5  Methoden und Materialien

Der Laborzyklus von S. mansoni wurde in der Maus Mus musculus Stamm BALB/c sowie der Wüstenrennmaus Meriones unguiculatus als Endwirt und der Wasserlungenschnecke Biomphalaria glabrata als Zwischenwirt etabliert. Die Endwirte wurden in Makrolonkäfigen im institutseigenen Tierhaus mit einem Hell-Dunkelrhythmus von 12 h gehalten. Der Zwischenwirt wurde bei 28°C unter Sprudelbelüftung in Wasser zur Schneckenhaltung (5.2.18) mit einem Hell-Dunkelrhythmus von 12 h kultiviert. B. glabrata wurde mit 10-20 Mirazidien pro Schnecke, die aus isolierten Schistosomeneiern (5.1.1.3) schlüpften, über Nacht unter einer Lichtquelle in 20 ml Wasser inkubiert. Nach 26 Tagen Kultur unter Standardbedingungen wurden die so infizierten Schnecken für 48 h abgedunkelt. Die Zerkarienausscheidung wurde induziert, indem die Schnecken verteilt auf 12-Loch-Platten starkem Licht ausgesetzt wurden; nach 2 h ließ die Zerkarienausscheidung nach und die Schnecken wurden entfernt. Die Zerkarien von mindestens 5 ausscheidenden Schnecken wurden vereinigt, um zu gewährleisten, dass männliche und weibliche Zerkarien für die Infektion des Endwirtes eingesetzt wurden. Die Tiere, die als Endwirte dienten, waren zum Zeitpunkt der Infektion mindestens 10 Wochen alt. Die zuvor durch Metofane-Inhalation betäubten Tiere wurden je nach Art mit 70-100 Zerkarien, die zuvor unter dem Binokular ausgezählt und in Spritzen in max. 0,1-0,3 ml Wasser aufgezogen wurden, infiziert. Die Infektion erfolgte durch subkutane Injektion von 70 Zerkarien in die Wüstenrennmäuse und von 100 Zerkarien in die Mäuse.

Zur Isolation von Würmern aus infizierten Endwirten wurden die Tiere 42 Tage nach ihrer Infektion durch CO₂-Inhalation getötet. Nach dem Öffnen der Bauchdecke wurden die Würmer durch vorsichtige Injektion von 50 ml 1 x PBS in den linken Herzventrikel aus den Mesenterialvenen herausgespült und konnten aus dem Bauchraum gesammelt werden. Die adulten Würmer wurden mehrfach mit sterilem [Seite 107↓]RPMI komplett gewaschen und bei 37°C und 5 % CO₂ unter sterilen Bedingungen bis zu 14 Tagen kultiviert. Da die weiblichen Würmer auf Grund starker Eigenfluoreszenz für Transformationsversuche ungeeignet waren, wurden Wurmpaare durch Inkubation für 15 min bei 4°C getrennt.

Schistosomeneier wurden aus Lebern infizierter Endwirte nach der Methode von Coustau et. al (1997) gewonnen. Die frisch entnommenen Lebern wurden durch ein Sieb gepresst und homogenisiert. In einem Erlenmeyerkolben wurde das Homogenat drei- bis fünfmal mit 200 ml kalter 1,8 %iger NaCl-Lösung aufgeschwemmt und auf Eis für 15 min inkubiert. Der Überstand wurde verworfen. Abschließend wurde einmal mit Wasser gewaschen, um die NaCl-Lösung zu entfernen. Die isolierten Eier mit den verbliebenen Leberbestandteilen wurden in einen 50 ml Messzylinder überführt. Der Messzylinder wurde mit 28°C warmen Wasser aufgefüllt und in ein gleichwarmes Wasserbad gestellt. Der Zylinder war bis auf einen Rand am oberen Ende durch Aluminiumfolie abgedunkelt. Das Schlüpfen der Mirazidien aus den Eiern wurde durch Inkubation für 2-4 h unter dem starken Licht einer Kaltlichtlampe induziert. Geschlüpfte Mirazidien sammelten sich an der Wasseroberfläche im Licht. Der gesamte Überstand wurde aus dem Messzylinder in 15 ml Reaktionsgefäße überführt und nachfolgend für 15 min auf Eis abgekühlt, um die Mirazidien zu konzentrieren. Eine anschließende Zentrifugation für 3 min bei 1000 Umdrehungen/Minute (rpm) ließ alle Mirazidien absinken. Der Überstand wurde bis auf 1 ml abgenommen und die Mirazidien erneut für 15 min unter Licht bei 28°C inkubiert. Der Überstand mit den freibeweglichen Mirazidien wurde in Kultur genommen. Zur Transformation in Muttersporozysten wurden die aufgereinigten Mirazidien auf eine 12-Loch-Platte verteilt. Die Transformation in Muttersporozysten wurde durch Zugabe von Sporozystenkulturmedium MEMSE-J (Kawanaka et al., 1986) induziert. Die vollständige Transformation erfolgte bei 28°C und 5 % CO₂ im Inkubator innerhalb von 24 h. Sporozysten, die für die Mikroinjektion eingesetzt wurden (5.1.2.1) wurden weitere 24 h kultiviert. Durch eine Zentrifugation für 2 min bei 1000 rpm wurden die Sporozysten aus der Kultur isoliert. Der Überstand wurde abgenommen und die Sporozysten konnten nun in dem verbliebenen kleinen Volumen pipettiert werden.

