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3  Diskussion

3.1 Entwicklung eines Transfektionssystems für Schistosomen

Transfektionssysteme sind wichtige molekularbiologische Werkzeuge: In transgenen Tieren oder Pflanzen wird durch Überexpression oder knockout anhand von Phänotypen die Funktion von Genen und deren regulatorischen Elementen in vivo untersucht (Brenin et al., 1997). Die Bedeutung von Genfunktionsanalysen in transgenen parasitischen Einzellern wurde bereits mehrfach beschrieben (Okuno et al., 2003; Kocken et al., 2002; Adamson et al., 2001; Misslitz et al., 2000). Für die parasitischen Filarien dient der freilebende Nematode C. elegans, für den ein etabliertes Transfektionsystem zur Verfügung steht (Brooks und Isaak, 2002; Hashmi et al., 2001), als Modellorganismus. Im heterologen C. elegans-System werden Promotorstudien von parasitischen Filarien durchgeführt (Kampkotter et al., 2003; Gomez-Escobar et al., 2002; Krause et al., 2001; Britton et al., 1999) oder die Funktion homologer Gene untersucht (Boag et al., 2003). Ein solcher Modellorganismus steht für den Trematoden S. mansoni nicht zur Verfügung. Nematoden und Trematoden stellen zudem kein einheitliches Taxon dar und sind nur weitläufig miteinander verwandt. Untersuchungen in C. elegans sind daher auch nicht auf Schistosomen übertragbar (Burglin et al., 1998). Deswegen muss für Schistosomen ein eigenes Gentransfersystem etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden der Gentransfer durch Mikroinjektion, Elektroporation oder Mikroprojektilbeschuss in S. mansoni untersucht.

Die Mikroinjektion ist eine gängige Methode zur Herstellung transgener Tiere, weil durch die Mikroinjektion große Mengen an DNA gezielt in einzelne Zellen transferiert werden können. Sie ist derzeit die Standardmethode zur Herstellung transgener Säugetiere. Durch die Injektion von DNA in den männlichen Vorkern einer befruchteten Eizelle integriert DNA in einer frühen Entwicklungsphase in das Genom der Wirtszelle (Brenin et al., 1997). Die Mikroinjektion wird auch zur Herstellung von transgenen C. elegans-Linien eingesetzt (Brooks und Isaak, 2002; Hashmi et al., 2001): Wird DNA in die Gonaden injiziert, wird die DNA direkt an die F1 weitergegeben, weil C. elegans ein Hermaphrodit ist (Mello et al., 1991). Außerdem ist C. elegans leicht zu kultivieren, sodass die Mikroinjektion weniger Individuuen [Seite 74↓]ausreicht, um transgene Wurmlinien zu züchten (Brooks und Isaak, 2002; Hashmi et al., 2001).

Ausgehend von den Protokollen für C. elegans wurden auch andere vielzellige Parasiten, vor allem parasitisch lebende Filarien, mikroinjiziert (Higazi et al., 2002; Lok und Massey, 2002). Wie bei C. elegans bietet auch bei parasitischen Filarien die Kutikula auf der Oberfläche einen mechanischen Widerstand, der die Mikroinjektion erleichtert (Mello et al., 1991). Protokolle zur Mikroinjektion von Filarien können jedoch nicht direkt auf S. mansoni übertragen werden, weil das flexible Tegument der Schistosomen bei der Mikroinjektion geschädigt würde. Die Mikroinjektion adulter Würmer wurde in dieser Arbeit nicht durchgeführt, weil eine Implantation von mikroinjizierten Würmern in die Blutgefäße des Endwirtes experimentell schwer durchzuführen ist (Cheever et al., 1994; Basch und Humbert, 1981). Die Etablierung einer Kultur von adulten Schistosomen ausgehend ist auch nicht möglich, weil in vitro infertile Eier erzeugt werden (Basch, 1981).

Im Unterschied zu adulten Stadien sind Muttersporozysten möglicherweise besser für die Mikroinjektion geeignet. Auch wenn das Tegument bei der Mikroinjektion verletzt wird, entwickeln sich Muttersporozysten möglicherweise in einer Kokultur mit Bge-Zellen in vitro zu Tochtersporozysten weiter. Das Tegument der Tochtersporozysten wäre vollständig intakt und die Tochtersporozysten ließen sich in die Zwischenwirtsschnecken implantieren (Coustau und Yoshino, 2000). Die Keimballen der Muttersporozysten, aus denen die Tochtersporozysten hervorgehen, besitzen eine ähnliche Größe wie die Vorkerne von Säugetierzellen, die wie erwähnt standardmäßig zur Herstellung von transgenen Tieren mikroinjiziert werden (Uchida et al., 2001; Brenin et al., 1997). In dieser Arbeit wurden daher Transfektionsversuche von Muttersporozysten durch Mikroinjektion durchgeführt: Nach der Anpassung der Parameter konnten Farbstoffe und EGFP-Plasmide in Muttersporozysten mikroinjiziert werden. Die Kultur dieser mikroinjizierten Sporozysten war bis zu einer Woche möglich, was zur Expression der Reportergene ausreicht. EGFP-Fluoreszenz konnte auf Grund der auftretenden endogenen Fluoreszenz aber nicht beobachtet werden. Auf Grund der Verletzung durch die Mikroinjektion starben die Sporozysten nach maximal 1 Woche in der Kultur ab. Eine Implantation in die Zwischenwirtsschnecken, welche eine 20tägige Entwicklung der [Seite 75↓]Muttersporozysten zu Tochersporozysten voraussetzt (Jourdane et al., 1985), war daher ausgeschlossen. Diese Methode zur Transfektion von S. mansoni wurde daher nicht weiterverfolgt.

Ein weiteres Verfahren zur Transfektion ist die Elektroporation. Sie wird u.a. zur Transfektion von einzelligen Parasiten (Purdy et al., 1993; Goonewardene et al., 1993) oder zur Transfektion von vielzelligen Embryonen eingesetzt (Gehl et al., 2003; Ogura, 2002). Für die Transfektion von S. mansoni wurden wiederum larvale Stadien verwendet. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Elektropermeabilisierung von Muttersporozysten möglich ist. Sporozysten, die in Anwesenheit des nicht membrangängigen Fluoreszenz-Farbstoffs Propidiumiodid elektroporiert wurden, zeigten nach der Elektroporation orange-rote Fluoreszenz des Farbstoffs in der Nähe des Tegumentes. Wurden sie in Anwesenheit von EGFP-Plasmiden elektroporiert, konnten Transkripte des Reporters, der unter der Kontrolle des HSP70 und des GST28-Promotors exprimiert wurde, durch RT-PCR nachgewiesen werden. Allerdings war die Effektivität dieser Transfektionsmethode gering. Elektroporierte Sporozysten ließen sich außerdem nur eine begrenzte Zeit weiterkultivieren, sodass eine Implantation in die Zwischenwirtsschnecke nicht durchgeführt werden konnte. Die Verteilung der Propidiumiodid-Fluoreszenz ausschließlich im Tegument elektroporierter Sporozysten weist auf ein weiteres Problem bei der Elektroporation hin: Undifferenzierte Zellen, die in den Keimballen im Inneren der Sporozysten zu finden sind, werden durch die Elektroporation nicht erreicht. Feldstärken, die in der Lage sind, die äußere Membran zu elektropermeabilisieren, sind nicht in der Lage, andere intrazelluläre Organellen zu elektropermeabilisieren, die auf Grund ihrer geringeren Größe einen größeren Widerstand besitzen (Gehl, 2003). Eine Transfektion von Keimzellen durch Elektroporation ist daher nicht möglich. Die Elektroporation eignet sich aber zur transienten Transfektion von Sporozysten.

Doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde auch durch Inkubation adulter S. mansoni in einer dsRNA-haltigen Lösung eingebracht (Boyle et al., 2003; Skelly et al., 2003). Bei dieser Methode wird die dsRNA nur über das Tegument aufgenommen, wenn sich die äußeren Membranen im Umbau befinden. Adulte Würmer oder aber vollständig entwickelte Sporozysten nehmen dagegen nur wenig dsRNA über ihr Tegument auf [Seite 76↓](Boyle et al., 2003). Daher ist die Möglichkeit, Gene mit dieser Methode in den Organismus einzubringen, auf Zerkarien und Mirazidien beschränkt. Skelly et al. (2003) untersuchten in ihrer Studie auch die Möglichkeit, dsRNA durch Lipofektion in Zerkarien einzubringen. In Anwesenheit von Liposomen wurde aber keine verbesserte Aufnahme der dsRNA erreicht (Skelly et al., 2003). Hinzu kommt, dass hauptsächlich Zellen im Bereich des Tegumentes transfiziert werden (Skelly et al., 2003). Keimzellen, die im Inneren des Parasiten liegen, werden dagegen vermutlich nicht erreicht. Beide Methoden sind daher auch nicht zur Etablierung eines Transfektionssystems geeignet.

Eine weitere Methode für den Gentransfer stellt der Mikroprojektilbeschuss dar. Er wurde ursprünglich zur Transfektion von pflanzlichen Zellen entwickelt (Sanford et al., 1993), der Mikroprojektilbeschuss wird aber auch zur Transfektion von Säugetieren (Johnston, 1990), Fischen (Zelenin et al., 1991) und auch einzelligen Parasiten wie Trypanosomen (Hara et al., 2002) eingesetzt. Zu Beginn dieser Arbeit lagen zwei Untersuchungen vor, die die Transfektion von parasitischen Helminthen beschrieben haben: Durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Ascaris suum Eier und adulte Schistosomen exprimierten Luciferase (Davis et al., 1999); Jackstadt et al. (1999) wiesen die transiente Expression von GFP und β-Galaktosidase in C. elegans und Litosomoides sigmodontis nach Mikroprojektilbeschuss nach. In neueren Arbeiten wurde Luciferase- und GFP-Expression in Brugia malayi nach dem Mikroprojektilbeschuss nachgewiesen (Shu et al., 2003; Higazi et al., 2002). Inzwischen konnte auch GFP-Expression in adulten und larvalen Schistosomen gezeigt werden (Rossi et al., 2003; Wippersteg et al., 2002 a und b).

Der erfolgreiche ballistische Transfer von Plasmid-DNA durch Mikroprojektilbeschuss wurde in dieser Arbeit in cos7-Zellen durch die Expression von EGFP bestätigt. Die Transfektionsrate lag mit 3 % jedoch deutlich unter der in der Literatur mit 35 % angegeben Transfektionsrate (Zhang et al., 2002). Die Methode war hier nicht für die Transfektion von Kulturzellen optimiert. Zellaggregate, gleichmäßige Verteilung und Abstand zur Probe beeinflussen die Transfektionsrate entscheidend.

