Studien zur Transfektion von
Schistosoma mansoni (Digenea)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Dipl. Biologe Oliver Heyers
06.12.1971 in Aachen

Präsident der Humboldt-Universität Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
3. PD Dr. Frank Seeber

Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.04

Zusammenfassung

Schistosomen verursachen die Tropenparasitose Schistosomiasis mit 250-300 Millionen infizierten Menschen weltweit. Zur Analyse von Genfunktionen, durch die wirksame Medikamente entwickelt werden könnten, wird ein System zur Herstellung transgener Schistosomen benötigt. In dieser Arbeit wurde daher versucht, ein System zur Transfektion von Schistosoma mansoni von der transienten Expression von Reportergenen ausgehend zu entwickeln. Die Funktionalität der hergestellten Plasmide zur transienten Transfektion wurde durch die Expression der Reporter Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und β-Galatosidase unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren für das Calreticulin, die 28 kDa-Glutathion-S-Transferase und das 70 kDa-Hitzeschockprotein in cos7-Zellen nachgewiesen. Für den Gentransfer in S. mansoni wurden Mikroinjektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss eingesetzt. Der Mikroprojektilbeschuss erwies sich als geeignete Methode, Plasmid-DNA zur transienten Expression von EGFP und β-Galaktosidase in adulte und larvale Stadien zu transferieren. Da die beobachtete Reportergenexpression schwach war, wurde durch den Einsatz von Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) als Reportergen versucht, das Transfektionsssytem zu optimieren. Außerdem wurden die potentiellen Promotoren für das Cathepsin D und für ein Aktin durch inverse PCR aus genomischer DNA isoliert. Die Funktionalität dieser Promotoren wurde in cos7- bzw. HeLa-Zellen nachgewiesen, eine verbesserte Expression in S. mansonidagegen wurde mit diesen zwei Promotoren und unter Einsatz von DsRed nicht erreicht. Da S. mansoni sich in vitro nicht kultivieren lässt, muss für die Etablierung eines Transfektionssystems ein in seinen Keimzellen transgenes Stadium in den Lebenszyklus eingeschleust werden. Durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Mirazidien (freilebende Stadien des Parasiten) infizierten Zwischenwirtsschnecken und entwickelten sich zu transgenen Sporozysten, was durch die Transkription von EGFP nachgewiesen wurde. Für eine stabile Integration in das Genom werden unter anderem mobile genetische Elemente eingesetzt. Boudicca ist ein endogenes long terminal repeat (LTR) Retroelement. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es in adulten Würmern, Sporozysten und Zerkarien transkribiert wird. Das LTR kann in vitro als Promotor zur Expression von EGFP eingesetzt werden. Außerdem wurde eine transkribierte Kopie kloniert und analysiert. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse weisen darauf hin, dass Boudicca als Vektor zur stabilen Transfektion von S. mansonieingesetzt werden kann.

Eigene Schlagworte: Schistosoma mansoni, transgene Parasiten, GFP, Gene Gun, Transfektion, Retrotransposon, LTR, Boudicca

Abstract

Schistosomiasis caused by schistosomes affects about 250-300 million people world wide. The establishment of a transgenesis system for schistosomes is a prerequisite to the identification of new drug targets and to the analysis of gene regulation and will add to our knowledge of parasite physiology and development. In this study, plasmids expressing Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) and β-galactosidase driven by the schistosomal promoters of the calreticulin, the 28kDa-glutathione-S-transferase and the 70kDa-heatshock protein were cloned and successfully tested in cos7-cells. Microinjection, electroporation and particle bombardment were used to introduce plasmid DNA into Schistosoma mansoni. Adult and larval stages of S. mansoni subjected to particle bombardment transiently expressed the reporter genes, although the observed transfection rates were very low. To optimize the transfection system Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) was used as a reporter gene. Furthermore, the schistosomal promoters of the aspartic protease cathepsin D and a cytoplasmatic actin gene were isolated from genomic DNA using inverse PCR. The isolated promoters were able to drive EGFP and DsRed expression in cos7- or HeLa-cells, but improved expression could not be observed in S. mansoni. Due to the complexity of the life cycle S. mansoni cannot be cultured in vitro. In order to develop a transgenesis system for schistosomes, the life cycle must consequently be completed by genetically modified parasites. In this study it was shown that the free-living and mobile miracidium that infects the intermediate host snail could be transformed by particle bombardment and reintroduced in the life cycle using the natural path of infection. Development into transgenic sporocysts was shown through the isolation of EGFP transcripts from intermediate host snails. Mobile genetic elements are used as molecular tools to achieve stable integration of a foreign gene into a genome. Boudicca is an endogeneous long-terminal repeat (LTR) transposon in the schistosomal genome. In this study it was shown that it is transcribed in adult worms, sporocysts and cercariae. The LTR drives EGFP expression in cell cultures. Furthermore, a Boudicca transcript was cloned and analyzed by sequencing. The results suggest that Boudicca can be used as a molecular tool for stable integration of transgenes into the schistosomal genome.