Die Mikroinjektion bietet den Vorteil des gezielten Transfers von DNA in einzelne Zielzellen und kann mikroskopisch verfolgt werden. Sie wurde unter einem Inversmikroskop (Axiovert 135, Zeiss) mit Hilfe eines Mikromanipulators (Leitz, Wetzlar) und eines Mikroinjektors (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt. Injektionsnadeln wurden hergestellt, indem Glaskapillaren mit Filament (Außendurchmesser: 1 mm; Innendurchmesser: 0,58 mm) mit Hilfe eines Ausziehgerätes für Glasnadeln (Kopf Instruments, USA) ausgezogen und so auf einen Innendurchmesser von 0,2-0,35 μm begrenzt wurden. Haltenadeln wurden hergestellt, indem Glaskapillaren ohne Filament (Außendurchmesser 1 mm, Wandstärke 0,125 mm) über einem Bunsenbrenner von Hand ausgezogen wurden und so der Innendurchmesser auf 5-10 μm begrenzt wurde. Die Injektionsnadel wurde beladen, indem sie mit der stumpfen Seite in die Injektionslösung gestellt wurde. Als Injektionslösungen wurden Trypan-Blau und DNA-Lösungen mit einer Konzentration von 2,25 μg/μl in 1 x Mikroinjektionspuffer verwendet. Die Injektionslösung wurde auf Grund von Kapillarkräften in die Nadel eingesaugt. Die Sporozysten wurden unmittelbar vor der Injektion für 10 min auf Eis inkubiert, um ihre Beweglichkeit einzuschränken. Die Mikroinjektion erfolgte auf Objektträgern mit Hohlschliff (Roth, Karlsruhe), in welche die Sporozysten in 20 μl Medium eingebracht und anschließend mit Paraffinöl überschichtet wurden. Eine Sporozyste wurde mit einer Haltenadel vom Boden gelöst und so positioniert, dass ein Keimballen unmittelbar an der Öffnung der Haltenadel zu liegen kam. Jetzt konnte die Injektionsnadel mit Hilfe des Mikromanipulators auf die Höhe der Sporozyste gebracht werden. Injiziert wurde, indem die Injektionsnadel in die Öffnung der Haltenadel geführt wurde und anschließend wieder ein kleines Stück zurückgezogen wurde, sodass ihre Spitze in dem Keimballen ruhte. Eingebracht wurde etwa 1/10 μl Lösung bei einem Druck von 4000 Psi. Nach der Mikroinjektion wurden die Sporozysten bei 28°C und 5 % CO₂ inkubiert. Nach 48 h wurde die Reportergenaktivität mikroskopisch untersucht.

Bei der Elektroporation werden Zellmembranen durch das Anlegen einer elektrischen Spannung reversibel elektrisch permeabilisiert, sodass DNA in die Zelle eindringen [Seite 109↓]kann. Die Elektroporation von Sporozysten wurde mit dem Elektroporator BTX ECM 830 (Qbiogene, Heidelberg) in 4 mm Elektroporationsküvetten (peqLab, Erlangen) durchgeführt. Ca. 500 Sporozysten wurden in einem Gesamtvolumen von 700 μl 1:3 verdünnten MEMSE-J für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit 10-50 μg DNA in Elektroporationsküvetten inkubiert. Elektroporiert wurde bei einer Feldstärke von 910 V/cm mit einem Puls von 250 μs und bei einer Feldstärke von 660 V/cm mit zwei Pulsen von 250 μs. Nach der Elektroporation wurden die Sporozysten zur Regeneration 10 min bei RT in den Küvetten belassen und danach für 48 h bei 28°C kultiviert. In einem weiteren Versuch zur Elektroporation wurden die Sporozysten nach der Methode von Neumann et al. (1996) in Anwesenheit von DEAE-Dextran in einer Konzentration von 3,1 μg/μl elektroporiert. Propidiumiodid wurde in einer Endkonzentration von 15 mg/ml (Sersa et al., 1995; Gabriel und Teissie, 1997) eingesetzt, um die Transfektion mikroskopisch mitzuverfolgen. Propidiumiodid fluoresziert bei einer Anregungswellenlänge von 546 nm (Grünlicht) orange-rot und ermöglichte eine direkte Untersuchung des Transfektionserfolgs ohne auf die Expression des Reportergens warten zu müssen.

Bei dieser Methode wird DNA auf Goldpartikel präzipitiert. Die Goldpartikel werden als Projektile genutzt und mit Hilfe von Druck gegen das Untersuchungsobjekt beschleunigt (Abb. 5.1). Der Druck wird bei der heliumbetriebenen Apparatur mit Hilfe von Helium hinter einer Plastikscheibe (Rupture Disk) aufgebaut, die je nach gewählter Rupture Disk bei Drücken von 900-2200 Psi zerreißt. Durch die Wahl der Rupture Disk lässt sich der aufgebaute Heliumdruck je nach Versuchsobjekt variieren. Durch einen größeren Heliumdruck beschleunigte Goldpartikel dringen tiefer in die zu transfizierende Probe ein und ermöglichen die Transfektion tiefer gelegener Zellschichten oder die Transfektion von Objekten mit einer härteren Oberfläche.
Der Mikroprojektilbeschuss wurde in dieser Arbeit zur Transfektion von adulten männlichen Würmern, von Sporozysten und von Mirazidien eingesetzt.
Die adulten Würmer wurden in die Mitte einer 6 cm Petrischale pipettiert und das Medium entfernt. Auch Sporozysten wurden in 6 cm Petrischalen transfiziert. Das Entfernen des Mediums geschah unter dem inversen Mikroskop. Mirazidien wurden zur Transfektion auf die Polycarbonatmembraneinlage einer 12 cm Kulturschale [Seite 110↓](Costar, Bodenheim) pipettiert. Wasser floss durch die semipermeable Membran ab, sodass die Mirazidien auf der Membran trocken fielen. Um eine effiziente Transfektion zu erzielen, wurden adulte Würmer, Sporozysten und Mirazidien auf einer maximalen Fläche von 0,5 cm Durchmesser aufgebracht. Die gelieferten Goldpartikel mit einer Größe von 1 μm (Biorad, München) mussten vor dem Gebrauch gewaschen werden: Basierend auf der Methode von Sanford et. al (1993) wurden 30 mg Goldpartikel in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß eingewogen und in 1 ml 70 % Ethanol für 5 min stark gevortext und anschließend für 15 min bei RT inkubiert. Die Goldpartikel wurden kurz 5 sec abzentrifugiert und der Ethanol abgenommen. Folgender Vorgang wurde dreimal wiederholt, um die Goldpartikel von dem Ethanol zu befreien: Zugabe von 1 ml sterilen Wassers, 1 min Inkubation bei RT, 1-2 sec Zentrifugation, Abnehmen des Überstandes. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Goldpartikel in 50 % sterilen Glycerols aufgenommen. Die Goldpartikelsuspension mit einer Konzentration von 60 mg/ml wurde bei 4°C aufbewahrt.

	Abb. 5.1: Ablauf des Mikroprojektil-Beschusses. Helium sammelt sich in einer Druckkammer hinter der Rupture Disk, die bei einem definierten Druck zerreißt. Die Helium-Druckwelle beschleunigt die auf einer Plastikscheibe (Macrocarrier) heftenden Goldpartikel (Microcarrier), die zuvor mit DNA beladen worden waren, gegen die Probe. Ein Metallsieb (Stopping Screen) hält den Macrocarrier zurück und lässt nur die Microcarrier passieren. A: variabler Abstand zwischen Rupture Disc und Macrocarrier; B: variabler Abstand zwischen Macrocarrier und Stopping Screen; C: variabler Abstand zwischen Stopping Screen und Probe. In dieser Arbeit wurde für A ein Abstand von 3-5 mm, für B der durch Unterlegscheiben bestimmbare mittlere Abstand von ca. 10 mm und für C der kleinste mögliche Abstand von 3 cm gewählt. (Die Zeichnung wurde verändert nach Biorad, München.)

