Diskussion

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In der vorliegenden Arbeit wurden Expressionsanalysen und Promotorstudien durchgeführt, die Hinweise auf die Genregulation der proteasomalen Gene und die damit verbundene Biogenese geben sollten. Zum einen wurde die Interferon γ-Antwort von POMP detailliert untersucht, zum anderen wurde der durch Proteasom-Inhibitoren ausgelöste Stress als genregulatorisches Signal identifiziert und charakterisiert.

4.1 Die Genstruktur von POMP

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Zur Untersuchung der Genregulation von POMP unter Interferon γ-Einfluss musste das POMP Gen genauer analysiert werden.

Das Maturierungsprotein POMP ist das humane Homolog des in Hefe beschriebenen UMP1. Zu Beginn der hier vorgelegten Arbeit war über die Genstruktur von POMP wenig bekannt. Griffin et al. vermuteten aufgrund von e x pressed sequence tags (EST)-Einträgen der NCBI-Datenbank zwei alternative Poly A-Signale für das humane Transkript (Griffin, et al., 2000). Diese Vermutung konnte durch einen Sequenzvergleich der cDNA-Einträge bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).

Es gibt verschiedene Beispiele in der Literatur, dass mehrere Transkriptvarianten eines Gens existieren, die differentiell reguliert sind. Zum Beispiel wurden kürzlich dem Gen einer Natrium-Kanal-Untereinheit alternative Transkriptvarianten mit Längenunterschieden sowohl in der 5`-UTR als auch in der 3`-UTR zugesprochen, die vermutlich entwicklungsabhängig differentiell reguliert werden (Shang and Dudley, 2004). Da es auch zwei verschiedene mRNA-Spezies von POMP gibt, die in vorliegender Arbeit POMP-L (long) und POMP-S (short) genannt wurden, könnte man auch hier zwei unterschiedliche Regulationsmechanismen vermuten. Die beiden mRNA-Varianten unterscheiden sich nur in der Länge ihrer 3`-UTR. Da die 3`-UTR einen Einfluss auf die posttranskriptionelle Regulation einer mRNA ausüben kann, wäre eine Regulation der POMP mRNA Varianten über differentielle mRNA-Stabilität denkbar (Grzybowska, et al., 2001;Guhaniyogi and Brewer, 2001).

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Erste Hinweise auf den Regulationsmechanismus lieferte die Analyse der putativen POMP-Promotorregion. Hierbei konnten in der Region des möglichen Transkriptionsstartpunktes mehrere SP1-Elemente und somit GC reiche Regionen gefunden werden. Dies würde für den Promotor eines Haushaltsgens (house keeping gene) sprechen, zumal der Promotor keine TATA-Box aufweist. Aufgrund der Sequenzinformationen der beiden Transkripte (Accession Nummern AF125097 und AF077200; s. Abb. 3) wurde der Transkriptionsstartpunkt auf 85 Basen downstream des ATG festgelegt. Deletionsexperimente zeigten, dass die Region des Kern-Promotors innerhalb der ersten 200 Basen vor dem ATG liegt. Es konnten im 5` Bereich von POMP keine Interferon γ-induzierbaren cis-acting Elemente identifiziert werden. An diesem Punkt unterscheidet sich der POMP-Promotor von den Interferon γ induzierbaren Untereinheiten des Proteasoms, die nachweislich funktionelle Interferon γcis-acting Elemente besitzen (Barton, et al., 2002;Brucet, et al., 2004;Foss and Prydz, 1999;Hayashi, et al., 1997). Für β5i(LMP7) ist die Funktionalität der potentiellen Interferon γ-stimulierbaren Elemente allerdings experimentell noch nicht bestätigt worden.

Es lässt sich vermuten, dass der Promotor von POMP durch unbekannte regulatorische Sequenzen beeinflusst wird oder ein anderer Regulationsmechanismus zum Tragen kommt.

4.2 Interferon γ vermittelt keine Induktion der Transkription von POMP

Interferon γ induziert das Immunoproteasom. Der Assemblierungsfaktor POMP wird auf mRNA-Ebene durch Interferon γ induziert (Witt, et al., 2000), was einen Einfluss dieses Faktors in der Assemblierung des Immunoproteasoms vermuten lässt. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe belegen die Beteiligung von POMP an der Immunoproteasom Biogenese (S. Heink, persönliche Mitteilung). POMP wird demnach sowohl auf transkriptioneller Ebene als auch auf Protein-Ebene unter Einwirkung von Interferon γ induziert. Zur näheren Untersuchung der Induzierbarkeit der POMP-mRNA durch Interferon γ wurde der Promotorbereich durch Reportergenfusion ermittelt. Es konnte bis zu 4 kb upstream des Transkriptionsstartpunktes Promotor-Aktivität durch Luciferase-Reportergenfusion nachgewiesen werden. Je größer das Fragment des Promotors, desto größer war dessen Aktivität. Das spricht für DNA-Sequenzen, die sich innerhalb der Sequenz der untersuchten 2,2 kb Fragment und dem 4 kb Fragment befinden müssen, an denen Regulationsfaktoren binden können.

