Studien zur Transfektion von
Schistosoma mansoni (Digenea)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin
von


Dipl. Biologe Oliver Heyers
06.12.1971 in Aachen

Präsident der Humboldt-Universität Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
3. PD Dr. Frank Seeber

Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.04


[Seite 2↓]

Zusammenfassung

Schistosomen verursachen die Tropenparasitose Schistosomiasis mit 250-300 Millionen infizierten Menschen weltweit. Zur Analyse von Genfunktionen, durch die wirksame Medikamente entwickelt werden könnten, wird ein System zur Herstellung transgener Schistosomen benötigt. In dieser Arbeit wurde daher versucht, ein System zur Transfektion von Schistosoma mansoni von der transienten Expression von Reportergenen ausgehend zu entwickeln. Die Funktionalität der hergestellten Plasmide zur transienten Transfektion wurde durch die Expression der Reporter Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und β-Galatosidase unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren für das Calreticulin, die 28 kDa-Glutathion-S-Transferase und das 70 kDa-Hitzeschockprotein in cos7-Zellen nachgewiesen. Für den Gentransfer in S. mansoni wurden Mikroinjektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss eingesetzt. Der Mikroprojektilbeschuss erwies sich als geeignete Methode, Plasmid-DNA zur transienten Expression von EGFP und β-Galaktosidase in adulte und larvale Stadien zu transferieren. Da die beobachtete Reportergenexpression schwach war, wurde durch den Einsatz von Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) als Reportergen versucht, das Transfektionsssytem zu optimieren. Außerdem wurden die potentiellen Promotoren für das Cathepsin D und für ein Aktin durch inverse PCR aus genomischer DNA isoliert. Die Funktionalität dieser Promotoren wurde in cos7- bzw. HeLa-Zellen nachgewiesen, eine verbesserte Expression in S. mansonidagegen wurde mit diesen zwei Promotoren und unter Einsatz von DsRed nicht erreicht. Da S. mansoni sich in vitro nicht kultivieren lässt, muss für die Etablierung eines Transfektionssystems ein in seinen Keimzellen transgenes Stadium in den Lebenszyklus eingeschleust werden. Durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Mirazidien (freilebende Stadien des Parasiten) infizierten Zwischenwirtsschnecken und entwickelten sich zu transgenen Sporozysten, was durch die Transkription von EGFP nachgewiesen wurde. Für eine stabile Integration in das Genom werden unter anderem mobile genetische Elemente eingesetzt. Boudicca ist ein endogenes long terminal repeat (LTR) Retroelement. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es in adulten Würmern, Sporozysten und Zerkarien transkribiert wird. Das LTR kann in vitro als Promotor zur Expression von EGFP eingesetzt werden. Außerdem wurde eine transkribierte Kopie kloniert und analysiert. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse weisen darauf hin, dass Boudicca als Vektor zur stabilen Transfektion von S. mansonieingesetzt werden kann.


[Seite 3↓]

Eigene Schlagworte: Schistosoma mansoni, transgene Parasiten, GFP, Gene Gun, Transfektion, Retrotransposon, LTR, Boudicca


[Seite 4↓]

Abstract

Schistosomiasis caused by schistosomes affects about 250-300 million people world wide. The establishment of a transgenesis system for schistosomes is a prerequisite to the identification of new drug targets and to the analysis of gene regulation and will add to our knowledge of parasite physiology and development. In this study, plasmids expressing Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) and β-galactosidase driven by the schistosomal promoters of the calreticulin, the 28kDa-glutathione-S-transferase and the 70kDa-heatshock protein were cloned and successfully tested in cos7-cells. Microinjection, electroporation and particle bombardment were used to introduce plasmid DNA into Schistosoma mansoni. Adult and larval stages of S. mansoni subjected to particle bombardment transiently expressed the reporter genes, although the observed transfection rates were very low. To optimize the transfection system Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) was used as a reporter gene. Furthermore, the schistosomal promoters of the aspartic protease cathepsin D and a cytoplasmatic actin gene were isolated from genomic DNA using inverse PCR. The isolated promoters were able to drive EGFP and DsRed expression in cos7- or HeLa-cells, but improved expression could not be observed in S. mansoni. Due to the complexity of the life cycle S. mansoni cannot be cultured in vitro. In order to develop a transgenesis system for schistosomes, the life cycle must consequently be completed by genetically modified parasites. In this study it was shown that the free-living and mobile miracidium that infects the intermediate host snail could be transformed by particle bombardment and reintroduced in the life cycle using the natural path of infection. Development into transgenic sporocysts was shown through the isolation of EGFP transcripts from intermediate host snails. Mobile genetic elements are used as molecular tools to achieve stable integration of a foreign gene into a genome. Boudicca is an endogeneous long-terminal repeat (LTR) transposon in the schistosomal genome. In this study it was shown that it is transcribed in adult worms, sporocysts and cercariae. The LTR drives EGFP expression in cell cultures. Furthermore, a Boudicca transcript was cloned and analyzed by sequencing. The results suggest that Boudicca can be used as a molecular tool for stable integration of transgenes into the schistosomal genome.


[Seite 5↓]

Keywords: Schistosoma mansoni, transgenic parasite, GFP, particle bombardment, long terminal repeat, retrotransposon, transformation, Boudicca

Inhaltsverzeichnis

Tabellen

Bilder



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
24.05.2004