Einleitung

1.1 Das Proteasomensystem

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Das 26S Proteasom stellt neben den lysosomalen Proteasen das wichtigste Degradationssystem in eukaryotischen Zellen dar. Das Proteasom-System und seine homologen Komplexe findet man in allen drei biologischen Reichen. Die Struktur des Proteasoms ist konserviert (Gille, et al., 2003). In Eukaryoten ist das Proteasom aus dem proteolytisch aktivem 20S Kern und dem 19S Regulator (PA700) aufgebaut. Der gesamte Komplex wird als 26S Proteasom bezeichnet. Die selektive Proteindegradation wird über das Ubiquitin-Proteasom-System vermittelt (Hershko and Ciechanover, 1992). Die Spezifität dieses Systems wird über die Struktur des Proteasoms und die Markierung der Substrate mit Polyubiquitinketten über eine Enzymkaskade erreicht. Durch dieses System wird die Homöostase der meisten zellulären Proteine gewährleistet (Rock, et al., 1994). Zu den Substraten gehört eine Vielzahl von Proteinen, darunter falsch gefaltete, kurzlebige regulatorische, cytosolische sowie nukleäre Proteine. Durch diesen mannigfaltigen Proteinabbau nimmt das Proteasom Einfluss auf unterschiedlichste zelluläre Prozesse. So ist das Proteasom beteiligt an der Zellzykluskontrolle, hat Einfluss auf die Signaltransduktion, die Genregulation und die Generierung von Peptiden zur Antigenpräsentation, um nur einige Prozesse zu nennen (Coux, et al., 1996). Interferon γ induziert das so genannte Immunoproteasom, welches modifizierte katalytische Eigenschaften besitzt.

Abb. 1: Struktur des 20S und 26S Proteasoms

Das 20S Proteasom besteht aus 28 Untereinheiten, von denen 14 nicht identische Proteine sind. Die Untereinheiten gliedern sich in α- und β-Untereinheiten, die vier heptamere Ringe bilden und so einen Zylinder formen, der als 20S Proteasom (Core) bezeichnet wird. Das 26S Proteasom wird aus dem 20S Proteasom und dem 19S Regulator gebildet. Der 19S Regulator besteht aus Base- und Lid-Komponenten. (Abbildung aus (Kloetzel, 2001)

Die Struktur des Proteasoms ist in Abb. 1 dargestellt und wird im Folgenden erläutert. Das 20S Proteasom besteht bei Eukaryoten aus 28 Untereinheiten, die aufgrund von Sequenzhomologien in je 7 verschiedene α- und β-Untereinheiten unterteilt werden (Heinemeyer, et al., 1994). Daraus ergeben sich 14 unterschiedliche Untereinheiten, die jeweils doppelt im 20S Proteasom vorhanden sind. Diese 28 Untereinheiten formen einen Zylinder aus 4 heptameren Ringen. Die äußeren Ringe werden durch die α-Untereinheiten α1-7 gebildet und die inneren Ringe von den jeweiligen β-Untereinheiten β1-7. Die Reihenfolge, in der die Untereinheiten angeordnet sind, ist festgelegt (Groll, et al., 1997). Nur die drei β-Untereinheiten β1(δ), β2(Z) und β5(MB1) sind in der Lage, Peptidbindungen zu spalten. Ihre katalytische Aktivität erlangen die aktiven Untereinheiten jeweils durch ein N-terminales Threonin, dessen Aminogruppe für die Peptidase Aktivität als Nukleophil dient (Groll, et al., 1997;Lowe, et al., 1995). Da jede Untereinheit doppelt repräsentiert ist, befinden sich sechs aktive β-Untereinheiten im Proteasom. Jede der aktiven β-Untereinheiten besitzt eine unterschiedliche Substratspezifität (Orlowski, 1990;Rivett, 1989). So schneidet β1(δ) bevorzugt nach sauren Aminosäuren (peptidyl–glutamyl–spaltende Aktivität), β2(Z) spaltet bevorzugt nach basischen Aminosäuren (trypsin-ähnliche Aktivität) und die Spaltung nach hydrophoben Aminosäuren (chymotrypsin-ähnliche Aktivität) wird β5(MB1) zugeordnet. Im Inneren des Zylinders befindet sich die proteolytische Kammer, in der die aktiven β-Untereinheiten Zugang zu ihrem Substrat bekommen. Die zwei äußeren α-Ringe verschließen diese Kammer, welche durch eine reversible Konformationsänderung der α-Untereinheiten durch die Aktivatoren wieder geöffnet werden kann (Groll, et al., 1997).