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Aus den Daten des Reportergen-Assays geht hervor, dass der Promotor von POMP nicht durch Interferon γ induziert wird. Es kommt sogar zu einer Reduktion der Aktivität, die auf mehrere Ursachen zurückzuführen sein kann. Die Transkription könnte durch Interferon γ reduziert werden, indem Interferon γ aktivierte Faktoren den POMP-Promotor reprimieren. Andererseits wird die mRNA von POMP durch Interferon γ induziert. Eine Repression der Expression würde diesen Effekt nicht erklären. Eine andere Möglichkeit ist in der Interferon γ induzierten Signalkaskade zu suchen. Es wird zum Beispiel auch das Gen RNAse L durch Interferon γ induziert. Die RNAse L wird jedoch erst nach zusätzlichem Stimulus durch doppelsträngige RNA aktiviert, es ist dennoch denkbar, dass eine geringe aktivierte Menge an RNA ausreichen würde, die Luciferase-mRNA abzubauen (Player and Torrence, 1998). Für eine generelle Reduktion der Luciferase in Anwesenheit von Interferon γ spricht auch die Reduktion der Luciferase-Aktivität des CMV-Promotors in einer ähnlichen Größenordnung wie die des POMP-Promotors (s. Konstrukt Nr.1 in Abb. 9a). Dagegen spricht die Induktion der Positivkontrolle durch Interferon γ. Die in vorliegender Arbeit gemessene Induktion entspricht der mRNA-Induktionsstärke, die von Foss et al. detektiert wurde (Foss and Prydz, 1999). Die Aussage dieser Experimente ist dennoch, dass der POMP-Promotor nicht durch Interferon γ induziert wird.

Die POMP-mRNA wird also auf andere Weise nach Interferon γ-Stimulus induziert. Es gibt mittlerweile verschiedene Untersuchungen zu alternativen Regulationswegen. So können Transkriptionsfaktoren regulatorische Sequenzen in Introns binden und dadurch die Transkription in unterschiedlicher Weise beeinflussen (Le Hir, et al., 2003). Da im Falle des POMP-Gens im ersten Intron mehrere putative Interferon γ-stimulierbare Elemente identifiziert wurden, wäre es denkbar, dass diese Elemente über einen Interferon γ-Regulationsweg die Transkriptionsinitiation beschleunigen. Anhand der Daten der Luciferase-Assays konnte die Funktionalität dieser Elemente nicht nachgewiesen werden. Die Interferon γcis-acting Elemente würden nach Tian et al. im Promotorbereich liegen. Denn Tian et al. postulierten 2002 einen alternativen Transkriptionsstartpunkt des Kalium-Kanal-assoziierten Proteins KCNA4B, welches zu 100% mit POMP homolog ist. Dort schlagen die Autoren den Beginn des Transkriptes am 5`-Anfang des Exons 2 vor. Das würde den Promotor um 4 kb in 3`-Richtung des ursprünglich angenommenen Promotors verschieben. Ähnliches wurde schon für das Gen der Immunountereinheit PSMB8 (LMP7) beobachtet (Glynne, et al., 1993). Im Falle der POMP mRNA würde die 5`-UTR wegfallen. Das wiederum könnte eine neue Promotorregion zur Folge haben, welche am Ende des ersten Introns und kurz vor dem 2. Exon zu finden wäre. Diese Möglichkeit ist unwahrscheinlich, weil die Translationsinitiation am Ende von Exon 1 liegt. Außerdem konnte ein Spleißendes Luciferase Konstruktes mit Intron1 eindeutig nachgewiesen werden (s. Abb. 9b).

Eine andere Möglichkeit der Regulation könnte in der mRNA-Stabilität bestehen. Den Sequenzen einer 3`-UTR werden verschieden Funktionen zugeschrieben. Sie können die Stabilität einer mRNA oder sogar die Translationsinitiation einer mRNA verändern (Grzybowska, et al., 2001;Guhaniyogi and Brewer, 2001;Wilkie, et al., 2003). In der Sequenz der mRNA von POMP ist der große 3`-UTR Bereich sehr auffällig. Die Sequenzdaten der 3`-UTR weisen mehrere AU-reiche Sequenzen auf. AU-reiche Sequenzen wurden ursprünglich als destabilisierende Sequenzen eines 3`-UTR Bereiches der mRNA angesehen (Shaw and Kamen, 1986). Später erkannte man, dass auch die AU-reichen Sequenzen durch verschiedene RNA-bindende Proteine stabilisierende Funktionen erlangen können (Brennan and Steitz, 2001). So wurde bei Bindung mit Faktoren, wie z.B. Hel-N1, die mRNA von c-Myc in humanen Neuronen stabilisiert (Levine, et al., 1993). Es wurden außerdem mehrere an AU-reiche Sequenzen bindende Faktoren identifiziert, welche mRNA stabilisieren können (Peng, et al., 1998). Ähnliche Mechanismen könnte man auch bei POMP vermuten. Zur Untersuchung der mRNA-Stabilität wurde die lange 3´UTR Variante von POMP im Reportergen-Assay getestet (s. Abb. 9). Weder konnte die 3´UTR von POMP alleine, noch in Verbindung mit dem POMP-Promotor oder zusätzlich mit dem Intron 1 einen Effekt erzielen. Im Vergleich zu dem POMP-Promotor ohne die 3`-UTR sind keine Unterschiede in der Expression der Luciferase zu erkennen. Dies weist eindeutig darauf hin, dass die lange Form der POMP 3´UTR (POMP-L) weder eine stabilisierende, noch eine destabilisierende Wirkung auf die POMP Expression unter Einfluss von Interferon γ besitzt.