Für einen Beschuss wurden 0,5 mg Gold und 5 μg DNA eingesetzt. Zur Beladung der Goldpartikel mit DNA wurde die Goldsuspension zunächst 5 min stark gevortext. 8,5 μl Goldsuspension wurden unter leichtem Vortexen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Dann wurden rasch 5 μg DNA in einem Volumen von 5-15 μl, 8,5 μl 2,5 M CaCl₂ und 3,5 μl 0,1 M Spermidin hinzugefügt. Der Ansatz wurde für ca. 2 min gevortext. Nach dem Vortexen wurden die Goldpartikel für 1 min stehen gelassen, damit sie sich am Boden sammelten. Der Überstand wurde abgenommen. Nachfolgend wurde das Gold zweimal mit 96-100 % Ethanol gewaschen und in 15 μl 96-100 % Ethanol aufgenommen. Die Goldsuspension wurde leicht gevortext, durch Pipettieren resuspendiert und auf die Macrocarrier übertragen. Der Überstand wurde abgenommen und das Gold trocknete unter der Sterilbank. Zur Optimierung der Methode wurden Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) gelabelte Oligonukleotide (MWG Biotech, Ebersberg) anstelle von DNA eingesetzt. FITC fluoresziert bei Grünlichtanregung gelb-grün und ermöglichte eine direkte Untersuchung des Transfektionserfolges ohne auf die Expression des Reportergens warten zu müssen. Der Beschuss fand unter Vakuum (15 mm Quecksilbersäule) statt. Adulte Würmer wurden innerhalb weniger Minuten zweimal bei einem Druck von 1800 Psi mit dem gleichen Konstrukt beschossen. Sporozysten wurden zunächst mit einem Druck von 1500 Psi und nach Optimierung der Methode mit einem Druck von 900
Psi beschossen. Mirazidien wurden mit einem Druck von 900 Psi beschossen. Nach
dem Beschuss wurden adulte Würmer bei 37°C und 5 % CO₂ inkubiert, Sporozysten bei 28°C und 5 % CO₂, Mirazidien wurden entweder zur Infektion von Zwischenwirtsschnecken (5.1.1.1) eingesetzt oder in vitro in Sporozysten transformiert (5.1.1.3). Zur Induktion eines Hitzeschocks wurden adulte Würmer 24 h nach der Transfektion für 4 h bei 42°C und danach für weitere 24 h bei 37°C inkubiert. Sporozysten wurden nicht hitzegeschockt. Mikroskopische, molekularbiologische oder biochemische Untersuchungen erfolgten 48-72 h nach der Transfektion.

Für die Präparation von Plasmid-DNA wurde LB-Medium steril mit einer isolierten E. coli-Kolonie von einer Agarplatte angeimpft. Zur Selektion auf das Vorhandensein des Plasmids wurde der Kultur das dem Plasmid entsprechende Antibiotikum zugesetzt. Die Endkonzentration für Ampicillin betrug 100 μg/ml, die für Kanamycin 50 μg/m. Die Kulturen wurden in einem Schüttler bei 37°C und 230 rpm über Nacht inkubiert. Die Plasmidausbeute bei der DNA-Präparation wurde erhöht, indem die Übernachtkultur durch Verdünnen einer 3 ml-Vorkultur im Verhältnis 1:250 bis 1:500 in frischem Medium angesetzt wurde. Die Vorkultur war ihrerseits aus einer Einzelkolonie oder durch Überimpfen von Zellen aus einer Gefrierkultur angeimpft worden und dann für 4 h bis 8 h bei 37°C im Schüttelinkubator kultiviert worden. Zur Isolation einzelner Klone wurden E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten (mit dem entsprechenden selektiven Antibiotikum) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Für die dauerhafte Aufbewahrung von E. coli-Zellen bei -80°C wurden 920 µl einer 3 ml-Kultur, die über Nacht gewachsen und von einer Einzelkolonie angeimpft worden war, mit 80 µl sterilen Glyzerins (87 %) versetzt und kurz gevortext. Diese Kulturen wurden dann sofort in flüssigem Stickstoff inkubiert. Während des raschen Einfrierens wurde eine Schädigung der E. coli-Zellen durch das Glyzerin verhindert

Die Isolation von RNA aus Zellkultur-Zellen und Parasiten wurde mit dem Materialsatz RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Zur Isolation von RNA aus Zellen wurden 3 x 10⁶ cos7-Zellen oder 7 x 10⁶ HeLa-Zellen eingesetzt, zur Isolation von RNA aus Schistosomen wurden 20 adulte Würmer, 500-1000 Sporozysten oder 1000-2000 Zerkarien verwendet. Zur Vermeidung von RNAse Kontamination der Proben wurden sämtliche Geräte vor der Verwendung mindestens 4 h bei 240°C sterilisiert und Lösungen mit DEPC behandeltem Wasser und frischen Chemikalien angesetzt. Parasiten-Material wurde nach der Aufnahme in den Lysis-Puffer zunächst mechanisch mit einem kleinen Pistill und unter mehrfachem Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff [Seite 113↓]mechanisch zerkleinert. Das Homogenisieren der Proben erfolgte dann mit QIAshredder-Säulchen (Qiagen, Hilden). Die RNA wurde nach ihrer Isolation in 50 ml DEPC-Wasser aufgenommen und bei -80°C gelagert.

50 μl RNA wurden vor ihrem Umschreiben in cDNA mit 2 μl RNAse freier DNAse (Stratagene, Heidelberg) bei 37°C für 3 h inkubiert, zur Stabilisierung der RNA wurden 2 μl RNAse Block (Stratagene, Heidelberg) dem Ansatz zugefügt.

Die in der Gesamt-RNA vorhandene mRNA wurde mit Hilfe der M-MLV Reversen Transkriptase (H-) (Promega, Mannheim) in cDNA umgeschrieben.