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Das 20S Proteasom selbst ist wahrscheinlich nicht in der Lage, Proteine zu entfalten und sie abzubauen (Nandi, et al., 1997;Zwickl, et al., 1999). Dazu sind regulatorische Komplexe notwendig, die sich an den jeweiligen Öffnungen an den Polen des Zylinders befinden. Diese Komplexe werden als 19S Regulator bezeichnet und bestehen speziesabhängig aus 18-20 verschiedenen Untereinheiten. Die Untereinheiten formen eine asymmetrische Struktur, die sich aus zwei Subkomplexen zusammensetzt, dem so genannten Base-Komplex und dem Lid-Komplex (Glickman, et al., 1998). Diese Struktur bindet ubiquitinierte Substrate, entfaltet sie und führt sie den proteolytisch aktiven Untereinheiten zu (Zwickl, et al., 1999). Es wurden bisher drei unterschiedliche regulatorische Komplexe entdeckt: Der schon erwähnte 19S Regulator oder PA700, der 11S Regulator (PA28), der bei der Immunantwort eine Rolle spielt, und PI31, der das Proteasom möglicherweise inhibiert (Dubiel, et al., 1992;Ma, et al., 1993;Tanahashi, et al., 1999;Waxman, et al., 1987;Zaiss, et al., 1999).

1.2 Die Biogenese des 20S Proteasoms

Die koordinierte Zusammenlagerung der 28 proteasomalen Untereinheiten ist sehr kompliziert und läuft in mehreren Schritten ab. Die zurzeit existierenden Modelle beruhen auf Untersuchungen des Proteasoms aus Archaebakterien, Eubakterien, der Hefe, der Maus und aus dem humanen System. Im Gegensatz zum eukaryotischen Proteasom, setzt sich das Proteasom des Archaebakterium Thermoplasma acidophilum aus jeweils einem Typ der α- und β-Untereinheiten zusammen (Dahlmann, et al., 1989). Die Assemblierung scheint in Archaebakterien und Eubakterien einfacher abzulaufen als in Eukyryoten, denn sowohl in Thermoplasma als auch in Rhodococcus ist eine Assemblierung der α- und β-Untereinheiten in vitro möglich, während dies in Eukaryoten nicht der Fall ist (Gerards, et al., 1997;Zuhl, et al., 1997;Zwickl, et al., 1992). In Experimenten mit rekombinantem α7(C8) Protein konnte zwar ein Ringkomplex gebildet werden, aber es konnte sich keine proteasomale Struktur durch Koexpression mit β7(N3) oder β1(δ) formen (Gerards, et al., 1997). Es ist daher anzunehmen, dass die eukaryotische Biogenese des 20S Proteasoms, verglichen mit der Assemblierung des Proteasoms bei Prokaryoten, komplizierter ist. Die Biogenese beginnt mit der Synthese proteasomaler Untereinheiten, wobei die meisten β-Untereinheiten mit einer N-terminalen Verlängerung, dem Propeptid, synthetisiert werden. In Mammalia werden fünf der sieben β-Untereinheiten mit Propeptiden exprimiert. Wie in Abb. 2 dargestellt, bildet sich vermutlich als erster Assemblierungsschritt ein heptamerer α-Ring, der als Matrize für die Anlagerung der β-Untereinheiten dient. Nach einem alternativen Model kommt es erst zu einer Dimerisierung der α- und β-Untereinheiten (Gerards, et al., 1998;Zuhl, et al., 1997). In Rhodococcus unterstützen die Propeptide die Assemblierung der α- und β-Untereinheiten (Kwon, et al., 2004), was auch bei Eukaryoten zu erwarten ist, da einige Propeptide essentiell für die Reifung des Proteasoms sind (Chen and Hochstrasser, 1996). In Mammalia lagern sich die ersten β-Untereinheiten an den α-Ring in Form eines so genannten 13S Komplexes an (Frentzel, et al., 1994). Bei diesen „frühen“ β-Untereinheiten handelt es sich um β2(Z), β3(C10) und β4(C7) (Nandi, et al., 1997). Darauf folgen die β-Untereinheiten β5(MB1), β6(C5), β7(N3) und β1(δ). Dieser Komplex wird dann 16S Hemiproteasom genannt. Für die anschließende Reifung des Proteasoms werden die beiden Hemiproteasomen zusammengelagert (Chen and Hochstrasser, 1996). Hierfür sind vermutlich die C-terminalen Bereiche der β-Untereinheiten β7(N3), β1(δ) und β2(Z) wichtig, indem sie als „molekulare Klammern“ wirken und den Assemblierungs-Komplexe stabilisieren (Ramos, et al., 2004). Für die Dimerisierung der 16S Komplexe ist es notwendig, dass sich das aktive Threonin von seiner geschützten Position innerhalb des Precursor-Komplexes in die Position des reifen Proteasoms bewegt (Mullapudi, et al., 2004). In diesem Assemblierungszustand kommt es in einem Zwei-Schritt Mechanismus zu einer autokatalytischen Abspaltung der Propeptide der aktiven Untereinheiten (Schmidtke, et al., 1996). Die inaktiven β-Untereinheiten werden von den bereits aktivierten Nachbar-Untereinheiten prozessiert (Heinemeyer, et al., 1997;Jager, et al., 1999). Nach den Prozessierungen folgt die Degradation von POMP und die Biogenese des 20S Proteasoms ist abgeschlossen (s. Abb. 1 und Abschnitt 1.2.1).

