Ergebnisse

3.1 Regulation von POMP durch Interferon γ

↓40

Durch Interferon γ wird eine Veränderung in der Zusammensetzung der proteasomalen Untereinheiten ausgelöst. Dabei werden die Untereinheiten β1(δ), β2(Z) und β5(MB1) über de novo Formation durch so genannte Immunountereinheiten β1i(LMP2), β5i(LMP7) und β2i(MECL-1) ersetzt. Außerdem wird durch Einfluss von Interferon γ die mRNA von POMP signifikant stimuliert (Burri, et al., 2000;Witt, et al., 2000). Da das Helferprotein POMP die Biogenese des konstitutiven Proteasoms unterstützt, kann man aufgrund der Interferon γ-Induktion von POMP vermuten, dass auch die Biogenese des Immunoproteasoms beeinflusst wird. Die transkriptionelle Induktion der Immunountereinheiten β1i(LMP2) und β2i(MECL-1) durch Interferon γ ist bereits beschrieben (Barton, et al., 2002;Brucet, et al., 2004;Foss and Prydz, 1999). Allerdings war weder die Genstruktur, noch der Promotorbereich von POMP bekannt. Durch Datenbankrecherche sollte die Genstruktur untersucht und potentielle Bindungsstellen für Interferon γ induzierte Transkriptionsfaktoren ermittelt werden.

3.1.1 Genstruktur von POMP

Um die Interferon γ-Induktion der POMP mRNA zu untersuchen, wurde zunächst die Genstruktur anhand von Datenbankanalysen ermittelt. Dazu wurden die cDNA Einträge mit der humanen genomischen Sequenz verglichen. Das POMP-Gen umspannt einen DNA-Bereich von 19,7 kb auf dem Chromosom 13 und gliedert sich in 6 Exons. Die Exongröße variiert zwischen 61 Basen (Exon 3) und 888 Basen (Exon 6), während die 5 Introns zwischen 2001 Basen (Intron 2) und 5602 Basen (Intron 5) groß sind. Der offene Leserahmen endet am Anfang des 6. Exons, so dass sich eine kleine 84 bp lange 5`- untranslatierte Region (UTR) und eine mit 888 bp sehr große 3`- UTR ergibt. Der translatierte Bereich beginnt am Ende des 1. Exons und umfasst 423 bp, die für ein 141 Aminosäuren großes Protein kodieren. In 5`- Richtung des 1. Exons liegt die putative Promotorregion, die experimentell bestätigt werden sollte (s. Abb. 3).

Abb. 3: Genregion von POMP

a) Schematische Darstellung der Genregion von POMP basierend auf cDNA (Acc.-Nr.: NM_015932) Sequenzvergleichen mit genomischen Sequenzen (Acc.-Nr.: AL359454) durch NCBI-BLAST. Exons sind durch Kästchen und Introns durch Striche zwischen den Kästchen dargestellt. Die jeweiligen Größen sind in Basenpaaren (bp) über den Exons und Introns angegeben. Die UTR-Bereiche sind dunkel hervorgehoben, mit Angabe der Lage von Start- und Stop-Kodons.
b) Dargestellt sind die aus cDNA-Sequenzen entnommenen Transkriptvarianten von POMP. Die Sequenzen unterscheiden sich allein in der Länge ihrer 3`-UTR-Region. Die kürzere Variante wurde als POMP-S (S für short) bezeichnet, während die lange Variante POMP-L (L für long) genannt wurde. Die UTR Bereiche sind dunkel hervorgehoben und entsprechend gekennzeichnet. Die Pfeile über der POMP-L-Variante gibt die Positionen der Oligonukleotidsequenzen der RT-PCR in Abb. 4 an.

↓41

Ausgehend von der Nukleotidsequenz der ursprünglich durch Datenbankvergleich der Aminosäuresequenz ermittelten cDNA (NCBI-Datenbank, Eintrag: AF125097; (Witt, et al., 2000), konnten sieben weitere dazu homologe cDNA-Sequenzen gefunden werden. Die ermittelten Transkripte variieren in der Position des Transkriptionsstartpunktes und in der Länge der mRNA-Sequenz.

Die cDNA´s sind zwischen 600 bp und 1300 bp groß, wovon drei der sieben Sequenzen ca. 600 bp groß sind. Fünf der sieben cDNA Sequenzen besitzen ein Poly A-Signal. Die unterschiedlichen Transkriptvarianten, die sich aus dem Vergleich der cDNA-Sequenzen ergeben sind in Abb. 3b schematisch dargestellt. Die Einträge der cDNAs wurden genau analysiert. Eine der Sequenzen mit dem NCBI-Datenbank-Eintrag AF262975 kodiert für ein akzessorisches Protein, welches mit der Untereinheit β 4.1 des spannungsabhängigen Kalium-Kanals interagiert und homolog zu der POMP-mRNA ist (Tian, et al., 2002). Eine weitere mRNA-Sequenz mit der Accession Nummer AF275807 weist eine Punktmutation auf, so dass der Leserahmen länger ist. Der offene Leserahmen umfasst hier 483 Nucleotide und resultiert in 161 Aminosäuren. Zur Verifizierung der aus den Sequenzdaten entnommenen verschiedenen Transkript-Größen wurden Oligonukleotide verwendet, die im 3´ UTR und im 5`-UTR Bereich des POMP-Gens binden (s. Position der Oligonukleotide in Abb. 3b). Wie in Abb. 4b zu erkennen ist, konnte der ca. 900 bp große Bereich aus HeLa cDNA mittels RT-PCR amplifiziert werden. Damit wurde die Existenz des POMP-L-Transkripts bestätigt. Die 600 bp lange POMP-S-mRNA Variante konnte durch Northern Blot-Analysen ermittelt werden (s. Abb. 4a). Die Größe der mRNA wurde in diesem Fall anhand der Größenstandards des Northern Blots bestimmt. Bemerkenswert war, dass die POMP-L-mRNA nur schwach oder gar nicht in den Northern Blot-Analysen zu detektieren war (s. Abb. 4).

Abb. 4: Charakterisierung der POMP Transkripte

Nachweis der Existenz der zwei unterschiedlichen POMP mRNA-Größen durch:
a) Northern Blot: 5 µg Gesamt-RNA aus unbehandelten HeLa-Zelllysaten wurden elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembren transferiert. DIG-markierte POMP Gegenstrang-RNA wurde als Sonde verwendet. (Bande über 1,5 kb unspezifisch; M = Marker)
b) RT-PCR: Es wurden 2 µl cDNA aus RNA von unbehandelten HeLa-Zellen als Matrize in der PCR verwendet. 900 bp Produkt wurde mit RACEUMP Primern (s. Abb. 3b) amplifiziert (M = Marker).

↓42

In Northern Blot-Analysen mit humanen Gewebe konnten zwei größere Transkripte identifiziert werden, die in etwa die Größen der POMP-L-mRNA entsprachen (Dr. E. Krüger, persönliche Mitteilung). Nach dem Beleg der Existenz beider mRNA-Varianten von POMP sollte untersucht werden, wie die Regulation nach Interferon γ Signal gesteuert ist. Die Nukleotid-Sequenz im 5`-Bereich dieser mRNA-Varianten sind identisch. Daher wurde zunächst auf die Charakterisierung des vermeintlichen Promotorbereichs fokussiert.

3.1.2 Reportergenfusion des putativen POMP Promotors

Zur Untersuchung des putativen Promotor-Bereichs von POMP wurde die Nukleotid-Sequenz upstream des mRNA Startpunktes auf mögliche Erkennungssequenzen für Transkriptionsfaktoren durchsucht. Es konnten keine Bindessequenzen für Interferon γ aktivierte Transkriptionsfaktoren upstream des mRNA-Startpunktes identifiziert werden. Die Analyse wurde bis 2 kb in 5`-Richtung des Translationsstartpunktes durchgeführt.

Drei unterschiedlich lange Bereiche der potentiellen Promotorregion wurden zur Bestimmung des Promotorbereiches mit einem Reportergen fusioniert. Dies gewährleistete, dass auch die Sequenzen möglicher Enhancer-Elemente, die sich sehr weit upstream des Transkriptionsstarts befinden konnten, mit einbezogen wurden.

↓43

Fragmente von 0,7 kb, 2,2 kb und 4 kb Größe upstream des putativen Transkriptionsstarts wurden mit dem genomischen Klon RP11 (Sanger Center) als Matrize amplifiziert. Die drei unterschiedlich langen Fragmente wurden durch Ligation in den Reporter-Vektor pXP-2 oder pGL2basic eingebaut. Die Funktionalität dieser Elemente wurde in einem Luciferase-Reportergen-Assay analysiert (s. Abb. 5). Dazu wurden die Konstrukte in HeLa Zellen transfiziert. Nach 16h Expressionsdauer wurde die Aktivität der Luciferase im Zelllysat gemessen.

Abb. 5: Der 5`-Bereich von POMP besitzt Promotoraktivität

Luciferase-Reportergen-Assay: Die Konstrukten von POMP-Promotoren unterschiedlicher Größe in Fusion mit dem Reportergen Luciferase wurden in HeLa-Zellen transfiziert. Auf der linken Seite sind die Längen der Promotorbereiche in kb angegeben (vom ATG in 5`-Richtung gemessen) und graphisch dargestellt (Die Boxen stellen die Lage des Reportergens Luciferase [Luc] dar). 24 h nach der Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität in den Zelllysaten gemessen. Die Aktivität ist in RLU / s angegeben und wurde jeweils aus drei Proben gemittelt. Die Standardabweichung ist am rechten Ende des jeweiligen Balkens angegeben. Als Kontrolle wurde der Leervektor (Vektor) ohne Promotor verwendet.