Keywords: Schistosoma mansoni, transgenic parasite, GFP, particle bombardment, long terminal repeat, retrotransposon, transformation, Boudicca

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Die Tropenparasitose Schistosomiasis
  • 1.2  Der Lebenszyklus von Schistosoma mansoni
  • 1.3 Krankheitsverlauf und Kontrolle der Schistosomiasis
  • 1.4 Das schistosomale Genom
  • 1.5 Versuche zur Transfektion von S. mansoni
  • 1.6 Stabile Transfektion mit Hilfe von mobilen genetischen Elementen
  • 1.7 Ziele dieser Arbeit
• 2  Ergebnisse
  • 2.1 Herstellung von Vektoren zur Expression von EGFP und β-Galaktosidase unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren
    • 2.1.1 Isolation des CAL-, des GST28- und des HSP70-Promotors aus genomischer DNA
    • 2.1.2 Subklonierung der Promotoren und Sequenzierung
    • 2.1.3 Herstellung von promotorlosen Kontrollplasmiden
    • 2.1.4 Herstellung von Plasmiden zur Expression von EGFP und β-Galaktosidase
    • 2.1.5 Überprüfung der Expression von EGFP und β-Galaktosidase in cos7-Zellen
    • 2.1.6  Endogene β-Galaktosidase-Aktivität in S. mansoni
    • 2.1.7  Ermittlung der Promotorstärke in der Zellkultur
    • 2.1.8 Herstellung eines durch Hitzeschock aktivierbaren Plasmids zur Expression von EGFP
  • 2.2 Entwicklung eines Systems zur genetischen Transfektion von S. mansoni
    • 2.2.1 Mikroinjektion
    • 2.2.2 Elektroporation
    • 2.2.3 Mikroprojektilbeschuss
      • 2.2.3.1 Nachweis der Reportergenaktivität in adulten Würmern und Sporozysten
  • 2.3 Versuche zur Optimierung der Expression von Reportergenen in S. mansoni
    • 2.3.1  Klonierung der 5’-UTR des Cathepsin D-Gens
    • 2.3.2 Klonierung der 5’-UTR eines Aktin-Gens
    • 2.3.3  Einsatz von DsRed als Reporter
    • 2.3.4 Herstellung von Plasmiden unter Einsatz der 5’-UTRs des Cathepsin D- und des Aktin-Gens und von DsRed als Reportergen
    • 2.3.5 Überprüfung der Plasmide in der Zellkultur
    • 2.3.6  Transfektion von S.mansonimit den DsRed-Konstrukten und den Aktin und Cathepsin D-Promotorkonstrukten
  • 2.4 Versuche zum Einschleusen von transgenen Mirazidien in den Lebenszyklus
    • 2.4.1 Überprüfung des Mikroprojektilbeschusses in vitro
    • 2.4.2 Überprüfung des Mikroprojektilbeschusses in vivo
    • 2.4.3 Nachweis der Reportergenaktivität in der Zwischenwirtsschnecke
    • 2.4.4 Überprüfung der Transfektion von Keimballenzellen
  • 2.5 Versuche zur Charakterisierung des endogenen Retrotransposons Boudicca
    • 2.5.1 Nachweis von Boudicca-Transkription in adulten Würmern, Zerkarien und Sporozysten
    • 2.5.2  Überprüfung der Promotorfunktion des long terminal repeats (LTR) in der Zellkultur
    • 2.5.3 Klonierung eines vollständigen Boudicca-Transkriptes
• 3  Diskussion
  • 3.1 Entwicklung eines Transfektionssystems für Schistosomen
  • 3.2 Versuche zu einer transienten Transfektion
    • 3.2.1 Expression unter der Kontrolle der eingesetzten schistosomalen Promotoren
    • 3.2.2 Eignung der eingesetzten Reporter als Transfektionsmarker
  • 3.3 Wege zu einer stabilen Transfektion
    • 3.3.1 Transfektion von Keimzellen und Einschleusen eines transgenen Stadiums in den Lebenszyklus
    • 3.3.2  Integrationen in das schistosomale Genom und Etablierung transgener Linien
      • 3.3.2.1 Charakterisierung des endogenen Retrotransposons Boudicca
• 4 Ausblick
• 5  Methoden und Materialien
  • 5.1 Methoden
    • 5.1.1 Methoden zur Haltung von Schistosoma mansoni
      • 5.1.1.1 Experimenteller Lebenszyklus
      • 5.1.1.2 Gewinnung und in vitro-Kultur adulter Würmer