Abb. 2: Modell der Mammalia 20S Proteasom Biogenese

Die Biogenese des 20S Proteasoms beginnt nach der Synthese der Untereinheiten vermutlich mit der Bildung einer α-Ring Matrix an der sich dann die „frühen“ β-Untereinheiten in Verbindung mit Assemblierungsproteinen, wie POMP, anlagern. Die Biogenese verläuft weiterhin über die Komplexe 13S und 16S. Die 16S Komplexe dimerisieren und formen so das 20S Proteasom. Detaillierte Beschreibung siehe Text (aus (Kruger, et al., 2003).

1.2.1  Helferproteine bei der Proteasombiogenese

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Anders als bei der Biogenese des Archaea-Proteasoms sind in der eukaryotischen Proteasom-Biogenese akzessorische Proteine notwendig. So wurde bei Fraktionierung von 16S Precursor Komplexen durch Saccharose-Gradientenzentrifugation das Chaperon Hsc73 gefunden (Schmidtke, et al., 1997). Man vermutete, dass Hsc73 die Konformation des Hemiproteasoms unterstützt. Ein Jahr später wurde ein weiteres Protein entdeckt, das den Assemblierungsprozess in Eukaryoten unterstützt. Ramos et al. identifizierte das Protein Ump1 (Ubiquitin-mediated proteolysis) bei einer Hefe-Mutante mit einem Defekt in der Proteolyse (Ramos, et al., 1998). Es besteht aus 148 Aminosäuren und ist mit den Pr e cursor-Komplexen des Proteasoms assoziiert. In Hefe bindet Ump1 vermutlich an die Aminosäuresequenz des Propeptids von β5. Eine Deletion von 5 Aminosäuren im Ump1-Protein verhindert im humanen System seine Assoziation mit dem Vorläufer Proteasom (Burri, et al., 2000;Ramos, et al., 1998). Es wird vermutet, dass Ump1 dort die koordinierte Prozessierung der Propeptide unterstützt und dann zum ersten Substrat des reifen Proteasoms wird (Ramos, et al., 1998). Seitdem wurden mehrere Ump1 homologe Proteine in anderen Organismen gefunden. Ump1 homologe Proteine wurden in Datenbanken für Mensch, Maus, Ratte, Drosophila melanogaster und Arabidopsis thaliana identifiziert (Kruger, et al., 2001). Daher gibt es seitdem mehrere Bezeichnungen für dieses Protein bei Mammalia. So wurde zum Beispiel POMP (proteasome maturation protein )im humanen System gefunden, außerdem wurde Proteassemblin bei der Maus und h/mUMP in murinen und humanen Zellen identifiziert (Burri, et al., 2000;Griffin, et al., 2000;Witt, et al., 2000). POMP bindet an das Propeptid der Mammalia und Hefe β-Untereinheit β5 (Cagney, et al., 2001;Jayarapu and Griffin, 2004). Diese Bindung scheint entscheidend für die Assemblierung des Proteasoms zu sein, da das β5-Propeptid essentiell für die Biogenese ist (Jager, et al., 1999). Die Rolle von POMP bei der Biogenese des Immunoproteasoms ist zurzeit noch Gegenstand kontroverser Diskussionen. Jayarapu et al. und Macagno et al. vermuteten aufgrund von yeast-two hybrid Analysen und Expressionsanalysen, dass POMP nicht in die Assemblierung des Immunoproteasoms eingreift (Jayarapu and Griffin, 2004;Macagno, et al., 2001). Im Gegensatz dazu zeigten Witt et al. und Griffin et al. eine Interaktion mit dem Präimmunoproteasom und eine Interferon γ vermittelte mRNA Induktion (Griffin, et al., 2000;Witt, et al., 2000).

1.3 Interferon γ und die Rolle des 26S Proteasoms für die Immunantwort

Das Proteasom spielt immunologisch eine wichtige Rolle. Unter Interferon γ-Einfluss werden die Schnitteigenschaften des 26S Proteasoms moduliert. Dazu werden die jeweiligen aktiven Untereinheiten β1(δ), β2(Z) und β5(MB1) durch die so genannten Immunountereinheiten iβ1 (LMP2), iβ2 (MECL-1) und iβ5 (LMP7) durch de novo Formation ersetzt (Kruger, et al., 2003). Bei dieser Immunoproteasom-Biogenese spielt wahrscheinlich auch das Assemblierungsprotein POMP eine wichtige Rolle, da seine mRNA durch Interferon γ stimulierbar und das Protein mit dem Precursor des Immunoproteasoms assoziiert ist (Burri, et al., 2000;Griffin, et al., 2000;Witt, et al., 2000). Die unter anderem durch das Immunoproteasom generierten Peptide werden über das Endoplasmatische Retikulum (ER) an die Zelloberfläche transportiert. Dazu werden die antigenen Peptide über den TAP (tran s porter associated with antigen processing) vom Cytosol in das ER-Lumen transportiert. Im Lumen werden die Peptide auf MHC Klasse I-Moleküle übertragen, der entstandene Komplex wird dann über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche zur Antigen-Präsentation befördert (Kruger, et al., 2003).

