4 Ausblick

Für die geringe Expression der Reporter in meinen Transfektionsexperimenten ist vermutlich die geringe Aktivität der in den Konstrukten vorliegenden Promotoren verantwortlich. Dennoch wäre die Quantifizierung der Transkription der verschiedenen Reporter in den Schistosomen durch quantitative Real Time PCR sinnvoll. Dadurch könnte abschließend geklärt werden, ob die geringe Reporterexpression auf eine geringe Transkription oder Translation zurückzuführen ist.

In etablierten Transfektionsystemen werden oft Promotoren des Cytoskeletts für die Expression von Reportern eingesetzt. Auch in dieser Arbeit wurde versucht, eine starke Expression durch einen Aktinpromotor zu erhalten. Der vorhandene Aktinpromotor führte aber zu keiner Verbesserung der Reporterexpression, da der klonierte Aktinpromotor vermutlich reguliert ist. Die Klonierung von Promotoren von Cytoskelettproteine sollte in weiteren Versuchen für eine starke Reportergenexpression durchgeführt werden. Da viele Cytoskelettproteine Proteinfamilien angehören, ist es notwendig, die Expressionsmuster der Aktine, der Myosine oder der Paramyosine aufzudecken, wie das für C. elegans geschehen ist. Damit wäre dann die Klonierung von starken house-keeping Genen möglich. Es ist auch notwendig, enhancer von Schistosomen zu klonieren bzw. größere Bereiche des nicht translatierten 5‘-Bereichs mit mehr regulierenden Bereichen aus genomischer DNA zu erhalten. Um in der Zukunft die Transfektionseffizienz zu optimieren, sollten Promotoren von Genen, die in hoher Kopienzahl in ESTs-Analysen gefunden werden, kloniert werden, da die Anzahl an gefundenen Kopien einen Hinweis auf die tatsächliche Expressionsstärke zulässt. Für die Expression von Reportern in Zerkarien wäre z.B. an den Promotor der GAPDH zu denken. Ein weiteres Problem bei der Transfektion von Schistosomen besteht in der Regulation der Expression in den verschiedenen Stadien. Bei der Wahl der Promotoren muss daher beachtet werden, welches Stadium transfiziert werden soll. Sollen z.B. integrierende Konstrukte in Schistosomen exprimiert werden, ist die Expression dieser Konstrukte durch Promotoren, die stark in Sporozysten exprimieren, notwendig. Die Expression eines Reporters zur Selektion transgener Zerkarien dagegen muss für Zerkarien optimiert sein. Der HSP70-Promotor ist z.B. in diesem [Seite 105↓]Zusammenhang ungeeignet, weil er in Zerkarien inaktiv ist. Möglicherweise muss mit verschiedenen Konstrukten kotransfiziert werden.

Unter Umständen reicht die gezeigte schwache Expression bereits aus, um eine stabile Integration in das schistosomale Genom zu erreichen. In ersten Ansätzen wäre es sinnvoll, DNA-Transposons für die stabile Transfektion einzusetzen: In Dugesia, einem Trematoden, wurde ein mariner ähnliches Transposon gefunden, was darauf hindeutet, dass diese Transposons auch in Schistosomen aktiv sind. Sinnvoll wäre z.B. der Einsatz des mos1/mariner Transposons für die stabile Transfektion in Schistosomen, weil sich gerade dieses Transposon durch eine weite Wirtsspezifität auszeichnet.

Auch Boudicca ist für eine solche stabile Transfektion geeignet, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, weist die vorhandene Kopie wenige Mutationen auf und ließe sich vermutlich reaktivieren. Vor allem die für die Integration notwendige Integrase weist eine intakte Struktur auf. Der Vorteil von Viren oder Retroelementen läge auch in einer hohen Transfektionsrate. Die Transfektion von Mirazidien durch Mikroprojektilbeschuss scheint als Methode geignet zu sein, ein transgenes Stadium in den Zyklus einzuschleusen.


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24.05.2004