in cDNA wurde durch spezifische Primer,
die innerhalb der Domäne für die Reverse Transkriptase von Boudicca in ORF 2a binden, in allen Stadien ein 447 bp-Fragment amplifiziert (Abb. 2.23). Mit Primern, die innerhalb dieses 447 bp-Fragmentes binden, wurde in einer nested PCR ein 183 bp-Fragment in allen Stadien amplifiziert. Zusätzlich konnte ein 1572 bp-Fragment aus der cDNA adulter Würmer mit Primern amplifiziert werden, die im ORF 1 und im ORF 2a binden. Das bedeutet, dass die ersten beiden Leserahmen als ein Transkript abgelesen werden. Für den Nachweis, dass die isolierte RNA nicht durch genomische DNA kontaminiert war, wurde als Negativkontrolle RNA nach dem Verdau mit RNAse freier DNAse ohne anschließende Transkription als Matrize in der PCR eingesetzt. Da es in keinem Versuch gelang, ein Fragment in der Negativkontrolle zu amplifizieren, ist der Nachweis der Transkription von Boudicca in adulten Würmern, Zerkarien und Sporozysten eindeutig geführt. Grundlage für das Design der Primer war die Sequenz der Boudicca-Kopie im BAC-Klon 53-J-5 (Copeland et al., 2003).


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Abb. 2.23: Nachweis der Transkription des endogenen Retroelementes Boudicca in adulten Würmern, Zerkarien und Sporozysten. A: Schematische Übersicht zum Nachweis von Boudicca-Transkripten durch RT-PCR: Die ausgefüllten Pfeile repräsentieren die in ORF 2a bindenden Primer P-1982-F und P-2429-R, die in der ersten Runde der nested PCR eingesetzt wurden und die ein 447 bp-Transkript amplifizieren; die offenen Pfeile repräsentieren die Primer P-2010-F und P-2193-R, die in der zweiten Runde der nested PCR eingesetzt wurden und die ein 183 bp–Fragment reamplifizieren. Der weiße Pfeil repräsentiert den Primer P-622-F, der im ORF 1 bindet, und in Kombination mit P-2193-R ein die beiden ersten Leserahmen überlappendes Transkript mit einer Größe von 1572 bp Größe amplifiziert. B: Nach der RNA-Isolation aus adulten Würmern, DNAse Verdau und anschließender reverser Transkription wurde ein 447 bp-Fragment in der ersten PCR amplifiziert (Spur 1); nach DNAse Verdau ohne anschließende Transkription konnte kein Fragment amplifiziert werden (Negativkontrolle Spur 2); ein entsprechendes Fragment wurde aus genomischer DNA amplifiziert (Positivkontrolle Spur 3); mit nested Primern wurde ein 183 bp-Fragment aus dem 447 bp-RT-PCR-Fragment aus adulten Würmern (Spur 4) und von der Positivkontrolle (Spur 6) reamplifiziert. Eine Reamplifikation der Negativkontrolle war nicht möglich (Spur 5); ein 1572 bp-Fragment wurde aus der cDNA adulter Würmer (Spur 7) und aus genomischer DNA (Spur 8) mit Primern, die die ersten beiden Leserahmen überspannen, amplifiziert. M ist der Marker.
C: Entsprechend wurde aus der cDNA von Larvenstadien ein 447 bp-Fragment in der ersten PCR amplifiziert (Spur 5: Sporozysten; Spur 6: Zerkarien); ein 183 bp-Fragment wurde aus der ersten PCR mit nested Primern reamplifiziert (Spur 8: Sporozysten; Spur 9: Zerkarien); entsprechende Fragmente wurden auch aus genomischer DNA amplifiziert (Spur 7 und Spur 10). Die Qualität der cDNA wurde durch Amplifikation der Cytochrom C Oxidase Untereinheit 1 (AF101196) getestet: Ein 343 bp-Fragment wurde amplifiziert (Spur 3: Sporozysten; Spur 4: Zerkarien); DNAse Verdau ohne anschließende reverse Transkription zeigt, dass keine Kontamination durch genomische DNA vorlag (Negativkontrolle: Spur 1: Sporozysten; Spur 2: Zerkarien).