Interferone wurden schon 1959 als antivirale Substanzen entdeckt. Isaacs und Lindenmann beobachteten in Zellkultur mit Influenza infizierten Hühnerzellen ein Sekret, welches die virale Infektion verhindern konnte (Isaacs and Lindenmann, 1957). Interferone gehören zur Gruppe der Zytokine, die als Mediatoren bei der koordinierten Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. Bei den Interferonen handelt es sich um kurze Glykoproteine, die unter anderem von Leukozyten, Fibroblasten und Lymphozyten gebildet werden können. Man unterteilt die Interferone in zwei Typen: Typ I Interferone, die auch als virale Interferone bezeichnet werden und Typ II oder Immun-Interferone. Zum Typ I gehören Interferon α und β, während den Typ II nur Interferon γ zuzuordnen ist. Interferone wirken in unterschiedlicher Weise auf ihre Zielzellen ein. So sprechen Interferon Typ I und Typ II verschiedene Rezeptoren an. Interferon α und β binden an den Rezeptor IFNAR (Interferon Alpha R e ceptor). Dieser Rezeptor gehört zur Familie der Tyrosinkinase- Rezeptoren und dimerisiert bei Bindung seines Substrates. Über eine Phosphorylierungskaskade werden die Transkriptionsfaktoren der Familie STAT (signal transd u cer and activator of transcription) phosphoryliert und somit aktiviert. Bei Interferon α/β Induktion interagieren STAT1 und STAT2 mit einem Nicht-STAT Protein p48 (IRF-9) und translozieren in den Zellkern, wo sie ihre Zielgene aktivieren. Bei Interferon γ gibt es einen ähnlichen Mechanismus. Nur wird hier der Interferon Gamma Reze p tor (IFNGR) angesprochen. Bei Bindung von Interferon γ an den Rezeptor werden die Tyrosin-Kinasen der Janus-Familie (JAK) aktiviert, die dann den Transkriptionsfaktor STAT1 phosphorylieren. Daraufhin bildet dieser ein Homodimer und kann in den Kern translozieren und über die Bindesequenzen der DNA die Effektorgene ansprechen. Interferon γ ist auch in der Lage, Genregulation über posttranskriptionelle mRNA-Stabilisierung zu erzielen. Zum Beispiel identifizierten Snyder et al. ein interferon response element (IRE) in der 3`-UTR des HLA-A2 Gens. IRE-Sequenzen werden gewöhnlich im Zusammenhang mit der Transkriptionskontrolle gefunden (s. Abschnitt 1.3.1). Beim HLA-A2 Gen ist die Sequenz das IRE mit der Stabilisierung der mRNA in Anwesenheit von Interferon γ verknüpft (Snyder, et al., 2001). Weitere Beispiele für diese Art der Regulation durch Interferon γ sind die posttranskriptionelle Regulationen der Gene nitric-oxide-synthase (NOS) und des CIC-2 Chlorid-Kanal-Gens (Chesler, et al., 2004;Chu, et al., 2004).

1.3.1  Interferon γ cis-acting DNA-Elemente

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Die bekanntesten Zielsequenzen der Interferon vermittelten STAT-Transkriptions-faktoren sind ISRE (Interferon stimulated response element) für Typ I Interferone, während GAS (gamma-activated sequence) von Interferon Typ II aktivierten Transkriptionsfaktoren angesprochen werden. Bei einer Reihe von STAT Proteinen wurde eine Bindung an GAS-ähnliche Sequenzen beschrieben (Bach, et al., 1997). Es werden weiterhin immer neue cis-acting-Elemente, die auf Interferon γ ansprechen, identifiziert. So wurde 2002 das GAIT-Element (gamma-IFN-activated transcript i onal element) und ein neuer Faktor, der Transkriptionsfaktor GBF (GAIT binding factor), identifiziert (Hu, et al., 2002). Es gibt Beispiele in denen auch cis-acting Elemente im 3`-UTR Bereich von Genen entdeckt wurden. So konnte innerhalb der Sequenz eines Glycoproteingens ein solches Element gefunden werden. Unter Interferon γ-Einfluss bindet die glutamyl- prolyl-tRNA synthetase (GluProRS) an eines dieser Elemente und inhibiert dadurch die Translation (Sampath, et al., 2003;Sampath, et al., 2004). In der Signaltransduktions-Kaskade sind einige zusätzliche Proteine beschrieben worden, die von dem Interferon γ-Signalweg aktiviert werden. Unter anderem werden die MAP-Kinasen (Mitogen-activated protein kinase) Pyk2, ERK 1 / 2 (extr a cellular-signal-regulated kinase 1 / 2), das G-Protein gekoppelte Signalmolekül C3G und Rap-1 (RAS GTPase-activating protein 1) durch Interferon γ aktiviert (Ramana, et al., 2002). Diese Aktivierung von Kinasen kann die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren zur Folge haben. Für die induzierenden STAT1 Homodimeren gibt es noch zahlreiche Co-Aktivatoren, welche die Transkription vieler Gene beeinflussen, wie z.B. das CREB-binding protein (CBP / p300) (Ramana, et al., 2002).