      • 5.1.1.3 Gewinnung von Schistosomeneiern, Mirazidienschlupf und Sporozystenkultur
    • 5.1.2  Methoden zur genetischen Transformation von S. mansoni
      • 5.1.2.1 Mikroinjektion
      • 5.1.2.2 Elektroporation
      • 5.1.2.3 Mikroprojektilbeschuss
    • 5.1.3  Molekularbiologische Methoden
      • 5.1.3.1 Kultur und Lagerung von Escherichia coli
        • Flüssigkultur und Kultur auf Agar-Festplatten
        • Glyzerin-Gefrier-Kulturen
      • 5.1.3.2 Isolation von RNA
      • 5.1.3.3 Verdau mit RNAse freier DNAse
      • 5.1.3.4 Umschreiben der RNA in cDNA
      • 5.1.3.5 Isolation von genomischer DNA
      • 5.1.3.6  Isolation von Plasmid-DNA
      • 5.1.3.7 Restriktion von DNA
      • 5.1.3.8  Agarosegelelektrophorese
      • 5.1.3.9 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
      • 5.1.3.10 Reinigung und Fällung von RNA und DNA
      • 5.1.3.11 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
      • 5.1.3.12 Glätten von 5’-überhängenden Restriktionsschnittstellen
      • 5.1.3.13 Dephosphorylierung
      • 5.1.3.14  Ligation
      • 5.1.3.15 Herstellung transformationskompetenter E. coli
      • 5.1.3.16 Transformation von E. coli
      • 5.1.3.17  Selektion transformierter E. coli-Bakterien
        • Blau-Weiß-Screening
        • Kolonie-PCR
        • Restriktionsanalyse
      • 5.1.3.18  Sequenzanalyse
      • 5.1.3.19 Polymerase-Kettenreaktion
        • Primerdesign
        • Klonierung von PCR-Produkten
        • Inverse PCR
    • 5.1.4 Zellbiologische Methoden
      • 5.1.4.1 Zellkultur
        • Kultur von HeLa- und cos7-Zellen
        • Einfrieren von Zellen
        • Zellzahlbestimmung
        • Methoden zur genetischen Transformation von Zellen
          • A) DEAE-Dextran
          • B) Lipofektion
          • C) Elektroporation
      • 5.1.4.2  Mikroskopie
      • 5.1.4.3 Methoden zur histologischen Untersuchung
        • Nachweis der β-Galaktosidaseaktivität in fixierten Zellen und Geweben
        • Gefrierschnitte
        • Paraffinschnitte
    • 5.1.5 Biochemische Methoden
      • 5.1.5.1 Proteingesamtextraktion aus B. glabrata und S. mansoni
      • 5.1.5.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen
      • 5.1.5.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
      • 5.1.5.4 Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität im Proteingesamtextrakt
    • 5.1.6 Immunologische Methoden
      • 5.1.6.1 Western-Blot
      • 5.1.6.2 Immunhistochemie
    • 5.1.7 Datenverarbeitung
  • 5.2  Materialien
    • 5.2.1 Laborgeräte
    • 5.2.2 Verbrauchsmaterialien
    • 5.2.3 Reagenzien
    • 5.2.4 Enzyme
    • 5.2.5 Kommerzielle Kits
    • 5.2.6 Primer
    • 5.2.7 Agarosegelelektrophoresepuffer
    • 5.2.8 Puffer für Plasmidpräparationen nach Willimzig (1985)
    • 5.2.9 Bakterien und Zelllinien
    • 5.2.10 Plasmide
    • 5.2.11 Bakterienkultur-Medien
    • 5.2.12  SDS-Polyacrylamid-Gele
    • 5.2.13 Immunoblot
    • 5.2.14 Medien für die Zellkultur
    • 5.2.15 Mikroinjektionspuffer
    • 5.2.16 Puffer für die β-Galaktosidase-Färbung
    • 5.2.17 Puffer für die Immunohistochemie
    • 5.2.18 Tiere und Medien zu ihrer Haltung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Sequenzen
• Klonierungsschemata
• Publikationen und Tagungsbeiträge
• Lebenslauf
• Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 2.1: Polymerase-Kettenreaktion zur Isolation schistosomaler Promotoren aus genomischer DNA
• Tab. 2.2: Übersicht 1 über die hergestellten Plasmide zur Expression von Reportern unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren und die Kontrollplasmide.
