Charakterisierung der proteasomalen Genregulation unter Biogeneseaspekten

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologe Dirk Heyken
geb. 07. 04. 1975, Wuppertal

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Koetzel
2. Prof. Dr. Wolfgang Dubiel
3. Prof. Dr. Harald Saumweber

Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2005

Zusammenfassung

Das 26S Proteasom ist ein großer Proteinase-Komplex, der aus 32 unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Das 26S Proteasom ist involviert in die ATP-abhängige Degradation von ubiquitinierten Proteinen, die eine Vielfalt an zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Stressantwort, transkriptionelle Regulation, Chromosomen-Segregation, DNA-Reparatur, Zellzyklus-Steuerung und die Prozessierung von Peptiden für die MHC I Antigen Präsentation regulieren. Die Prozessierung von Peptiden wird verstärkt durch eine Interferon γ stimulierbare Variante des Proteasoms übernommen, dem so genannten Immunoproteasom.

Die Biogenese dieses großen Komplexes ist ein komplizierter Mechanismus, welcher Expression und Assemblierung der proteasomalen Untereinheiten beinhaltet.

In Eukaryonten sind für die Assemblierung und Maturierungsprozesse Helferproteine notwendig. In Mammalia übernimmt diese Funktion das Prote a som maturation Protein POMP. POMP ist wahrscheinlich auch bei der Biogenese des Immunoproteasoms von Bedeutung, da die mRNA von POMP durch Interferon γ induziert wird. Um die Regulation dieser Induktion zu untersuchen wurde der Promotor von POMP für die erste Fragestellung dieser Arbeit charakterisiert und seine Induzierbarkeit durch Interferon γ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die erhöhte mRNA-Menge durch Interferon γ-Stimulation nicht auf eine Promotor-Induktion, sondern auf post-transkriptionelle Ereignisse zurückzuführen ist.

In der zweiten Fragestellung dieser Arbeit sollte die Genregulation des Proteasoms unter Stressbedingungen untersucht werden. Der Stress wurde durch Inhibition der proteolytischen Aktivität des Proteasoms ausgelöst.

Wie seit längerem bekannt ist, werden in Bakterien und Hefe die ATP-abhängigen Proteasekomplexe über ein kompliziertes regulatorisches Netzwerk gesteuert. Über die transkriptionelle Regulation des Mammalia Proteasoms war bisher wenig bekannt. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der proteolytischen Aktivität des Proteasoms durch Behandlung von Mammalia-Zellen mit Proteasom-Inhibitoren durch eine gesteigerte Genexpression der proteasomalen Untereinheiten kompensiert wird. Alle proteasomalen Untereinheiten werden konzertiert hochreguliert. Exemplarisch an der proteasomalen Untereinheit Rpt1(S7) und an dem Maturierungsfaktor POMP konnte eine posttranskriptionelle Regulation unter Proteasom-Inhibitor Einfluss ausgeschlossen werden. Die vom Inhibitor induzierte Genaktivierung resultiert in einer de novo Protein-Synthese und führt daher zu einer gesteigerten de novo Biogenese des Proteasoms. Dieses Phänomen ist begleitet durch eine vermehrte Expression vom POMP. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Menge an Proteasom in Mammalia auf transkriptioneller Ebene reguliert wird und dass vermutlich ein autoregulatorischer feedback-Mechanismus eine verminderte proteolytische Aktivität kompensieren kann. Diese Daten werden durch Ergebnisse der CAT-Reportergen-Assays des β1(δ)-Promotors gestützt. Exemplarisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität dieses Promotors in Anwesenheit von Proteasom-Inhibitoren ansteigt. Die induzierbare Promotorregion konnte bis auf 130 bp eingegrenzt werden. Innerhalb dieser Promotorsequenz konnte die Bindung eines Transkriptionsfaktors (Nrf2) durch EMSA-Technik nachgewiesen werden.

Summary

The 26 S proteasome is a high molecular mass proteinase complexthat is built by of least 32 different protein subunits. The 26S proteasome is involved in the ATP-dependent degradation of ubiquitinated proteins that regulate a variety of cellular processes including signal transduction, stress response, transcriptional control, chromosome segregation, DNA repair, cell cycle progression and processing of antigenic Peptides for the MHC I pathway. Biogenesis of this large complex is a complicated process comprising expression, assembly and maturation of all subunits. This crucial step is supported by POMP (proteasome maturation protein). POMP mRNA is induced by Interferon gamma (IFN γ). We investigated this phenomenon via Reportergen assays with the Promoter region of POMP. POMP mRNA seems not to be regulated on a trancriptional level, but on posttranscriptional events.

ATP-dependentprotease complexes in bacteria and yeast are systems that undergoa highly sophisticated network of gene expression regulation.However, regulation of mammalian proteasome gene expressionhas been neglected so far as a possible control mechanism forthe amount of proteasomes in the cell. We showed that treatmentof cells with proteasome inhibitors and the concomitant impairmentof proteasomal enzyme activity induce a transient and concertedup-regulation of all mammalian 26S proteasome subunit mRNAs.Proteasome inhibition in combination with inhibition of transcriptionrevealed that the observed up-regulation is mediated by coordinatedtranscriptional activation of the proteasome genes and not bypost-transcriptional events. Our experiments also demonstratethat inhibitor-induced proteasome gene activation results inenhanced de novo protein synthesis of all subunits and in increasedde novo formation of the proteasome. This phenomenon is accompaniedby enhanced expression of the proteasome maturation factorPOMP. Thus, our experiments present first evidence thatthe amount of proteasomes in mammalia is regulated at the transcriptionallevel and that an auto regulatory feedback mechanism existsthat allows the compensation of reduced proteasome activity. These data are also supported by CAT reportergene assays with the proteasomal subunit β1(δ)-promoter. Exemplary we show the increase of CAT activities in response to proteasome inhibition. We can restrict the region of the promoter to 130 bp and identify Nrf2 as a possible candidate for a transcription factor via EMSA.

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31.10.2005