Weitere Beispiele für eine transkriptionelle Regulation durch Interferon γ liefern die Immunountereinheiten des Proteasoms. Bisher ist nur von zwei Immunountereinheiten bekannt, wie die Interferon γ Antwort gesteuert wird. Die proteasomalen Gene PSMB9 -(LMP2) und PSMB10 (MECL-1) werden unter Einfluss von Interferon γ und der STAT-Signalkaskade transkriptionell induziert (Barton, et al., 2002). Der Promotor von PSMB9 (LMP2) wird durch ein GAS-Element kontrolliert (Barton, et al., 2002;Brucet, et al., 2004), während der PSMB10 (MECL-1) Promotor über IRE durch Interferon γ angesprochen wird (Foss and Prydz, 1999;Hayashi, et al., 1997). Für das Assemblierungsprotein POMP gibt es noch keine Hinweise auf die Regulation durch Interferon γ.

1.4 Proteasom-Inhibitoren

Die Inhibition von Enzymen ist ein wirkungsvoller Mechanismus, um komplexe Zusammenhänge in der Zelle zu verstehen. Für das Proteasom gibt es mittlerweile eine ganze Reihe von inhibitorischen Substanzen. Proteasom-Inhibitoren unterteilt man in zwei Gruppen, die synthetischen Analoga und die Naturprodukte (s. Tab. 1).

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Tab. 1: Proteasom-Inhibitoren
Gruppenaufteilung und deren Mitglieder

Synthetische

Substrat-Analoga

Naturprodukte

Peptid-Aldehyde

Epoxyketone

Peptid-Venyl-Sulfone

Peptid-Macrocycles

Peptid-Benzamine

γ-Lactam-Thiol-Ester

Peptid-α-Ketoamide

Epipolythiodioxopiperazin Toxin

Peptid-Borsäuren

 

Peptid-α-Ketoaldehyde

 

Zu den bekanntesten und weit verbreiteten synthetischen Analoga gehören die Peptid-Aldehyde. Sie werden schon länger als Inhibitoren für Serin- und Cystein- Proteasen verwendet. Der Mechanismus der Inhibition durch Peptid-Aldehyde beruht auf Hemiacetal-Bildung mit dem Threonin 1 der katalytischen Untereinheiten. Diese Bindung ist unter physiologischen Bedingungen reversibel. Zu den Peptid-Aldehyden gehört auch das in dieser Arbeit verwendete MG132 (Rock, et al., 1994). Die Gruppe der Peptid-Aldehyd-Inhibitoren zeichnet sich durch die reversible Bindung an das aktive Zentrum und die Inhibition der chymotrypsin-ähnlichen Aktivität des Proteasoms aus. Außerdem besitzen alle Peptid-Aldehyde eine hervorragende Zellpermeabilität, die durch das Lösungsmittel DMSO unterstützt wird. Weitere Mitglieder der synthetischen Analoga sind die Vinyl-Sulfonate. Sie sind bekannt für eine Inaktivierung ihres Substrates durch Wasserstoffbrückenbindung am aktivem Zentrum. Sie können das 20S Proteasom inhibieren, indem sie eine irreversible Modifikation des katalytischen Threonins verursachen (Bogyo, et al., 1997;Glas, et al., 1998). Eine andere Gruppe der Peptid basierten Inhibitoren hat Borsäure als reaktive Gruppe. Sie werden Peptid-Borsäure Inhibitoren genannt und sind wasserlöslich. Die Inaktivierung des Proteasoms verläuft anders als bei den vorangegangenen Inhibitoren über eine nicht-kovalente Komplex-Bildung. Der Mechanismus der Inhibition beruht auf eine „pseudo-kovalente“ Bindung zwischen dem Bohr-Atom und dem Sauerstoffatom des proteasomalen Threonin 1. Die am besten charakterisierte Substanz aus dieser Klasse ist Dipeptid-Borsäure PS-341 (Adams, et al., 1998). PS-34, auch bekannt unter dem Namen Bortezomib, ist als potenter Inhibitor in der Krebstherapie zugelassen (An, et al., 2004;Durrant, et al., 2004;Kondagunta, et al., 2004;Shah, et al., 2004).