Die Luciferase-Aktivität basierte auf der jeweilige Promotoraktivität. Bei einer Aktivität, die größer war als die der Kontrolle ohne Promotor, wurde dem DNA-Bereich Promotoraktivität zugesprochen. Bei allen drei Konstrukten war die Luciferase-Aktivität deutlich stärker als bei der Kontrolle. Es konnte nun davon ausgegangen werden, dass es sich hier um einen Promotor handelte. Bemerkenswert war, dass die Aktivität der Luciferase nahezu linear mit der Länge der DNA Konstrukte zunahm. Das lässt auf verschiedene regulatorische Komponenten weit entfernt des Transkriptionsstartpunktes schließen.

↓44

Nachdem nun die Sequenz in 5`Richtung des Translationsstartpunktes als Promotor bestätigt wurde, konnte mit der Charakterisierung dieses Abschnitts begonnen werden. Dazu wurde zunächst die DNA-Sequenz der 5`-UTR der mRNA untersucht, da diese einen Einfluss auf deren Genexpression haben kann (Wilkie, et al., 2003). Bei dem Gen POMP umspannt diese Region nur etwa 80 Basenpaare. Um den Effekt auf die Expression zu untersuchen, sollte ein Klon ohne 5`-UTR generiert werden. Da zum Zeitpunkt der Erstellung des Klons die längeren Varianten der 5`-UTR noch nicht bekannt waren, wurde ab Position -48 ein Klon generiert und dessen Luciferase-Aktivität gemessen. Die Sequenz wurde aus der cDNA mit der Accession Nummer BC003390 entnommen. In Abb. 6 ist der Vergleich der Expressionsklone des POMP-Promotors mit und ohne 5`-UTR dargestellt. Im Vergleich ist die Aktivität der Luciferase ohne 5`-UTR ein wenig stärker, so dass davon auszugehen ist, dass der untersuchte Bereich der 5`-UTR die Aktivität leicht reprimiert (s. Abb. 6).

Weiterhin wurde der Promotor charakterisiert, indem der Bereich des Minimalpromotors eingegrenzt wurde. Zur Messung der basalen Promotoraktivität wurde ein Bereich von 200 bp in 5’ Richtung des Transkriptionsstarts deletiert und deren Luciferase-Aktivität ermittelt (Klon 0,7 kb –200; s. Abb. 6). Ohne die ersten 200 Basen vor dem Translationsstart konnte keine Luciferase-Aktivität gemessen werden, so dass dort der Minimalpromotor sein muss.

Die Sequenz der 5’ UTR des POMP-Promotors hat einen Einfluss auf die Transkription. Außerdem sind die ersten 200 Basen des Promotors essentiell für dessen Aktivität und können als Basis-Promotor bezeichnet werden. Weiter upstream befinden sich vermutlich Bindungssequenzen an denen Regulatorproteine andocken können. Enhancer- Proteine binden, aufgrund der deutlich gesteigerten Aktivität der größeren Promotorfragmente, wahrscheinlich in den Regionen von 700 bp bis 4000 bp. Da nun der Promotorbereich eingegrenzt wurde, konnte seine Regulierbarkeit auf Interferon γ Stimulation näher untersucht werden.

↓45

Abb. 6: Charakterisierung des 0,7 kb Promotors von POMP

Luciferase-Reportergen-Assay: Mit den drei POMP-Promotor Konstrukten wurde der Einfluss der 5`-UTR und der Minimalpromotor festgelegt. HeLa-Zellen wurden mit den Konstrukten 0,7 kb POMP Promotor mit 5`-UTR (Konstrukt 0,7 kb mit Kästchen (Exon1) vor der Luciferase Box), 0,7 kb POMP-Promotor ohne 5`-UTR (0,7 kb) und POMP-Promotor ohne die ersten 200 Basen vor dem ATG (0,7 kb –200) transfiziert. Die Luciferase-Aktivität wurde 24h nach der Transfektion im Zelllysat gemessen. Die Aktivität ist in RLU / s angegeben und wurde jeweils aus drei Proben gemittelt. Die Standardabweichung am rechten Ende des jeweiligen Balken angegeben. Als Kontrolle wurde der Leervektor (Vektor) ohne Promotor verwendet.

HeLa Zellen wurden mit den in Abb. 7 dargestellten Reportergenfusionen transfiziert und anschließend mit 200 U / ml Interferon γ behandelt.

Die Luciferase-Aktivität war bei Interferon γ-Stimulation (helle Balken) der Zellen für die drei unterschiedlich langen POMP Promotorbereiche reduziert im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle (dunkle Balken). Als Positivkontrolle wurde der als Interferon γ induzierbar beschriebene MECL-1-Promotor verwendet (Foss and Prydz, 1999). Die Aktivität des MECL-1-Promotors wurde bei Interferon γ-Zugabe ca. 4fach verstärkt. Wie diese Ergebnisse zeigen konnten, ist der POMP-Promotor nicht durch Interferon γ stimulierbar, sondern wird gegenüber der Kontrolle reprimiert.

↓46

Abb. 7: Interferon γ reprimiert die Aktivität des POMP- Promotors

Luciferase-Reportergen-Assay: HeLa-Zellen wurden mit drei POMP-Promotor Konstrukten unterschiedlicher Größe und der positiv Kontrolle (MECL) transfiziert (POMP Konstrukte siehe auch Abb. 5). Als positiv Kontrolle wurde der MECL-1-Promotor verwendet (Foss and Prydz, 1999). 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen für 24h mit 200 U/ml Interferon γ (IFN - helle Balken) oder ohne Interferon γ (Kontrolle - dunkle Balken) versetzt. Das Diagramm zeigt die gemessene Luciferase-Aktivität des Zelllysates. Die Werte wurden aus drei unterschiedlichen Proben gemittelt.

Aufgrund der Reportergen-Analysen ist die vermehrte Expression der mRNA von POMP in Abhängigkeit von Interferon γ nicht auf die Promotor-Aktivität zurückführen. Eine weitere Möglichkeit der Beeinflussung von Transkription kann auch durch Sequenzen in den Introns gewährleistet werden. So wurden zum Beispiel im Mimecan-Gen im ersten Intron zwei Sequenzen für funktionelle interferon-stimulated response elements (ISRE) gefunden, die die Transkription beeinflussen (Tasheva, 2002).

Mehrere putative γ-IRE (γ-Interferon response elements) cis-acting Bindungsstellen wurden innerhalb des ca. 3 kb großen Introns 1 des POMP Gens identifiziert. Um die Funktionalität dieser Elemente zu überprüfen, wurden mehrere Reportergenkonstrukte, die die Sequenz des Intron 1 enthalten generiert. Die Sequenz der kompletten Genregion des 0,7 kb großen Promotorfragmentes bis zum Exon 2 wurde hierfür verwendet. Mittels RT-PCR wurde getestet, ob das Intron 1 korrekt aus dem Konstrukt gespleißt wurde (s. Abb. 9b).

↓47

Abb. 8: Das Intron 1 des POMP Gens hat keinen Einfluss auf die γ Interferon Regulation

Luciferase-Reportergen-Assay: HeLa-Zellen wurden mit 0,7 kb großem POMP-Promotor (oberes Konstrukt; 0,7kb) und mit der Genregion von POMP (0,7 kb POMP-Promotor mit Intron 1, s. unteres Schema) transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen wie in Abb. 7 beschrieben behandelt. Das Diagramm zeigt die gemessene Luciferase-Aktivität des Zelllysates. Die Werte wurden aus drei unterschiedlichen Proben gemittelt.

Die Funktionalität des γ-IRE Elements konnte mittels Luciferase Aktivität nicht bestätigt werden. Denn die Luciferase-Aktivität des Konstruktes inklusive Intron 1 wurde in vergleichbarem Maße durch Interferon γ reprimiert, wie die Aktivität des Konstruktes ohne Intron 1 (s. Abb. 8).

Das erste Intron spielt also keine Rolle bei der Interferon γ-Stimulation. Da es aber bei Interferon γ-Stimulation zu einer vermehrten Bildung der POMP mRNA kommt, könnte dies auf eine posttranskriptionelle Kontrolle zurückzuführen sein.

