Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

• 1 Einleitung

  • 1.1 Das Proteasomensystem

  • 1.2 Die Biogenese des 20S Proteasoms

    • 1.2.1  Helferproteine bei der Proteasombiogenese

  • 1.3 Interferon γ und die Rolle des 26S Proteasoms für die Immunantwort

    • 1.3.1  Interferon γ cis-acting DNA-Elemente

  • 1.4 Proteasom-Inhibitoren

  • 1.5 Regulation von proteasomalen Genen in Mammalia und Homologe in Hefe und Bakterien

  • 1.6 Oxidativer Stress

  • 1.7 Ziel der Arbeit

• 2 Material und Methoden

  • 2.1 Material

    • 2.1.1  Oligonukleotide

      • 2.1.1.1 Oligonukleotide für EMSA

    • 2.1.2 Geräte

    • 2.1.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

    • 2.1.4 Kits

    • 2.1.5 Verwendete Antikörper

    • 2.1.6 Vektoren

  • 2.2 Methoden

    • 2.2.1 Molekularbiologische Methoden

      • 2.2.1.1 Klonierungsmethoden

        • 2.2.1.1.1 Restriktion von DNA

        • 2.2.1.1.2 Präparation von Klonierungsvektoren

      • 2.2.1.2 Dephosphorylierung von kompatiblen Enden

      • 2.2.1.3 Ligation

      • 2.2.1.4 Transformation von Bakterienzellen

      • 2.2.1.5 Herstellung kompetenter E.coli Zellen (vom DH5α-Typ)

    • 2.2.2 Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli

      • 2.2.2.1 Kochpräparation

      • 2.2.2.2 Miniprep (Qiagen)

      • 2.2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese

    • 2.2.3 PCR (polymerase chain reaction)

      • 2.2.3.1 RT-PCR

    • 2.2.4 Northern Hybridisierung

      • 2.2.4.1 RNA Isolation aus Säugetier - Zellen

      • 2.2.4.2 Herstellung von DIG-RNA Sonden

      • 2.2.4.3 Northern Blot

    • 2.2.5 Exonuclease III Verdau

    • 2.2.6 EMSA

    • 2.2.7 Zellkultur

      • 2.2.7.1 Zelllinien

      • 2.2.7.2 Medien für humane Zellinien

      • 2.2.7.3 Kultur von adhärenten Zellen

      • 2.2.7.4 Kultur von Suspensionszellen

      • 2.2.7.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen

      • 2.2.7.6 Behandlung von Kulturzellen mit Proteasom - Inhibitor

      • 2.2.7.7 Behandlung von Kulturzellen mit α - Amanitin

      • 2.2.7.8 Transfektion von adhärenten Zellen

      • 2.2.7.9 Markierung von Zellen mit ³⁵S

      • 2.2.7.10 Aktivitätsbestimmung der Luziferase

      • 2.2.7.11 Aktivitätsbestimmung der Chloramphenicol acetyltransferase (CAT)

      • 2.2.7.12 Kernprotein-Extraktion

      • 2.2.7.13 Hitze Schock an transfizierten HUVEC

    • 2.2.8 Proteinbiochemische Methoden

      • 2.2.8.1 SDS PAGE (SDS – Polyacrylamidelectrophorese) nach Lämmli

      • 2.2.8.2 Western Blot Analyse

      • 2.2.8.3 Dichtegradientenzentrifugation

      • 2.2.8.4 Immunopräzipitation

      • 2.2.8.5 Aktivitätsbestimmung des Proteasoms

      • 2.2.8.6 Proteinbestimmung

• 3 Ergebnisse

  • 3.1 Regulation von POMP durch Interferon γ

    • 3.1.1 Genstruktur von POMP

    • 3.1.2 Reportergenfusion des putativen POMP Promotors

  • 3.2 Konzertierte Transkript-Induktion proteasomaler Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren

    • 3.2.1 Analyse der Genexpression durch real time RT-PCR

    • 3.2.2 Die Induktion auf transkriptioneller Ebene

    • 3.2.3 Induktion auf Proteinebene

    • 3.2.4 Beeinflussung der POMP Expression und der Proteasom Biogenese durch Inhibition des Proteasoms