Inhibitoren aus der Klasse der Naturprodukte wurden in verschiedenen Organismen entdeckt. Zum Beispiel ist Lactacystin ein Metabolit aus Streptomyces lactacystinaeus und ist ursprünglich aufgrund seiner Eigenschaft die Neuronendifferenzierung zu beeinflussen aufgefallen (Omura, et al., 1991;Omura, et al., 1991). Später konnte Lactacystin noch eine Rolle bei der Inhibition des Zellzyklus zugeordnet werden (Fenteany, et al., 1994). 1995 konnte gezeigt werden, dass Lactacystin irreversibel an die aktiven β-Untereinheiten des 20S Proteasoms bindet (Fenteany, et al., 1995). Der zugrunde liegende Mechanismus konnte 1996 durch Dick et al. aufgeklärt werden (Dick, et al., 1996). Es wurde gezeigt, dass sich Lactacystin unter physiologischen Bedingungen in die stabile Form clasto-Lactacystin β-lacton umwandelt und mit den Hydroxygruppen des Threonins der aktiven β-Untereinheiten reagiert. Die Inhibition des Proteasoms ist hoch spezifisch, auch wenn es einige Berichte über eine Einwirkung auf andere zelluläre Proteasen gibt (Ostrowska, et al., 1997). In Actinomyceten wurde der Proteasom-Inhibitor Epoxomicin entdeckt (Hanada, et al., 1992). Epoxomicin ist ein Mitglied einer Familie von linearen Peptiden. 1999 konnte die spezifische Inhibition des 20S Proteasoms durch dieses Naturprodukt gezeigt werden (Meng, et al., 1999). Die Spezifität von Epoxomicin wurde durch Ko-Kristallisation des Epoxomicin mit dem 20S Proteasoms aus der Hefe aufgeklärt (Groll, et al., 2002).

1.5 Regulation von proteasomalen Genen in Mammalia und Homologe in Hefe und Bakterien

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In Gram-positiven Bakterien existieren Proteasen (ClpCP), die den β-Untereinheiten des eukayotischen Proteasoms homolog sind. Sie sind wie das 26S Proteasom, ATP-abhängig und bestehen aus zwei hexameren Ringen (Bochtler, et al., 1997). Die ClpCP-Operons befinden sich unter Kontrolle eines Repressors (CtsR), der von McsA, einem Zink-Finger-Protein, unter Normalbedingungen stabilisiert wird. Unter Stressbedingungen wird der Repressor durch ClpCP und mit Hilfe der putativen Kinase McsB degradiert, was zu einem positiven Rückkopplungsmechanismus führt (Kruger, et al., 2001). Ein anderes Beispiel für einen solchen Rückkopplungsmechanismus wurde in E. coli für den σ32-Faktor entdeckt (Gottesman, 1996).

Über die eukaryotische Genkontrolle des Proteasoms ist nur wenig bekannt. Bei niederen Eukaryoten, wie in Sa c charomyces cerevisiae, werden 26 der 32 Gene der proteasomalen Untereinheiten durch ein 5` cis-acting Element reguliert (Mannhaupt, et al., 1999). Der Transkriptionsfaktor Rpn4 bindet an das so genannte PACE-Element (Pr o teasome-associated control element) und aktiviert die Transkription (Mannhaupt, et al., 1999). Rpn4 ist nicht nur ein allgemeiner Transkriptionsfaktor, sondern ist auch Substrat des Proteasoms und ermöglicht somit einen negativen Rückkopplungsmechanismus für die Kontrolle der proteasomalen Homöostase in der Zelle (Ju, et al., 2004;Xie and Varshavsky, 2001). Die Degradation durch das Proteasom kann durch zwei unterschiedliche Signalwege vermittelt werden. Es wurde gezeigt, dass Rpn4 ubiquitiniert und nicht-ubiquitiniert degradiert werden kann (Ju and Xie, 2004;Wang, et al., 2004).