↓48

Die mRNA POMP-L besteht zur Hälfte aus 3`-UTR (s. Abb. 3), was die Wahrscheinlichkeit auf stabilisierende Elemente auf der mRNA erhöht. Um die Funktion dieses großen Bereiches der mRNA zu untersuchen, wurden drei unterschiedliche Konstrukte generiert. Die 3`-UTR wurde aus dem Genom amplifiziert und in einen Vektor mit einem Cytomegalovirus-Promotor (CMV) ligiert. Der so entstandene DNA Bereich umfasste nun ein Luciferase-Gen unter Kontrolle eines CMV-Promotors (CMV + Luciferase + 3`-UTR in Abb. 9). Dieser Vektor wurde als Grundkonstrukt verwendet. Wie in Abbildung 8 dargestellt, wurden vier unterschiedliche Vektoren hergestellt. Drei davon enthielten die Sequenz des 3`-UTR-Bereich von POMP. Der CMV-Promotor wurde aus dem Vektor CMV + Luciferase + 3`-UTR entfernt und durch den 0,7 kb großen POMP-Promotor ersetzt (0,7kb + Luciferase + 3`-UTR; s. Abb. 9). Weiterhin wurde hinter den POMP-Promotor das erste Intron eingefügt, so dass der komplette Promotorbereich bis zur Region um Exon 2 auf diesem Vektor vorhanden war (0,7 kb + I1 + Luc + 3`-UTR; s. Abb. 9). Alle drei Konstrukte wurden wie zuvor beschrieben in HeLa Zellen transfiziert und die Zellen wurden anschließend für 24h mit je 200 U/ml Interferon γ behandelt (s. Abb. 9a). Als Kontrolle für die Interferon γ-Induktion dienten der Promotor von MECL-1 und das Konstrukt mit dem 0,7 kb POMP-Promotor allein (0,7kB; s. Abb. 9).

In Abb. 9a ist die Induktion des Reportergens relativ zur unstimulierten Kontrolle aufgezeigt. Die Balken resultieren aus dem Quotienten aus der Luciferase-Aktivität von stimulierten Zellen gegenüber der Luciferase-Aktivität unstimulierter Zellen. Bei allen angegebenen Konstrukten war die Luciferase-Aktivität in Anwesenheit von Interferon γ reduziert gegenüber der Kontrolle. Des weiteren wurde über RT-PCR nachgewiesen, dass das Intron 1 korrekt gespleißt und die 3`-UTR transkribiert wurde (s. Abb. 9b). Die erhöhte mRNA-Menge von POMP nach Interferon γ-Stimulation ließ sich aufgrund der Ergebnisse dieser Untersuchung nicht auf die Erhöhung der Transkriptionsinitiations-Rate zurückführen. Ein Einfluss der POMP-L mRNA-Form auf eine posttranskriptionelle Stabilisierung konnte ebenfalls ausgeschlossen werden.

Abb. 9: Die 3`-UTR der POMP-L mRNA zeigt keinen stabilisierenden Effekt nach Interferon γ-Stimulation

a) Luciferase-Reportergen-Assay: HeLa-Zellen wurden mit drei 3`-UTR POMP-Konstrukten transfiziert: 1. 3`-UTR mit CMV-Promotor (Lage der Komponenten im Schema CMV + Luciferase + 3`-UTR); 2. 3`-UTR mit 700 Basen großem POMP-Promotor ; 3. 3`-UTR mit Genregion 700 Basen POMP-Promotor und Intron 1. Als Kontrollen wurden der MECL-1-Promotor (Foss and Prydz, 1999) und der 700 Basen große POMP-Promotor ohne 3`-UTR transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen für 24h mit 200 U/ml Interferon γ oder ohne Interferon γ (Kontrolle) versetzt. Das Diagramm zeigt die relative Luciferase-Aktivität im Verhältnis zur Kontrolle.
b) RT-PCR: HeLa-Zellen wurden mit dem Konstrukt Nummer 3 aus Abb. 9a transfiziert. Nach 24 h wurde aus dem Zelllysat cDNA isoliert und anschließend als Template für die PCR mit folgenden Primern benutzt Primerpaar 1: Primer um Intron 1 (s. Schema neben dem Bild) Primerpaar 2: Primer in Luciferase – Gen und 3`-UTR von POMP-L. Als Positivkontrolle wurde das Konstrukt als Template mit dem Primerpaar 1 amplifiziert. Ungespleißt wird ein Amplifikat von ca. 3 kb Größe erlangt. Als Negativkontrolle wurde Wasser als Template verwendet (s. leer). Schematische Darstellung der Primerpositionen (Pfeile über der schematischen Darstellung des Konstruktes)

↓49

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die 0,6 kb große POMP-S-mRNA Variante stabilisiert wird. Daher wurde die mRNA Stabilität von POMP-S durch den RNA Polymerase II-Inhibitor α-Amanitin überprüft. HeLa Zellen wurden nach Stimulation mit Interferon γ für 4 Stunden mit diesem Hemmstoff behandelt und im Anschluss die Menge an POMP mRNA in Northern Blots verglichen (s. Abb. 10)

Abb. 10: POMP-S-mRNA wird durch Interferon γ Behandlung stabilisiert

Northern Blot: HeLa-Zellen wurden für 24 h mit 200 U / ml IFNγ behandelt (Spuren IFN und IFN / Ama) und anschließend zusätzlich für 6 h mit 2,5 µg / ml α-Amanitin (Spuren Amanitin und IFN / Ama). Die extrahierte RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. DIG-markierte POMP antisense RNA wurde als Sonde verwendet. Als Ladekontrolle wurde die mit Ethidiumbromid gefärbte 28S rRNA verwendet. Die Bezeichnungen der Spuren richten sich nach der Behandlung der Zellen.

In Abb. 10 wird der Einfluss Interferon γ auf POMP-S verdeutlicht. Die Interferon γ-Induktion der mRNA ließ sich nicht durch den Transkriptions-Hemmer α-Amanitin blockieren. Es wurde also hier nicht die Transkriptionsinitiationsrate erhöht, sondern die POMP-S-mRNA wurde stabilisiert. Als Kontrolle konnte gezeigt werden, dass α-Amanitin die Menge an Transkript ohne zusätzliche Stimulation durch Interferon γ tatsächlich reduziert (s. Spur: Amanitin in Abb. 10).

↓50

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die POMP Expression durch Interferon γ stimuliert wird. Dies konnte mittels Northern Blot-Analysen nachgewiesen werden (Burri, et al., 2000;Witt, et al., 2000). Luciferase Reportergen-Assays zeigten, dass diese Induktion nicht auf die Aktivität des Promotors zurückzuführen ist. Die beiden mRNA-Varianten POMP-L und POMP-S sind zwei unterschiedliche Transkripte von POMP, die sich nur in der Länge ihrer 3`-UTR unterscheiden. POMP-L wurde mittels Luciferase Reportergen-Analysen untersucht. Es konnten keine Effekte nach Interferon γ-Stimulation festgestellt werden. Daher wurde die Stabilität der POMP-S-mRNA im Northern Blot unter Einfluss von Interferon γ analysiert. In diesen Experimenten konnte die Stabilität dieser mRNA nachgewiesen werden. Demnach ist die Ursache der Erhöhung der mRNA Menge auf posttranskriptionelle Ereignisse von POMP-S zurückzuführen.

3.2 Konzertierte Transkript-Induktion proteasomaler Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren

Über die Gen-Regulation der proteasomalen Untereinheiten ist noch wenig bekannt. Es wurden schon mehrere Hinweise auf eine Regulation des Proteasoms beobachtet. So entdeckten Wojcik und DeMartino (2001), dass ein knock down von proteasomalen Untereinheiten durch RNA interference zu eine Hochregulation der nicht betroffenen Untereinheiten führt (Wojcik and DeMartino, 2001). In Rattenmuskeln wurde bei Diabetes eine höhere mRNA-Expression der proteasomalen Untereinheiten α2(C3), α3(C9) und β6(C5) gefunden (Price, et al., 1996). Außerdem induzieren synthetische Glucocorticoide proteasomale Untereinheiten wie α2(C3), während NF-κB die Untereinheit herunterreguliert (Du, et al., 2000). Aufgrund dieser Anhaltspunkte ist es wahrscheinlich, dass ein Regulationsmechanismus für das Proteasom existiert. Dieser sollte in den folgenden Experimenten untersucht werden.

3.2.1 Analyse der Genexpression durch real time RT-PCR

Meiners et al. entdeckten einen ersten Zusammenhang zwischen Inhibition des Proteasoms und der daraus resultierenden Hochregulation proteasomaler Untereinheiten mit kommerziell erhältlichen cDNA microarray. Diese wurde in Abhängigkeit von Proteasom-Inhibition mit clasto-Lactacystin und MG132 bei den proteasomalen Genen α2(PSMA2), α4(PSMA7), α6 (PSMA1), β1(PSMB6, β3(PSMB3), β4(PSMB2) und β7(PSMB4) ermittelt und durch Real time RT-PCR bestätigt. In Zusammenarbeit mit dieser Arbeitsgruppe sollte die Induktion der Untereinheiten genauer charakterisiert werden. Dazu wurden glatte Gefäßmuskelzellen der Ratte (VSMC, vascular smooth muscle cells) für jeweils 6 Stunden mit 10 µM clasto-Lactacystin, 10 µM MG132 oder 0,1 % DMSO als Kontrolle behandelt.