In einen 20 μl Ansatz wurden folgende Komponenten pipettiert:

Nach Mischen und anschließender Inkubation für 10 min bei 70°C wurde der Ansatz für 2 min auf Eis schnell abgekühlt und nachfolgend abzentrifugiert. Danach wurden dazu gegeben:

Der Ansatz wurde wiederum gemischt und für 2 min bei 42°C inkubiert, die nachfolgende Transkription der RNA in cDNA erfolgte nach Zugabe von 1 μl Transkriptase für 50 min bei 42°C. Transkriptase und RNAse Block wurden dann durch Inkubation des Ansatzes für 20 min bei 70°C inaktiviert.

Genomische DNA aus adulten Schistosomen wurde mit dem DNeasy Tissue Kit (Qiagen,Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert: 10-25 adulte Würmer wurden enzymatisch durch Inkubation mit Proteinase K aufgeschlossen. Durch Zugabe von chaotropen Salzen wird die Hydrathülle der DNA zerstört, sodass diese an die Silikamembran der Säulen bindet. Die Elution erfolgte in 50-100 μl Wasser.

Minipräparationen von Plasmid-DNA zur anschließenden Restriktionsanalyse
wurden nach der Methode von Willimzig (1985) durchgeführt.
1,5 ml einer E. coli-Übernachtkultur wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß abzentrifugiert und das Bakterien-Pellet in 125 µl TELT-Lösung (Tris/HCl; EDTA; LiCl; Triton X-100), der Lysozym in einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt war, durch starkes Vortexen vollständig resuspendiert und für 15-20 min bei RT inkubiert. Danach wurden die Proben 3 min bei 95°C erhitzt und 5 min auf Eis abgekühlt. Nachdem die Probe 15 min bei 10000 rpm in der Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert worden war, wurde das Pellet mit sterilen Zahnstochern entfernt. Der Überstand wurde mit 300 µl 100 % Ethanol versetzt. Nach 5 Minuten Inkubation bei RT wurden die Proben wiederum bei 10000 rpm zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet mit 200 µl 70 % Ethanol (v/v) gewaschen. Nach dem Trocknen wurde die DNA in 50 µl Wasser aufgenommen. Zur vollständigen Resuspension der Pellets wurde Plasmid-DNA kurz gevortext. RNA wurde durch Zugabe von RNAse A in den Restriktionsansatz verdaut. Zur Isolation von hochreiner DNA bzw. zur Aufreinigung großer Mengen an DNA für Sequenzierung, Transformation und Transfektion wurden kommerziell erhältliche Säulen (Clontech, Heidelberg) verwendet. Grundlage dieses Verfahrens ist das Prinzip der alkalischen Lyse nach Birnboim und Doly (1979), das modifiziert und zur Aufreinigung der DNA mit Anionenaustauschersäulchen, die als Ladungsträger gereinigtes Silicat enthalten, kombiniert wurde. Bei Einsatz eines high-copy-Plasmids konnten so bei der Präparation einer 25 ml Kultur (Midi-Präp) bis zu 100 µg und bei der Präparation einer 100 ml Kultur (Maxi-Präp) bis zu 500 µg Plasmid-DNA gewonnen werden.

Zur Restriktion wurden pro µg DNA 3 Units Restriktionsendonuklease eingesetzt. Die Restriktion erfolgte in dem mitgelieferten 10 x Reaktionspuffer nach Angaben des Herstellers für 1-3 h. Weil das im Enzympuffer enthaltene Glyzerin die Restriktion störte, durfte die Menge an Enzym max. 10 % der Gesamtmenge betragen. Bei Verdau mit zwei verschiedenen Enzymen in dem gleichen Puffer betrug die Aktivität beider Enzyme mindestens 50 % laut Hersteller. Die Restriktionsendonukleasen wurden anschließend durch Hitzeinaktivierung deaktiviert oder durch Phenol-Chloroform-Fällung oder Auftrennung im Agarosegel entfernt.

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach einer Restriktion und zur Aufreinigung von DNA wurden Agarosegele von 0,7-1,5 %, denen zur späteren Visualisierung unter UV-Licht Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml zugesetzt war, in einer horizontalen Gelapparatur verwendet. Je nach Größe der Gele erfolgte die Auftrennung bei einer Spannung zwischen 60 und 100 V. Die Proben wurden mit 6 x Probenpuffer versetzt. Der Probenpuffer enthielt neben Glyzerin, das ein Absinken der Probe in die Geltasche bewirkt, einen blauen Farbstoff, der den Fortgang der Elektrophorese auf dem Gel beobachten ließ. Zur Beurteilung der Größe der DNA-Fragmente diente der 1 kb-DNA-Leiter (Rapidozym, Berlin) und der SmartLadder DNA-Marker (Eurogentec, Belgien). Zur Dokumentation wurden die Gele nach der elektrophoretischen Auftrennung der DNA in der Geldokumentationsanlage im UV-Licht von einer Kamera aufgenommen. Die Bilder wurden von einem Fotoprinter ausgedruckt oder zur späteren Bildverarbeitung auf Diskette abgespeichert.

Nach vollständiger Auftrennung des Restriktionsansatzes konnte die Bande, in der das erwünschte Fragment lief, durch Vergleich mit den Banden des Größenmarkers ermittelt und mit Hilfe eines gereinigten Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten werden. Die DNA wurde nur kurz dem zur Visualisierung notwendigen UV-Licht ausgesetzt, um eine Schädigung zu verhindern. Die Isolation der DNA aus dem Gel wurde mit Hilfe des NucleoSpin Extraction Kit (Clontech, Heidelberg) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach dem Schmelzen der Agarose wurde die DNA über Säulchen mit Silikamembran aufgereinigt.

Kontaminierende Proteine wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion nach Sambrook et al. (1989) entfernt: Die Probe wurde mit einem Volumen Roti-Phenol-Chloroform-Gemisch (Roth, Karlsruhe) versetzt. Nach gründlichem Vortexen und Zentrifugation für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit wurde die wässrige
Phase mit der RNA oder DNA abgenommen. Verbliebene Phenolreste wurden mit
einem Volumen (Vol) Chloroform-iso-Amylalkohol ausgewaschen. Nachfolgend wurde die RNA oder DNA durch Zugabe von 0,1 Vol Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5 Vol 100 % Ethanol bei 4°C für mehrere Stunden gefällt. Danach wurde der [Seite 116↓]Fällungsansatz bei 14000 rpm und 4°C für 30 bis 60 min zentrifugiert.
Nach dem Waschen mit 70 % Ethanol wurde das RNA-oder DNA-Pellet getrocknet. RNA wurde in DEPC-Wasser gelöst. Alternativ wurde RNA durch Zugabe von 1 Vol Isopropanol bei 4°C für mehrere Stunden gefällt. PCR-Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Extraction Kit (Clontech, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers aus dem PCR-Reaktionsansatz isoliert.