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Eine weitere Möglichkeit der Regulation ist in der kurzen Form, POMP-S, zu suchen. Die 3`-UTR von POMP-S ist nur ca. 100 bp lang. Zusammen mit der kodierenden Sequenz ergibt das eine Größe von ca. 600 bp. Dieses Transkript ist im Gegensatz zu POMP-L sehr gut in Northern Blot Analysen detektierbar. Daher konnte die Stabilität der mRNA durch den RNA Polymerase II-Inhibitor α-Amanitin untersucht werden. Wie in Abb. 10 gezeigt, wurde die mRNA des POMP-S-Gens in Anwesenheit von Interferon γ tatsächlich stabilisiert. Anscheinend gibt es bei POMP zwei Transkripte, die sich nur in der Länge der 3`-UTR unterscheiden und von denen POMP-S Interferon γ induzierbar ist. Witt et al. vermuteten im Jahr 2000 schon zwei POMP mRNA Spezies (Witt, et al., 2000). Es wurde vorgeschlagen, dass die eine Form POMP exprimieren, welches in die Maturierung des konstitutiven Proteasoms involviert ist, die andere Form sollte die Biogenese des Immunoproteasoms unterstützen (Witt, et al., 2000). Da sich innerhalb des ca. 100 Basen großen Sequenzbereichs der kurzen Form der POMP 3´UTR keine bekannten cis-acting Sequenzen identifizieren ließen, spielen hier möglicherweise unbekannte stabilisierende cis-acting Elemente eine Rolle. Diese Sequenzen sind damit natürlich auch Teil der langen 3`-UTR Variante. Denkbar wäre, dass bei dieser mRNA Variante Sequenzbereiche am 3`Ende der 3`-UTR mit den stabilisierenden Elementen am 5`-Ende der 3`-UTR konkurrieren. Die Funktion der längeren POMP mRNA ist noch unklar. Eventuell spielt sie nur eine gewebsspezifische Rolle, da EST-Einträge, die vom 3`Ende sequenziert wurden, nur in Geweben wie Dickdarm, Plazenta und Niere existieren.

Die Interferon γ-Induktion von POMP ist anderer Natur als die der Immunountereinheiten des Proteasoms (s. 1.3.1). Dieses Ergebnis ist sehr interessant, da die Biogenese des Immunoproteasoms vermutlich von POMP unterstützt wird (Griffin, et al., 2000;Witt, et al., 2000); mündliche Mitteilung von Sylvia Heink) und es daher zu erwarten war, dass POMP auf eine ähnliche Weise wie die Immunountereinheiten durch Interferon γ induziert wird. Dies war aber nicht der Fall. Eventuell spielt hier die zeitliche Reihenfolge eine Rolle, denn die mRNA von POMP ist in VSMC relativ stabil (Beobachtung aus unserer Arbeitsgruppe). Dort ist die POMP-S-mRNA über 8 h stabil (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zu einer transkriptionellen Induktion würde also das POMP Transkript zeitlich versetzt exprimiert werden. Denn bei einer Stabilisierung eines schon relativ stabilen Transkriptes findet die Induktion sehr langsam statt. Vermutlich wird das Genprodukt POMP in der Biogenese des Immunoproteasoms erst zu einem späteren Zeitpunkt benötigt. Frentzel et al. zeigten, dass die Dauer für den Biogenese-Prozess des 20S Proteasoms einen Zeitraum von nahezu 8 Stunden umfasst (Frentzel, et al., 1994). Aufgrund von Pulse-chase Experimenten in Anwesenheit des Translations-Hemmstoffs Cycloheximid vermuteten Frentzel et al. die Notwendigkeit fortlaufender Proteinsynthese für die Biogenese des Proteasoms (Frentzel, et al., 1994). Dies würde auch dafür sprechen, dass die Expression einzelner Komponenten, wie z.B. des Proteins POMP, zeitlich versetzt erfolgt. Im Falle von POMP würde dies durch eine unterschiedliche Kontrolle der Genexpression im Vergleich zu den proteasomalen Immunountereinheiten erreicht. Möglicherweise gilt das nur für das Immunoproteasom, da in vorliegender Arbeit gezeigt wurde, dass die Regulation von POMP der des konstitutiven Proteasoms ähnelt.

4.3 Induktion proteasomaler Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren

Proteasom-Inhibitoren wie clasto-Lactacystin und MG132 blockieren die proteolytische Aktivität des Proteasom durch Bindung an β5(MB1) (Groll, et al., 1997). Diese Inhibition unterbindet den Ubiquitin-Proteasom-Degradationsweg und verhindert so den Abbau von vielen zellulären Proteinen. Diese Inhibition führt bei Zellen konzentrationsabhängig zu Apoptose (zusammengefasst in (Drexler, 1998). Wie die Zellen die geringere Menge an aktiven Proteasomkomplexen kompensieren, ist in der vorliegenden Arbeit näher untersucht worden.

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Die Daten der quantitativen RT-PCR in Tab. 2 weisen deutlich auf eine gemeinsame Regulation proteasomaler Untereinheiten hin. Als Reaktion auf die Inhibition des Proteasoms wurde die mRNA verschiedener proteasomaler Untereinheiten signifikant induziert. Nicht alle Untereinheiten werden im gleichen Maße hochreguliert, aber die Untereinheiten des 20S Proteasoms und die meisten Untereinheiten des 19S Regulators werden zwischen 1,5fach und 4fach induziert. Ein deutliches Zeichen für eine spezifische, gemeinsame Regulation des konstitutiven Proteasoms ist darin zu sehen, dass die Expression der Immunountereinheiten kaum verändert ist. Die Immunountereinheiten unterliegen somit vermutlich einem anderen Regulationsmechanismus.