↓51

Tab. 2: Real time RT-PCR Analyse der Expression proteasomaler Gene nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

Relative RNA Expression

Gen / Untereinheit

clasto-Lactacystin

MG132

PSMA1 (α6 / C2)

3,8

3,4

PSMA2 (α2 / C3)

1,8

1,8

PSMA3 (α7 / C8)

2,4

2,5

PSMA4 (α3 / C9)

2,4

1,8 α-UE

PSMA5 (α5 / zeta)

4,0

3,9

PSMA6 (α1 / iota)

2,1

1,3

PSMA7 (α4 / XAPC7)

3,6

2,5

PSMB1 (β6 / C5)

1,8

1,9

PSMB2 (β4 / C7-1)

2,8

2,4

PSMB3 (β3 / C10)

3,1

3,4

PSMB4 (β7 / N3)

2,3

2,9 β-UE

PSMB5 (β5 / Mb1)

1,5

1,5

PSMB6 (β1 / δ)

2,5

2,6

PSMB7 (β2 / Z)

2,3

2,6

PSMB8 (ß5i / LMP7)

0,5

0,5

PSMB9 (β1i / LMP2)

1,2

1,2

PSMC1 (Rpt2 / S4)

2,1

1,3

PSMC2 (Rpt1 / S7)

2,1

1,9

PSMC3 (Rpt5 / S6a)

2,2

2,1

PSMC4 (Rpt3 / S6b)

2,9

2,7

PSMC5 (Rpt6 / S8)

3,3

2,2

PSMC6 (Rpt4 / S10b)

2,1

2,3 19S

PSMD1 (Rpn2 / S1)

2,4

1,6

PSMD3 (Rpn3 / S3)

3,6

3,7

PSMD4 (Rpn10 / S5a)

1,3

1,6

PSMD8 (Rpn12 / S14)

2,3

1,7

PSMD9 (Rpn12 / S15)

1,6

1,0

PSMD10 (Rpn12 / p28)

0,4

0,3

PSMD11 (Rpn6 / S9)

3

1,3

PSMD13 (Rpn13 / S11)

1,5

1,5

Ratten VSMCs wurden für 6 h mit 10 µM clasto-Lactacystin, 10 µM MG132 oder 0,1 % DMSO versetzt und die Expression der angegebenen proteasomalen Gene mittels real time RT-PCR analysiert. Die Werte beziehen sich auf die relative RNA-Expression von Zellen, die mit Proteasom-Inhibitor behandelten wurden, gegenüber DMSO behandelte Kontrollzellen (2-ct).
Es wurde die Gennamen-Nomenklatur verwendet. Durchgeführt von Meiners et al. Meiners et al. 2003

Die Tab. 2 zeigt die Veränderung der relativen mRNA-Menge unter Inhibitor-Einfluss im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Die konstitutiven Untereinheiten des 20S Proteasoms (PSMA1-PSMB7) wurden 1,5 bis 4fach induziert. Die Höhe der Induktion von clasto-Lactacystin und MG132 war vergleichbar. So wurde PSMA5 (α5) durch clasto-Lactacystin 4fach induziert und mit MG132 3,9fach, während PSMA6 (α1) 2,1fach durch clasto-Lactacystin aber nur 1,3fach durch MG132 induziert wurde. Generell werden aber sowohl alle konstitutiven 20S Untereinheiten als auch die für ATPase-Untereinheiten kodierenden Gene PSMC1 - PSMC6 hochreguliert. Bei den Nicht-ATPase-Untereinheiten ist diese gemeinsame Induktion nicht zu erkennen, wie ein Vergleich der Untereinheit PSMD3 (Rpn3) und PSMD10 (Rpn12) verdeutlicht. PSMD10 (Rpn12) wird unter Inhibitor-Einfluss deutlich geringer als die Kontrolle induziert, während PSMD3 (Rpn3) eine 3,6 - 3,7fache Hochregulation aufweist. Die Immunountereinheiten PSMB8 (LMP7) und PSMB9 (LMP2) wurden entweder herunterreguliert oder nur sehr mäßig induziert, was eine komplett unabhängige Regulationskontrolle für die Immunountereinheiten vermuten lässt.

Tab. 2 verdeutlicht, dass die Zelle auf Inhibition des Proteasoms mit konzertierter Induktion der proteasomalen mRNAs reagiert.

3.2.2 Die Induktion auf transkriptioneller Ebene

↓52

Die Ergebnisse der real time RT-PCR dienten dazu, einen Einblick in die Regulation der Genexpression des Mammalia-Proteasoms zu erhalten. Zum ersten Mal hatte man eine gemeinsame Induktion von proteasomalen Untereinheiten als Reaktion auf einen äußeren Reiz erkennen können, so dass eine gemeinschaftliche Regulation nahe liegt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden exemplarisch für das Proteasom drei Untereinheiten und der Maturierungsfaktor POMP für die nachfolgenden Experimente ausgewählt. Es wurden jeweils Antikörper oder Sonden von einer Untereinheit des 19S Regulators, Rpt1(S7), dem Maturierungsprotein POMP, einer α - Untereinheit α6(C2) und einer β-Untereinheit, β1(δ) verwendet. POMP wurde als Marker für die Biogenese des Proteasoms ausgewählt, die zusätzlich auch durch die β1(δ)-Proformanalysiert werden kann.

Um die Expression auf transkriptioneller Ebene zu überprüfen, wurde die mRNA-Menge der ausgewählten Gene nach Zugabe von Inhibitor analysiert. Dazu wurden VSMC wahlweise für 6 h mit 10 µM clasto-Lactacystin, 10 µM MG132, 10 µM unspezifischen Calpain-Inhibitor ALLM oder 0,1 % DMSO behandelt. Mit der extrahierten RNA wurde mittels Northern-Hybridisierung exemplarisch Rpt1(S7) mRNA nachgewiesen (s. Abb. 11). Rpt1(S7) wurde als Beispiel in den Northern Blot-Analysen verwendet, da diese ATPase-Untereinheit durchschnittliche Induktionswerte in der Real-time RT-PCR in Tab. 2 aufwies und der Northern Blot für diese Untereinheit etabliert war. Weitere Beispiele für Northern Blot-Analysen wurden von Meiners et al. veröffentlicht (Meiners, et al., 2003).

Abb. 11: Stimulation der RPT1(S7)-mRNA durch Proteasom-Inhibitoren

Northern Blot: VSMCs wurden für 6 h mit 10 µM clasto-Lactacystin (Spur: c-Lacta), 10 µM MG132 (Spur: Mg132), 10 µM ALLM (Spur: ALLM) oder 0,1 % DMSO (Spur: Kontrolle) behandelt. Die extrahierte Gesamt-RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran transferiert. Die geblottete RNA wurde dann mit DIG-markierter RNA-Sonde gegen Rpt1(S7) detektiert. Als Ladekontrolle diente die Ethidumbromid gefärbte rRNA.

↓53

Abb. 11 verdeutlicht, dass die Menge an Rpt1 (S7) mRNA in den beiden Kontrollspuren ALLM und Kontrolle nahezu identisch waren, während in den Spuren der mit Proteasom-Inhibitor behandelten Zellen die mRNA-Menge deutlich erhöht war. Die moderate 2,1fache Induktion von Rpt1(S7) der Real time RT-PCR (Tab. 2) konnte also auch im Northern Blot experimentell visualisiert werden.

Die Menge an mRNA kann entweder durch erhöhte Syntheserate oder durch verminderten Abbau der mRNA gesteigert werden. Um zu überprüfen, ob die Induktion nach Behandlung mit Proteasom-Inhibitor auf posttranskriptionelle Ereignisse zurückzuführen ist, wurden die VSMC nach 6h Inkubation mit MG132 für 16 h mit RNA Polymerase II-Inhibitor α-Amanitin versetzt. Bei einem stabilen Transkript sollte sich die Menge an mRNA nach Zugabe von α-Amanitin nicht verändern. Nach der Behandlung wurde die RNA präpariert und mittels Northern-Hybridisierung mit spezifischen Sonden Rpt1(S7) und POMP detektiert (s. Abb. 12).

Abb. 12: Induktion der mRNA von POMP und Rpt1(S7) nach Proteasom-Inhibitorbehandlung ist nicht auf eine Stabilisierung zurückzuführen

Northern Blot: VSMCs wurden für 6 h mit 10 µM MG132 (Spur: MG132) oder 0,1 % DMSO (Spur: Kontrolle) behandelt. Anschließend wurden die Zellen für 16 h mit 10 µg / ml α-Amanitin versetzt (+). Die extrahierte RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran transferiert. Die geblottete RNA wurde mit DIG-markierten RNA-Sonden gegen Rpt1(S7) und POMP detektiert. Als Ladekontrolle diente die Ethidumbromid angefärbte rRNA.

↓54

Das Signal nahm für beide mRNA´s im Falle von MG132 nach α-Amanitin Zugabe ab. Es ist davon auszugehen, dass die mRNA nicht stabilisiert wurde, sondern die Induktion auf eine gesteigerte Transkription zurückzuführen ist.

3.2.3 Induktion auf Proteinebene

Um zu zeigen, dass die mRNA-Induktion auch zu einer gesteigerten Tanslation führt wurden Western Blot-Analysen durchgeführt. Dazu wurden VSMC 8 Stunden mit je 10 μM der Proteasom-Inhibitoren c-Lactacystin oder MG132 inkubiert. Zur Kontrolle wurde das Lösungsmittel DMSO und der unspezifische Calpain-Inhibitor ALLM verwendet. Die Proteine wurden mit Rpt1(S7), α6(C2) und β1(δ) spezifischen Antiseren nachgewiesen (s. Abb. 13a). Die Wirksamkeit der proteasomalen Inhibitoren wurde durch den signifikanten Anstieg von ubiquitinierten Proteinen und HSP70 im Western Blot mit Zelllysat nachgewiesen. Ubiquitin und HSP70 werden nach Inhibition des Proteasoms entweder angestaut oder induziert, daher sind diese beiden Proteine als Marker für die Inhibition gut geeignet (Bush, et al., 1997;Kim, et al., 1999). Eine Hemmung des Proteasoms konnte zusätzlich durch die Messung der Chymotrypsin-ähnlichen proteolytischen Aktivität des Proteasoms im Zellextrakt gezeigt werden (s. Abb. 13b).