Die Konzentration an Nukleinsäuren wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm, bei der Nukleinsäuren ihr Absorptionsmaximum besitzen, bestimmt. Bei einer Schichtdicke der Küvette von 1 cm entspricht die optische Dichte OD₂₆₀ von 1 50 µg doppelsträngiger DNA, 40 µg einzelsträngiger DNA bzw. RNA und 20 µg einzelsträngiger Oligonukleotide (Sambrook et al., 1989). Verunreinigungen mit Proteinen wurden durch eine zweite Messung bei 280 nm nachgewiesen, da die aromatischen Aminosäuren wie Tyrosin und Tryptophan bei dieser Wellenlänge ihr Absorptionsmaximum besitzen. Der Quotient OD₂₆₀/OD₂₈₀ liegt bei einer proteinfreien Nukleinsäurelösung zwischen 1,8 und 2 (Sambrook et al. 1989).

Aus 5’-überhängenden Restriktionsschnittstellen können durch Auffüllen glatte Enden erzeugt werden. Dazu wird die DNA in Anwesenheit von dNTPs mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli inkubiert.

Folgender Reaktionsansatz wurde pipettiert.

Zur Verhinderung der Selbstligation von DNA-Fragmenten wurden die terminalen 5’-Enden durch die alkalische Kälberphosphatase abgespalten. Die DNA wurde in einer Konzentration von 0,5 μg/10 ml in 1 x Reaktionspuffer verdünnt. Pro mg Vektor wurden 0,5 Einheiten alkalische Phosphatase dazugegeben. Der Reaktionsansatz wurde für 1 h bei 37°C inkubiert.

Bei der Ligation werden die bei der Restriktion entstandenen freien 5’-Phosphatenden durch Inkubation mit der T4-Ligase kovalent unter ATP-Verbrauch mit den freien 3’-Hydroxylenden verknüpft. Zur Ligation wurden 250 ng Vektor-DNA im molaren Verhältnis 1:3 mit dem zu ligierenden DNA-Fragment in einem Gesamtvolumen von 10-15 µl eingesetzt. Die Ligation fand unter Einsatz von 1 Einheit T 4-DNA-Ligase in 1 x Ligasepuffer statt. Ligiert wurde für mehrere Stunden bei RT oder über Nacht bei 4°C.

Kompetente E. coli-Zellen wurden nach der Methode von Inoue et. al (1990) hergestellt. In 200 ml LB-Medium wurden E. coli-Bakterien bis zu einer Dichte von 0,6 OD₆₀₀ kultiviert. Nach einer Inkubation von 10 min auf Eis wurden die Bakterien für 10 min bei 4°C und 2500 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterien in 80 ml kaltem TB-Puffer aufgenommen. Nach einer erneuten Inkubation von 10 min auf Eis wurden die Bakterien wiederum abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet in 20 ml TB-Puffer aufgenommen. Tropfenweise wurde DMSO bis zu einer Endkonzentration von 7 % zugegeben. Anschließend wurden die Bakterien aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei –80°C gelagert.

Zur Transformation von Plasmid-DNA nach Hanahan (1985) in kompetente E. coli-Zellen wurden 100 µl kompetente Zellen auf Eis aufgetaut und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Dann wurden 50 ng Plasmid-DNA bzw. 5-10 µl eines Ligationsansatzes dazugegeben und gut vermischt. Der Transformationsansatz wurde für 30 min auf Eis, 1 min bei 42°C und dann für 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 500 µl SOC-Medium dazu gegeben. Bakterien, die mit einem Ampicillin-Resistenz vermittelnden Plasmid transformiert worden waren, wurden sofort auf Agarplatten ausgestrichen. Die anderen Transformationsansätze wurden für 30 min bei 37°C und 230 rpm im Inkubationsschüttler kultiviert und anschließend ausgestrichen. Je nach eingesetzter DNA-Menge wurden 50-250 µl von dem Transformationsansatz auf Agarplatten (mit dem entsprechenden Antibiotikum) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Beim Blau-Weiß-Screening produzieren die eingesetzten Bakterien eine inaktive β-Galaktosidase, die durch α-Komplementation aktiviert wird. Das für die Komplementation notwendige Protein wird auf dem Plasmid kodiert und enthält einen multiplen Klonierungsbereich. Durch den Einbau eines Inserts in diesen Klonierungsbereich wird die kodierende Sequenz unterbrochen und die Bildung des für die Komplementation notwendigen Proteins unterbleibt. Damit kann keine β-Galaktosidase in den Bakterien synthetisiert werden. Da die β-Galaktosidase das Substrat X-Gal zu einem blauen Farbstoff hydrolysiert, lassen weiße Kolonien auf ein Plasmid mit Insert schließen, wohingegen negative Klone blau gefärbt sind. Zur Isolation von positiven Transformanten wurden die Bakterien nach der Transformation auf LB-Platten mit Antibiotikum, die mit 15 ml 20 % (v/v) IPTG und 50 μl 2 % (w/v) X-Gal in DMF bestrichen waren, aufgebracht.

Die Kolonie-PCR wurde als zweite Methode zur Isolation von positiven Transformanten eingesetzt: Eine Einzelkolonie wurde mit Hilfe eines Zahnstochers in ein PCR-Reaktionsgefäß, in dem bereits die Komponenten für eine PCR vorgelegt worden waren, überführt. Durch Rühren wurden Bakterien von dem Zahnstocher gelöst, der dann nachfolgend zum Animpfen einer Flüssigkultur diente. Durch Kochen der Bakterien im Verlauf der PCR wurde die Plasmid-DNA freigesetzt und konnte als Matrize zur Amplifikation spezifischer Fragmente dienen (5.1.3.19).

Für die Überprüfung der Klonierung mittels Restriktion wurden 12 Kolonien pro Platte einer Transformation ohne vorheriges Blau-Weiß-Screening bzw. 6 weiße Kolonien aus einem Blau-Weiß-Screening zum Animpfen von 3 ml-Minikulturen eingesetzt. Nach der Inkubation der Bakterien-Kulturen bei 37°C über Nacht im Schüttelinkubator wurde die Plasmid-DNA isoliert und geschnitten. Die Restriktionsansätze wurden elektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, sodass anhand des Bandenmusters erfolgreich transformierte Klone identifiziert werden konnten.