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2.5.2  Überprüfung der Promotorfunktion des long terminal repeats (LTR) in der Zellkultur

Die Transkription der nachgewiesenen Boudicca Transkripte findet unter der Kontrole des LTRs statt. Um seine Funktion als Promotor auch in vitro nachzuweisen, wurde die LTR-Sequenz am 5’-Ende aus der veröffentlichten Boudicca-Sequenz mit spezifischen Primern amplifiziert (Abb. 2.24) und für die Expression von EGFP eingesetzt. Der Primer LTR-for hybridisiert mit 38 Basen oberhalb der Sequenz für das LTR, die unter der Zugangsnummer BK000439 in der Genbank veröffentlicht ist, im BAC-Plasmid. Der Primer LTR-rev hybridisiert innerhalb der veröffentlichten Sequenz für Boudicca mit den Basen 335 bis 354 im gag-Gen. Die Herstellung des Plasmids EGFP-LTR, das die Expression von EGFP unter der Kontrolle des LTR ermöglicht, erfolgte analog der Klonierung von pEGFP-A und pPEGFP-CD (siehe Anhang II).


Abb. 2.24: Isolation des LTR von Boudicca aus BAC-DNA Klon 53-J-5. Spur 1 und 2: Amplifikation des 392 bp Fragmentes mit der Sequenz des LTR. Spur 3: Negativkontrolle: PCR ohne BAC-DNA als Matrize. M ist der Marker.


Die Funktionalität des hergestellten Plasmids pEGFP-LTR wurde in Kulturzellen nachgewiesen (siehe 2.1.5 und 2.3.5). EGFP wurde 48 h nach der Transfektion epifluoreszenzmikroskopisch in 2 % der HeLa-Zellen nachgewiesen (Abb. 2.17 c S. [Seite 69↓]58). EGFP-Fluoreszenz trat nicht in der Negativkontrolle auf, die durch mit pEGFP-oP-pSL transformierte Zellen repräsentiert wurde (Tab. 2.5 S. 58). In cos7-Zellen wurde keine EGFP-Fluoreszenz detektiert.

2.5.3 Klonierung eines vollständigen Boudicca-Transkriptes

Mit Primern, die auf der Boudicca-Kopie 53-J-5 basieren, wurden in zwei unabhängigen Versuchen drei überlappende Fragmente, RC1-6, aus der cDNA adulter Würmer amplifiziert, die einen Bereich von dem Start-Kodon (nt 622) im gag-

Gen bis zum Stopp-Kodon (nt 4464) im pol-Gen bzw. bis zur Position nt 4428 im pol-Gen überspannen (Abb. 2.25).


Abb. 2.25: Übersicht über die Boudicca -Kopie im BAC-Klon 53-J-5 und Darstellung der Klonierung eines vollständigen Boudicca -Transkriptes aus der cDNA adulter S. mansoni . Die Boudicca-Kopie aus dem BAC-Klon 53-J-5 ist degeneriert: Das pol-Gen wird durch zwei offene Leserahmen kodiert (ORF 2a und 2b) und durch einen 225 bp-Abschnitt unterbrochen, der sich zunächst durch Sequenzanalyse nicht zuordnen ließ. Ob ein dritter Leserahmen tatsächlich für ein envelope-Glykoprotein kodiert (ORF 3) konnte nicht eindeutig ermittelt werden. Die LTRs weisen Boudicca als LTR-Retrotransposon aus (Copeland et al., 2003). Um die Organisation von transkribierten Boudicca-Kopien zu untersuchen, wurde die RT-PCR eingesetzt. Nach der RNA-Isolation aus adulten Würmern, DNAse Verdau und anschließender reverser Transkription wurden drei überlappende Fragmente kloniert, die den gesamten Bereich vom gag-Gen bis zum pol-Gen überspannen. Sequenzdaten für RC1-RC6 sind in der Genbank unter den Zugangsnummern AY308018 bis AY308023 veröffentlicht. Die Amplifikation eines die ersten beiden Leserahmen überlappenden Fragmentes gelang nicht mit den Vorwärtsprimern P-505-F, P-532-F oder P-557-F. Die Amplifikation eines Transkriptes des potentiellen ORF 3 mit den Primern P-3430-F und P-4882-R war nicht möglich. Primer wurden nach ihrer Position in der Boudicca-Kopie 53-J-5 benannt.