Abb. 13: Stimulation auf Proteinebene

Western Blot: VSMC wurden für 8h mit Inhibitoren behandelte und die Zellysate wurden im PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend erfolgte eine Western Blot-Analyse.
a) jeweils 10 µM clasto-Lactacystin (c-Lacta); 10 µM MG132, 10 µM ALLM oder 0,1 % DMSO (Kontrolle), detektiert mit angegebenen Antikörpern.
b) Kontrolle der Inhibition des Proteasoms durch Western Blot-Analysen von Ubiquitin-Konjugaten und HSP70. Chymotrypsin-ähnlicher Aktivitätstest wurde an Zelllysat durchgeführt.

↓55

In Abb. 13 ist der Induktions-Effekt bei Inhibitor-Zugabe auch auf Proteinebene zu erkennen. Rpt1(S7), α6(C2) und β1(δ) werden bei Inhibitor-Zugabe eindeutig stärker exprimiert als bei den Kontrollen. Für die β-Untereinheit β1(δ) ist die verstärkte Synthese hauptsächlich auf der Zunahme der Menge an Proprotein zurückzuführen.

Als Folge der Inhibition des Proteasoms wurde nicht nur die mRNA, sondern auch die Menge an Protein erhöht. Dies deutet darauf hin, dass die Inhibition des Proteasoms und der damit verbundene Anstieg der proteasomalen Untereinheiten auf Proteinebene nicht Folge einer Proteinakkumulation durch fehlenden Abbau ist sondern auf Neusynthese des Proteasoms beruht. Um diese de novo Synthese des Proteasoms nachzuweisen, wurden VSMC mit den Inhibitoren behandelt und anschließend metabolisch mit 35S-Methionin markiert. Mit einem 20S-Antikörper wurde das 20S Proteasom präzipitiert und in einer denaturierenden PAGE nach Größe getrennt (s. Abb. 14).

Abb. 14: de novo Synthese von Proteasom nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

Immunpräzipitation des 20S Proteasom aus mit 35S-Methionin markierter Zellen mit einem Antikörper gegen 20S Proteasom (K08)
a) VSMC wurden jeweils für 8h mit 10 µM clasto-Lactacystin ; 10 µM MG132, 10 µM ALLM oder 0,1 % DMSO (Kontrolle) behandelt und anschließend für 16h mit 35S-Methionin metabolisch markiert. Aus dem markierten Zelllysat wurde 20S Proteasom mit einem Antikörper gegen das 20S Proteasom immunpräzipitiert. Es wurden identische Mengen des 35S-Methionin markierter Zelllysates in SDS-PAGE aufgetrennt und die radioaktiven Signale detektiert.
b) Konzentrationsreihe MG132: VSMC wurden jeweils für 8h mit den sngegebenen Konzentrationen von MG132 oder 0,1 % DMSO (Kontrolle) behandelt und anschließend für 16h mit 35S-Methionin metabolisch markiert. Aus dem markierten Zelllysat wurde 20S Proteasom mit einem Antikörper gegen das 20S Proteasom immunpräzipitiert. Es wurden identische Mengen des 35S-Methionin markierter Zelllysates in SDS-PAGE aufgetrennt und die radioaktiven Signale detektiert.

↓56

In Abb. 14 sind die autoradiographisch detektierten Banden des präzipitierten Proteasoms zu sehen. Es zeigt das typische Proteasom-Bandenmuster, welches in einer Größe zwischen 22 und 32 kDa in einer SDS-PAGE migriert. Es ist ein deutlicher Anstieg der Signalintensität der mit Proteasom-Inhibitor behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle zu erkennen. Es ist daher davon auszugehen, dass die Zellen auf Verlust der proteasomalen Aktivität durch Proteasom-Inhibition mit einer de novo Synthese der proteasomalen Untereinheiten reagieren. Diese gesteigerte Expression ist von der Konzentration des Inhibitors abhängig, wie in Abb. 14b gezeigt.

3.2.4 Beeinflussung der POMP Expression und der Proteasom Biogenese durch Inhibition des Proteasoms

Proteasom-Inhibitoren induzieren folglich eine erhöhte Translation von proteasomalen Untereinheiten. Diese Neusynthese von proteasomalen Untereinheiten führt vermutlich über den Biogeneseweg zu reifem 20S Proteasom. Diese Vermutung wird gestützt von der Tatsache, dass vermehrt 20S Proteasom aus metabolisch markierten Zelllysaten präzipitiert werden konnte, von Zellen die vorher mit Proteasom-Inhibitoren behandelt wurden. Reifes 20S Proteasom wird nur über den Biogeneseweg neu gebildet. Die Situation des 26S Proteasoms wird in nachfolgenden Experimenten aufgeklärt. Zunächst wurde der Biogeneseweg untersucht

Um die Ergebnisse der Immunpräzipitation zu verifizieren und die Biogenese des Proteasoms näher zu analysieren, wurde das Maturierungsprotein POMP untersucht. Dazu wurden VSMC Zellen für die Northern Blot-Analysen 6 h oder für die Western Blot-Analysen 8 h mit 10 µM clasto-Lactacystin, 10 µM MG132, 10 µM des unspezifischen Inhibitors ALLM oder 0,1 % der Negativkontrolle DMSO behandelt. Es zeigte sich, dass POMP sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene durch die Zugabe von MG132 und clasto-Lactacysin hochreguliert wird (s.

↓57

Abb. 15).

POMP ist bekannt als Assemblierungsfaktor, der als erstes Substrat des Proteasoms abgebaut wird. Dieses Protein begleitet den Biogeneseweg des Proteasoms und ist Teil des Precursor-Komplexes. Ausgehend von der Annahme, dass das Proteasom durch de novo Synthese mit vollständiger Biogenese nach Inhibitorbehandlung neu gebildet wird, müsste POMP als Assemblierungsfaktor verstärkt in den Pr e cursor-Komplexen zu finden sein.

Abb. 15: Induktion von POMP durch Proteasom-Inhibitoren auf mRNA- und Proteinebene

Western Blot und Northern Blot: VSMCs wurden für die Northern Blot-Analysen 6 h und für die Western Blot-Analysen 8 h mit 10 µM clasto-Lactacystin (Spur: c-Lacta), 10 µM MG132 (Spur: Mg132), 10 µM ALLM (Spur: ALLM) oder 0,1 % DMSO (Spur: Kontrolle) behandelt. Das Zelllysat wurde für den Western Blot im SDS-PAGE aufgetrennt und mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern POMP detektiert. Für den Northern Blot wurde Gesamt-RNA aus den Zellen extrahiert und elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde anschließend auf eine Nylonmembran transferiert und mittels DIG-markierter RNA-Sonde detektiert. Als Ladekontrolle für den Northern Blot diente die mit Ethidiumbromid gefärbte 28S rRNA. Sowohl die Proteinmenge, als auch die mRNA-Menge ist deutlich erhöht in den Spuren der mit Proteasom-Inhibitor behandelten Zellen.

↓58

In 20S Proteasom-Komplexen ist POMP nicht zu detektieren, da POMP durch das reife 20S Proteasom abgebaut wird. Daher wurden Precursor-Komplexe aus VSMC-Zelllysat immunpräzipitiert, welches aus Zellen stammt, die 6h mit Protesom-Inhibitoren behandelten wurden und metabolisch radioaktiv markiert wurden (s. Abb. 16). Die Präzipitation wurde mit dem Antikörper C8 durchgeführt, der spezifisch Precursor-Konformationen erkennt (Antikörper aus (Nandi, et al., 1997). Aus den mit clasto-Lactacystin und MG132 behandelten Zellen wurden im Vergleich zu den Kontrollen, die mit DMSO und ALLM behandelt wurden, sowohl signifikant mehr POMP, als auch Proteasom Precursor-Komplexe präzipitiert.

Proteasom-Inhibition führt zu einer Zunahme der mRNA und des Proteins von POMP. Darüber hinaus konnte nach Inhibition des Proteasoms vermehrt mit POMP assoziierte Precursor-Komplexe immunpräzipitiert werden. Vermutlich kommt es tatsächlich zu einer gesteigerten Biogenese, was nach dem Nachweis einer größeren Menge an Precursor-Komplexen, verursacht durch die Inhibition des Proteasoms, wahrscheinlich wird. Dies sollte durch weitere Experimente belegt werden, welche die Biogenese des Proteasoms unter Inhibitoreinfluss zeigen.

Abb. 16: Induktion von POMP und Proteasom Precursor-Komplexen nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

VSMC wurden jeweils für 8h mit 10 µM clasto-Lactacystin (c-Lacta); 10 µM MG132, 10 µM ALLM oder 0,1 % DMSO (Kontrolle) behandelt und anschließend für 16h mit 35S-Methionin markiert. Aus dem markierten Zelllysat wurden Precursor-Komplexe mit C8-Antikörper immunpräzipitiert und identische Mengen an radioaktiven Zelllysat durch SDS-PAGE getrennt und die radioaktiven Signale detektiert. Die POMP-Bande ist mit einem Pfeil gekennzeichnet und wurde densitometrisch gemessen (s. Diagramm). Die Balken geben die relative Menge an POMP im Vergleich zu der Kontrolle an.