In einem zweiten Schritt konnte die erfolgreiche Transfektion eines Vielzellers nach Beschuss durch die GFP-Expression in C. elegans nachgewiesen werden. Der Einsatz des Mikroprojektilbeschusses zur Transfektion von S. mansoni wurde dann [Seite 77↓]durch den Einsatz von FITC-gelabelten Oligonukleotiden evaluiert (siehe 2.2.3). Nachdem in Vorversuchen gezeigt werden konnte, dass der Einsatz von Vakuum beim Mikroprojetilbeschuss keinen Einfluss auf die Überlebensrate von adulten und larvalen Stadien besaß, erwies sich der Druck, der zur Beschleunigung der Mikrocarrier eingesetzt wurde, als kritischer Faktor. Während adulte Würmer widerstandfähig gegenüber dem Mikroprojektilbeschuss waren, mussten Sporozysten bei einem Druck von 900 Psi beschossen werden, um eine Schädigung des Tegumentes zu verhindern. Die Überlebensrate adulter Würmer lag bei nahezu 100 %, reproduzierbar konnte eine gute Goldverteilung auf dem Objekt erreicht werden. Mikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass die Goldpartikel auch tatsächlich eingedrungen waren. Die Transfektionsrate lag bei ca. 5 % der adulten Würmer. Größere Fluoreszenzbereiche konnte nur in 3 der ca. 300 untersuchten adulten Würmer nachgewiesen werden. Die Expression war so gering, dass zu ihrer Detektion ein Laserscanningmikroskop eingesetzt werden musste. EGFP-Transkripte konnten durch RT-PCR-Untersuchungen detektiert werden, wohingegen der Nachweis von Protein im Westernblot nicht möglich war. Die geringe Transfektionsrate und schwache Expression wurden auch von Wippersteg (persönliche Mitteilung) beobachtet, sodass kein Artefakt vorliegen dürfte.

Maximal 80 % der Sporozysten überlebten die Transfektion durch Mikroprojektilbeschuss. Bei Sporozysten konnte GFP-Fluoreszenz nur in einzelnen Zellen nachgewiesen werden. Der Mikroprojektilbeschuss erwies sich aber grundsätzlich als geeignet zur Transfektion von adulten und larvalen Stadien von S.mansoni.

3.2 Versuche zu einer transienten Transfektion

3.2.1 Expression unter der Kontrolle der eingesetzten schistosomalen Promotoren

Wenige schistosomale Gene sind bislang in ihrer genomischen Organisation bekannt (Le Paslier et al., 2000; Oliveira und Kemp, 1995; Charrier-Ferrara et al., 1992).

Zu Beginn dieser Arbeit lagen Promotorstudien des Calreticulin (CAL) (Khalife et al., 1995), der 28 kDa-Glutathion-S-Transferase (GST28) (Serra et al., 1997 und 1996; Zemzoumi et al., 1995) und des 70 kDa-Hitzeschockproteins (HSP70) (Levy-Holtzman und Schechter, 1995) vor. Neuere Promotorstudien beschreiben die [Seite 78↓]Promotoren der Cysteinprotease ER60 (Wippersteg et al., 2002 b) und des Calcineurin A (Rossi et al., 2003). Der SL-Promotor wurde von Davis et al. (1999) zur schwachen transienten Expression von Luciferase in adulten S. mansoni eingesetzt. Durch den Einsatz dieses Promotors wurde später auch in Brugia malayi fluoreszenzmikroskopisch nachweisbar GFP exprimiert, weil dieser Promotor in Filarien eine starke Expression vermittelt (Higazi et al., 2002). Die unterschiedliche Stärke dieses Promotors erklärt sich aus seiner biologischen Funktion bei der Regulation des Transspleißens: In Filarien werden 90 % der Gene transgespleißt (Blaxter und Liu, 1996; Maroney et al., 1995), während ein Transspleißen von Genen in Schistosomen selten stattfindet (Davis et al., 1995). Der Promotor vermittelt in Schistosomen daher nur eine schwache Expression und wurde deswegen im Rahmen dieser Arbeit nicht für Transfektionsversuche eingesetzt.

In dieser Arbeit wurden der CAL, der GST28 und der HSP70-Promotor durch eine präparative PCR aus genomischer DNA isoliert. Funktionale Studien von schistosomalen Promotoren sind problematisch, weil keine schistosomale Zelllinie zur Verfügung steht. Der Nachweis der Funktionalität der hergestellten Konstrukte erfolgte daher durch die Expression von EGFP und β-Galaktosisdase unter der Kontrolle dieser Promotoren in cos7-Zellen. Die Promotorstärken wurden durch colorimetrische Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität im Proteingesamtextrakt quantifiziert. Schistosomale Promotoren wurden bereits in der Hamsterzelllinie CHO (Levy-Holtzman und Schechter, 1995) und in HeLa- u. Jurkat-Zellen (Serra et al., 1997) auf ihr cis-aktivierendes Potential untersucht. Dies ist möglich, weil die regulatorischen Elemente und ihre assoziierenden Transkriptionsfaktoren konserviert sind, um auch in nicht-schistosomalen Zellen eine Transkription zu ermöglichen (Serra et al., 1996). In dieser Arbeit wiesen bei der qualitativen Überprüfung der Expression von EGFP und β-Galaktosidase unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren ca. 0,5 % der Zellen Reportergenexpression auf. In der Positivkontrolle lag die Transfektionsrate bei 2,5 %. Die quantitative Analyse der schistosomalen Promotoren ergab für den CAL und den HSP70-Promotor eine Steigerung der β-Galaktosidaseaktivität um 40 % gegenüber der Negativkontrolle. Wurden die mit pEGFP-H transfizierten Zellen hitzegeschockt, betrug die Steigerung gegenüber der Negativkontrolle 25,7 %. Diese geringere Expression gegenüber den nicht [Seite 79↓]hitzegeschockten Zellen ist vermutlich auf eine Schädigung durch den Hitzeschock zurückzuführen. Der GST-Promotor erwies sich mit einer Steigerung von 128,6 % gegenüber der Negativkontrolle als der stärkste schistosomale Promotor in vitro. In der Positivkontrolle war die β-Galaktosidaseaktivität 297,1 % gegenüber der Negativkontrolle gesteigert. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch cos7-Zellen konservierte Transkriptionsfaktoren exprimieren, die für eine basale Aktivität schistosomaler Promotoren in vitro ausreichen.

Zur Induktion des HSP70-Promotors in dem Konstrukt pEGFP-H war kein Hitzeschock notwendig. Um den Einfluss der endogenen nicht translatierten 3’-Region (3’-UTR) des HSP70-Gens auf die Expression zu untersuchen, wurde das Plasmid pH-EGFP-H kloniert, das eine Expression von EGFP unter der Kontrolle der 5' und 3'-UTRs ermöglicht. Eine Quantifizierung der Expression von pH-EGFP-H wurde nicht durchgeführt. In vitro konnte abernur nach der Induktion durch einen Hitzeschock EGFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden. Offensichtlich besitzt auch die 3’-UTR des schistosomalen HSP70-Gens wie bereits erwähnt regulatorische Eigenschaften. Die Bedeutung der 3’-UTR für die Vermittlung eines Hitzeschocks konnte z. B. auch in menschlichen Zellen (Moseley et al., 1993), in Leishmania infantum (Quijada et al., 2001), in B. malayi (Shu et al., 2003) und in Theileria annulata (Adamson et al., 2001) nachgewiesen werden. Auch andere Hitzeschockproteine wie das HSP83 aus Leishmania (Aly et al., 1994) sind über die 3’-UTR reguliert. Die beobachtete Expression von EGFP durch das Plasmid pEGFP-H ohne endogene 3’-UTR beruht vermutlich auf der Plasmid-Konstruktion: Das der Klonierung zu Grunde liegende Ursprungsplasmid pEGFP besitzt ein SV40-Origin (BD Biosciences Clontech USA). Eine T-Antigen-vermittelte Regulation der Transkription führt zu einer Vermehrung von Plasmiden mit einem SV40-Origin in cos7-Zellen (Gluzman, 1981). Die schwache konstitutive Expression durch den HSP70-Promotor (Neumann et al., 1993) ermöglicht bei einer hohen Plasmid-Zahl in der Zelle die sichtbare Expression von EGFP.

Für andere schistosomale Promotoren ist nicht bekannt, ob der 3’-UTR eine regulatorische Funktion zukommt: In Transfektionsversuchen von Schistosomen kombinierten Davis et al. (1999) den SL-Promotor mit der 3’-UTR der Enolase. Bei Calcineurin A erfolgt keine gewebespezifische Expression über die 3’-UTR (Rossi et [Seite 80↓]al., 2003). 3’-UTRs können aber spezifische regulatorische Elemente enthalten, die für die cytoplasmatische Regulation notwendig sind (van der Velden et al., 2001; Wormington, 1994). Die Polyadenylierungssequenz kann neben der Stabilisierung der mRNA regulatorische Funktionen übernehmen (Gallie, 1991), wobei auch die Länge der 3’-UTR entscheidend sein kann (Tanguay und Gallie, 1996). Um die Funktion der 3’-UTRs zu untersuchen, sind experimentelle Analysen notwendig, die in dieser Arbeit nicht durchgeführt wurden.

Die hexameren Polyadenylierungssequenzen für das HSP70-Gen (AATAAT) und das des CAL-Gens (ATAAAT) weisen Im Vergleich zu der Konsensussequenz der Polyadenylierungssequenzen von Säugetier-mRNAs (AATAAA) nur zwei Basenaustausche auf (Zarudnaya et al., 2003). Da nicht in allen Genen, deren Promotoren in dieser Arbeit verwendet wurden, die 3’-UTRs bekannt sind, wurde die SV40-Polyadenylierungssequenz standardmäßig in allen Konstrukten eingesetzt. In Filarien wurde die Funktionalität SV40-Polyadenylierungssequenz bereits nachgewiesen (Shu et al., 2003; Jackstadt et al., 1999). Die SV40-Polyadenylierungsequenz ist deswegen vermutlich auch in Schistosomen funktional.