    • 3.2.5 β1(δ)-Promotor-Analysen durch Reportergenfusion

    • 3.2.6  Heat Shock Element und Antioxidanz Response Element

• 4 Diskussion

  • 4.1 Die Genstruktur von POMP

  • 4.2 Interferon γ vermittelt keine Induktion der Transkription von POMP

  • 4.3 Induktion proteasomaler Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren

    • 4.3.1  Proteasom-Inhibitoren induzieren die Expression proteasomaler Untereinheiten auf Ebene der Transkriptionsinitiation

    • 4.3.2 Induktion der proteasomalen Untereinheiten durch Proteasom-Inhibitoren auf Proteinebene

  • 4.4 Untersuchung der Promotorregion von β1(δ) durch Reportergenfusion und EMSA

    • 4.4.1 Ausblick und Bedeutung

• Literaturverzeichnis

• Abkürzungsverzeichnis

• Lebenslauf

• Veröffentlichungen

• Danksagung

• Erklärung

• Urheberrechtshinweis

• Copyright notice

• Tab. 1: Proteasom-Inhibitoren Gruppenaufteilung und deren Mitglieder

• Tab. 2: Real time RT-PCR Analyse der Expression proteasomaler Gene nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

• Tab. 3: Vorkommen der Bindesequenzen HSE und ARE im 5’ Bereich der angegeben proteasomalen Gene

• Abb. 1: Struktur des 20S und 26S Proteasoms

• Abb. 2: Modell der Mammalia 20S Proteasom Biogenese

• Abb. 3: Genregion von POMP

• Abb. 4: Charakterisierung der POMP Transkripte

• Abb. 5: Der 5`-Bereich von POMP besitzt Promotoraktivität

• Abb. 6: Charakterisierung des 0,7 kb Promotors von POMP

• Abb. 7: Interferon γ reprimiert die Aktivität des POMP- Promotors

• Abb. 8: Das Intron 1 des POMP Gens hat keinen Einfluss auf die γ Interferon Regulation

• Abb. 9: Die 3`-UTR der POMP-L mRNA zeigt keinen stabilisierenden Effekt nach Interferon γ-Stimulation

• Abb. 10: POMP-S-mRNA wird durch Interferon γ Behandlung stabilisiert

• Abb. 11: Stimulation der RPT1(S7)-mRNA durch Proteasom-Inhibitoren

• Abb. 12: Induktion der mRNA von POMP und Rpt1(S7) nach Proteasom-Inhibitorbehandlung ist nicht auf eine Stabilisierung zurückzuführen

• Abb. 13: Stimulation auf Proteinebene

• Abb. 14: de novo Synthese von Proteasom nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

• Abb. 15: Induktion von POMP durch Proteasom-Inhibitoren auf mRNA- und Proteinebene

• Abb. 16: Induktion von POMP und Proteasom Precursor-Komplexen nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

• Abb. 17: Gesteigerte Expression proteasomaler Untereinheiten und POMP nach Proteasom-Inhibitorbehandlung

• Abb. 18: Die gesteigerte Promotor-Aktivität nach Proteasom-Inhibitor Behandlung ist konzentrationsabhängig

• Abb. 19: Untersuchung einzelner Abschnitte der Promotorregion des β1(δ)-Gens unter dem Einfluss von Proteasom-Inhibitor

• Abb. 20: Räumliche Verteilung der putativen regulatorischen Elemente im 5` Bereich des β1 (δ)-Gens

• Abb. 21: Bindung von Kernproteinen an die Elemente HSE und ARE

• Abb. 22: Spezifitätsuntersuchung der Transkriptionsfaktorbindungen an regulatorischen Elementen des β1(δ)-Promotors

• Abb. 23: Funktionalitätstest von HSE im 130 bp β1(δ)-Promotor

• Abb. 24: Model der induzierten Proteasom-Expression nach Proteasom-Inhibitorbehandlung