↓59

In den verschiedenen Stadien der Biogenese des Proteasoms entstehen Zwischenstadien unterschiedlicher Größe. Um die Verteilung dieser Zwischenstadien nachzuweisen ist eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt worden. Proteine und Komplexe trennen sich nach ihrer Größe und lassen sich dadurch besonders gut unterscheiden. Dies würde Aussagen über die verschiedenen Stadien der Proteasom-Biogenese zulassen, die sich durch unterschiedlich große Komplexe charakterisieren lassen. Dazu wurden VSMC für 8h mit 10 µM claso-Lactacystin oder 0,1 % DMSO behandelt. Von den Zellen wurde Gesamtzelllysat präpariert und gleiche Proteinmengen in einer Dichtegradientenzentrifugation getrennt und fraktioniert. Anschließend wurden die einzelnen Fraktionen im Western Blot mit spezifischen Antiseren gegen Rpt1(S7), β1(δ), POMP und gegen das 20S Proteasom analysiert (s. Abb. 17).

Abb. 17: Gesteigerte Expression proteasomaler Untereinheiten und POMP nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

Saccharose-Dichtegradient: VSMC wurden für 8 h mit 10 µM clasto-Lactacystin oder 0,1 % DMSO behandelt. Das Zelllysat wurde über einen Dichtegradienten sedimentiert und fraktioniert (beginnend bei 40% Saccharosekonzentration). Gleiche Volumina der Fraktionen wurde über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Antikörpern gegen 20S Proteasom (Proteasom), β1(δ) und POMP detektiert. Die Pfeile markieren die Signale der Proteine. Die Fraktionen in denen üblicherweise 26S, 20S und Precursor Proteasom migrieren, sind markiert. Es ist ein deutlicher Unterschied in der Menge an Precursor-Proteasom als auch 20S und 26S Proteasom zu erkennen. Mit Proteasom-Inhibitor wurde die Expression der proteasomalen Untereinheiten stimuliert.

Die proteasomale Verteilung in einem Saccharosegradienten ist in Abb. 17 dargestellt. In den Fraktionen höherer Dichte (#3-9) findet man große Komplexe wie das 26S Proteasom. Hier waren auch Signale der „reifen“ proteasomalen Untereinheiten zu detektieren. Der 20S Komplex findet sich in den Fraktionen 10-13 wieder. Die Fraktionen geringerer Dichte führen somit kleinere Komplexe wie die Precursor-Komplexe bis hin zu den freien Untereinheiten.

↓60

In den Fraktionen 16-23 sind deutliche Unterschiede der β1(δ) Signale zu erkennen. Es ist im Unterschied zur DMSO Kontrolle deutlich mehr β1(δ)-Proform detektierbar (# 16-23). Außerdem wurde mehr POMP in diesen Fraktionen nachgewiesen. Das Signal der reifen Proteasom-Untereinheiten sowie 20S Proteasom und Rpt1(S7) war bei Zugabe von clasto-Lactacystin verstärkt in den hochmolekularen Fraktionen des Gradienten zu bestimmen. Dies lässt vermuten, dass mehr 26S Proteasom in den Zellen vorhanden war.

Zusammenfassend führt Proteasom-Inhibition zu einer vermehrten de novo Synthese von POMP und von Proteasom-Precursor-Komplexen. Dies wurde durch metabolische Markierung von neu synthetisierten Proteinen gezeigt. Dieser Pr e cursor-Anstieg mündet in einer gesteigerten Protesom-Biogenese mit einer signifikant größeren Menge an 20S und 26S Proteasom.

3.2.5 β1(δ)-Promotor-Analysen durch Reportergenfusion

In Hefe werden alle proteasomalen Untereinheiten durch den Transkriptionsfaktor Rpn4 reguliert (Mannhaupt, et al., 1999). Dieser Faktor wird proteasomal abgebaut, so dass die Menge an exprimiertem Proteasom durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus steuerbar ist (Xie and Varshavsky, 2001). Ein solcher Mechanismus könnte durchaus auch bei Mammalia von Bedeutung sein, da die mRNA nicht stabilisiert wird. Es konnte bisher allerdings weder ein PACE-Element noch ein dem Rpn4 homologes Protein gefunden werden. Deshalb ist davon auszugehen, dass einer oder mehrere Faktoren die Steuerung der Expression beeinflussen könnten.

↓61

β1(δ) zeigt eine durchschnittlich 2,5fache Induktion der Genexpression als Antwort auf Hemmung des Proteasoms und wurde deshalb für Promotorstudien ausgewählt. Die Auswahl eines Gens, welches zu weit vom Durchschnitt abweicht wurde nicht verwendet, da nach einem Regulationsmechanismus für das gesamte Proteasom gesucht wird.

Grundlage für das Primerdesign war der genomische NCBI-Datenbankeintrag mit der Accession Nummer AC027820. Zur Gewinnung der regulatorischen Region des β1(δ)-Gens wurde 1,5 kb in 5’ Richtung (gerechnet vom Transkriptionsstartpunkt) aus der genomischen DNA von HeLa Zellen amplifiziert und in den Vektor pCR2.1 TOPO (Invitrogen) ligiert. Das Fragment wurde anschließend mit den Restriktionsendonukleasen SacI und XhoI behandelt und mit dem Vektor pCAT3basic (Promega) fusioniert. Der Vektor trägt Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) als Reportergen, welches durch einen ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) detektiert werden kann. Der Grund für die Verwendung des CAT-Systems anstelle der Luciferase ist deren Sensitivität gegen Proteasom-Inhibitoren (Deroo and Archer, 2002). Die Aktivität der Luciferase wird durch Proteasom-Inhibitoren gehemmt, so dass dieses System für die Zwecke dieser Arbeit nicht zu verwenden ist. Zunächst wurde die Promotor-Aktivität in HeLa-Zellen nachgewiesen. Durch die gesteigerte CAT-Menge im Vergleich zur Kontrolle konnte eindeutig eine Promotor-Aktivität nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Für die angestrebte Analyse waren HeLa-Zellen nicht geeignet, da schnell wachsende Krebszelllinien nicht den Effekt der Induzierbarkeit von proteasomalen Untereinheiten zeigen konnten (Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe). Die verwendete immortalisierte HUVEC-Zelllinie (Edgell, et al., 1983) ist ebenfalls eine permanente Zelllinie, besitzt aber die gleichen langsamen Wachstumseigenschaften, wie eine primäre Zelllinie und ist daher besser für die Experimente geeignet.

↓62

HUVEC Zellen wurden mit dem 1,5 kb großen Promotor-Konstrukt transfiziert und mit verschiedenen Konzentrationen des Proteasom-Inhibitors MG132 behandelt. Es wurde nun nur der Inhibitor MG132 verwendet, da MG132 für das CAT-Reportergen-System schon beschrieben ist (Deroo and Archer, 2002). Der CAT-Reportergen-Assay läuft nach folgendem Prinzip: Das Gen der CAT ist in dem Vektor kodiert. Die multiple Klonierungsstelle liegt so, dass das eingefügte DNA-Fragment der CAT als Promotor dienen kann. Somit wird die CAT in Abhängigkeit des Promotors exprimiert und die CAT-Proteinmenge wird mittels des CAT-ELISA bestimmt. Die CAT-Menge ist mit der Aktivität des Promotors direkt korreliert. Das System wurde für den Promotorbereich von β1(δ) genutzt. Um die Promotor-Aktivität in Abhängigkeit der zugesetzten Konzentration des Proteasom-Inhibitors zu bestimmen, wurde eine Konzentrationsreihe von 0,01 µM bis 0,1µM MG132 für 16 h etabliert. Bei einer Konzentration von 0,1 µM MG132 für 16 h war die Aktivität am größten (s. Abb. 18).

Abb. 18: Die gesteigerte Promotor-Aktivität nach Proteasom-Inhibitor Behandlung ist konzentrationsabhängig

CAT-ELISA: HUVEC wurden mit dem 1,5 kb großen β1(δ)-Promotor Konstrukt transfiziert und für 16 h mit der angegebenen Konzentration an MG132 (MG) behandelt. Anschließend wurde die CAT-Menge im Photometer mit der Wellenlänge 405 nm gemessen und gegen die DMSO Kontrolle normiert. Die CAT-Menge stieg linear mit der Konzentration von MG132 an. Die größte Promotor-Aktivität konnte mit einer Konzentration von 0,1 µM MG132 gemessen werden.

Bei dieser Konzentration war die detektierte Menge der CAT mehr als doppelt so hoch als die der DMSO-Kontrolle. Hiermit konnte also gezeigt werden, dass Inhibitoren des Proteasoms einen Einfluss auf die Promotor-Aktivität der Untereinheit β1(δ) ausüben. Die Induktion des β1(δ)-Gens kann daher auf eine erhöhte Promotor-Aktivität zurückgeführt werden.