Die konzertierte Induktion der konstitutiven Untereinheiten ist zeit- und konzentrationsabhängig (s. Abb. 14 und (Meiners, et al., 2003). Die Konzentration des Inhibitors ist insofern von Bedeutung, da die Menge an aktivem Proteasom nicht zu gering werden darf. Dies hätte Apoptose durch die Akkumulation von zum Beispiel Tumor-Suppressor p53 oder von Hitzeschock-Proteinen, proapoptotischen Proteinen wie Bax und Bid oder Proteine der Caspase-Familie zur Folge (Breitschopf, et al., 2000Chen, 2003 #429;Bush, et al., 1997;Li and Dou, 2000;Lopes, et al., 1997). Die Zeitabhängigkeit, die bei Meiners et al. gezeigt wurde, bezieht sich auf die transiente Form der Induktion (Meiners, et al., 2003). Die Induktion hatte nach 12 h ihr Maximum erreicht und nahm danach wieder ab. Diese Form der Transkriptionsinduktion deutet häufig auf einen Rückkopplungsmechanismus hin (Becskei and Serrano, 2000). In diesem Fall wird ein Faktor eine Induktion so lange aufrechterhalten, bis ausreichend Produkt vorhanden ist, welches wiederum die Induktion des Faktors verhindern kann und es zu einem Rückgang der Stimulation kommt.

Die Aktivierung des Ubiquitin-Proteasom-Systems wurde schon unter anderen Bedingungen beobachtet. So wird bei verschiedenen Krankheiten, wie Diabetes, Muskelatrophie, Azidose, Urämie und Krebs die Expression des Proteasoms aktiviert (Bailey, et al., 1996;Baracos, et al., 1995;Mitch, et al., 1999;Price, et al., 1996). Die jeweilige Induktions-Stärke korreliert mit der von uns gemessenen 2-4fachen Induktion (Meiners, et al., 2003). Diese Daten weisen eindeutig auf eine gemeinsame Regulation der Genexpression proteasomaler Untereinheiten hin und wurden in dieser Arbeit eingehender untersucht.

4.3.1  Proteasom-Inhibitoren induzieren die Expression proteasomaler Untereinheiten auf Ebene der Transkriptionsinitiation

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Die vermehrte mRNA-Expression proteasomaler Untereinheiten kann mehrere Ursachen haben. Vermutlich werden ein oder mehrere Faktoren nicht mehr durch das Proteasom abgebaut, welche dann zu einer erhöhten mRNA-Menge führen. Dies könnte durch eine Bindung von Faktoren an den Promotor bewirkt werden, was die Steigerung der Transkriptionsrate zur Folge hätte. Möglich wäre auch eine Interaktion mit untranslatierten Regionen der mRNA selbst. Sowohl die Bindung an der 5`-UTR als auch die Bindung an der 3`-UTR kann stabilisierende Auswirkungen für die mRNA haben (Grzybowska, et al., 2001;Tebo, et al., 2000). In Hefe wird das Proteasom transkriptionell reguliert (Mannhaupt, et al., 1999;Xie and Varshavsky, 2001). Eine mRNA-Stabilisierung unter Einfluss von Proteasom-Inhibitoren konnte in Mammalia ausgeschlossen werden (s. Abb. 12). Auch die POMP-mRNA wird unter diesen Bedingungen nicht stabilisiert. Deshalb konnte sicher davon ausgegangen werden, dass die konzertierte Induktion proteasomaler Untereinheiten auf transkriptioneller Genkontrolle beruht. Eine Induktion der α2(C3)-Untereinheit bei Diabetes und Muskelatrophie ist mit diesen Beobachtungen in Einklang zu bringen, da auch hier eine transkriptionellen Kontrolle beobachtet wurde (Du, et al., 2000;Mitch, et al., 1999).

4.3.2 Induktion der proteasomalen Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren auf Proteinebene

Nach Inhibition des Proteasoms stellt sich ein drastischer proteasomaler Aktivitätsverlust ein (ca. 80 %ige Reduktion der Aktivität, s. Abb. 13b). Da die Zellen dies auch für einen längeren Zeiträumen überleben, muss sich ein Mechanismus entwickelt haben, der dieses Defizit ausgleichen kann. Ein negativer feedback-Mechanismus, wie in Sa c charomyces cerevisiae, wäre eine Möglichkeit, dieses zu kompensieren (Ju, et al., 2004). Um dies zu zeigen, musste zunächst nachgewiesen werden, dass die erhöhte mRNA Menge auch zu einer vermehrten Protein-Synthese führt.

Es ist bekannt, dass der Proteasom-Inhibitor zu einer Verringerung der Autoprozessierung aktiver β -Untereinheiten führt, so dass es zu einer Akkumulation von Precursor-Komplexen des Proteasoms kommt (Chen and Hochstrasser, 1996;Heinemeyer, et al., 1997;Schmidtke, et al., 1997). Frentzel et al. zeigten für Maus-RMA-Zellen eine Reifung des Proteasoms in ca. 4-8 h, so dass nach 8 h Inhibition die Biogenese des Proteasoms stark verlangsamt ablaufen dürfte (Frentzel, et al., 1994). Der in dieser Arbeit in Abb. 13 dargestellte Anstieg der Proteinmenge ausgewählter proteasomaler Untereinheiten kann also Folge der unvollständigen Assemblierung sein. Der Precursor-Anstieg ist jedoch auf eine de novo Synthese zurückzuführen (s. Abb. 14), denn die Menge an metabolisch markierten und damit neu synthetisierten Proteasomen ist unter Proteasom-Inhibitor Behandlung deutlich erhöht. Das Bandenmuster der Präzipitate entspricht dem von reifen Proteasomen (Fig.1b in (Frentzel, et al., 1994). Die neu synthetisierten Proteine sind daher schon prozessiert worden und haben die Proteasom-Maturierung durchlaufen (Chen and Hochstrasser, 1996;Frentzel, et al., 1994;Schmidtke, et al., 1997;Seemuller, et al., 1996). Bisher konnte damit gezeigt werden, dass die proteasomalen Untereinheiten über de novo Synthese nach Inhibition des Proteasoms hochreguliert werden. Zur Untersuchung, ob die verstärkte Expression einzelner proteasomaler Untereinheiten in maturiertes 20S Proteasom mündet, sollte die Proteasom-Biogenese analysiert werden.