• Tab. 2.3: Fragmente zur Herstellung eines Konstruktes zur Expression von EGFP unter den nativen Bedingungen des HSP70-Gens
• Tab.2.4: Übersicht über die Nachweisbarkeit von EGFP und β—Galaktosidase in Sporozysten und adulten Würmern nach der Transfektion mit Konstrukten, die den GST28 - oder den HSP70-Promotor enthalten. Unter der Kontrolle des CAL-Promotors konnte keine Reportergen-expression nachgewiesen werden.
• Tab. 2.5: Übersicht über die hergestellten Plasmide zur Optimierung der Expression durch Einsatz von DsRed und den Promotoren für das Cathepsin D und ein Aktin.

Bilder

• Abb. 1.1: Lebenszyklus und Verbreitung von S. mansoni
• Abb. 2.1: Isolation der schistosomalen Promotoren aus genomischer DNA. Spur 1 und 2: Amplifikation der 623 bp umfassenden 5’-UTR des Cal-Gens mit den Primern Cal-for und Cal-rev. Spur 3 und 4: Amplifikation der 337 bp umfassenden 5’-UTR des GST28-Gens mit den Primern GST-for und GST-rev. Spur 5 und 6: Amplifikation der 532 bp umfassenden 5’-UTR des HSP70-Gens mit den Primern HSP-for und HSP-rev. M ist der Marker.
• Abb. 2.2: EGFP-Expression in cos7-Zellen unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: Positivkontrolle: mit pEGFP-N1 transfizierte Zellen; a’: zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme. b: mit pEGFP-C transfizierte Zellen; b’ zu b korrespondierende Durchlichtaufnahme. c: mit pEGFP-G transfizierte Zellen; c’ zu c korrespondierende Durchlichtaufnahme. d mit pEGFP-H transfizierte Zellen; d’ zu d korrespondierende Durchlichtaufnahme. Größenbalken 50 μm.
• Abb. 2.3: β -Galaktosidase-Expression in cos7 -Zellen unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: Positivkontrolle: mit pβ-Gal-CMV transfizierte Zellen. b: mit pβ-Gal-C transfizierte Zellen. c: mit pβ-Gal-G transfizierte Zellen. d: mit pβ-Gal-H transfizierte Zellen. Größenbalken 150 μm.
• Abb. 2.4: Endogene β -Galaktosidase-Aktivität in adulten S. mansoni . Es wurden keine Werte für die spezifische Aktivität bestimmt: Dennoch zeigt sich, dass die Weibchen eine stärkere endogene β-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die Männchen.Dargestellt sind die Werte für die Extinktion bei 570 nm, für die Messung wurden gleiche Proteinmengen eingesetzt.
• Abb. 2.5: Ermittlung der Stärke schistosomaler Promotoren durch Messung der spezifischen β -Galaktosidase-Aktivität in cos7 -Zellen. Als Negativkontrolle diente eine Zellpopulation, die mit dem promotorlosen Plasmid transfiziert wurde, Positivkontrolle ist eine Zellpopulation, in der β-Galaktosidase unter dem CMV-Promotor exprimiert wird. Der GST28-Promotor erwies sich in der Zellkultur als stärkster Promotor. Ein Hitzeschock hat keinen Einfluss auf die Expression unter der Kontrolle des HSP70-Promotors in dem Plasmid pβ-Gal-H (HSP70+ mit Hitzeschock; HSP70- ohne Hitzeschock). Dargestellt sind die Mittelwerte inkl. Standardabweichung, die aus den Vierfachbestimmungen berechnet wurden.