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Als Negativkontrolle wurde RNA nach dem Verdau mit RNAse freier DNAse ohne anschließende Transkription als Matrize in der PCR eingesetzt. In den Kontrollen gelang es nicht entsprechende Fragmente zu amplifizieren.

Die Amplifikation eines Fragmentes mit dem Primer P-3430-F und dem Primer P-4882-R, der innerhalb des potentiellen env-gens bindet, gelang nur aus genomischer DNA.

Der erste Leserahmen von Boudicca, der für das gag-Gen kodiert, weist im 5’-Bereich zwei Startkodons auf (Abb. 2.26); Die Amplifikation des 5’-Bereiches von gag mit Vorwärtsprimern, die oberhalb des zweiten Start-Kodons in Position 622 im ersten Leserahmen binden, gelang nicht. Offensichtlich wird das zweite Start-Kodon bei nt 622 als Transkriptionsstartpunkt gegenüber dem ersten Start-Kodon bei nt 505 bevorzugt. Die Analyse der tertiären Struktur der mRNA in diesem Bereich, die im Rahmen einer Kooperation wurden, ergab, dass das Startkodon in Position nt 505 innerhalb einer stabilen sekundären Struktur liegt und deswegen für die DNA-Polymerase nicht zugänglich ist. In der schistosomalen EST-Datenbank wurden aber Transkripte eines vollständigen gag-Gens gefunden (Zugangsnummern in der Genbank: AI395459 und AI067132), die mit dem ATG bei nt 505 beginnen.



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Das gag-Gen in der Boudicca-Kopie 53-J-5 weist bei nt 999 ein TGA-Stopp-Kodon auf. Die Konsensus-Sequenz dieser Region aus den mRNA-Transkripten RC1 und RC4 weist dieses Stopp-Kodon als Mutation aus, ein intaktes Retrotransposon besitzt einen vollständigen ersten Leserahmen, der für ein gag-Gen kodiert (Abb. 2.27 a).


Abb. 2.27: Sequenzvergleich zwischen mutierten Regionen der 53-J-5 Boudicca -Kopie und den jeweiligen mRNA-Transkripten. Die Transkripte RC1 und RC4 weisen das in Position 999 liegende TGA-Stopp-Kodon in 53-J-5 als Mutation aus (a). Drei Mutationen weist die Integrase aus der 53-J-5 Boudicca-Kopie auf, die in den Transkripten RC3 und RC6 nicht nachgewiesen werden konnten: Eine Integration bei nt 3577 (b), die eine Verschiebung des Leserahmens zur Folge hat, ein TAA-Stopp-Kodon bei nt 3923 (c) und ein TGA-Stopp-Kodon bei nt 4167 (d).


Die Integrase-Domäne, die im zweiten ORF pol-Bereich kodiert wird, ist im Klon 53-J-5 am stärksten degeniert. Die Konsensus-Sequenz der Integrase-Domäne aus mRNA-Transkripte RC3 und RC6 weist die Integration des Desoxyguanosinmonophosphates bei nt 3577 und die damit verbundene [Seite 72↓]Verschiebung des Leserahmens als Mutation aus (Abb. 2.27 b). Die Stopp-Kodons TAA bei nt 3923 (Abb. 2.27 c) und TGA bei nt 4167 (Abb. 2.27 d) weitere Mutationen in der Integrase-Domäne dar. Die Analyse der mRNA-Transkripte weist darauf hin, dass im schistosomalen Genom nicht mutierte Boudicca-Kopien vorliegen, die transkribiert werden. Diese nicht mutierten Kopienbestehen aus einem vollständigen gag- und einem pol-Gen. Durch die Sequenzanalyse der Transkripte wird außerdem gezeigt, dass die vorliegende Boudicca-Kopie 53-J-5 in ihrer Struktur bis auf wenige Mutationen einer intakten Kopie ähnlich.


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24.05.2004