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Die Biogenese des Proteasoms ist eng an den Maturierungsfaktor POMP gebunden (Witt, et al., 2000). Deshalb wurde auch die Genexpression von POMP nach Inhibition des Proteasoms untersucht. Daher ist zu erwarten, dass bei einer vermehrten Biogenese des Proteasoms in gleichem Ausmaß mehr POMP benötigt wird. Präzipitierte Precursor-Komplexe aus metabolisch markierten Zellen, wie in Abb. 16 dargestellt, beinhalten deutlich mehr POMP in den mit Proteasom-Inhibitor behandelten Proben. Der Anstieg der Proteinmenge von POMP ist ebenfalls auf eine erhöhte de novo Synthese zurückzuführen. Die POMP-mRNA steigt im gleichen Maße an wie die der proteasomalen Untereinheit Rpt1 (S7). Dieser Anstieg beruht ebenfalls nicht auf mRNA-Stabilität (s. Abb. 12). Es ist also davon auszugehen, dass hier derselbe Mechanismus wie für die Induktion der proteasomalen Untereinheiten zu Grunde liegt.

Die Hypothese, dass ein komplett neues Biogenese-Programm durchlaufen und dadurch neues, reifes Proteasom gebildet wird, konnte durch eine Dichte-Gradienten-Fraktionierung der zellulären Komplexe beantwortet werden (s. Abb. 17). Wie schon im Western Blot des Totalllysates ist auch im Western Blot der Fraktionen der Dichtegradientenzentrifugation ein starker Anstieg an Proteasom-Vorläufern zu erkennen (s. Abb. 17; Fraktionen 19-23). Hier wurde deutlich gezeigt, dass die Blockierung des Proteasoms über eine de novo Synthese und Biogenese zu reifem Proteasom führte. Das bedeutet, dass POMP vermutlich eine Schlüsselrolle in der Homöostase der Proteasom-Menge in einer Zelle spielt. Ohne POMP würde die Biogenese vermutlich verlangsamt ablaufen, wie es für Sacch a romyces cerevisiae schon gezeigt wurde. Die Induktion des Proteasoms wäre verzögert oder verhindert (Ramos, et al., 1998).

Des Weiteren war eine Verschiebung der Signale von Rpt1(S7), β1(δ) und des Antikörpers gegen das 20S Proteasom in Richtung der 26S Fraktionen zu beobachten (s. Abb. 17). Aus elektronenmikroskopischen Studien geht hervor, dass es drei unterschiedliche Zustände des Proteasoms gibt: Das 20S Proteasom kommt frei, oder als ein- bis zweifach mit dem 19S Regulator assoziierter Komplex in der Zelle vor (Walz, et al., 1998). Die Verschiebung des Bandenmusters im Gradienten zu den höhermolekularen Fraktionen könnte eine vermehrte Bildung von 26S Proteasomen zur Ursache haben, die mit zwei 19S Komplexen assoziiert sind. Das 26S Proteasom interagiert häufig auch mit Chaperonen, wie zum Beispiel dem Hitzeschock-Protein Hsp90 (Eleuteri, et al., 2002). Solche Chaperone werden auch durch Proteasom Inhibition induziert, was vermuten lässt, dass es zu einer vermehrten Assoziation zwischen Proteasom und Hsp90 kommen könnte.

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Die moderate mRNA Induktion und der damit verbundene äquivalente Proteinanstieg sind relativ zu der Menge des Proteasoms in einer Zelle zu sehen. Das Proteasom hat einen Anteil von etwa 1 % der Gesamtproteinmenge (Tanaka and Ichihara, 1989), bei einer 2-4 fachen Steigerung dieser Menge an Proteasom, wäre der Anstieg im Vergleich zur Gesamtproteinmenge ausreichend, um eine Kompensation der Inhibition zu erklären.

4.4 Untersuchung der Promotorregion von β1(δ) durch Reportergenfusion und EMSA

Proteasom-Inhibitoren verändern das metabolische Gleichgewicht der Zelle (Rock, et al., 1994). Aus den bisherigen Ergebnissen geht hervor, dass die Zelle auf die Störung der Homöostase mit einer kompletten de novo Biogenese des Proteasoms reagiert. In Saccharomyces cerevisiae ist der Transkriptionsfaktor Rpn4 der Schlüssel-Faktor, der für ein konzertierte Regulation des Proteasoms verantwortlich ist (Ju, et al., 2004;Mannhaupt, et al., 1999;Xie and Varshavsky, 2001). In Mammalia konnte bisher kein homologer Mechanismus gefunden werden. Die transkriptionelle Hochregulation der proteasomalen Untereinheiten im Säugersystem lässt jedoch einen ähnlichen Mechanismus wie in Sacchar o myces cerevisiae vermuten.