Die Abhängigkeit der EGFP-Expression von der HSP70 3‘-UTR zeigte sich bei Transfektionsversuchen von S. mansoni auch in vivo: Großflächige EGFP-Fluoreszenz konnte in 1 % der adulten Würmer, die EGFP unter der Kontrolle der 3‘ und 5‘-UTRs des HSP70-Gens exprimieren, nach der Induktion durch einen Hitzeschock am Laserscanningmikroskop detektiert werden. Bevorzugt trat die Fluoreszenz im posterialen Ende und im Kopfbereich auf. Dieses Expressionsmuster ist vermutlich spezifisch (Wippersteg et al., 2002 a). In nicht hitzegeschockten Würmern wurde keine EGFP-Floreszenz detektiert. In Würmern, die mit pEGFP-H, das eine SV40-PolyA besitzt, transfiziert wurden, wurde sowohl mit als auch ohne Hitzeschock keine EGFP-Fluoreszenz beobachtet. Die Aktivität des HSP70-Promotors in dem Plasmid pEGFP-H konnte aber durch den Nachweis von EGFP-Transkripten erfolgreich gezeigt werden. Diese Ergebnisse decken sich mit den Untersuchungen von Neumann et al. (1993), die nachwiesen, dass der HSP70-Promotor in adulten Würmern konstitutiv aktiv ist und durch einen Hitzeschock noch zusätzlich induziert werden kann, wodurch die Expression verstärkt wird. [Seite 81↓]Transkription von EGFP durch den GST28-Promotor konnte in adulten Würmern nur auf mRNA-Ebene gezeigt werden.

In den Sporozysten gelang der epifluoreszenzmikroskopische Nachweis einer EGFP-Expression in einzelnen Zellen, wobei EGFP unter der Kontrolle des GST28-Promotors exprimiert wurde. Da nur wenige Zellen transfiziert waren, konnte hier kein typisches Expressionsmuster ermittelt werden. Der Nachweis einer EGFP-Transkription in Sporozysten durch den HSP70-Promotor gelang nur auf mRNA-Ebene. In den Sporozysten ist der HSP70-Promotor schwach konstitutiv aktiv und nicht durch einen Hitzeschock reguliert (Neumann et al., 1993). Transfizierte Sporozysten wuden daher keinem Hitzeschock ausgesetzt. Der CAL-Promotor führte weder in adulten Würmern noch in Sporozysten zu einer sichtbaren EGFP-Expression.

EGFP-Expression durch den CMV-Promotor, der als besonders starker Promotor in Säugetierzellen gilt und deswegen dort als Standardpromotor für die Transfektion eingesetzt wird (van der Velden, 2001), konnte in S. mansoni nicht nachgewiesen werden. Auch in dem apikomplexen Parasiten Theileria annulata ist dieser Promotor nicht aktiv (Adamson et al., 2001). Vermutlich sind im Laufe der Evolution neue Transkriptionsfaktoren hinzugekommen, sodass ein hochentwickelter Promotor wie der CMV-Promotor in Zellen mit einfachen Regulationen nicht funktional ist.

Bei allen Versuchen zur Transfektion mit schistosomalen Promotoren war die Transfektionsrate gering. Eine geringe Transfektionsrate kann durch eine ineffektive Transfektionsmethode verursacht werden. Beobachtete Expressionsmuster können wegen dieser geringen Transfektionsrate auch Artefakte darstellen: Bei der Transfektion von B. malayi treten bei der Transfektion durch Mikroinjektion oder Mikroprojektilbeschuss unterschiedliche Expressionsmuster, weil verschiedene Gewebe durch die unterschiedlichen Methoden transfiziert werden (Higazi et al., 2001).
Eine geringe Transfektionsrate kann aber auch auf dem Fehlen von Enhancern, die in vivo eine stärkere Expression vermitteln, beruhen. Ein SL-Promotorfragment, das 115 bp oberhalb des Transkriptionsstartpunktes endet, führte in vitro zu einer maximalen Luciferase-Expression. In vivo dagegen wurde durch längere Fragmente (341, 526 und 1038 bp) eine stärkere Luciferase-Expression erreicht (Davis et al., [Seite 82↓]1999). Der ca. 200 bp große Minimal-Promotor des Aktin 1 aus C. elegans führte nur zu einer schwachen EGFP-Fluoreszenz (Jackstadt et al., 1999), wohingegen 1,2 kb des Aktin2-Promotors in Strongyloides stercoralis zu einer epifluoreszenz-mikroskopisch detektierbaren GFP-Fluoreszenz führten (Lok und Massey, 2002). Eine Verkürzung des Promotors der Cysteinprotease AC-2 aus Ostertagia circumcincta von 2,3 kb auf 0,7 kb führte zu einer signifikant niedrigeren β-Galaktosidaseexpression (Britton et al., 1999).

Die geringe Transfektionsrate lässt sich darüberhinaus durch eine gewebespezifische oder stadienspezifische Regulation in S. mansoni erklären:

Das Calreticulin ist ein im Endoplasmatischen Retikulum vorliegendes Ca2+ bindendes Protein (Scott und McManus, 1999). Da es essentiell an der Ca2+-Regulation beteiligt ist, wird es in allen Stadien exprimiert und nimmt die Aufgabe eines house-keeping-Gens ein (Khalife et al., 1994), obgleich seine Expression gewebeabhängig ist (Khalife et al., 1995 und 94) und die Expression z.B. in einer am Kopf liegenden Drüse von Zerkarien auch für eine stadienspezifische Regulation spricht (Khalife et al., 1994). Der Promotor ist untypisch für ein house-keeping-Gen: Er enthält unter anderem eine TATA-Box. TATA-Boxen treten normalerweise nicht in house-keeping-Genen auf (Chung und Keller, 1990). Als weitere Bindestellen für Transkriptionsfaktoren wurden eine AP-1 Bindungsstelle und CCAAT-Boxen ermittelt, die möglicherweise eine gewebespezifische Expression vermitteln (Khalife et al., 1995). Der fehlende Nachweis einer EGFP-Expression kann demnach unmittelbar mit der Regulation zusammenhängen: Gewebe, in denen eine starke Expression möglich wäre, werden eventuell durch den Mikroprojektilbeschuss nicht erreicht. Vermutlich sind auch nicht alle regulatorischen Bindestellen des Promotors ermittelt, da einer komplexen Regulation weitere regulatorische Elemente zu Grunde liegen müssen.

GST28 ist ein wichtiges Oberflächenantigen (Liu et al., 1996). Es wird stärker in männlichen als in weiblichen Würmern exprimiert (O’Leary und Tracy, 1991; Holy et al., 1989) und erfährt eine Bedeutung als Vakzine Kandidat (Capron et al., 1995). GST28 wird in allen Stadien konstitutiv exprimiert, vermutlich wird die Expression durch AP-1 Bindemotive und CCAAT-Boxen gewebespezifisch reguliert (Serra et al., 197 und 1996; Zemzoumi et al., 1995). GSTs sind Enzyme, die an der Zellentgiftung [Seite 83↓]und an der Beseitigung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten beteiligt sind (Brophy und Pritchard, 1994). Auch das Abtöten von Parasiten durch Immunzellen des Wirtes kann ein sauerstoffabhängiger Prozess (Kampkotter et al., 2003). Parasiten können sich durch entsprechende Entgiftungsenzyme schützen (O’Leary und Tracy, 1991). Den GSTs kommt dabei eine besondere Rolle zu: Es ist das am stärksten exprimierte Protein aus dieser Gruppe der Entgiftungsenzyme in Sporozysten (Janowsky und Zelck, 2002). Der Nachweis von EGFP in den Sporozysten kann daher auf eine stadienspezifische Aktivität des GST28-Promotors zurückzuführen sein.

Das HSP70 ist ein wichtiges schistosomales Hitzeschockprotein, das an der Entwicklung des Parasiten beteiligt ist und eine große Bedeutung für seine Pathogenität besitzt (Hedstrom et al., 1987). In den meisten Eukaryoten bilden die HSP70-Proteine eine Genfamilie. In C. elegans umfasst diese Familie z.B. sechs Mitglieder, von denen einige konstitutiv, andere nach einem Hitzeschock aktiv sind (Snutch et al., 1988). In S. mansoni ist das HSP70 dagegen ein single copy-Gen (Wippersteg et al., 2002 a). Es wird in allen Entwicklungsstadien außer in Zerkarien konstitutiv exprimiert (Neumann et al., 1993). Diese an das Entwicklungsstadium gebundene Transkription wird durch zwei im Promotor lokalisierte Hitzeschockelemente reguliert (Levy-Holtzman und Schechter, 1996). In dieser Arbeit wurde gezeigt, das EGFP, das unter der Kontrolle des HSP70-Promotors exprimiert wurde, im Tegument auftrat. Die Lokalisation der Expression im Tegument wird auch durch die Beschreibung des HSP70 als Oberflächenantigen unterstützt (Hedstrom et al., 1987). Da das HSP70-Gen das Hitzeschockprotein ist, das am stärksten nach einem Hitzeschock heraufreguliert wird (Vivinus et al., 2001) handelt es sich bei der Expression in den adulten Würmern um eine stadienspezifische Expression. In den Sporozysten ist der Promotor nur schwach konstitutiv aktiv und EGFP ist deshalb nur auf Transkriptionsebene nachweisbar. Wippersteg et al. (2002 b) konnten vermutlich GFP-Expression auch in Sporozysten nachweisen, weil sie in ihren Versuchen eine größere Zahl an Sporozysten auf ihre Transkription untersuchten. In besonders stark transfizierten Sporozysten konnte vermutlich auf Grund eines Gen-Dosis-Effektes GFP nachgewiesen werden.


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Eine Regulation des HSP70 könnte als Anpassung an den Wirt verstanden werden: Das Überleben in einem homoiothermen Endwirt, ist nur möglich, wenn der Parasit über eine Möglichkeit verfügt, Hitzeschockproteine zu exprimieren, die ihn vor Fieberreaktionen des Wirtes schützen, auch wenn diese Temperaturschwankungen vergleichsweise gering sind. Die poikilothermen Schnecken dagegen unterliegen in ihren natürlichen Bedingungen ständig größeren Temperaturschwankungen, sodass hier eine Hitzeschockregulation nicht sinnvoll wäre.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der CAL-, der GST28- und der HSP70-Promotor starken Regulationsmechanismen unterliegen; diese Promotoren sind zwar schwach konstitutiv in fast allen Stadien aktiv, eine starke Expression wird aber gewebe- und stadienspezifisch reguliert. Die daran beteiligten Transkriptionsfaktoren sind noch nicht identifiziert worden. Die Regulation erschwert aber den Einsatz dieser Promotoren für Transfektionsversuche.