• Abb. 2.6: Vorgang der Mikroinjektion einer Muttersporozyste. Die Sporozyste (S) wird von der Haltenadel (H) fixiert, sodass ein Keimballen (Pfeil) in der Öffnung der Haltenadel liegt (a). Mit der Injektionsnadel (I) wird Plasmid-DNA direkt in den Keimballen injiziert (b). Größenbalken 200 μm.
• Abb. 2.7: Nachweis der EGFP-Expression in elektroporierten Sporozysten. Spur 1: pEGFP-H: Elektroporation bei 660V/cm und 2 Pulsen; Spur 2: pEGFP-H: Elektroporation bei 910V/cm und 1 Puls; Spur 3: pEGFP-G: Elektroporation bei 660V/cm und 2 Pulsen; Spur 4: Negativkontrolle pEGFP-oP: Elektroporation bei 660 V/cm und 2 Pulsen.
• Abb. 2.8: Epifluoreszenzmikrokopische EGFP-Detektion in Sporozysten. a: bei einem Druck von 1500 Psi mit pEGFP-G beschossene Sporozyste 48 h nach der Transfektion. EGFP ist unter Blaulichtanregung detektierbar (Pfeil); a’ zu a korrespondierende Fluoreszenzaufnahme bei Grünlichtanregung; EGFP-Fluoreszenz ist nicht zu erkennen; a’’ zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme: Die Sporozysten wurde durch den Mikroprojektilbeschuss verletzt, sodass Trypan-Blau eindringen konnte. b: Fluoreszenzaufnahme einer intakten mit pEGFP-G bei einem Druck von 900 Psi beschossenen Sporozyste. c: Negativkontrolle zu b: mit pEGFP-oP transfizierte Sporozyste: Es ist kein Unterschied zu der Sporozyste in b zu erkennen. Bei der auftretenden punktförmigen Fluoreszenz handelt es sich daher um unspezifischen Hintergrund.
• Abb. 2.9: EGFP-Expression in adulten Würmern. a: Epifluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines mit pH-EGFP-H transfizierten Wurms. a’: zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme: Goldpartikel sind in unterschiedlichen fokalen Ebenen nachzuweisen. b: Negativkontrolle: mit pEGFP-oP transfizierte Würmer: Es ist kein Unterschied zu dem Wurm in a zu erkennen. c: Nachweis der Transkription von EGFP: Nach der Isolation der Gesamt-RNA und dem Umschreiben in cDNA wurde eine PCR mit EGFP-spezifischen Primern durchgeführt. Sowohl in mit pH-EGFP-H (Spur 1) als auch in mit pEGFP-G (Spur 2) transfizierten Würmern wurde EGFP-mRNA detektiert. In der Negativkontrolle (mit pEGFP-oP transfizierte Würmer) konnte keine EGFP-mRNA detektiert werden (Spur 3).
• Abb. 2.10: EGFP-Detektion mit dem Laserscanningmikroskop in adulten Würmern. a: Fluoreszenzaufnahme bei Blaulichtanregung: EGFP-Fluoreszenz kolokalisiert mit einzelnen Goldpartikeln (weiße Pfeile); a’: zu a korrespondierende Fluoreszenzaufnahme bei Grünlichtanregung: EGFP Fluoreszenz ist nicht detektierbar; a’’: Überlagerung von a und a’: Die unspezifische Fluoreszenz auf Grund der Läsion der Oberfläche erscheint gelb (gelber Pfeil); die EGFP-Fluoreszenz setzt sich als grüne Fluoreszenz ab. b: Großflächige EGFP-Fluoreszenz im Saugnapf eines mit pH-EGFP-H transfizierten Wurms.
• Abb. 2.11: β -Galaktosidase Expression in adulten Würmern. a: mit pβ-Gal-G transfizierter adulter Wurm: Auf der Oberfläche sind Goldpartikel zu erkennen (weiße Pfeile). Ein Bereich im Bereich des Pharynx ist blau angefärbt (roter Pfeil). b: Negativkontrolle: unbeschossener Wurm, der entsprechende Bereich weist die gleiche Färbung auf.
• Abb. 2.13: Inverse PCR zur Klonierung der 5’-UTR des Cathepsin D. Spur 1: Amplifikation eines 951 bp-Fragmentes aus mit XbaI verdauter und ligierter schistosomaler DNA. Spur 2: Negativkontrolle: mit XbaI verdaute genomische DNA. Spur 3: Negativkontrolle: genomische DNA. M ist der Marker.