Zur detaillierten Untersuchung der proteasomalen Genkontrolle wurde der β1(δ)-Promotor verwendet, da β1(δ) schon Gegenstand der Expressionsanalysen war und es mit 2,5facher Induktion in der quantitativen RT-PCR eine durchschnittliche Hochregulation aufwies (s. Tab. 2). Die Promotorregion von β1(δ) ist bisher noch nicht publiziert. Daher war es nötig, die Funktionalität des Promotors zu untersuchen. Im 5` Bereich des Gens konnte eine Vielzahl von repetitiven Sequenzen gefunden werden, die ab 600 Basen vom Transkriptionsstart entfernt vorkommen (Daten nicht gezeigt). Diese Sequenz- Motive könnten auch auf eine Art epigenetischer Kontrolle hindeuten (Grewal and Moazed, 2003). Dies wurde allerdings nicht eingehender untersucht, da repetitive Sequenzen kein gemeinsames Merkmal der proteasomalen Untereinheiten sind.

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Im Gegensatz zum POMP-Promotor wurde die Aktivität des β1(δ)-Promotors mit zunehmender Länge nicht deutlich stärker (s. Abb. 19). Dies deutet darauf hin, dass sich nur wenige Kontrollelemente außerhalb des Minimalpromotors befinden.

Die Induktion der proteasomalen Gen-Expression ist von der Konzentration des Inhibitors und dem Zeitraum der Inkubation abhängig (Meiners, et al., 2003). Der Inkubationszeitraum der CAT-Assays lag bei 16 h, war also doppelt so lang wie bei den Western Blot-Analysen. Dies ist der Grund, warum der Proteasom-Inhibitor in dem CAT-Assay 100fach geringer konzentriert war als er bei den Northern und Western Blot-Analysen eingesetzt wurde. Ein anderer Grund ist, dass die Empfindlichkeit des CAT-Systems gegenüber Proteasom-Inhibitoren um ein vielfaches höher lag als die in Western und Northern Blot-Analysen. Ein anderes Reportergen-System, das der Luciferase, wurde sogar für ungeeignet im Hinblick auf die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren erklärt (Deroo and Archer, 2002). Es ist davon auszugehen, dass dieses System extrem sensitiv auf Inhibitoren reagiert.

Der β1(δ)-Promotor wird durch proteasomale Inhibition aktiviert. Bei geringen Mengen des Inhibitors wird der Promotor 1,5 bis 2fach induziert, was mit den Daten der real time PCR für PSMB6 in Tab. 2 korreliert. Dies lässt vermuten, dass durch den verminderten Abbau von Proteinen ein Regulationsweg aktiviert wird, der in einer Steigerung der Transkription proteasomaler Untereinheiten mündet. Diese Aktivierung ist in dem Reportergen-Modell für das Gen β1(δ) spezifisch, da bei ähnlicher Stimulation des MECL-1-Promotors keine Induktion zu beobachten war. Sowohl für die Stimulation als auch für die Grundaktivität des β1(δ)-Promotors waren eine Promotorgröße von 130 bp notwendig (s. Abb. 19). Es gab kaum Unterschiede zwischen der Induktionsstärke des 1,5 kb und des kleinsten Stückes mit 130 bp, so dass davon auszugehen ist, dass sich alle für die Induktion notwendigen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren innerhalb dieses 130 bp Sequenzbereiches befinden. Daraus geht hervor, dass die Induktion des proteasomalen Gens β1(δ) auf eine erhöhte Promotoraktivität zurückzuführen ist.

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Bisher war im Zusammenhang mit proteasomaler Genexpression in Mammalia wenig bekannt. Das einzige Motiv, welches man für eine gemeinsame Regulation verantwortlich machen könnte, wurde in der Maus gefunden. Es handelte sich dabei um den Transkriptionsfaktor Nrf2, der bei oxidativem Stress eine Rolle spielt (Kwak, et al., 2003). Dieser Faktor bindet an das 5` cis Element ARE (antioxidant re s ponse element) (Itoh, et al., 1997). Dieses Element konnte auch im Gen von PSMB6 (β1;δ) 5` Bereich identifiziert werden (s. Abb. 20).

Eine weitere in Frage kommende regulatorische Bindestelle war das Hitzeschock-Element (HSE) an Position –130, an den der Transkriptionsfaktor HSTF1 bindet. Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren werden durch Proteasom-Inhibitoren aktiviert (Bush, et al., 1997;Kim, et al., 1999;Pritts, et al., 2002;Zhou, et al., 1996). Eine Bindung an diese Elemente konnte in vitro mittels EMSA gezeigt werden (s. Abb. 22). Im Falle des Hitzeschock-Transkriptionsfaktors konnte allerdings keine Spezifität der Bindung nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis konnte durch Messung der Promotoraktivität nach einem Hitzeschock bestätigt werden. Während Hsp70, welches von HSTF1 reguliert wird, auf Proteinebene stark induziert wurde, konnte der β1(δ)-Promotor nicht stimuliert werden (Zhou, et al., 1996). Das Hitzeschock-Element im Promotorbereich von β1(δ) hat also keine physiologische Relevanz. Normalerweise kommen Hitzeschock-Elemente in repetitiver Form vor (La Volpe, et al., 1988). Ein weiteres Indiz dafür, dass dieser Faktor nicht für die proteasomale Hochregulation alleine verantwortlich sein kann, ist die Abwesenheit dieses Elementes in den meisten 5`-Bereichen der proteasomalen Gene (s. Tab. 3). Kuckelkorn et al. konnten außerdem für die proteasomalen Gene PSMA2 (α2) und PSMA4 (α3) zeigen, dass die Transkripte unmittelbar nach einsetzendem Hitzeschock reprimiert werden (Kuckelkorn, et al., 2000). Dieses Ergebnis korreliert auch mit den Ergebnissen von Frentzel et al. die in proteasomalen Genen der Fruchtfliege Dr o sophila melanogaster PRO-dm35 (α1) und PRO-Dm28.1 (α7) jeweils nicht funktionelle Hitzeschock-Elemente im 5`-Bereich identifiziert haben (Frentzel, et al., 1992). Es scheinen nur zufällige Sequenzübereinstimmungen mit HSE zu sein, die keine regulatorische Relevanz besitzen.