↓63

Der 1,5 kb große β1(δ)-Promotor-Bereich muss Sequenzen enthalten, die als Bindestelle für einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren dienen. Diese spielen wahrscheinlich bei der Genregulation durch Proteasom-Inhibitoren eine wichtige Rolle. Um die Region, in der die Bindungsstellen liegen, einzuschränken, wurde der 1,5 kb große β1(δ)-Promotor sukzessive verkürzt. Das 1,5 kb große Konstrukt wurde liniarisiert und unter Ausnutzung der Exonuklease III-Aktivität verkürzte Promotoren erzeugt. Die entstandenen Verkürzungsklone sind in Abb. 19 zusammengefasst.

Die HUVEC-Zellen wurden mit den in Abb. 19 schematisch dargestellten Plasmiden transfiziert. Die CAT-Menge und damit die β1(δ)-Promotor-Aktivität wurde nach 16 Stunden Inkubation mit 0,1 µM MG132 im Vergleich zur DMSO-Kontrolle gemessen. Als Negativkontrolle diente der MECL-1-Promotor, der ebenfalls in den Vektor pCAT3basic kloniert wurde (s. MECL-1 in Abb. 19). Der MECL-1-Promotor wurde als Kontrolle verwendet, da die Immunountereinheiten nicht durch Inhibition des Proteasoms induziert werden. Somit ist zu erwarten, dass der Promotor von MECL-1 nicht aktiviert wird. Es wurden β1(δ)-Promotor-Fragmente mit den Größen 1500 bp, 400 bp, 200 bp 130 bp, 100 bp und 40 bp in 5´ Richtung des Gens eingesetzt (s. Abb. 19). Die CAT-Menge wurde jeweils in Zelllysaten gemessen, die aus MG132-behandelten (dunkler Balken) oder DMSO-behandelten (heller Balken) Zellen extrahiert wurden. Bei den Konstrukten von 1500 bp bis 130 bp Länge konnte eine stärkere Promotor-Aktivität der MG132-Proben im Vergleich zur Kontrolle (DMSO) gemessen werden. Bei den kleineren Promotorfragmenten (100 und 40 bp) konnte keine Promotor-Aktivität mehr gemessen werden. Dies ist daran zu erkennen, dass die exprimierte CAT-Menge im Bereich der Negativkontrolle lag (s. Vektorkontrolle Abb. 19). Das bedeutet, dass innerhalb der 130 bp Sequenz eine oder mehrere Bindungsstellen für die regulatorischen Faktoren zu finden sind, da das 130 bp lange Sequenz des Promotors eindeutig induzierbar ist.

Abb. 19: Untersuchung einzelner Abschnitte der Promotorregion des β1(δ)-Gens unter dem Einfluss von Proteasom-Inhibitor

CAT-ELISA: HUVEC wurden mit den Exonuklease-Konstrukten angegebener Größe (vom Translationsstartpunkt aus gesehen) transfiziert. Die CAT-Menge wurde gemessen nach 16 h 0,1 µM MG132 (weiße Balken) oder 0,1 % DMSO (Kontrolle; dunkle Balken) Behandlung im Photometer bei 405nm. MECL-1-Promotor und Leervektor (CAT) dienten als Kontrolle.

↓64

Die MECL-1-Promotorkontrolle zeigte erwartungsgemäß keine Induktion bei MG132-Zugabe.

In einer kürzlich veröffentlichten Untersuchung wurde ein so genanntes Antioxidant Response Element (ARE) in den Promotorregionen proteasomaler Untereinheiten der Maus entdeckt (Kwak, et al., 2003). Nach oxidaktivem Stress bindet der Transkriptionsfaktor Nrf2 an das ARE der proteasomalen Untereinheiten. In einer hier durchgeführten Analyse konnte die Konsensus-Sequenz dieses Elementes auch im humanen β1(δ)-Promotorbereich gefunden werden. Damit ist ein potentieller Kandidat eines gemeinsamen Regulators der proteasomalen Genexpression gefunden.

3.2.6  Heat Shock Element und Antioxidanz Response Element

Für die nähere Untersuchung des β1(δ)-Promotors wurde die Sequenz auf mögliche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren mittels des Programms TESS (http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess?RQ=NBss) untersucht (s. Abb. 20).

↓65

Abb. 20: Räumliche Verteilung der putativen regulatorischen Elemente im 5` Bereich des β1 (δ)-Gens

Die Promotorsequenz von ß1(δ) ist hier 130 bp vom Translationsstartpunkt aus angegeben. Die putativen Bindungsstellen Heat Shock Element (HSE) und Antioxidant response element (ARE) sind unterstrichen und in fetten Buchstaben hervorgehoben. +1 gibt den Transkriptionsstartpunkt an.

Putative Consensus Sequenzen für die Transkriptionsfaktoren Heat shock transcription factor 1 (HSTF1), der an HSE bindet und Nrf2, der mit ARE interagiert wurden festgestellt. Der Transkriptionsfaktor HSTF1 ist ein Hitzeschock-Transkriptionsfaktor, der auch bei proteasomaler Inhibition induziert wird und unter anderen das Hitzeschock Protein Hsp70 hochreguliert (Kawazoe, et al., 1998;Kim, et al., 1999;Lee and Goldberg, 1998). Nrf2 ist dafür bekannt, bei oxidativen Stress antioxidative Protein-Expression zu kontrollieren. Die möglichen Bindestelle für HSTF1, Heat shock element (HSE), liegt im Bereich zwischen 130 bp und 100 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt, während die Zielsequenz für Nrf2 (TGACnnnGC; (Li and Jaiswal, 1992) 6 Basen vor dem Transkriptionsstartpunkt des β1(δ) Gens liegt (s. Abb. 20). Tab. 3 zeigt die Verteilung von den Elementen ARE und HSE in den 5` Regionen verschiedener proteasomaler Untereinheiten.

Tab. 3: Vorkommen der Bindesequenzen HSE und ARE im 5’ Bereich der angegeben proteasomalen Gene

Proteasom Unterei n heit

ARE

HSE

PSMA1 (α6 / C2)

-

-

PSMA2 (α2 / C3)

1x (-800)

1x (-70)

PSMA3 (α7 / C8)

1x

-

PSMA4 (α3 / C9)

  

PSMA5 (α5 / zeta)

1x(-500)

-

PSMA6 (α1 / iota)

  

PSMA7 (α4 / XAPC7)

3 x ; (1 x ca.-50)

-

PSMB1 (β6 / C5)

1x (–800)

-

PSMB2 (β4 / C7-1)

  

PSMB3 (β3 / C10)

1x (-500)

-

PSMB4 (β7 / N3)

1x(-300)

-

PSMB5 (β5 / Mb1)

-

-

PSMB6 (β1 / δ)

1x (–30)

1x(-120)

PSMB7 (β2 / Z)

1 x ; (-800)

-

PSMC4 (Rpt3 / S6b)

1 x; (-300)

-

PSMC5 (Rpt6 / S8)

-

-

PSMD1 (Rpn2 / S1)

1 x: (-150)

-

PSMD3 (Rpn3 / S3)

2x

-

PSMD11 (Rpn6 / S9)

-

-

Die Sequenz jeweils 1 kb in 5`-Richtung des Translationsstartpunkt der proteasomalen Gene wurde auf die Consensus-Sequenz der jeweiligen cis-acting Elemente untersucht. Die Anzahl der gefundenen übereinstimmenden Sequenzen wurde angegeben. Die Zahlen in Klammern geben den Abstand zum Translationsstartpunkt an.

↓66

Zur näheren Analyse der putativen Bindungsstellen wurde ein electrophoretic mobility shift assay (EMSA) durchgeführt. Je 20 bp lange sense und antisense Oligonukleotide mit den entsprechenden Zielsequenzen wurden miteinander hybridisiert und zu je 300 µM im EMSA eingesetzt. Die Oligonukleotide waren am 5` Ende mit dem Farbstoff Cyanin5 (Cy5) gekoppelt, so dass sie im Fluoroimager detektierbar waren. Die doppelsträngigen Oligonukleotide wurden mit Kernextrakten aus den Zellinien HUVEC und HeLa inkubiert und anschließend durch eine nicht denaturierende PAGE der Größe nach aufgetrennt. Oligonukleotide, die mit Kernproteinen komplexieren, migrieren in einem nativen PAA-Gel im höhermolekularen Bereich und lassen sich gut von den ungebundenen Oligonukleotiden trennen. Vor Isolation der Kernextrakte aus den Zellen, wurden diese mit MG132 oder DMSO behandelt. Waren die Banden der Komplexe aus Oligonukleotid und Protein nach Inhibitor-Behandlung stärker, konnte eine Aussage über das verstärkte Auftreten des entsprechenden Transkriptionsfaktors getroffen werden.

Im Falle des Oligonukleotids mit der Zielsequenz des ARE konnte man keine Unterschiede erkennen (s. Abb. 21).

Von beiden Transkriptionsfaktoren HSTF1 und Nrf2 ist bekannt, dass sie bei proteasomaler Inhibition induziert werden, so dass deren Proteinmenge als Kontrolle der proteasomalen Inhibition dienen kann (Itoh, et al., 2003;Kawazoe, et al., 1998;Kim, et al., 1999;McMahon, et al., 2003;Sekhar, et al., 2002;Stewart, et al., 2003). Die in Abb. 21b detektierten Signale der Proteine HSTF1 und Nrf2 sind nach der Behandlung deutlich hochreguliert. Die Inhibition des Proteasoms wurde dadurch indirekt nachgewiesen.