• Abb. 2.14: Konsensussequenz der bei der inversen PCR erhaltenen Klone mit dem 5’-flankierenden Bereich des Cathepsin D. Die Primer zur Amplifikation von 5’ - und 3’ Bereich des Cathepsin D wurden unterstrichen; Mit +1 wurde das Desoxyadenosinmonophosphat im Startkodon (fett gedruckt) bezeichnet. Ein kurzes Intron (nt +50) (kursiv gedruckt) unterbricht die kodierende Sequenz; die Sequenz der 821 bp im nicht translatierten Bereich weist promotortypische Strukturen auf: Eine T/A-reiche Region (nt -45, hellgrau unterlegt) mit einer potentiellen TATA-Box; zwei inverse NF-Y-Konsensusequenzen (nt -95 und -408, dunkelgrau unterlegt, doppelt gerahmt) und zwei NF-Y-Konsensussequenzen (nt -629 und nt –221, dunkelgrau unterlegt); die zweite NF-Y-Konsensussequenz befindet sich unmittelbar unterhalb einer AP1-Bindungsstelle mit der Erkennungssequnz TGAGTCA (nt –234, hellgrau unterlegt). Die Sequenz wird umschlossen von zwei Xba I-Schnittstellen (umrahmt).
• Abb. 2.15: Inverse PCR zur Klonierung der 5’-UTR des Aktin-Gens. Spur 1: Negativkontrolle: ungeschnittene DNA; Nach dem Verdau genomischer DNA mit Hind III (Spur 2), EcoRI (Spur 3), XbaI (Spur 4) oder PstI (Spur 5) und der anschließenden Ligation wurden die DNA-Ringe als Matrize für eine PCR eingesetzt. In dem mit Hind III verdauten und anschließend ligierten Ansatz (Spur 2) wurde ein 464 bp bp-Fragment amplifiziert. M ist der Marker.
• Abb. 2.17: EGFP und DsRed-Expression in cos7 -Zellen (a, d) und HeLa -Zellen (b, c) unter der Kontrolle schistosomaler Promotoren. a: mit pH-EGFP-H transfizierte Zellen nach Hitzeschock; a’ zu a korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.1.8). b: mit pEGFP-CD transfizierte Zellen; b’ zu b korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.3.3). c: mit pEGFP-LTR transfizierte Zellen; c’ zu c korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.5.2). d mit pDsRed-A transfizierte Zellen; d’ zu d korrespondierende Durchlichtaufnahme (siehe 2.3.3). Größenbalken 50 μm.
• Abb. 2.18: In vitro generierte Muttersporozyste, die sich aus einem beschossenen Mirazidium entwickelt hat. Die Muttersporozyste ist in drei verschiedenen mikroskopischen Bildebenen dargestellt, in denen sich Goldaggregate (schwarze Pfeile) nachweisen lassen. Die Sporozyste weist ein intaktes Protonephridialsystem (gelber Pfeil) auf. Größenbalken 100 μm.
• Abb. 2.19: Paraffinschnitt von Biomphalaria glabrata zwei Wochen nach der Infektion mit beschossenen Mirazidien (Färbung Haema-toxylin/Eosin). a: Überblick über den Schnitt durch Maul, Mittelkörper, Kopf und Fuß der Schnecke. Die Box markiert die Nierenregion, die mit Sporozysten infiziert ist. b: Vergrößerung des Ausschnittes in a: Die Box markiert die Region, in der Sporozysten in der Nierenregion der Schnecke liegen; links oberhalb ist die Radula der Schnecke zu erkennen. c: Vergrößerung des Ausschnittes in b mit einer Nahaufnahme einer Sporozyste. Die schwarzen Pfeile markieren Goldpartikel, die in unmittelbarer Nähe von Keimballenzellen liegen. Der gelbe Pfeil markiert im Vergleich den Nukleolus einer Keimballenzelle.
• Abb. 2.20: Immunhistochemischer Nachweis von Sporozysten in einem Gefrierschnitt von Biomphalaria glabrata 10 Tage nach der Infektion mit unbehandelten Mirazidien (primärer Antikörper: Maus-Infektionsserum gegen S. mansoni ; sekundärer Antikörper IgG-Ziege-Anti-Maus, Peroxidase-gekoppelt). Die Struktur schlechter erhalten als in den Paraffinschnitten, dennoch ist der Nachweis von drei Sporozysten (Pfeile) möglich.