Um weitere potentielle Promotoren für die Transfektion zur Verfügung zu haben, die eine stärkere Reportergenexpression ermöglichen, wurden die 5‘-UTRs des Cathepsin D und eines cytoplasmatischen Aktins kloniert. In dieser Arbeit wurden keine genauen Promotoranalysen durchgeführt und die Transkriptionsstartpunkte wurden nicht bestimmt. Die Einstufung als potentielle Promotoren gelang durch den Nachweis der Expression eines Reporters in vitro in HeLa oder cos7-Kulturzellen und durch eine computergestützte Analyse möglicher Bindestellen für Transkriptionsfaktoren mit dem MatInspector (Quandt et al., 1995)Eine Analyse von schistosomalen Promotoren mit diesen vorhandenen Algorithmen ist allerdings schwierig, weil nur wenige schistosomale Transkriptionsfaktoren bekannt sind und es dadurch zu falschen Zuordnungen kommen kann (Werner et al., 1999). Die Analyse bezog sich daher nur auf die bereits bekannten wenigen Bindesequenzen von Transkriptionsfaktoren.

Für die Transfektion können die Promotoren stark exprimierter Gene eingesetzt werden. Die Aspartylprotease Cathepsin D ist entscheidend am schistosomalen Stoffwechsel beteiligt (Brindley et al., 2001 und 1997). Deswegen wurde die 5‘-UTR im Rahmen dieser Arbeit durch inverse PCR kloniert. In dem klonierten 821 bp-Fragment konnten eine potentielle TATA-Box, sowie CCAAT-Boxen und eine Bindestelle für das activator protein 1 (AP-1) detektiert werden. TATA-Boxen finden [Seite 85↓]sich auch in den bereits beschriebenen Promotoren für das CAL, die GST28 und das HSP70 (Khalife et al., 1993; McNair et al., 1993; Neumann et al., 1992). An die CCAAT-Box können verschiedene Transkriptionsfaktoren binden (Dorn, 1987). Der Nachweis, dass der nuclear factor 1 (NF-Y) an die CCAAT-Box des GST28-Promotors bindet, wurde von Serra et al. (1996) erbracht. Die CCAAT-Box wurde deswegen als NF-Y-Bindemotiv bezeichnet. AP1 und NF-Y-Bindemotive finden sich auch im Cal- (Khalife et al., 1995) und im GST28-Promotor (Serra et al., 1997 und 1996; Zemzoumi et al., 1995). NF-Y Bindemotive wurden auch in dem HSP70-Promotor nachgewiesen (Levy-Holtzman und Schechter, 1995). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der 821 bp-Abschnitt in der Lage ist, EGFP in HeLa-Zellen, nicht aber in cos7-Zellen zu exprimieren. Möglicherweise ist wie bei dem Calreticulin (Serra et al., 1997; Khalife et al., 1995) die AP-1 Bindestelle an der Initiation der Transkription beteiligt. AP-1 wird in HeLa-Zellen in ihrer Eigenschaft als Tumorzellen konstitutiv exprimiert (Soto et al., 1999). Auch von dem Dopamin 3 Rezeptor-Gen-Promotor ist nachgewiesen, dass er in HeLa-Zellen, nicht aber in cos7-Zellen exprimiert (D’Souza et al., 2001). Cathepsin D wird vermutlich in allen Stadien exprimiert, was für ein house-keeping Gen sprechen würde. Eine zusätzliche geschlechts-, gewebe oder stadienspezifische Regulation z.B. durch AP-1 oder NF-Y (Serra et al., 1997 und 1996; Khalife et al., 1995; Zemzoumi et al., 1995), die z.B. auch für die spezifische EGFP-Expression in HeLa-Zellen verantwortlich sein könnte, kann aber dennoch nicht ausgeschlossen werden. Die fehlende Nachweisbarkeit einer EGFP-Expression in vivo beruht daher vermutlich auf einer sehr lokalen Expression in den Blinddärmern adulter Würmer (Brindley et al., 2001), die durch den Mikroprojektilbeschuss nicht transfiziert werden können.

Auch die Promotoren von house-keeping Genen, die eine starke konstitutive Expression ermöglichen sind potentiell für Transfektionsversuche geeignet.

Aktine verkörpern eine hoch konservierte Familie von Genen, die in allen eukaryotischen Zellen auftreten. Globuläres Aktin (G-Aktin) kann durch Polymerisation in filamentöses Aktin (F-Aktin) übergehen (Holmes et al., 1990). Das F-Aktin unterliegt dabei einem ständigen Auf-und Abbau. Damit diese Dynamik aufrecht erhalten werden kann, muss ein endogener Pool an G-Aktin in der Zelle vorliegen, was für eine konstitutive Expression bestimmter Aktine als house-keeping [Seite 86↓]Gene spricht. In der Zelle werden verschiedene Aktingene exprimiert (Sheterline und Sparrow, 1994). In Schistosomen wurde die Beteiligung von Aktin am Aufbau des Tegumentes (Kusel et al., 1984) und der Muskeln (MacGregor und Shore, 1990) nachgewiesen. Aktin liegt auch im Cytoplasma vor und ist an der Reparatur des Tegumentes bei Schistosomen beteiligt (Linder und Thors, 1992). In Schistosomen werden mehrere Aktin-Isoformen exprimiert (Abbas und Cain, 1989).

Zwei kurze Fragmente der 5’-UTRs von Aktinen, die auf Grund ihrer Homologien den cytoplasmatischen Invertebraten-Aktinen zugeordnet werden, wurden von Oliveira und Kemp (1995) beschrieben. In der veröffentlichten 5’-UTR des SmAct2, das nur 43 Basen umfasst, wurden keine regulatorischen Sequenzmotive detektiert. Das SmAct besitzt dagegen in der 5’-UTR mehrere solcher potentieller Sequenzmotive. Aber dieses 168 bp umfassende Fragment vermittelt vermutlich wegen seiner geringen Länge nur eine schwache Expression. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ausgehend von der bekannten Sequenz (Oliveira und Kemp, 1995) durch inverse PCR eine 388 bp umfassende 5’-UTR aus genomischer DNA isoliert. Die Sequenz dieses Fragmentes, das aus dem Schistosomen-Stamm Puerto Rico isoliert wurde, unterschied sich in 5 % der Nukleotide von der veröffentlichten Sequenz, die aus dem Liberianischen Stamm stammt. Unterschiede der gleichen Gene innerhalb verschiedener Schistosomen-Stämme sind auch für das HSP70-Gen beschrieben (Wippersteg et al., 2002 a). In den ersten 168 bp des Aktingens upstream des Startkodons wiesen Oliveira und Kemp (1995) potentielle regulatorische Sequenzen für eine TATA-Box, eine CAAT-Box, eine E-Box und eine CArG-Box. Innerhalb der im Rahmen dieser Arbeit klonierten 5’-UTRs lassen sich drei zusätzliche NF-Y-Bindesequenzen nachweisen, es finden sich außerdem zusätzliche potentielle regulatorische Sequenzen für eine CAAT-Box und eine CArG-Box. Wie bereits erwähnt, ist der Transkriptionsstartpunkt unbekannt. Deswegen ist die Lage des eigentlichen Promotors und der regulatorischen Sequenzen in der 5’-UTR nicht genau zu bestimmen. Das Aktin, dessen 5’-UTR kloniert wurde, wird nicht transgespliced (Oliveira und Kemp, 1995). Der eigentliche Promotor beginnt deswegen vermutlich wenige Basen oberhalb des Translationsstartpunktes.

Insbesondere die CArG-Box als Erkennungssequenz des serum response factors spielt eine große Rolle bei der Regulation der Aktinexpression sowohl in Vertebraten [Seite 87↓](Marsh et al., 1998) als auch in Invertebraten (Casero und Sastre, 2001; Kusakabe, 1997). E-Boxen sind wichtige cis-regulatorische Elemente in Aktin-Promotoren aus Vertebraten (Kumar et al., 2003; Jung et al., 1999). Die von Oliveira und Kemp (1995) beschriebene E-Box und die CArG-Box liegen untypischerweise downstream der TATA-Box. Aktive E-Boxen und CaRG-Boxen liegen in den bisher beschriebenen Vertebraten-Aktin-Promotoren upstream der TATA-Box (Chow und Schwartz, 1990; Mohun et al., 1989). Diese Lage könnte ein Hinweis darauf sein, dass sie nicht an der Regulation bei der Expression des SmAct beteiligt sind (Oliveira und Kemp, 1995). Die zweite upstream liegende CArG-Box (CCACATAAGG) weist eine Mutation zu der Konsensussequenz (CC (A oder T)6 GG) (Taylor et al., 1988) auf. Möglicherweise ist sie deswegen auch nicht an einer Regulation beteiligt. Vertebraten-Aktin-Promotoren besitzen oft bis zu 2 kb oberhalb des Transkriptonsstartpunktes liegende Enhancer-Sequenzen, die für eine starke Expression essentiell sind (Kusakabe et al., 1999; Kovacs und Zimmer, 1998), solche Enhancer sind demnach auch nicht auf dem klonierten 5’-UTR des schistosomalen Aktins zu finden, da es nicht diese Länge umfasst. Enhancer sind auch für die Aktinexpression in Invertebraten essentiell: Für die Expression des Act5C aus Drosphila sind Promotorfragmente >1,9 kb für eine starke Expression notwendig. Die konstitutive Expression von ACT5C erfolgt durch regulatorische Bereiche 190-450 bp upstream des Transkriptionsstartpunktes (Bond-Matthews und Davidson, 1988). In C. elegans gelingt keine starke Expression von GFP oder β-Galaktosidase mit dem 200 bp großen Minimal-Promotor Aktin1 (Jackstadt et al., 1999), dagegen wird durch ein 1,2 kb-Fragment des Aktin2-Promotors in S. stercoralis eine starke Reportergenexpression vermittelt (Lok und Massey, 2002). Die Analyse der Sequenz spricht für eine geringe Promotoraktivität, was durch Transfektionsversuche, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, bestätigt wurde: Das 338 bp umfassende Fragment der 5’-UTR des SmAct enthält regulatorische Elemente, die für eine basale Transkription in cos7-Zellen ausreichen, in vivo konnte dagegen keine Reportergen-Expression nachgewiesen werden. Hinzu kommt, dass das Smact möglicherweise einer geschlechtsspezifischen Regulation unterliegt (Busek et al., 2002).


