[Seite 33↓]

2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Proben

Bei den Patientenproben handelt es sich um EDTA-Blut, das aus Berlin, Homburg/Saar, Ulm und Hannover stammt.

Für die Kontrollgruppe wurde DNA von Berliner Medizinstudenten verwendet.

2.1.2 DNA-Extraktion

Geräte

Absauggerät miniport (KNF Neuberger)
Heizplatte criblock DB3D (Techne)
Vortexgerät (Janke und Kunkel)
Zentrifuge Biofuge A (Heraeus-Christ, Hamburg)

Materialien

1,5 ml safe lock Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg)
Pipetten Finnpipette (Labsystems)
Pipettenspitzen (Eppendorf, Hamburg)

Chemikalien

Proteinase K (Merck, Darmstadt)
TE-Puffer (Tris, EDTA)
DB-Puffer (KCl, Tris, MgCl2, Tween 20)

2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Geräte

DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer, Überlingen)
Robocycler (Stratagene)
[Seite 34↓]TRIO-Thermoblock (Biometra, Göttingen)

Materialien

0,2 ml MicroAmp reaction tubes und caps (8 caps/strip)

Chemikalien

Amplitaq- Gold (Perkin-Elmer, Weiterstadt)
Bayol F (Merck, Darmstadt)
dNTPs (Perkin-Elmer, Weiterstadt)
PCR-Puffer (New England Biolabs)
Primer F1, R1, R1a, R1b, R1c (Tib Molbiol, Berlin)
Taq-Polymerase (Pharmacia, Freiburg)

2.1.4 Polyacrylamidgele

Geräte

Magnetrührer RCT basic (Janke und Kunkel)
Waage PG5002 (Mettler, Toledo)

Materialien

50 ml combitip Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg)
GelBondfolien (FMC, Rockland, USA)
Glasplatten, 100 x 260 x 5 mm (Pharmacia, Freiburg)
Glasplatten, 200 x 260 x 5 mm (Pharmacia, Freiburg)
Glasplattenklemmen (Pharmacia, Freiburg)
Kimwipes (Kimberly & Clark)
Meßzylinder
Roller

Chemikalien

Acrylamid (Bio Rad, Hercules, USA)
Ammoniumpersulfat (Bio Rad, Hercules, USA)
Bis-N-N-Methylen-Bis-Acrylamid (Bio Rad, Hercules, USA)
[Seite 35↓]Borsäure (Merck, Darmstadt)
Dimethyl-Dichloro-Silane (Repel-Silane) (Merck, Darmstadt)
Dinatrium-Ethylen-Diamin-Tetraacetat (EDTA, Titriplex) (Merck, Darmstadt)
Harnstoff (Merck, Darmstadt)
N-N-N-N-Tetra-Methyl-Ethylen-Diamin (Bio Rad, Hercules, USA)
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Merck, Darmstadt)

2.1.5 Gelelektrophorese

Geräte

Elektrophoresekammer (Multiphor II, Pharmacia Freiburg)
Kühlung K 20 (Haake)
Power-Pac 3000 (Bio-Rad, München)

Materialien

10 bp DNA-Leiter (GIBCO, Eggenstein)
100 bp DNA-Leiter (GIBCO, Eggenstein)
1000 bp DNA-Leiter (GIBCO. Eggenstein)
Filterpapier (Whatman)

Chemikalien

1x TBE-Puffer (Borsäure, Tris, EDTA, H2O)
Bromphenolblau (Merck, Darmstadt)

2.1.6 Silberfärbung

Geräte

Celloshaker (Renner, Darmstadt)
Scanner Gel Doc 1000 (Bio-Rad, München)

Materialien

Entwicklungsschale
Färbeschale
Meßzylinder
[Seite 36↓]Plastikfolie

Chemikalien

Ethanol (Merck, Darmstadt)
Formaldehyd 37 % (Merck, Darmstadt)
Hac (Eisessig) (Merck, Darmstadt)
Natriumborhydrid (Merck, Darmstadt)
Natriumhydroxid (Merck, Darmstadt)
Silbernitrat (Merck, Darmstadt)

2.1.7 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus

Geräte

s. PCR

Materialien

s. PCR

Chemikalien

Cfo I (New England Biolabs, Schwalbach)
Hae II (New England Biolabs, Schwalbach)
Hae III (New England Biolabs, Schwalbach)
Restriktionspuffer L (Boehringer, Mannheim)
Restriktionspuffer M (Boehringer, Mannheim)
Restriktionspuffer NEB 2 (New England Biolabs)

2.1.8 Sequenzierung

Geräte

ABI DNA-Sequenzer 373 A (Perkin-Elmer, Weiterstadt)
Speed Vacuum Schleuder Centrivac (Heraeus-Christ, Hanau)
Tischzentrifuge 5415 (Eppendorf, Hamburg)

[Seite 37↓]Materialien

Eis
Glasplatten (Perkin-Elmer, Weiterstadt)
Glasplattenklemmen
Haifischkamm (Perkin-Elmer, Weiterstadt)
Meßzylinder
Tetra Analyze Software (SoftGene, Berlin)
Vorkamm (Perkin-Elmer, Weiterstadt)

Chemikalien

Alconox
Di-Natrium-Ethylen-Diamino-Tetraacetat (Merck, Darmstadt)
Ethanol (Merck, Darmstadt)
Formamid (Sigma, St. Louis, USA)
QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Hilden)
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden)
TBE-Puffer (Gibco, Eggenstein)
Siehe 2.1.3


[Seite 38↓]

2.2  Methoden

2.2.1 Proben

Die anonymisierten 231 Blutproben der ALS-Patienten stammen aus der ALS-Sprechstunde der Charité und wurden uns von den Universitätskliniken Hannover, Homburg/Saar und Ulm zugesandt.