Nrf2 hingegen bindet spezifisch an die Sequenz der β1(δ) Promotorregion (s. Abb. 22). Dies konnte durch die Kompetitions-Analysen vermutet werden. Die Menge an gebundenem Nrf2 war nach MG132 Behandlung unverändert, obwohl der Level der Transkriptionsfaktoren HSTF1 und Nrf2 nach Inhibitor-Behandlung im Zellkern markant erhöht war (s. Abb. 21). Da die Stimulation von β1(δ) auf mRNA-Ebene etwa dem doppelten bis dreifachen der Kontrollen entsprach, war ein starker Effekt nicht zu erwarten. Das experimentelle Design könnte aber an dieser Stelle noch verändert werden, so dass auch eine quantitativ höhere Bindung von Nrf2 an ARE detektiert werden könnte. So werden Transkriptionsfaktoren in einem anderen Zeitfenster aktiviert als die Induktion auf Proteinebene. Demnach würde eine Verschiebung der Inkubationszeit mit Proteasom-Inhibitor einen deutlicheren Effekt erzielen.

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Proteasomale Gene werden in der Maus nach oxidativem Stress durch den Transkriptionsfaktor Nrf2 hochreguliert (Kwak, et al., 2003). Nrf2 bindet an das cis-acting-Element ARE (Itoh, et al., 1997). Diese Elemente konnten ebenfalls im 5` Bereich vieler humaner proteasomaler Gene gefunden werden (s. Tab. 3). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass dieser Faktor auch in der Gen-Kontrolle bei Stress durch verminderte Proteolyse eine Rolle spielen könnte. Nrf2 wird von einem cytoplasmatischen Bindeprotein Keap1 am Cytoskelett arretiert und dem 26S Proteasom im Cytoplasma zur Degradation zugeführt (Nguyen, et al., 2003;Zhang and Hannink, 2003). Wird Nrf2 durch Phosphorylierung oder Einwirkung von ROS von Keap1 gelöst, akkumuliert es im Zellkern (Huang, et al., 2002;Itoh, et al., 1999). Dort wird Nrf2 ebenfalls durch das 26S Proteasom degradiert (Itoh, et al., 2003). Fehlt dieser Degradationsweg, häuft sich dieser Transkriptionsfaktor im Kern an und kann mit Hilfe von anderen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. einem Protein der Maf-Familie, als Heterodimer seine Zielsequenz binden (Bloom and Jaiswal, 2003;Motohashi, et al., 2004). Es wurde gezeigt, dass die Überexpression von Nrf2 zur Aktivierung der Transkription eines Reportergens führte (Itoh, et al., 1995). Das deutet darauf hin, dass eine Akkumulation von Nrf2 im Zellkern ausreichen könnte, um ARE-haltige Promotoren, wie beispielsweise den β1(δ)-Promotor, zu induzieren. Nguyen et al. konnten außerdem zeigen, dass ein Reportergen mit ARE-haltigem Promotor durch MG132 oder clasto-Lactacystin stimulierbar war (Nguyen, et al., 2003). Die Induktion betrug 2,5 – 3,5fach im Vergleich zur DMSO-Kontrolle, und lag somit ein wenig höher als die Induktion in vorliegender Arbeit, korreliert aber klar mit den Daten aus der Real time RT-PCR (s. Tab. 2). Es wurde außerdem gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren Kinasen wie MAP / ERK aktivieren (Shibata, et al., 2002). Die Kinasen können eine nicht unerhebliche Rolle in der Aktivierung von Nrf2 haben (Numazawa and Yoshida, 2004). Nrf2 besitzt noch weitere Merkmale, die es als Kandidat für die Regulation eines negativen Rückkopplungsmechanismus des Proteasoms interessant machen. Der Transkriptionsfaktor wird nicht nur vom Proteasom abgebaut, sondern aktiviert sich auch selbst durch ein ARE im Nrf2 Promotor (Kwak, et al., 2002). Des Weiteren erfüllt Nrf2 nicht nur eine Aufgabe in der Abwehr von ROS, sondern ist auch an einer Reihe von anderen Prozessen beteiligt. Nrf2 greift in die Stress-Antwort des Endoplasmatischen Reticulums ein, spielt eine Rolle bei der Wundheilung und bei der Apoptose (Braun, et al., 2002;Cullinan, et al., 2003;Morito, et al., 2003). Alle diese Indizien verdeutlichen, dass dieser Transkriptionsfaktor nicht nur in der Abwehr von ROS eingreift, sondern auch durchaus viele andere zelluläre Prozesse aktiviert, so zum Beispiel auch das Proteasom. Ein Model für diesen Regulationsweg ist in Abb. 24 dargestellt.