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Um geeignete Promotoren für die Transfektion von Schistosomen zu isolieren, müssen vermutlich größere Promotorfragmente isoliert werden, wobei house-keeping Gene des Cytoskeletts für Transfektionsversuche geeignet wären. Wie bereits erwähnt werden Aktinpromotoren häufig für Transfektionsversuche eingesetzt (Lok und Massey, 2002; Higashijima et al., 1997; Dahler et al., 1994). Gene, deren Transkripte in großer Zahl in EST-Analysen nachgewiesen werden, sind stark exprimiert (Santos et al., 1999). Deswegen könnte auch die Analyse von ESTs einen Hinweis auf besonders starke Promotoren geben. Die GAPDH wird in Zerkarien stark exprimiert (Santos et al., 1999), ihr Promotor ist daher möglicherweise für Transfektionsversuche geeignet. Die Sequenzierung und Charakterisierung von Enhancern kann auch für die Transfektion von Schistosomen entscheidend sein: In C. elegans unterliegt die Regulation der Myosin-Gene der Kooperation von gewebespezifischen Promotoren mit upstream liegenden gewebespezifischen Enhancern (Okkema et al., 1993). Vielleicht gibt es auch in Schistosomen ubiquitär funktionale Enhancer: In Säugetierzellen verstärkt ein 213 bp Fragment in der HSP70 5’-UTR die Expression unter dem SV40-Promotor und dem CMV-Promotor ohne die Induktion eines Hitzeschocks zu benötigen. Dieses System ist möglicherweise auch auf Invertebraten übertragbar (Vivinus et al., 2001).

3.2.2 Eignung der eingesetzten Reporter als Transfektionsmarker

GFP ist ein nicht invasiver Reporter, der art- und zellunspezifisch in sehr verschiedenen Organismen exprimiert wird, weil die Ausbildung der fluorophoren Gruppe autokatalytisch erfolgt und keine zelleigenen Kofaktoren benötigt (Prasher, 1995). Deswegen eignet sich GFP für die Selektion von transgenen Tieren in vivo (Wimmer, 2003). Wippersteg et al. (2002 a und b) und Rossi et al. (2003) benutzten in ihren Versuchen zur Transfektion von S. mansoniein für die Expression in Pflanzen optimiertes GFP (Reichel et al., 1996) als Reporter. Nur in 5 von ca. 1000 adulten Würmern, die besonders viele Goldpartikel aufwiesen, wurde großflächige GFP-Fluoreszenz am Laserscanningmikroskop beobachtet (persönliche Mitteilung Wippersteg). Die beobachtete schwache GFP-Expression in Schistosomen kann auf einer geringen Transkription beruhen. Möglicherweise wird das Protein auch auf der Translationsebene falsch gefaltet, was auch eine geringe Konzentration an aktivem GFP zur Folge hätte.


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In dieser Arbeit wurde versucht, die Expression eines Transfektionsmarkers für S. mansonidurch den Einsatz des kommerziell erhältlichen EGFP (BD Biosciences Clontech, USA) zu optimieren. Die Mutationen in dieser GFP-Variante von Phenylalanin in Position 64 zu Leucin und von Serin in Position 65 zu Threonin (Cormack et al., 1996) führen zu einer 35 fachen Verstärkung der Fluoreszenz (Cormack et al., 1996; Yang, 1996). Die schnellere Faltung der chromophoren Gruppe führt bei dieser Variante außerdem zu einer besseren Faltung bei 37°C (Cormack et al., 1996; Crameri et al., 1996). Weil adulte Würmern und Sporozysten bei 37°C bzw. 28 °C kultiviert werden, ist möglicherweise diese GFP-Variante besser zur Expression in adulten und larvalen Stadien geeignet.

Wie in dieser Arbeit dargestellt, konnte eine Verbesserung der Reporterexpression nicht erzielt werden. Die Häufigkeit des Auftretens großflächiger Fluoreszenz in adulten Würmern entsprach den Beobachtungen von Wippersteg (persönliche Mitteilung). Auch EGFP-Fluoreszenz konnte nur am Laserscanningmikroskop beobachtet werden. Der Nachweis von EGFP auf Proteinebene durch Westernblot-Analyse gelang auf Grund der geringen Expression nicht. In Sporozysten wurde in einzelnen Zellen epifluoreszenzmikroskopisch EGFP beobachtet, nachdem die auftretende Eigenfluoreszenz durch Trypan-Blau reduziert wurde. In intakten Sporozysten wurde dagegen mit dem Einsatz eines Laserscanningmikroskopes keine EGFP-Fluoreszenz festgestellt.

Die Funktionalität der eingesetzten Konstrukte und die Übertragung von Plasmid-DNA durch Mikroprojektilbeschuss wurden jedoch erfolgreich durch die Expression von EGFP in HeLa- u. cos7-Zellen nachgewiesen. Als weitere Positivkontrolle für das Einbringen von DNA in einen vielzelligen Organismus konnte die Expression von GFP nach dem Mikroprojektilbeschuss in C. elegans nachgewiesen werden. Dies beweist, dass eine starke GFP-Expression grundsätzlich auch epifluoreszenzmikroskopisch detektiert werden kann.

In Arabidopsis thaliana kommt es zu einem Fehlspleißen der Wildtyp GFP-mRNA, sodass keine vollständigen Transkripte nachzuweisen sind (Haseloff et al., 1997). Ein Fehlspleißen des EGFP in Schistosomen ist dagegen unwahrscheinlich, weil es als Protein fluoreszenzmikroskopisch, aber auch als Transkript durch RT-PCR detektiert werden konnte. Außerdem sind Signale für das cis-Spleißen bei S. [Seite 90↓] mansonikonserviert (Charrier-Ferrara et al., 1992). Diese konservierten Signale sind in der EGFP-Sequenz aber nicht enthalten.

Möglicherweise kommt es bei der Translation von EGFP zu Problemen, weil der Kodon-Gebrauch, der bei dem eingesetzten EGFP für die Expression in Säugetierzellen angepasst wurde (Haas et al., 1996), nicht geeignet zur Expression in Schistosomen ist. EGFP wurde bisher zur Expression in Pflanzen, verschiedenen Insekten, anderen Plathelminthen und Bakterien eingesetzt, lediglich die Expression in Hefen ist limitiert (Cormack et al., 1997). Für Filarien ist zur Expression von Reportern das Einführen von kleinen Intron-Sequenzen notwendig (Fire et al., 1990). Die Detektion von Fluoreszenz nach der Expression dieses für die Expression in Nematoden adaptierten GFPs unter der Kontrolle des schistosomalen GST-Promotors war nicht in S. mansoni möglich (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise können andere Mutationen am GFP zu einer verbesserten Expression in Schistosomen führen.

Für die Detektion von GFP oberhalb der Autofluoreszenz ist eine ausreichende Konzentration an GFP in der Zelle notwendig (Niswender et al., 1995). Dabei führt eine subzelluläre Lokalisation zu einem intensiveren Signal, weil die Expression auf einen eng umgrenzten Raum innerhalb der Zelle beschränkt ist. Das schistosomale Tegument bildet ein Syncytium, in dem GFP frei diffundieren kann. Auch in dieser Arbeit wurde GFP-Fluoreszenz beobachtet, die nicht mit Goldpartikeln kolokalisierte, was durch GFP-Diffusion zu erklären ist. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch von Wippersteg et al. in S. mansoni(2000 a) und von Jackstadt et al. in Filarien (1999) gemacht. Bei der Selektion von transgenen Insekten wird EGFP deswegen lokal in den Augen exprimiert, um die Detektion zu erleichtern (Wimmer, 2003). In S. mansoni besteht ein weiteres Problem darin, dass sowohl adulte als auch larvale Stadien bei der Anregung mit blauem Licht (GFP-Anregungswellenlänge 490 nm) eine starke Eigenfluoreszenz entwickeln. Dieses Phänomen konnte auch in Filarien beobachtet werden (Jackstadt et al., 1999).

Für die starke Eigenfluoreszenz in weiblichen Würmern sind bei S. mansoni Proteine verantwortlich, die an der Oogenese beteiligt sind, die in vitro nur unvollständig verläuft. Diese Proteine werden daher von weiblichen Würmern beständig ausgeschieden. Bei einer längeren Kokultur von weiblichen und männlichen [Seite 91↓]Würmern, die diese Proteine ständig passiv mit dem Medium aufnehmen, tritt endogene Fluoreszenz deswegen auch in den Männchen auf. In dieser Arbeit wurden aus diesem Grund nur separat kultivierte Männchen für Transfektionsversuche eingesetzt.

Eine weitere Reduktion der endogenen Fluoreszenz wurde durch den Einsatz von DsRed als Reporter erreicht. Schistosomen weisen bei der Anregung mit grünem Licht (546 nm DsRed-Anregungswellenlänge) nur eine geringe Eigenfluoreszenz aufweisen. DsRed besitzt außerdem eine andere Primärstruktur wird deswegen möglicherweise besser exprimiert als EGFP (Yarbrough et. al, 2001). Die Aktivierung der fluorophoren Gruppe und die Faltung des DsRed erfolgen wie bei GFP autokatalytisch (Gross et al., 2000). Wie in dieser Arbeit dargestellt, konnte jedoch die Expression von DsRed in Schistosomen nicht nachgewiesen werden.

Als weiterer Reporter wurde auch β-Galaktosidase eingesetzt. Dieser Reporter wird im Unterschied zu GFP und DsRed anaerob exprimiert. Seine Expression kann histologisch in transfizierten Geweben vielzelliger Parasiten nachgewiesen werden (Jackstadt et al., 1999; Fire, 1992). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass männliche Schistosomen eine geringere endogene Aktivität an β-Galaktosidase besitzen als weibliche Schistosomen. Dennoch kolokalisierten Goldpartikel bei der Transfektion von adulten Würmern mit β-Galaktosidase-Konstrukten nicht mit der Färbung. Nur in Sporozysten gelang der Nachweis von β-Galaktosidase bei der Expression unter der Kontrolle des GST28-Promotors. Der Nachweis einer stärkeren β-Galaktosidase-Expression in Zerkarien, die sich aus transfizierten Mirazidien entwickelten, war dagegen nicht möglich. Insgesamt zeigen diese Versuche, dass β-Galaktosidase als Reportergen für die Transfektion auf Grund der endogenen Aktivität sowohl in adulten und larvalen Schistosomen als auch in den Zwischenwirtsschnecken ungeeignet ist.

Um eine Keimzellentransfektion nachzuweisen, würde sich Luciferase eignen, die bereits in S. mansoni exprimiert wurde. Sogar die schwache Expression durch den schistosomalen SL-Promotor konnte durch Davis et al. (1999) gezeigt werden. Entscheidender Nachteil beim Einsatz der Luciferase ist aber, dass sich dieser Reporter nur in einem Proteingesamtextrakt nachweisen ließe.