↓67

Abb. 21: Bindung von Kernproteinen an die Elemente HSE und ARE

EMSA: HUVEC-Zellen wurden für 6 h oder 16h mit 1µM MG132 behandelt. Aus den Zellen wurden Kern- und cytoplasmatische- Proteine extrahiert. Anschließend wurden Cy5 markierte Oligonukleotide der β1(δ)-HSE bzw. ARE für 30 Minuten bei 25° C mit jeweils 10 µg Kernextrakt inkubiert. Darauf folgend wurde der Ansatz durch eine nicht denaturierende PAGE aufgetrennt. Die Signale von Cy5 wurden mit dem Fluoroimager detektiert.
a) Die Zellen wurden für 16 h oder 6 h mit 1 µM MG132 (+) oder mit 0,1 % DMSO (-) behandelt. B = BSA Kontrolle, statt Kernextrakt wurde 10 µg BSA verwendet; C= cytoplasmatisch, statt Kernextrakt wurde Cytoplasmaextrakt verwendet
b) Indirekte Kontrolle der Proteasom-Inhibition durch den Nachweis der Proteine HSTF1 und Nrf2 in Western Blot-Analysen; HUVEC wurden für 6h mit 1µM MG132 (+) und 0,1% DMSO (-) behandelt und das Zelllysat im Western Blot mit angegebenen Antikörpern detektiert

Durch eine Veränderung im Laufverhalten der Oligonukleotide in der PAGE konnte gezeigt werden, dass die doppelsträngigen Oligonukleotiden HSE und ARE mit Kernproteinen interagieren (s. Abb. 21a). Durch dieses Ergebnis konnte aber keine Aussage darüber getroffen werden, ob es sich bei den Kernproteinen um spezifische Transkriptionsfaktoren handelt. Der Nachweis für die Spezifität der Bindung sollte durch einen Kompetitions-Assay erbracht werden. Bei diesem Versuch, konkurrieren CY5 markierte Oligonukleotide mit unmarkierten Oligonukleotiden um die Bindung mit den Kernproteinen. Die unmarkierten Oligonukleotide sind nicht zu detektieren. Konkurrieren die Oligonukleotide um dasselbe Protein, würde die Signalstärke der markierten Oligonukleotide abnehmen, da das unmarkierte Oligonukleotid im Überschuss eingesetzt wurde und so statistisch mehr Protein mit dem nicht detektierbaren Oligonukleotid interagiert. Die Spezifität der Bindung weist man dadurch nach, dass ein unmarkiertes Oligonukleotid der gleichen Sequenz des markierten Oligonukleotids die Bindung des markierten Oligonukleotids abschwächt, während ein unmarkiertes Oligonukleotid einer anderen Sequenz diesen Effekt nicht erzielen sollte. Diese Untersuchung der Bindungsspezifität wurde mit HeLa Kernextrakt durchgeführt. In Abb. 22 ist ein EMSA mit den Oligonukleotiden der Bindesequenz des β1(δ) HSE und ARE dargestellt. In den mit (–) gekennzeichneten Spuren wurden die Oligonukleotide mit Kernextrakt von HeLa für 30 Minuten bei 25° C inkubiert. In den Spuren, die mit (+) gekennzeichnet sind, wurden die Proben zusätzlich noch mit einem 10fachen Überschuss an Oligonukleotiden derselben Sequenz inkubiert, während in den mit (U) markierten Spuren unmarkierte Oligonukleotide einer anderen Sequenz dazugegeben wurden (s. Abb. 22).

Abb. 22: Spezifitätsuntersuchung der Transkriptionsfaktorbindungen an regulatorischen Elementen des β1(δ)-Promotors

Kompetetiver EMSA: CY5 markierte doppelsträngige Oligonukleotide (ARE und HSE) wurden mit je 10 µg HeLa Kernextrakt inkubiert. Den markierten Oligonukleotiden wurden spezifische unmarkierte Oligonukleotide in den mit (+) gekennzeichneten Fraktionen in 10-fachem Überschuss zugegeben. In den mit (U) gekennzeichneten Fraktionen wurden unspezifische Kompetitions-Oligos zugegeben. (B) kennzeichnet die Negativkontrolle, die nur mit BSA behandelt wurde.

↓68

Bei beiden Elementen (HSE und ARE) waren Komplexbildungen mit Proteinen des Kernextraktes durch höhermolekulare Migration (Shift) in dem Gel zu erkennen. Im Falle der HSE–Box verschwand der Shift nach Zugabe der Kompetitionsoligonukleotide, und zwar sowohl bei der spezifischen als auch bei der unspezifischen Sequenz. Im Falle der ARE-Sequenz ließ sich die Bindung nur durch die spezifischen Oligonukleotide verdrängen. Daher kann man vermuten, dass die Sequenz der ARE–Box aus dem β1(δ)-Promotor spezifisch an den Faktor Nrf2 gebunden hatte, während die Bindung der Kernproteine an HSE als unspezifisch einzustufen ist.

Das HSE wurde außerdem auf Funktionalität und Bindungsspezifität untersucht. Bei der Funktionalitätsuntersuchung wurde das 130 bp-Promotorelement, welches das HSE beinhaltet, unter Hitzeschock-Bedingungen getestet. Der Promotorbereich mit dem Reportergen wurde in HUVEC transfiziert und anschließend einem Hitzeschock von 42° C über eine Stunde ausgesetzt. Das Konstrukt MECL-1-Promotor wurde als Negativkontrolle ausgewählt, da innerhalb der Promotorsequenz kein HSE identifiziert werden konnte und daher davon auszugehen ist, dass dieses Konstrukt keine Reaktion auf den Hitzeschock zeigt.

Abb. 23: Funktionalitätstest von HSE im 130 bp β1(δ)-Promotor

a) CAT-ELISA: HUVEC wurden mit dem 130 bp großem β1(δ)-Promotor-Reportergen Konstrukt (130 bp) transfiziert. Anschließend wurden die Zellen für eine Stunde bei 42° C inkubiert und dann 2 Stunden zur Erholung bei 37° C belassen. Im Zelllysat wurde die CAT-Menge bestimmt und im Diagramm dargestellt (Hitzeschock = helle Balken; Kontrolle = dunkle Balken). Das HSE ist in der schematischen Darstellung der Konstrukte als Raute dargestellt. Zur Kontrolle wurden der Leervektor (Vektor) und der MECL-1-Promotor transfiziert und analysiert.
b) Kontrolle des Hitzeschocks: HUVEC-Zellen wurden wie in a) beschrieben einem Hitzeschock unterzogen und anschließend wurde im Zelllysat mittels Western Blot-Analysen Hsp70 nachgewiesen.

↓69

Wie in Abb. 23 dargestellt ist, nahm die CAT-Menge und somit die Promotor-Aktivität, sowohl von dem β1(δ)-Promotor, als auch von der Negativkontrolle MECL-1-Promotor ab. Obwohl ein Hitzeschock stattgefunden hatte (s. Abb. 23b), wurde der β1(δ)-Promotor demzufolge nicht induziert. Die verringerte CAT-Menge ist vermutlich auf die denaturierende Wirkung des Hitzeschocks zurückzuführen, die das CAT-Protein beeinträchtigt haben könnte. Die gemessene CAT-Menge war gegenüber der MECL-1 Kontrolle nicht verändert, so dass davon auszugehen ist, dass das HSE nicht funktional ist. (s. Abb. 23). Ausgehend von den Hitzeschock Daten war zu erwarten, dass die Bindung des HSTF an dem Element des β1(δ)-Promotors unspezifisch war. Dies bestätigt auch den Kompetitions-Test durch EMSA-Untersuchungen. In Abb. 22 erkennt man, dass sich das Signal sowohl von dem spezifischen als auch von dem unspezifischen Oligonukleotid unterdrücken lässt. Dieses putative heat shock element ist demzufolge nicht funktional.

Es konnte gezeigt werden, dass bei Behandlung von Zellen mit Proteasom-Inhibitoren und der damit verbundenen Reduktion der proteolytischen Aktivität eine transiente Antwort induziert wird, indem alle proteasomalen Untereinheiten konzertiert hochreguliert werden. Inhibition des Proteasoms mit gleichzeitiger Inhibition der Transkription ließ auf eine gemeinsame transkriptionelle Regulation und nicht auf posttrankriptionelle Ereignisse schließen. Diese durch Inhibitor-induzierte Genaktivierung resultierte in einer de novo Protein-Synthese und somit in einer gesteigerten de novo Biogenese des Proteasoms. Dieses Phänomen wurde begleitet durch eine gesteigerte Expression des Maturierungsfaktors POMP. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Menge an Proteasom in Mammalia auf trankriptioneller Ebene reguliert wird und dass ein autoregulatorischer feedback-Mechanismus die verminderte proteolytische Aktivität kompensiert. Diese Daten werden unterstützt von CAT-Reportergen-Assays mit dem Promotor der proteasomalen Untereinheit β1(δ). Exemplarisch konnte gezeigt werden, dass die Promotor-Aktivität in Anwesenheit von Proteasom-Inhibitoren ansteigt. Die induzierbare Promotorregion konnte bis auf 130 bp upstream des Transkriptionsstarpunktes eingegrenzt werden. Die Bindung des Transkriptionsfaktors Nrf2 konnte durch EMSA-Technik nachgewiesen werden.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
31.10.2005