Für die Sequenzierung wurde hochreine DNA eingesetzt. Die Sequenzierung wurde von der Firma Agowa (Berlin) nach dem Kettenabbruch-Verfahren von Sanger et al. (1977) durchgeführt. Das automatisierte Sequenzierverfahren beruht auf dem Einbau nukleotidspezifischer Farbstoffe während der Sequenzreaktion, die nach Anregung durch Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge Licht in einer anderen spezifischen Wellenlänge wieder emittieren. Dadurch können die DNA-Fragmente bereits während der Auftrennung der Sequenzreaktionsprodukte nachgewiesen werden. Ein Computer wertet die aufgenommenen Lichtsignale automatisch aus.

Die PCR (Mullis und Faloona, 1987) wurde in dieser Arbeit zur Gewinnung der schistosomalen Promotorenfragmente aus genomischer DNA, zur Amplifikation von cDNA-Sequenzen aus einem Transkriptionsansatz (5.1.3.4), bei der Überprüfung des Transformationserfolges in der Kolonie-PCR (5.1.3.17.2) und zur Isolation von unbekannten Sequenzen in der inversen PCR (5.1.3.19.3) eingesetzt. Sie wurde mit den unter 5.2.6 angegebenen PCR-Primern in einem Thermocycler (Perkin/Elmer, USA) durchgeführt. Zur Durchführung der PCR mit der Taq-Polymerase (Saiki et al., 1988) wurden folgende Substanzen in einem 0,2 oder 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäß vereinigt:

Im ersten Programmschritt wurde die DNA für 3 min bei 94°C denaturiert. Es erfolgte die Amplifikation in 30-35 Zyklen: 1 min Denaturieren des DNA-Doppelstranges bei 94°C; 1 min Hybridisierung der Primer mit der DNA (5.1.3.19.1), 1 min Polymerase-Reaktion pro 1000 bp bei 72°C. Nach dem letzten Zyklus wurden die Proben 10 min bei 72°C inkubiert, um die Synthese aller DNA-Moleküle durch die Polymerase zu [Seite 120↓]vollenden, zur Klonierung in pGEM-T easy (5.1.3.19.2) wurde dieser Schritt auf 20 min verlängert.

Zur spezifischen Amplifikation wurden Primer mit einer Länge von 18-25 Nukleotiden eingesetzt, wobei der Anteil an G/C-Nukleotiden ca. 50 % betrug. Um eine bessere Bindung der Primer an die DNA zu ermöglichen und um damit eine fehlerhafte Amplifikation zu verhindern endeten die Primer vorzugsweise mit 1-2 G/C-Nukleotiden am 3‘-Ende. Für die Klonierung konnte am 5‘-Ende eine Restriktionsschnittstelle eingeführt werden, ein weiteres überhängendes Ende aus unspezifischen Nukleotiden am 5‘-Ende sorgte für ein effizientes Schneiden des PCR-Produktes mit dem Restriktionsenzym. Die Schmelztemperatur TM für die PCR wurde mit der Formel:

TM= {22+ 1,46 * [(Anzahl A + Anzahl T) + 2 * (Anzahl G + Anzahl C) ]}*°C

kalkuliert.

Die in der PCR eingesetzte Taq-Polymerase hängt an den 3’-Enden der DNA-Fragmente unspezifisch einen Adenosinrest an, der zur Klonierung in den Vektor pGEM-T-Easy (Stratagene, Heidelberg) mit 3’-T-Überhang genutzt wurde.
Für die Ligation wurde folgender Ansatz pipettiert und nachfolgend über Nacht bei 4°C inkubiert:

Die inverse PCR (Ochman et al., 1993) ermöglicht es, unbekannte genomische Sequenzen in der Nachbarschaft bekannter Sequenzbereiche zu analysieren. Sie wurde eingesetzt zur Klonierung des 5’-Bereiches des Cathepsin D und des Aktins von S. mansoni.

Nach dem Schneiden von schistosomaler genomischer DNA mit einer Restriktionsendonuklease (5.1.3.7) wurde das Restriktionsenzym durch Hitzeeinwirkung inaktiviert. Die DNA-Fragmente wurden stark verdünnt und durch [Seite 121↓]Ligation (5.1.3.14) zu DNA-Ringen zirkularisiert. Diese DNA-Ringe dienten als Matrize in einer PCR, in der Primer eingesetzt wurden, die eine entgegengesetzte Orientierung aufwiesen. Die PCR-Amplifikate wurden über ein Agarosegel aufgetrennt (5.1.3.8) und in pGEM-T easy (5.1.3.20.2) zur Sequenzierung kloniert.

HeLa-Zellen wurden in RPMI komplett mit nicht inaktiviertem fetalem Rinderserum (FCS) bei 37°C und 5 % CO₂ (Standardbedingungen für die Zellkultur)kultiviert. Zellen in konfluent bewachsenen Zellkulturflaschen wurden zur Passagierung zunächst zweimal mit 1 x PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen durch Trypsin/EDTA-Verdau bei 37°C für 2 min vom Boden gelöst. Das Trypsin wurde inaktiviert durch Zugabe von RPMI komplett. Die Zellen wurden bei 800 rpm zentrifugiert und 1:4 in frischem RPMI komplett verdünnt in neue Zellkulturflaschen überführt. Cos7-Zellen wurden unter den gleichen Bedingungen in RPMI komplett mit hitzeinaktiviertem FCS kultiviert. Zur Passagierung wurden diese Zellen mit dem Zellschaber gelöst und in neue Zellkulturflaschen überführt.

Zellen wurden in FCS, dem 10 % DMSO zugefügt worden war, durch langsames Abkühlen in einer Styroporbox bei –80°C eingefroren. Nach 24 h wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.

Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauerzählkammer bestimmt, tote Zellen wurden zur Unterscheidung von lebenden Zellen mit Trypan-Blau (Sigma, München) angefärbt und bei der Bestimmung der Zellzahl nicht berücksichtigt.

Durch Inkubation von DNA mit DEAE-Dextran werden bei dieser Methode DNA-haltige Komplexe erzeugt, die sich an die Zelloberfläche heften und
die Aufnahme der DNA in die Zelle durch Endocytose ermöglichen.
10⁵ Zellen wurden am Vortag der Transfektion pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät. Nachdem die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen worden waren, [Seite 122↓]wurden sie in 4 ml Dulbeccos Modiefied Eagel Medium (DMEM) komplett kultiviert. Pro Transfektionsansatz wurden 4 μg DNA in sterilem 1 x TBS gelöst. Zu der gelösten DNA wurden 80 μl DEAE-Dextran (10mg/ml) zugegeben. Diese Lösung wurde den Zellen zugesetzt. Nach einer Inkubation von 4 h bei 37°C wurde das Transfektionsmedium entfernt. Die Aufnahme von DNA in die Zellen wurde erhöht, indem sie für 1 min in 1 x PBS inkl. 10 % DMSO bei RT inkubiert wurden. Danach wurden sie einmal mit 1 x PBS gewaschen und unter Standardbedingungen weiterkultiviert.