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Der Einsatz verschiedener Standard-Reporter für die Transfektion von S. mansoni ist ein Hinweis darauf, dass für die geringe Expression der Reporter schwache Promotoren verantwortlich sind (Tsien, 1998). Für die Etablierung des Transfektionssystems müssen deswegen weitere konstitutiv stark exprimierende Promotoren kloniert werden.

3.3 Wege zu einer stabilen Transfektion

Die Versuche zur Transfektion von S. mansoni bezogen sich in dieser Arbeit bislang auf eine transiente Transfektion adulter Würmer und in vitro erzeugter Muttersporozysten. Es wurde nachgewiesen, dass eine transiente Transfektion von S. mansoni grundsätzlich möglich ist. Zur Etablierung eines Transfektionsystems sind allerdings weitere Schritte notwendig: Es müssen Konstrukte entwickelt weden, die eine Integration in das schistosomale Genom ermöglichen, um eine stabile Transfektion zu erhalten. Außerdem muss der transgene Organismus in den Lebenszyklus eingebracht werden, weil eine Kultur des gesamten Zyklus in vitro ineffetiv ist (Ivanchenko et al., 1999)

Damit Plasmide an die nachfolgende Generation weitergegeben werden, muss die DNA nicht unbedingt in das Genom integriert werden. In C. elegans und in humanen Zellen bildet Plasmid-DNA große Konkatamere, die extrachromosomal vererbt werden (Schindelhauer und Laner, 2002; Mello et al., 1991). Die Bildung von Konkatameren ist unmittelbar abhängig von der transferierten DNA-Menge (Schindelhauer und Laner, 2002; Mello et al., 1991). Wie in 3.1 diskutiert besteht bei Schistosomen das Problem, große DNA-Mengen durch Mikroinjektion zu transferieren, wodurch die Bildung von extrachromosomal vererbaren Konkatameren unwahrscheinlich ist. Hinzu kommt auch, daß durch extrachromosomale Konkatamere, keine stabile Transfektion erreicht wird, weil diese sich im Laufe der Zeit ausverdünnen.

Eine zeitweilige Blockierung der Genexpression erreicht man in Schistosomen durch RNAi. Aber weder bei der Suppression der Expression des Cathepsin B in Zerkarien (Skelly et al., 2003) noch bei der Suppression der SGTP1 und der GAPDH in Muttersporozysten (Boyle et al., 2003) wurden Phänotypen erzeugt, obwohl die Transkription der betroffenen Gene signifikant um bis zu 80 % reduziert war. In C. elegans, wo RNAi-Effekte bislang am besten untersucht wurden, treten Phänotypen [Seite 93↓]meist erst in der F1-Generation, selten in der F2 und F3-Generation auf (Montgomery et al., 1998; Tabara et al., 1998). Im Unterschied zu C. elegans kann der komplexe Lebenszyklus von S. mansoni nicht vollständig in vitro kultiviert werden, sodass Phänotypen durch RNAi vermutlich schwieriger zu erzeugen sind.

Die Transfektion von Keimzellen und das Einschleusen eines transgenen Stadiums dagegen ermöglicht eine phänotypische Charakterisierung in allen Stadien. Deswegen wurde in dieser Arbeit versucht, eine Transfektion von Keimzellen innerhalb eines Stadiums zu erreichen, das in den Zyklus eingeschleust werden kann.

3.3.1 Transfektion von Keimzellen und Einschleusen eines transgenen Stadiums in den Lebenszyklus

Ein besonderer Vorteil der Transfektion von Schistosomen durch Mikroprojektilbeschusses besteht in der Möglichkeit, die Parameter auf die verschiedenen Stadien anzupassen, sodass sowohl Zellen nahe des Tegumentes aber auch Gewebe im Inneren des Parasiten transfiziert werden können
(Davis et al., 1999). Durch Optimierung der Parameter wurden in dieser Arbeit sowohl adulte Würmer als auch Muttersporozysten transient transfiziert.

Adulte Würmer sind aber aus zwei Gründen ungeeignet zur Etablierung eines Transfektionsystems: Die Implantation in die Mesenterialvenen wie sie von Cheever et al. (1994) und Basch und Humbert (1981) beschrieben wurde ist technisch schwer durchzuführen, sodass transgene Würmer nur mit großem Aufwand in den Zyklus integriert werden können. Außerdem besitzen sie nur wenige Keimbahnzellen, die für eine stabile Transfektion erreicht werden müssten, im Verhältnis zu somatischen Zellen.

Auch der Einsatz von Muttersporozysten, die viele totipotente Zellen in den Keimballen besitzen (Pan, 1980), ist in diesem Zusammenhang problematisch: Wie bereits geschildert, ist ihre Kultur in vitro nur über einen kurzen Zeitraum möglich (Jourdane und Yoshino, 2000). Die weitere Kultur von Muttersporozysten zu Tochtersporozysten, die notwendig ist für eine Implantation in die Zwischenwirtsschnecken (Jourdane et al., 1985), ist nur in Anwesenheit einer Bge-Zelllinie möglich und daher experimentell aufwendig. Eine Implantation bedeutet zudem einen chirugischen Eingriff für die Schnecken. Die Überlebensrate sowohl für [Seite 94↓]die Schnecken als auch für die implantierten Sporozysten ist daher gering (Jourdane et al., 1985).

Um ein transgenes Stadium in den Zyklus einzuschleusen, ist es sinnvoll, den natürlichen Infektionsverlauf im Lebenszyklus von S. mansoni auszunutzen. Im Lebenszyklus treten zwei freilebende Stadien auf, die Mirazidien, die aus den Eiern schlüpfen und den Zwischenwirt infizieren und die Zerkarien, die von dem Zwischenwirt ausgeschieden werden und den Endwirt infizieren. Zerkarien verlieren mechanisch gestresst leicht ihren Gabelschwanz und sind dann nicht mehr infektiös (Skelly et al., 2003). Mirazidien besitzen außerdem Keimballenzellen, aus denen sich die Sporozysten entwickeln. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Mirazidien transfiziert, mit denen der Zwischenwirt infiziert werden kann.

Nach Anpassung des Mikroprojektilbeschusses zur Transfektion von Mirazidien überlebten 60 % dieses Stadiums den Beschuss und wandelten sich in vitro in Muttersporozysten um. In 15 % der sich entwickelnden Muttersporozysten wurden Goldpartikel nachgewiesen. Die Transfektionsrate ist jedoch vermutlich größer, da sich einzelne Goldpartikel nur schlecht nachweisen lassen. Sich bewegende Wimpernzellen in den Protonephridien und peristaltische Bewegungen der Sporozysten zeigten, dass die Transformation der Mirazidien zu Muttersporozysten durch den Mikroprojektilbeschuss nicht beeinflusst wurde. Goldpartikel wurden in unterschiedlichen fokalen Ebenen nachgewiesen. Das bedeutet, dass unterschiedliche Gewebe innerhalb der Sporozyste getroffen wurden.

Um die Transformation beschossener Mirazidien auch in vivo zu untersuchen, wurden Mirazidien nach dem Mikroprojektilbeschuss für die Infektion von Schnecken eingesetzt. Unterschiede im Infektionsverhalten im Vergleich zu unbehandelten Mirazidien konnten nicht festgestellt werden. 10 Tage nach der Infektion wurden in den Schnecken Sporozysten nachgewiesen. Die Ansiedlung der Sporozysten in der Nierenregion und die Morphologie der Sporozysten stimmt mit den Beschreibungen aus der Literatur überein (Lemos und Andrade, 2001; Luchtel et al., 1997). Morphologisch ließen sich Sporozysten, die sich aus beschossenen Mirazidien entwickelten, nicht von Sporozysten unterscheiden, die sich aus unbehandelten Mirazidien entwickelten. Die Nukleoli beschossener Sporozysten waren deutlich erkennbar und es konnte Eu- und Hetrochromatin an der Zellmembran [Seite 95↓]nachgewiesen werden. Die Nukleoli wiesen Vakuolen auf, die ein Hinweis auf eine starke Translationssaktivität sind (Underwood, 1990; Smetana, 1974). In vielen Fällen kolokalisierten Goldpartikel mit den Keimballenzellen. Diese Kolokalisation und die morphologische Integrität zeigen, dass es möglich ist, Mirazidien zu beschießen und für die Infektion von Schnecken einzusetzen.

In dieser Arbeit wurde außerdem nachgewiesen, dass sich aus transgenen Mirazidien transgene Sporozysten innerhalb der Schnecke entwickeln. Der Transfektionserfolg wurde in zwei unabhängigen Versuchen durch den Nachweis von EGFP-Transkripten gezeigt. Der Nachweis von EGFP als Protein gelang vermutlich auf Grund der geringen Expression nicht. In der Positivkontrolle gelang nur der Nachweis von Sporozysten durch ein Infektionsserum aus BALB/c-Mäusen.

Durch den Beschuss von Mirazidien ließe sich ein Transfektionssystem für Schistosomen etablieren, weil sich allein aus den Keimballenzellen in den Muttersporozysten die nächste Generation, die Tochtersporozysten, entwickeln (Jourdane et al., 1980). Die Transfektion von Organellen innerhalb einer Zelle ist bereits in mehreren Studien beschrieben worden (Rohou et al., 2001; Ruf et al., 1997; Butow et al., 1996; Lorito et al., 1993; Klein und Fitzpatrick-McElligot, 1993; Daniell, 1993). Die Keimballenzellen liegen innerhalb des Mirazidiums und können vermutlich nur durch Mikroprojektilbeschuss transfiziert werden. Durch Lipofektion, die vermutlich die Sporozysten weniger schädigen würde, könnten nur Zellen in der Nähe des Tegumentes erreicht werden.

Der Nachweis, dass tatsächlich Keimzellen transfiziert wurden, konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden. In zwei unabhängigen Versuchen konnte in den Zerkarien, die sich aus transfizierten Mirazidien entwickeln, kein EGFP nachgewiesen werden. Der fehlende Nachweis beruht vermutlich auf einer zu geringen Expression des EGFP und weil durch die eingesetzen Plasmide keine Integration in das Genom erfolgt, kommt es vermutlich zu einer Verdünnung der Plasmide. Dadurch wird die ohnehin geringe EGFP-Menge unter die Nachweisgrenze gesenkt. Um eine Keimzellentransfektion nachweisen zu können, müssen stärkere Promotoren eingesetzt werden, die konstitutiv in den Zerkarien aktiv sind oder es müssen Reporter eingesetzt werden, die einen sensitiveren Nachweis ermöglichen.