• Abb. 2.21 EGFP-Transkription im Gewebe einer Schnecke, die mit Mirazidien infiziert worden war, die zuvor mit H-PEGFP-H transfiziert worden waren. Spur 1 und 3: Nested PCR mit EGFP-spezifischen Primern; Spur 2 und 4: Negativkontrolle: Gesamt-RNA vor der Umschreibreaktion; Spur 5: Negativkontrolle: Nested PCR mit EGFP-spezifischen Primern und genomischer DNA aus nicht infizierten Schnecken als Matrize; Spur 6: Positivkontrolle: PCR mit EGFP-spezifischen Primern und Plasmid-DNA als Matrize. M ist der Marker. Die Spuren 1/2 und 3/4 zeigen Daten aus unabhängigen Versuchen.
• Abb. 2.22: Ermittlung der endogenen β -Galaktosidaseaktivität in nicht infizierten und infizierten Zwischenwirtsschnecken Die Schnecken, aus denen der Gesamtproteinextrakt, gewonnen wurde, wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten. Die Schnecken waren zu dem Zeitpunkt der Proteinextraktion gleich groß, die Infektion war 10 Tage zuvor erfolgt. Dargestellt sind die Mittelwerte inkl. Standardabweichung, die aus den Dreifachbestimmungen berechnet wurden.
• Abb. 2.23: Nachweis der Transkription des endogenen Retroelementes Boudicca in adulten Würmern, Zerkarien und Sporozysten. A: Schematische Übersicht zum Nachweis von Boudicca-Transkripten durch RT-PCR: Die ausgefüllten Pfeile repräsentieren die in ORF 2a bindenden Primer P-1982-F und P-2429-R, die in der ersten Runde der nested PCR eingesetzt wurden und die ein 447 bp-Transkript amplifizieren; die offenen Pfeile repräsentieren die Primer P-2010-F und P-2193-R, die in der zweiten Runde der nested PCR eingesetzt wurden und die ein 183 bp–Fragment reamplifizieren. Der weiße Pfeil repräsentiert den Primer P-622-F, der im ORF 1 bindet, und in Kombination mit P-2193-R ein die beiden ersten Leserahmen überlappendes Transkript mit einer Größe von 1572 bp Größe amplifiziert. B: Nach der RNA-Isolation aus adulten Würmern, DNAse Verdau und anschließender reverser Transkription wurde ein 447 bp-Fragment in der ersten PCR amplifiziert (Spur 1); nach DNAse Verdau ohne anschließende Transkription konnte kein Fragment amplifiziert werden (Negativkontrolle Spur 2); ein entsprechendes Fragment wurde aus genomischer DNA amplifiziert (Positivkontrolle Spur 3); mit nested Primern wurde ein 183 bp-Fragment aus dem 447 bp-RT-PCR-Fragment aus adulten Würmern (Spur 4) und von der Positivkontrolle (Spur 6) reamplifiziert. Eine Reamplifikation der Negativkontrolle war nicht möglich (Spur 5); ein 1572 bp-Fragment wurde aus der cDNA adulter Würmer (Spur 7) und aus genomischer DNA (Spur 8) mit Primern, die die ersten beiden Leserahmen überspannen, amplifiziert. M ist der Marker. C: Entsprechend wurde aus der cDNA von Larvenstadien ein 447 bp-Fragment in der ersten PCR amplifiziert (Spur 5: Sporozysten; Spur 6: Zerkarien); ein 183 bp-Fragment wurde aus der ersten PCR mit nested Primern reamplifiziert (Spur 8: Sporozysten; Spur 9: Zerkarien); entsprechende Fragmente wurden auch aus genomischer DNA amplifiziert (Spur 7 und Spur 10). Die Qualität der cDNA wurde durch Amplifikation der Cytochrom C Oxidase Untereinheit 1 (AF101196) getestet: Ein 343 bp-Fragment wurde amplifiziert (Spur 3: Sporozysten; Spur 4: Zerkarien); DNAse Verdau ohne anschließende reverse Transkription zeigt, dass keine Kontamination durch genomische DNA vorlag (Negativkontrolle: Spur 1: Sporozysten; Spur 2: Zerkarien).