Abb. 24: Model der induzierten Proteasom-Expression nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

a) Situation von unbehandelten Zellen: Keap1 arretiert Nrf2 am Zytoskelett und führt es der Degradation durch das Proteasom zu. Nrf2 kann nicht in den Zellkern migrieren und keine Zielgene aktivieren. Kinasen wie MAP / ERK werden durch das Proteasom abgebaut.
b) Situation in Anwesenheit von Proteasom-Inhibitor (MG132): Die verminderte Degradation von Nrf2 führt zu gestiegenen Mengen an Nrf2 im Zellkern. Zusätzlich werden weniger Kinasen abgebaut und können Nrf2 von Keap1 freisetzten und aktivieren. Dadurch werden die Zielgene transkribiert. Die Zielgene sind ROS – Abwehr Enzyme (Phase II Enzyme), das Proteasom und Nrf2 selber. Durch die Aktivierung von Nrf2 kommt es zu einem Rückkopplungsmechanismus.
(Modifiziert nach (Itoh, et al., 2003)

Bei einigen proteasomalen Genen konnte keine ARE-Sequenz gefunden werden. Dies könnte daran liegen, dass nach 100 %iger Übereinstimmung mit der Konsensus-Sequenz gesucht wurde. Falls für die Aktivierung aber eine geringere Übereinstimmung ausreicht, würde man eventuell in allen Untereinheiten eine Aktivierungssequenz finden. Andererseits wäre auch denkbar, dass nicht alle Untereinheiten auf identische Weise aktiviert werden, sondern auch über andere Transkriptionsfaktoren. Dies würde eine zusätzliche Heterogenität der Proteasom-Struktur gewährleisten, indem die Möglichkeit besteht, einzelne Untereinheiten unterschiedlich zu regulieren (Masson, et al., 2003). Tamura et al. vermuteten schon 1994 für die humanen Transkripte der proteasomalen Gene PSMA2(α2) und PSMA5(α5) eine unterschiedliche Regulation (Tamura, et al., 1994). Eine andere Möglichkeit ist die, dass mindestens zwei Faktoren involviert sind. Das Glutathione S-Transferase (GST)-Gen, welches für eines der Proteine der Oxidationsabwehr kodiert, wird zum Beispiel von einem Promotor kontrolliert, in dem das CCAAT/enhancer bi n ding protein-beta (C/EBPbeta) zusammen mit Nrf2 die Transkription beeinflusst (Park, et al., 2004). Wird nur einer der Co-Faktoren angeboten, wird die Expression zur Hälfte reduziert (Park, et al., 2004). 2002 wurde C/EBPbeta, der Transkriptionsfaktor, der durch Glucocorticoide stimuliert wird, mit dem Proteasom in Verbindung gebracht (Penner, et al., 2002). Die Vermutung liegt also nahe, dass ein weiterer Faktor in die Kontrolle eingreift. Das würde zumindest erklären, warum nicht alle proteasomalen Untereinheiten dieses ARE besitzen. Es wäre also noch mindestens ein weiterer Faktor nötig, um die Transkription komplett zu aktivieren. In 11 von 14 Untereinheiten konnten im Bereich von 250 bp upstream des Translationsstartpunktes gemeinsame Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen identifiziert werden. Darunter sind zum Beispiel der Transkriptionsfaktor CREB (cAMP-responsive transcriptional e n hancer-binding protein), der cAMP abhängig seine Zielgene aktiviert, oder RFX1 (X-box binding protein 1), der unter anderen mit einem Element des MHC II-Promotor interagiert und als Aktivator fungiert (Hoeffler, et al., 1988;Reith, et al., 1990); Daten nicht gezeigt). Ein anderer Transkriptionsfaktor wurde kürzlich mit der konzertierten Stimulation proteasomaler Gene in Verbindung gebracht. Der unter anderen im Fettstoffwechsel involvierte Transkriptionsfaktor PPARα (Peroxisome prolif e rator activated-receptor alpha), induziert proteasomale Gene unabhängig von Nrf2 (Anderson, et al., 2004). Dieser Transkriptionsfaktor wird außerdem durch das Proteasom abgebaut (Blanquart, et al., 2002). Allerdings konnte nur in 6 der 14 proteasomalen Gene ein von PPARα angesprochenes Element identifiziert werden, obwohl alle 14 Gene hochreguliert wurden (Anderson, et al., 2004). Offensichtlich sind noch einige Regulationsmechanismen bei der Proteasom-Genexpression aufzuklären. Anscheinend gibt es mehrere unabhängige noch aufzudeckende Signalwege, über welche die proteasomale Homöostase gesteuert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein wichtiger Schritt für die Aufdeckung eines dieser Mechanismen geleistet.

4.4.1 Ausblick und Bedeutung

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Eine Absicherung der bisher erzielten Ergebnisse könnte über ein Reportergen-Assay des β1(δ) Gens erfolgen. Falls das ARE des β1(δ)-Promotors funktional ist, müsste der Promotor sich durch ein Nrf2 aktivierendes Agens wie Dithiolethion (Dick and Kensler, 2002) induzieren lassen. Des Weiteren könnte möglicherweise eine Studie mit Proteasom-Inhibition in einer Nrf2 knock-out Mauszelllinie die Vermutungen unterstützen.

Proteasom-Inhibitoren sind bedeutende Substanzen in der Krebsforschung geworden (zusammengefasst in (Adams, 2004). An dieser Stelle kann die medizinische Relevanz der hier vorgelegten Ergebnisse diskutiert werden. Die Wirkung der Proteasom-Inhibitoren in der Tumor-Therapie ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die letale Konzentration von Proteasom-Inhibitor bei Krebszellen geringer ist, als es bei gesunden Zellen der Fall ist. Aufgrund der hier vorgelegten Ergebnisse ist die Ursache dafür vermutlich ein fehlender feedback-Mechanismus. Die in vorliegender Arbeit erzielten Ergebnisse sind wichtige Erkenntnisse in der Aufklärung des Mechanismus von Proteasom-Inhibitoren, welche in der Krebs-Therapie eingesetzt werden. Die molekularen Grundlagen, die dem Mechanismus zu Grunde liegen, könnten in Zukunft eine wichtige Rolle spielen.


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31.10.2005