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3.3.2  Integrationen in das schistosomale Genom und Etablierung transgener Linien

Durch den Mikroprojektilbeschuss ist die Menge an DNA, die in die Zellen übertragen wird, bei S. mansoni limitiert.

Wie bereits dargestellt ist deswegen die Bildung von extrachromosomalen Konkatameren, die bei C. elegans durch Bestrahlung integriert werden können, unwahrscheinlich (Kampkotter et al., 2003).

Eine weitere Möglichkeit zur stabilen Integration stellt die homologe Rekombination dar. Diese direkte Mutagenese von chromosomalen Genloci durch den Austausch mit einem homologen mutierten Gen wird in vielen Systemen zur Transfektion eingesetzt. Die meisten in dieser Arbeit vorgestellten Konstrukte besitzen keine endogenen 3’-Bereiche und sind daher für eine Integration durch homologe Rekombination nicht geeignet. Lediglich das Konstrukt pH-EGFP-H kann mit den endogenen nicht translatierten 5’ und 3’-Bereichen des HSP70-Gene dazu eingesetzt werden. Für eine effektive homologe Rekombination sind die nicht translatierten Bereiche in diesem Konstrukt vermutlich zu kurz (Donald und Roos, 1995). Die homologe Rekombination ist ein seltenes Ereignis, sie tritt vorallem in teilungaktiven Zellen auf, in denen nach einem Doppelstrangbruch die eingebrachte DNA mit der chromosomalen DNA rekombiniert (Brenin et al., 1997). Deswegen findet die homologe Rekombination vor allem Anwendung in Transfektionssystemen, in denen durch Elektroporation, Lipofektion oder Mikroinjektion größere DNA-Mengen eingebracht werden können (Mamoun et al., 1999; Donald und Roos, 1998 und 1995; Brenin et al., 1997).

Eine andere Methode zur stabilen Integration ist der Einsatz mobiler genetischer Elemente (MGEs). Diese besitzt gegenüber der homologen Rekombination den Vorteil, dass einmal eingebrachte Konstrukte bis zum Abbau der Plasmid-DNA in der Zelle aktiv sind und dadurch die Insertionshäufigkeit steigt. Mobile genetische Elemente sind in ihrer Aktivität auch nicht auf zellteilungsaktive Zellen fixiert.

Eine Art solcher Elemente sind Transposons. Sie gehören zu den MGEs der Klasse II und sind direkt als DNA im Genom aktiv (Brindley et al., 2003; Finnegan et al., 1989). MGEs der Klasse II wurden bisher nicht in Schistosomen gefunden. Mitglieder der TC1/mariner-Superfamilie innerhalb dieser Klasse finden sich aber in Pflanzen, Pilzen und verschiedenen Tierstämmen (Plasterk et al., 1999). Die Transposons [Seite 97↓]dieser Superfamilie kodieren für eine Transposase, die von inverted repeats flankiert wird (Plasterk et al., 1999). Ihre Transposition findet nach einem cut and paste-Mechanismus in ein TA Dinukleotid statt (Luo et al., 1998; van Luenen und Plasterk, 1994) und wird allein durch die Transposase ermöglicht (Lampe et al., 1996; Vos et al., 1996). Die bekanntesten Vertreter aus dieser Superfamilie sind TC1 aus C. elegans (Emmons et al., 1983) und Mos1 aus Drosophila mauritana (Medhora et al., 1991; Jacopson et al., 1986). Das mariner/Mos1 wurde bereits als molekularbiologisches Werkzeug zur Transfektion in verschiedenen Tierstämmen eingesetzt (Bessereau et al., 2001; Mamoun et al., 2000; Wang et al., 2000; Coates et al., 1998; Gueiros-Filho und Beverley, 1997) Es wurde auch ein mariner-Transposons in dem Plathelminthen Dugesia (Garcia-Fernandez et al., 1995) nachgewiesen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass heterologe mariner-Transposons möglicherweise auch im Genom von Schistosomen aktiv sein könnten und daher für eine stabile Transfektion dieses Parasiten eingesetzt werden können (Brindley et al., 2003). Ein erster Schritt zur Überprüfung der Funktionalität des Mos1/mariner–Transposon könnten Versuche zur Transposition in vitro sein (Goyard et al., 2001; Tosi und Beverley, 2000), in denen der Beweis eines Transpositionsereignisses leichter zu führen ist als in vivo. Für in vivo Versuche sind starke Promotoren zur Expression der Transposase notwendig, weil die Häufigkeit an Transpositionsereignissen direkt mit der Transposase-Konzentration in der Zelle zusammenhängt (Besserau et al., 2001). Mit integrierenden Konstrukten wäre auch die Weiterentwicklung der RNAi, die für Schistosomen nachgewiesen wurde (Skelly et al., 2003; Boyle et al., 2003), möglich: In Drosophila melanogaster wurde durch stabile Integration eines Konstruktes, das bei der Transkription eine doppelsträngige Struktur ausbildet, dauerhaft die Expression eines Transkriptionsfaktors inhibiert (Piccin et al., 2001).

Bei der Etablierung eines Transfektionssystems ist eine Selektion der Transformanten notwendig. Die für parasitische Einzeller (Mamoun et al., 1999; Donald und Roos, 1998) und eukaryotische Zelllinien (Izsvak et al., 2000; Luo et al., 1998; Ivizs et al., 1997) eingesetzten Resistenzgene, die eine Antibiotikaresistenz vermitteln, eignen sich nicht zur Selektion bei S. mansoni: Bei der Transfektion von Mirazidien entwickeln sich die transgenen Tochtersporozysten in der [Seite 98↓]Zwischenwirtsschnecke und sind dort für eine Antibiotikaselektion vermutlich schwer zugänglich. Auf Grund der eingeschränkten Kulturmöglichkeiten ist auch eine Selektion in vitro nicht möglich.

Eine weitere Möglichkeit zur Selektion transgener Organismen bietet der Einsatz von GFP als Transfektionsmarker, der eine Detektion in vivo ermöglicht. Auch im Rahmen dieser Arbeit wurde EGFP-Expression in S. mansoni nachgewiesen, was die grundsätzliche Eignung dieses Reporters als Transfektionsmarker in Schistosomen beweist.

Für das Transfektionssystem von Insekten steht ein in vivo-Selektionssystem zur Verfügung: Der artifizielle 3XP3-Promotor, der auf den Promotor des Pax-6/sine occulis-Transkriptionsfaktors zurückgeht (Horn und Wimmer, 2000; Czerny und Busslinger, 1995; Wilson et al., 1993), ermöglicht die Expression von EGFP in den Augen verschiedener Insekten-Ordnungen (Wimmer, 2003; Thomas et al., 2002; Kokoza et al., 2001; Horn et al., 2000; Horn und Wimmer, 2000; Berghammer et al., 1999). Dabei ist eine einzige Integration von EGFP unter dem starken Promotor bereits erkennbar (Wimmer, 2003; Berghammer et al., 1999). Das Transfektionssystem ist auch unter der Verwendung des bereits beschriebenen Mos1/mariner-Transposon verfügbar (Berghammer et al., 1999). Der Transkriptionsfaktor Pax-6/sine occulis nimmt eine zentrale Stellung im regulatorischen Netzwerk ein, das der Augenentwicklung der Metazoa (Pichaud und Desplan, 2002; Callaerts et al., 1997) bei den verschiedenen Rezeptor-Subtypen (Sheng et al., 1997) zu Grunde liegt. Die Augenentwicklung von Girardia tigrina, einem Vetreter der Plathelminthen, ist auf molekularer Ebene aufgeklärt und unterliegt ebenfalls dem Transkriptionsfaktor Pax-6/sine occulis (Pineda et al., 2002; Callaerts et al., 1999). Für Girardia tigrina ist bereits die Verwendbarkeit des Selektionssystems der Insekten beschrieben (Wimmer, 2003). Der Nachweis von Pax6/sine occulis ist für S. mansoni noch nicht erfolgt. Dennoch ist dieses System möglicherweise auch auf Schistosomen zu übertragen: Für Zerkarien, die als erstes freilebendes Stadium nach der Transfektion von Mirazidien die Zwischenwirtsschnecke wieder verlassen, ist die Existenz von Photorezeptoren morphologisch nachgewiesen worden (Short und Gagne, 1975). Auch auf Transkriptionsebene wurde die Existenz eines an der Photorezeption beteiligten [Seite 99↓]Proteins nachgewiesen (Santos et al., 1999). Diese Tatsache macht das Vorhandensein einer Regulation durch Pax-6/sine occulis und damit die Eignung der vorliegenden Konstrukte zur Selektion von transgenen Zerkarien wahrscheinlich.

Bei der Mutagenese besteht das Problem bei Schistosomen, dass zur Erzeugung von Phänotypen beide Allele des diploiden Organismus mutiert sein müssen. Deswegen sind Kreuzungen von transgenen Schistosomen notwendig. Eine Klonierung von transgenen Schistosomen-Stämmen wäre möglich, indem transgene Zerkarien zur Infektion des Endwirtes eingesetzt und sich entwickelnde Mirazidien einzeln zur Infektion von Schnecken verwendet würden (Den Hollander und Erasmus, 1984). Die sich entwickelnden Zerkarien bilden einen Klon. Für die Infektion des Endwirtes lässt sich das Geschlecht der Zerkarien durch eine PCR-Methode bestimmen (Grevelding et al., 1997).

Neben Klasse II MGEs sind auch mobile genetische Elemente der Klasse I, wie z.B. Retroelemente, die über ein RNA-Intermediat transponieren, für Transfektionsversuche einsetzbar (Kaiser, 2003; Zhu et al., 2003). Diese besitzen eine größere Wirtszellspezifität. Deswegen ist der Einsatz eines endogenen Retroelementes notwendig. Boudicca aus S. mansoni ist das erste LTR-Retrotransposon, das in seiner gesamten Länge beschrieben ist und in seiner ganzen Sequenz vorliegt. Untersuchungen zu seiner Aktivität im schistosomalen Genom wurden im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt.