• Abb. 2.24: Isolation des LTR von Boudicca aus BAC-DNA Klon 53-J-5. Spur 1 und 2: Amplifikation des 392 bp Fragmentes mit der Sequenz des LTR. Spur 3: Negativkontrolle: PCR ohne BAC-DNA als Matrize. M ist der Marker.
• Abb. 2.25: Übersicht über die Boudicca -Kopie im BAC-Klon 53-J-5 und Darstellung der Klonierung eines vollständigen Boudicca -Transkriptes aus der cDNA adulter S. mansoni . Die Boudicca-Kopie aus dem BAC-Klon 53-J-5 ist degeneriert: Das pol-Gen wird durch zwei offene Leserahmen kodiert (ORF 2a und 2b) und durch einen 225 bp-Abschnitt unterbrochen, der sich zunächst durch Sequenzanalyse nicht zuordnen ließ. Ob ein dritter Leserahmen tatsächlich für ein envelope-Glykoprotein kodiert (ORF 3) konnte nicht eindeutig ermittelt werden. Die LTRs weisen Boudicca als LTR-Retrotransposon aus (Copeland et al., 2003). Um die Organisation von transkribierten Boudicca-Kopien zu untersuchen, wurde die RT-PCR eingesetzt. Nach der RNA-Isolation aus adulten Würmern, DNAse Verdau und anschließender reverser Transkription wurden drei überlappende Fragmente kloniert, die den gesamten Bereich vom gag-Gen bis zum pol-Gen überspannen. Sequenzdaten für RC1-RC6 sind in der Genbank unter den Zugangsnummern AY308018 bis AY308023 veröffentlicht. Die Amplifikation eines die ersten beiden Leserahmen überlappenden Fragmentes gelang nicht mit den Vorwärtsprimern P-505-F, P-532-F oder P-557-F. Die Amplifikation eines Transkriptes des potentiellen ORF 3 mit den Primern P-3430-F und P-4882-R war nicht möglich. Primer wurden nach ihrer Position in der Boudicca-Kopie 53-J-5 benannt.
• Abb. 2.27: Sequenzvergleich zwischen mutierten Regionen der 53-J-5 Boudicca -Kopie und den jeweiligen mRNA-Transkripten. Die Transkripte RC1 und RC4 weisen das in Position 999 liegende TGA-Stopp-Kodon in 53-J-5 als Mutation aus (a). Drei Mutationen weist die Integrase aus der 53-J-5 Boudicca-Kopie auf, die in den Transkripten RC3 und RC6 nicht nachgewiesen werden konnten: Eine Integration bei nt 3577 (b), die eine Verschiebung des Leserahmens zur Folge hat, ein TAA-Stopp-Kodon bei nt 3923 (c) und ein TGA-Stopp-Kodon bei nt 4167 (d).
• Abb. 5.1: Ablauf des Mikroprojektil-Beschusses. Helium sammelt sich in einer Druckkammer hinter der Rupture Disk, die bei einem definierten Druck zerreißt. Die Helium-Druckwelle beschleunigt die auf einer Plastikscheibe (Macrocarrier) heftenden Goldpartikel (Microcarrier), die zuvor mit DNA beladen worden waren, gegen die Probe. Ein Metallsieb (Stopping Screen) hält den Macrocarrier zurück und lässt nur die Microcarrier passieren. A: variabler Abstand zwischen Rupture Disc und Macrocarrier; B: variabler Abstand zwischen Macrocarrier und Stopping Screen; C: variabler Abstand zwischen Stopping Screen und Probe. In dieser Arbeit wurde für A ein Abstand von 3-5 mm, für B der durch Unterlegscheiben bestimmbare mittlere Abstand von ca. 10 mm und für C der kleinste mögliche Abstand von 3 cm gewählt. (Die Zeichnung wurde verändert nach Biorad, München.)
• BSK-C Sequenzvergleich zwischen dem PCR-Produkt des CAL-5’-Bereiches und der publizierten Sequenz (L24159) (siehe 2.1.2)
• Sequenzvergleich zwischen dem PCR-Produkt des HSP70-5’-Bereiches und der publizierten Sequenz (L02415) (siehe 2.1.2)
• Sequenzvergleich zwischen dem PCR-Produkt des LTR und der publizierten Konsensus-Sequenz (BK000439) (siehe 2.5.2)
• Schema zur Klonierung von pEGFP-C/G/H (siehe 2.1.4)
• Schema zur Klonierung von pEGFP-A/CD/LTR (siehe 2.3.4 und 2.5.2)