Hinweise auf einen ähnlichen Mechanismus der Regulation wurden in Drosophila gefunden. Mittels RNA Interference (RNAi) wurde gezielt die Menge an Transkript einzelner proteasomaler Untereinheiten reduziert. Die Zellen reagierten mit einer gesteigerten Expression der proteasomalen Untereinheiten, die nicht Ziel von RNAi waren (Wojcik and DeMartino, 2002). In Drosophila wurden cis-acting Elemente in einigen 5`DNA-Sequenzen von proteasomalen Genen identifiziert, die eine gemeinsame Regulation der verschiedenen Gene vermuten lassen können (Masson, et al., 2003). Jedoch konnte nur in 6 der 14 proteasomalen Untereinheiten eine solche Sequenz gefunden werden. In Mammalia gibt es ebenfalls Hinweise auf eine solche Regulation proteasomaler Gene. Dort wurde im Zusammenhang mit Muskelatrophie eine Hochregulation von Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems beobachtet, so dass man auch für Mammalia eine solche Form der Regulation erwarten kann (Price, 2003). Es gibt mehrere Berichte, dass Komponenten des 19S Regulators in Mechanismen der Transkription eingreifen. Für Rpt6 und Rpt4, zwei ATPase-Untereinheiten des 19S Regulators, konnte eine Interaktion mit Promotorelementen nachgewiesen werden (Chang, et al., 2001;Makino, et al., 1999). Allerdings konnte bisher kein Zusammenhang zwischen dem 19S Komplex und der Regulation proteasomaler Gene hergestellt werden. Es ist zurzeit weder nachgewiesen, ob es eine gemeinsame Regulation proteasomaler Gene gibt, noch ob die proteasomalen Untereinheiten einen gemeinsamen Transkriptionsfaktor ähnlich wie in Hefe besitzen.

1.6 Oxidativer Stress

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Oxidativer Stress entsteht hauptsächlich durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Zu den ROS werden einerseits Sauerstoffradikale wie das Superoxidanion (O2 - *)oder das Hydroxylradikal (OH*) gezählt. Andererseits gehören zu dieser Substanzgruppe auch Nichtradikale wie Wasserstoffperoxid (H2O2), die aufgrund ihrer oxidierenden Wirkung eine Radikalbildung begünstigen. ROS werden unter physiologischen Bedingungen im Rahmen des oxidativen Metabolismus freigesetzt. In den Mitochondrien werden in der Atmungskette die meisten Radikale gebildet (McCord, 2000). Die freigesetzten Radikale verursachen kovalente Modifikationen von Makromolekülen, führen zu Gewebsschädigungen und Mutationen der DNA. Um diesen enormen Zellschäden entgegenzuwirken, haben die Organismen verschiedene Schutzmechanismen entwickelt. Dazu gehören zum Beispiel die Antioxidantien. Sie können in zwei Gruppen unterteilt werden. Zu der ersten Gruppe gehören Metabolite und Vitamine, die aufgenommen oder synthetisiert werden. Dazu gehören Vitamin A, C und E, weiterhin NAD(P)H / NAD(P), Harnsäure und die Ionen Mg2+ oder Cu2+ (Berlett and Stadtman, 1997;Stadtman, 1990). Zur zweiten Gruppe gehören Proteine und Enzyme. Hierzu gehören Katalase (KAT), Glutathion-Peroxidase (GPx), Superoxiddismutase (SOD) und andere Peroxidasen (Berlett and Stadtman, 1997). Die Enzymreaktionen sind im Folgenden zusammengefasst:

Superoxiddismutase (SOD):

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Durch diese Reaktion wird das Sauerstoffradikal unschädlich gemacht und das Produkt in der nachfolgenden Reaktion zu H2O umgesetzt.

Katalase (KAT):

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Glutathion-Peroxidase (GPx):

Diese Reaktionen werden durch die so genannten Phase II Enzyme katalysiert, die nach Freisetzung von ROS gemeinsam aktiviert werden.

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Genomische Analysen der induzierbaren Gene weisen ein gemeinsames cis-actin DNA-Element auf, welches anti o xidant response element (ARE) genannt wird (Rushmore, et al., 1990;Rushmore, et al., 1991). Dieses Element wurde weiterhin in verschiedenen Genen von DNA-Reparatur- oder Stress-Proteinen gefunden sowie auch bei dem Proteasom (Talalay, et al., 2003). Die transkriptionelle Regulation dieser Gene wird über den Transkriptionsfaktor NF-E2-related factor 2 (Nrf2) reguliert (Itoh, et al., 1997). Dieser Faktor bindet am Cytoskelett durch das Protein Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) (Itoh, et al., 1999). Keap1 agiert als Sensor für die ROS durch einen Cystein-Rest, der nach oxidativem Stress posttranslational modifiziert wird (Dinkova-Kostova, et al., 2002;Zhang and Hannink, 2003). Die Modifikation bewirkt eine Freisetzung von Nrf2. Keap1 führt Nrf2 im inaktivem Zustand einer Ubiquitin-abhängigen Degradation durch das Proteasom zu (Zhang and Hannink, 2003). Nrf2 wird im Normalzustand relativ schnell durch das Proteasom abgebaut. Es besitzt eine Halbwertszeit von nur 10 bis 30 Minuten (Nguyen, et al., 2003). In Zellen, die unter oxidativem Stress stehen, wird Nrf2 von Keap1 befreit und durch den Repressor iNrf2 stabilisiert (Sekhar, et al., 2002). So kann Nrf2 in den Kern transloziert werden. Dieser Mechanismus wird durch andere Faktoren unterstützt, die Nrf2 aktivieren können. Huang et al. konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass Nrf2 durch die Protein-Kinase C (PKC) phosphoryliert wird und sich so von Keap1 lösen kann (Huang, et al., 2000;Huang, et al., 2002). Es wird diskutiert, dass mehrere Signale zusätzlich diesen Weg beeinflussen können. So gibt es mehrere Berichte, dass der Phosphadidylinositol-3-kinase (PI3K)-Signalweg in die Nrf2-Aktivierung eingreift (Kang, et al., 2002;Lee, et al., 2001). Es werden außerdem noch drei weitere Kinasen mit der Aktivierung von Nrf2 in Verbindung gebracht: Mitogen-activated protein kinase (MAPK; (Elbirt, et al., 1998;Otterbein, et al., 2000), extracell u lar signal-regulated kinase (ERK; (Numazawa and Yoshida, 2004) und c-jun N-terminal kinase (JNK; (Oguro, et al., 1998).