Die Transfektion von HeLa Zellen erfolgte mit einem für die Transfektion von Endothelzellen optimiertem Materialsatz Lipofectin Reagent (Invitrogen, Karlsruhe). Lipofectin ist ein synthetisches Lipidpolymer, das unter physiologischen
Bedingungen mit der Zellmembran verschmilzt und so eine effiziente
DNA-Aufnahme durch Endozytose in die Zelle ermöglicht.
Am Vortag der Transfektion wurden 10⁵ Zellen pro Vertiefung einer 12-Loch-Platte ausgesät. 2 μg DNA und 8 μl Lipofectin wurden separat in 100 μl serumfreien DMEM für 30 min bei RT inkubiert. Nach dem Mischen beider Lösungen wurde die fertige Transfektionslösung 30 min bei RT inkubiert. Die Transfektionslösung wurde mit 800 μl DMEM ergänzt und zu den Zellen gegeben, die zuvor mit 1 x PBS gewaschen worden waren. Die Inkubation in dem Transfektionsmedium erfolgte für mindestens 6 h unter Standardbedingungen. Anschließend wurde das Transfektionsmedium durch RPMI komplett ersetzt.

10⁶ cos7-Zellen wurden für die Elektroporation (5.1.2.2) in RPMI komplett mit 5 mg DNA bei RT in 4mm Elektroporationsküvetten (peqLAB, Erlangen) für 10 min inkubiert. Elektroporiert wurde bei einer Feldstärke von 3,75 kV/cm mit 1-2 Pulsen von 90 μs Länge. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in den Küvetten für 30 min bei 37°C gehalten, bevor sie wieder in Zellkulturflaschen überführt und unter Standardbedingungen für die Zellkultur weiterkultiviert wurden.

Zur Induktion des HSP70-Promotors wurden Zellen 24 h nach der Transfektion für 4 h bei 42°C inkubiert und dann bei 37°C unter Standardbedingungen für die Zellkultur weiterkultiviert.

Lichtmikroskopische und epifluoreszenzmikroskopische Arbeiten wurden an einem Zeiss Axioplan Fluoreszenzmikroskop mit Blaulichtfilter Nr. 487909 und Grünlichtfilter Nr. 487915 durchgeführt. Mit Hilfe eines Kameraaufsatzes und einer elektronischen Steuereinheit für die Kamera wurden mikroskopische Bilder nach der Bedienungsanleitung des Herstellers aufgenommen. Zur Verbesserung der Detektion von EGFP-Fluoreszenz wurde das Leica DM/R Mikroskop mit digitaler Bildspeicherung eingesetzt. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie wurde durchgeführt an einem Leica TCS SP Mikroskop mit einem Argon/Krypton-Gaslaser (Leica). Der Laser wurde auf 50-60 % eingestellt, die Anregungswellenlänge für GFP war 488 nm. Störende endogene Fluoreszenz unter der Blaulichtanregung wurde durch Quenchen mit Trypan-Blau nach der Methode von Loike und Silverstein (1983) verhindert.

Zur histologischen Untersuchung mussten Zellen nach ihrer Transfektion in einem geeigneten Kulturgefäß (35 mm Petrischale oder 6 Loch-Platte) kultiviert werden. 48 h nach der Transfektion mit β-Galaktosidase exprimierenden Plasmiden wurden die Zellen zweimal mit 1 x PBS gewaschen, die Fixierung der
Zellen erfolgte für 10 min in 1 x PBS inkl. 1 % Glutaraldehyd unter leichtem Schwenken. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit 1 x PBS inkl.
1mM MgCl₂ vorsichtig gewaschen, ohne sie vom Boden des Kulturgefäßes zu lösen. Danach wurden die fixierten Zellen in der Färbelösung bei
37°C inkubiert bis die gewünschte Färbung erreicht wurde.
Ganze Schnecken wurden nach dem Entfernen der Gehäuse für 45 min in Fixierlösung auf Eis unter leichtem Schwenken fixiert. Dann wurden die fixierten Proben dreimal für 15 min mit Waschpuffer gewaschen und mit der Färbelösung über Nacht bei 37°C unter Schütteln im Dunkeln inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten für 10 min mit 1 x PBS wurden die Proben in Bouin-Lösung nachfixiert und bei 4°C gelagert (5.2.16).

Die Gehäuse der Schnecken wurden unter dem Binokular entfernt. Nach einem kurzen Waschen in 1 x PBS wurden die Schnecken in die Mitte von [Seite 124↓]Einbettungsschalen platziert und mit dem Einbettungsmedium Tissue Tec bedeckt. Ein rasches Einfrieren wurde erreicht, indem die Einbettungsschalen während des ganzen Vorgangs auf Trockeneis inkubiert wurden. Eingefrorene Proben wurden bis zu ihrer Aufbereitung bei –80°C gelagert. Das Schneiden von 10 μm Schnitten wurde im Cryocut (Reichert-Jung (Leica), Solms) durchgeführt. Die Schnitte wurden auf beschichtete Objektträger (Superfrost/Plus, Roth, Karlsruhe) überführt und nachfolgend für 10 min in 1 x PBS inkl. 2,5 % Paraformaldehyds fixiert.

Gehäuse zu untersuchender Schnecken wurden mit Hilfe einer Pinzette unter dem Binokular entfernt, die anschließende Fixierung erfolgte in Bouin-Lösung bei RT. Die anschließende histologische Aufarbeitung der Proben wurde von Frau Marko und Dr. Bleiß (AG Elektronenmikroskopie; Lehrstuhl für Molekulare Parasitologie; Humboldt-Universität) durchgeführt: Die Proben wurden mit 70 % Ethanol gewaschen, in 100 % Ethanol entwässert und in Xylol überführt. Dann erfolgte die Einbettung in Paraplast Plus (Paraffin) unter Einsatz von Standardmethoden (Romeis. 1989; Lemos and Andrade, 2001). Fünf-Mikrometer-Semidünnschnitte wurden mit Haematoxylin und Eosin gefärbt und mikroskopisch untersucht.