3.3.2.1 Charakterisierung des endogenen Retrotransposons Boudicca

Das Genom von S. mansoni ist ca. 270 Mb groß (Simpson et al., 1982). Diese Größe entspricht der Genomgröße der anderen humanpathogenen Schistosomen (Hirai et al., 2000; Grossman et al., 1981 a und b). Die Chromosomen von S. mansoni werden von zwei Familien an Nicht-LTR-Transposons besiedelt (Drew et al., 1999; Drew und Brindley, 1997), die für Transfektionsversuche nicht eingesetzt werden können. Boudicca ist demgegenüber das erste LTR-Retrotransposon, das in seiner gesamten Länge sequenziert und analysiert ist. Boudicca nimmt einen relativ großen Anteil am schistosomalen Genom ein, ausgehend von einer Größe von 5,8 kb mit 1000 Kopien macht es ca. 4 % im Genom von S. mansoni aus (Copeland et al., 2003). Die Boudicca-Kopie im BAC Klon 53-J-5 ist degeneriert und deswegen vermutlich inaktiv. Inaktive Kopien von Retrotransposon können aber durch [Seite 100↓]vorhandene intakte Kopien an anderer Stelle im Genom aktiviert werden (Wei et al., 2001; Ansari-Lahi und Gibbs, 1996; Chaboissier et al., 1995).

In dieser Arbeit wurden Boudicca-Transkripte in adulten Würmern, Sporozysten und Zerkarien nachgewiesen. Boudicca ist deswegen vermutlich im Genom von S. mansoni aktiv und besitzt auf Grund seines häufigen Vorkommens im Genom möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf die Evolution des schistosomalen Genoms (Petrov et al., 2000; Charlesworth et al., 1994). Die von Ivanchenko et al. (1999) nachgewiesenen Transkripte einer reversen Transkriptase können unter anderem auf der Transkription von Boudicca beruhen.

Obgleich die vorliegende Boudicca-Kopie durch Mutationen inaktiv ist, weist die Integrität der Organisation in ein gag- und ein pol-gen darauf hin, dass Boudicca ein aktives Retrotransposon im schistosomalen Genom ist (Brindley et al., 2003; Copeland et al., 2003). Damit es als molekularbiologisches Werkzeug eingesetzt werden kann, müsste es durch Mutagenese reaktiviert werden.

Eine Aktivierung eines inaktiven MGE ist für das TC1/mariner-Transposons Sleeping Beauty beschrieben: Durch Ermittlung einer Konsensussequenz aus 12 teilweise bekannten Sequenzen TC1-ähnlicher Elemente aus acht verschiedenen Fischarten rekonstruierten Ivics et al. (1997) ein aktives TC1/mariner-Transposon, Sleeping Beauty, das seine Aktivität in HeLa-zellen bewies. Himar1 aus Haematobia irritans wurde auch durch Mutagene reaktiviert (Robertson und Lampe, 1995) und stand nachfolgend für Transfektionsversuche sowohl in vitro (Lampe et al., 1998) als auch in vivo (Zhang et al., 1998) zur Verfügung.

Mit der Klonierung eines vollständigen Boudicca-Transkriptes aus mRNA-Transkripten in dieser Arbeit wurde eine Boudicca-Sequenz ermittelt, die einem aktiven Retroelement entspricht und die deswegen als Grundlage für eine Reaktivierung der inaktiven Kopie 53-J-5 dienen kann. Die Ergebnisse der Sequenzierung des Boudicca-Transkriptes unterstützten die Vermutung, dass Boudicca im Genom von S. mansoni aktiv ist: Das gag-Gen wird in einem zusammenhängenden ORF kodiert. Das bei nt 999 in der Kopie 53-J-5 vorhandene Stopp-Kodon konnte in den Transkripten nicht nachgewiesen werden. Wichtig für den Einsatz von Boudicca als molekularbiologisches Werkzeug ist aber vorallem der Erhalt der Integrase-Domäne innerhalb des zweiten ORF: In der Boudicca-Kopie 53-[Seite 101↓]J-5 bestand die Integrase-Domäne aus mehreren offenen Leserahmen, die durch Stopp-Kodons und Verschiebungen im Leserahmen verursacht wurden. In der Kopie 53-J-5 konnte daher ein 225 bp-Abschnitt innerhalb der Integrase-Domäne nicht zugeordnet werden (Copeland et al., 2003). Die Kosensussequenz aus den Transkripten weist nach, dass es sich bei den Stopp-Kodons bei nt 3923 und bei nt 4167 um Mutationen handelt. Auch die Verschiebung des Leserahmens durch Integration eines Nukleotids bei nt 3577 lässt sich in den Transkripten nicht nachweisen. Die Integrität der Integrase, die eine zentrale Stellung im Lebenszyklus der Retroviren einnimmt (Rice und Baker, 2001; Craigie, 2001; Wlodawer, 1999), weil sie die Integration der retroviralen DNA in die Wirts-DNA ermöglicht (Fujiwara und Mizuuchi, 1988; Craigie und Mizzuchi, 1985), macht deutlich, dass Boudicca als Grundlage für ein Vektor-System zur Transfektion von Schistosomen dienen könnte.

In mehreren Versuchen gelang keine Amplifikation des dritten ORF, der auf Grund von Sequenzhomologien für ein envelope-Protein kodieren könnte (Copeland et al., 2003). Bei Boudicca handelt es sich daher um ein Retroelement mit zwei ORF, die für ein gag-Gen und ein pol-Gen mit den enzymatischen Domänen für eine Protease, eine Reverse Transkriptase, eine RNAse H und eine Integrase kodieren. Dieser Aufbau, der durch die Klonierung der aktiven Kopie aus mRNA-Transkripten bestätigt wurde, beweist unter anderem die Verwandtschaft von Boudicca zu den Retroelementen kabuki aus Bombyx mori und CsRn1 aus Clonorchis sinensis innerhalb der Ty3/gypsi-ähnlichen LTR-Retrotransposons (Brindley et al., 2003; Copeland et al., 2003).

Die Amplifikation der gag-Transkripte aus der cDNA gelang nur mit Primern, die mit dem ATG-Starkodon bei nt 622 hybridisierten. Eine Amplifikation der davor liegenden Sequenzen bis zum Startkodon bei nt 505 war nicht möglich. Wie Analysen der Sekundärstruktur in diesem Bereich gezeigt haben, liegt das Startkodon bei nt 505 innerhalb einer stabilen Sekundärstruktur und ist daher nicht für die reverse Trankriptase zugänglich. Der Nachweis, dass der vollständige Leserahmen, der für das gag-Gen kodiert, tatsächlich bei nt 505 beginnt, wird wie bereits erwähnt durch schistosomale ESTs (Zugangsnummern in der Genbank: AI395459 und AI067132), die diesen Bereich überlappen, erbracht. Die reverse Transkription ist ein entscheidender Vorgang bei der Verbreitung der Retroelemente im Wirtsgenom. [Seite 102↓]Stabile Sekundärstrukturen stellen regulatorische cis-Elemente dar, die abhängig von der reversen Transkriptase und weiteren Transkriptionsfaktoren die Transkription beeinflussen (Brooks et al., 1995). Die Bedeutung solcher cis-Elemente im nicht translatierten 5’-Bereich für die Regulation von Translation, Replikation oder Transkription ist auch von anderen Viren bekannt (Raman et al., 2003; Beuzon et al., 1999; Hemmings-Mieszczak und Hohn, 1999; Suo und Jonson, 1997; Carvalho und Derse, 1991; Feng und Holland, 1988). Diese Regulation ist entscheidend für das Überleben der Retroviren im Genom. Rerotransposons können als genetische Parasiten im Wirtsgenom verstanden werden, die im Laufe der Koevolution Mechanismen entwickelt haben, um das eigene Überleben zu sichern und um ein Überschwemmen des Wirtsgenoms durch Limitierung der eigenen Zahl zu verhindern (Deininger und Batzer, 2002). Die Komplexität dieses Systems wird besonders deutlich am Beispiel der pflanzlichen Pararetroviren, bei denen die Ribosomen durch Transkriptionsfaktoren an sekundären Faltungsstrukturen vorbeigeleitet werden und die Translation an spezifischen AUGs, die abwärts liegen, fortsetzen. Diese Regulation wird als ribosome shunting bezeichnet (Hohn et al., 2001).

Die Regulation der Transkription von Boudicca geschieht durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren aus der Wirtszelle an das LTR, das ein wesentliches Strukturmerkmal ist. Das Boudicca-LTR weist keine signifikanten Homologien zu den LTRs anderer Retrotransposons auf. Es besitzt mit einer Länge von 328 bp eine durchschnittliche Länge innerhalb der LTRs der Ty3/gypsi-ähnlichen LTR-Retrotransposons. Das LTR aus Boudicca beginnt mit dem Triplet TGT und endet mit dem Triplet TCA. Diese Triplets sind typische Strukturmerkmale der LTR-Retrotransposons und werden als direct inverted repeats bezeichnet (Bowen und McDonald, 1999; Dej et al., 1998). In dieser Arbeit wurde überprüft, ob das 5’-LTR der vorhandenen Kopie 53-J-5 in vitro als Promotor dienen kann. Das LTR des human imunodeffiency virus-1 (HIV-1) wurde bereits für die Expression von EGFP eingesetzt (Kar-Roy et al., 2000). Basierend auf dieser Studie wurde das LTR von Boudicca kloniert und zur EGFP-Expression eingesetzt. Die Expression von EGFP konnte in HeLa-Zellen, nicht aber in cos7-Zellen nachgewiesen werden. Dies spricht für eine Regulation des LTR durch zelleigene Transkriptionsfaktoren. Für das HIV1-[Seite 103↓]LTR sind zahlreiche Transkriptionsfaktoren bekannt (Wahlers et al., 2002; Kar-Roy et al., 2000). Das LTR von Boudicca enthält zwei TATA-Boxen und eine CCAAT-Box. Die TATA-Box ist ein kritischer Faktor für die basale Transkription des HIV1-Virus (Kashanchi et al., 1994; Berkhout und Jeang, 1992). TATA-Boxen und CCAAT-Boxen sind aber vermutlich nicht für die zellspezifische Aktivierung verantwortlich, weitere Erkennungssequenzen wie sie für das HIV1-LTR beschrieben sind, konnten dem Boudicca-LTR aber nicht zugeordnet werden. Zellspezifische Aktivität ist bei Retroviren sehr verbreitet (Wahlers et al., 2002; Derse et al., 1985). Insgesamt ist die Aktivität des Boudicca-LTR als Promotor ein weiterer Beweis für die Integrität dieses Retroelementes aus S. mansoni und seine Aktivität im schistosomalen Genom.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die vorliegende Boudicca-Kopie 53-J-5 nach ihrer Reaktivierung durch Mutagenese als Grundlage für die Herstellung von Vektoren zur stabilen Transfektion von S. mansoni dienen könnte.


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24.05.2004