1.7 Ziel der Arbeit

Eine Interferon γ-Behandlung hat zahlreiche Auswirkungen auf eine Zelle. Zum Beispiel wird das so genannte Immunoproteasom über de novo Formation gebildet. Es besitzt im Vergleich zu dem konstitutiven Proteasom modifizierte Schnitteigenschaften. Vermutlich wird diese Neubildung des Immunoproteasoms auch durch das an der Biogenese des konstitutiven Proteasoms beteiligten Proteasome maturation protein (POMP) unterstützt. Gestützt wird diese Annahme durch die Tatsache, dass die mRNA von POMP nach Interferon γ-Stimulation induziert wird. Bekannt ist, dass die mRNA-Menge von POMP unter Interferon γ Einwirkung zunimmt. Die Ursache für diesen Effekt ist bis heute allerdings noch nicht aufgeklärt. Es ist zu vermuten, dass die Induktion von POMP ähnlich der der Immunountereinheiten gesteuert wird. Diese werden transkriptionell über STAT Transkriptionsfaktoren reguliert (Barton, et al., 2002;Brucet, et al., 2004;Foss and Prydz, 1999;Hayashi, et al., 1997). Um diese offene Fragestellung zu untersuchen, sollte der bisher noch unbekannte Promotorbereich des POMP-Gens zunächst durch Reportergen-Analysen eingegrenzt werden. Der so ermittelte Promotor sollte dann im Hinblick auf die Interferon γ-Antwort charakterisiert werden. Für den Fall, dass die Induktion nicht transkriptionell gesteuert wird, sollte untersucht werden, ob ein posttranskriptioneller Einfluss die Ursache hierfür sein kann.

ATP-abhängige Proteasesysteme in Bakterien und Hefen sind streng reguliert. In einigen Bakterien erfüllen die Clp-Proteasen die Funktionen des eukaryotischen Proteasom-Systems. In Hefe ist ein transkriptioneller Aktivator für proteasomale Untereinheiten beschrieben (Xie and Varshavsky, 2001). RPN4 bindet an eine 5´ regulatorische Sequenz (PACE) und wird durch das Proteasom abgebaut (Mannhaupt, et al., 1999). Auch in Drosophila deutet sich eine Regulation proteasomaler Untereinheiten auf Transkriptionsebene an. Ein knock-down proteasomaler Untereinheiten durch RNA Interference in Drosophila führt zu einer Kompensation durch Induktion der Untereinheiten, die nicht Ziel der RNAi waren (Wojcik and DeMartino, 2001). Für Säugerzellen gab es Hinweise zur Regulation des Proteasoms bei verschiedenen Krankheiten (Du, et al., 2000;Price, et al., 1996).

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Diese Beispiele deuten auf eine Regulation der Synthese des Proteasoms hin, da jede Zelle bei unterschiedlichen Bedingungen verschiedene Mengen des Proteasoms benötigt. Kürzlich konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Meiners et al. ein Zusammenhang zwischen der Inhibition des Proteasoms und daraus resultierender transkriptioneller Hochregulation von proteasomalen Untereinheiten festgestellt werden. Denkbar ist, dass durch die Inhibiton des Proteasoms der Abbau eines regulatorischen Proteins blockiert wurde. Dieses würde einen autoregulatorischen Feedback-Mechanismus in Gang setzten. In der vorliegenden Arbeit sollte dieser Effekt eingehender untersucht werden. Da die Art der Induktion nicht bekannt war, sollte zuerst geprüft werden, ob die Induktion auf transkriptioneller Ebene auch auf translationaler Ebene nachweisbar ist. Die Fragestellung, die sich daran anschloss war, ob eine Expression der proteasomalen Untereinheiten ausreicht, um den kompletten Biogeneseweg zu forcieren. Falls die Induktion der proteasomalen Gene transkriptioneller Natur sein sollte, wäre zu testen, ob ein Transkriptionsfaktor zu finden ist. Dazu sollte exemplarisch der Promotor einer Untereinheit des Proteasoms untersucht werden.


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31.10.2005