20-40 adulte Würmer oder der Hepatopankreas einer Schnecke wurden zunächst mit kleinen Pistillen in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gemörsert. Für den anschließenden Zellaufschluss wurde ein Ultraschallgerät (Heinemann, Schwäbisch Gmünd) eingesetzt. Die Proben wurden nach Zugabe von 500 μl 1 x PBS auf Eis für 3 min bei 180 Pulsen pro Minute homogenisiert. Anschließend wurde der Extrakt für 5 min bei 10000 g zentrifugiert und bei –20°C gelagert.

Zur Bestimmung der Konzentration von Proteinlösungen wurde die Methode von Bradford (1976) eingesetzt. Dazu wurde der Materialsatz Bio-Rad Protein Assay (Biorad, München) nach Angaben des Herstellers verwendet.

Bei der SDS-Gelelektrophorese werden Proteine in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) auf Grund ihres Molekulargewichtes im Polyacrylamidgel [Seite 125↓]aufgetrennt (Laemmli, 1970). Die Proteine werden denaturiert und durch Anlagerung von SDS negativ geladen.

Für die Auftrennung von Proteinen wurden 6 %ige Sammelgele und 10 %ige Trenngele verwendet. Eine Proteinprobe wurde im Verhältnis 1:1 mit 2 x Probenpuffer versetzt, nachfolgend für 5 min bei 95°C erhitzt und für 5 min bei 12000 rpm in der Tischzentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde auf das Gel aufgetragen und bei 120 V für 1,5 h aufgetrennt. Zur Visualisierung der Proteine im Gel, wurde es mit Coomassie-Lösung gefärbt und anschließend mehrfach in Entfärbelösung entfärbt.

Zum Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität wurde das High sensitivity β-Galactosidase Assay Kit (Stratagene, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Grundlage ist die Spaltung von Chlorophenol-Rot-β-D-Galaktopyranosid (CPRG) in Galaktose und das Chormophor Chlorophenol -Rot, durch die β-Galaktosidase. Der damit verbundene Farbumschlag von
gelb nach rot lässt sich photometrisch durch Messung der Extinktion bei 570 nm quantifizieren.
Cos7-Zellen wurden in dem Lysis-Puffer aufgeschlossen, für die Messung von β-Galaktosidase-Aktivität von Schnecken oder Würmern wurde der Proteingesamtextrakt eingesetzt (5.1.5.1).

Der immunologische Nachweis von Proteinen wurde nach der Methode von Towbin et al. (1979) durchgeführt. Im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennte Proteine (6.1.5.3) wurden über Nacht in Transferpuffer bei 80 mA auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Zur Blockierung unspezifischer Bindungen wurde die Membran 1 h in Blocklösung inkubiert und anschließend dreimal für 5 min in 1 x PBS-T gewaschen. Es folgte die Inkubation mit dem ersten an E. coli-Lysat präadsorbierten Antikörper (Kaninchen-Antiserum gegen EGFP bzw. Maus-Antiserum gegen EGFP) in einer Verdünnung von 1:200 in 1 x PBS-T. Nach 1 h wurde die Membran wiederum für dreimal 5 Minuten 1 x PBS-T gewaschen und mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen bzw. Anti-Maus-Antikörper) in einer [Seite 126↓]Verdünnung von 1:2500 für eine Stunde inkubiert. Wiederum wurde dreimal für 5 min mit 1 x PBS-T gewaschen. Die Entwicklung des Blots fand in Peroxidase-Substratlösung statt. Waren die Banden gut sichtbar, wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von Wasser abgestoppt.

Fixierte Gefrierschnitte (5.1.4.3.2) wurden zum Waschen 1 min in 1 x PBS inkubiert. Nachfolgend wurde die endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation in Methanol inkl. 0,3 % H₂O₂ geblockt. Die Schnitte wurden dreimal für 5 min in 1 x PBS-T gewaschen und über Nacht bei 4°C mit dem ersten Antikörper (Kaninchen-Antiserum gegen EGFP bzw. Maus-Antiserum gegen EGFP) in einer Verdünnung von 1:100 bis 1:400 inkubiert. Nach dem Waschen für 10 min in 1 x PBS-T wurden die Schnitte für 30 min bei RT mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen bzw. Anti-Maus-Antikörper) in einer Verdünnung von 1:800 inkubiert. Mit 1 x PBS-T wurde für 10 min gewaschen und die Schnitte mit der DAB-Färbelösung inkubiert. Gestoppt wurde die Reaktion durch Inkubation der Schnitte in 1 x PBS.

Die Auswertung von Sequenzdaten und die Suche nach Sequenzen erfolgte mit Programmpaketen, die im Internet zur Verfügung standen (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ und TIGR Schistosoma mansoni Gene Index (SMGI) http://www.tigr.org/tdb/tgi/smgi/); Promotoranalysen wurden mit dem MatInspector (Quandt et al., 1995) unter http://www.genomatix.de durchgeführt. Die statistische Auswertung durch den Student’schen T-Test wurde unter http://www.bio.miami.edu/rob/perls_t/ durchgeführt.

Fotos von Mikroskopischen Präparaten wurden gescannt, die Kontrastverstärkung und Tonwertkorrektur wurde mit Adope Photoshop 5.0 durchgeführt; zusammengestellt und beschriftet wurden die Bilder in Microsoft PowerpointX:Mac.

Die allgemeinen Verbrauchsmaterialen für das Labor (Petrischalen; Pipettenspitzen; 0,2, 0,5, 1,5 und 2 ml Reaktionsgefäße; Gefrierröhrchen; 12, 14 und 50 ml Polypropylen-Röhrchen) wurden von Greiner (Nürtingen) bezogen. Verbrauchsmaterialen für den Mikroprojektilbeschuss (Macro-u. Microcarrier; Rupture Discs; Stopping Screens) stammten von Biorad (München) und die Verbrauchsartikel für die Zellkultur (6 u. 12 -Lochplatten, Petrischalen, Zellkulturflaschen) wurden von Costar (Bodenheim) hergestellt.

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Die allgemeinen Chemikalien stammten von den Firmen Roth (Karlsruhe), AppliChem (Darmstadt) und Sigma (München) und besaßen „zur Analyse“-Qualität; für die Zellkultur oder die Kultur von Parasiten wurden Chemikalien eingesetzt, die lt. Hersteller für die Molekularbiologie getestet waren. Organische Lösungsmittel wurden außerdem von Merck, Darmstadt und von der Humboldt-Universität bezogen.

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