Die 138 Proben der Kontrollgruppe entstammen einer Zufallsauswahl Berliner Medizinstudenten.

Die Blutproben wurden mittels Venenpunktion unter sterilen Gesichtspunkten gewonnen und in EDTA K Monovetten mit dem Volumen 2,7 ml der Firma Sarstedt eingefüllt. Hiernach wurden die Blutproben bis zu ihrer Weiterverarbeitung tiefgefroren. Ein Teil der verwendeten Patientenproben sowie alle Proben der Kontrollgruppe lagen nicht als Vollblut sondern bereits als fertig extrahierte DNA vor.

Das Votum der Ethik-Kommission der Humboldt-Universität Berlin liegt vor.

2.2.2 DNA-Extraktion

Die DNA-Extraktion wurde nach dem Protokoll des Institutes für Pathobiochemie und Laboratoriumsmedizin der Humboldt-Universität in Form einer DNA-Schnellextraktion durchgeführt.

Hierzu wurden zunächst die Blutproben schonend aufgetaut und aus jeder 2,7 ml Monovette 1 ml in ein 1,5 ml safe lock Gefäß der Firma Eppendorf überführt. Der verbliebene Rest der Blutproben wurde für etwaige zukünftige Untersuchungen umgehend wieder eingefroren.

Von dem so gewonnenen 1 ml Vollblut wurden 200 νl Blut zusammen mit 1000 νl TE-Puffer in ein neues 1,5 ml safe lock Gefäß überführt und bis zur vollständigen Durchmischung kurz auf das Vortexgerät verbracht. Hiernach wurden die Proben in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 20 Sekunden bei 13000 rpm zentrifugiert, wodurch eine Trennung in eine organische und eine wässrige Phase erreicht wurde. Die wässrige Phase wurde nun abgegossen bzw. mit dem Absauggerät vorsichtig abgesaugt, so daß lediglich das Sediment verblieb. Um einen höheren Reinheitsgrad zu erreichen, wurde nun zu dem Sediment abermals 1000 νl TE-Puffer hinzugegeben, gevortext, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.

Um nun die stabilere Membran der kernhaltigen Leukozyten zu lysieren und die verbliebenen Proteine zu verdauen, wurde zu jeder Probe 300 νl Proteinase-K-Pufferlösung gegeben. Zur [Seite 39↓]Herstellung dieser Proteinase-K-Pufferlösung wurden 10 mg Proteinase K in 1000 νl H20 gelöst. Um die Proteinase-K-Pufferlösung zu erhalten, wurden 10 νl dieser Lösung mit 1000 νl DB-Puffer gemischt.

Die mit 300 νl dieser Pufferlösung versehene Probe wurde erneut kurz gevortext und schließlich beim Temperaturoptimum der Proteinase K von 56°C in der Heizplatte inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf eine Heizplatte mit der Arbeitstemperatur von 100°C überführt, um die Proteinase K zu inaktivieren, da diese sonst zu einer verminderten Wirksamkeit der in der PCR verwendeten Taq-Polymerase führen würde.

Die so erhaltenen Proben mit der extrahierten DNA wurden nun entweder bis zu ihrer baldigen Weiterverarbeitung bei –4°C gekühlt gelagert oder bei –18°C tiefgefroren.

Pufferlösungen für den Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP):

TE-Puffer (pH 8):

20mM

Tris

 

1mM

EDTA

DB-Puffer:

50 mM

Tris

 

20mM

KCl

 

2,5 mM

MgCl2

 

0,5 %

Tween 20

2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Erforschung des menschlichen Genoms hat durch eine Entdeckung im Jahre 1985 eine entscheidende Wende erfahren. In diesem Jahr entwickelte Kary Mullis eine neue Methode zur gezielten Vervielfältigung bestimmter Desoxyribonukleinsäure-(DNA-)Abschnitte, die sogenannte Polymerasekettenreaktion (PCR), für deren Entdeckung er 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt.

Zur Amplifizierung von DNA-Abschnitten mit Hilfe der PCR benötigt man als Starter Oligonukleotidprimer, also kurze, einzelsträngige DNA-Sequenzen, die zu den Enden einer definierten Sequenz der DNA-Matrize komplementär sind. Eine DNA-Polymerase verlängert unter geeigneten Reaktionsbedingungen und in Gegenwart von Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) die Primer entlang der einzelsträngigen denaturierten DNA-Matrize und synthetisiert so [Seite 40↓]neue DNA-Stränge, deren Sequenz komplementär zur Matrize ist. Durch zyklische Wiederholung der Reaktion vermehrt sich die DNA exponentiell, da die in der vorherigen Reaktion neu synthetisierten DNA-Stränge in der nächsten Reaktion zusätzlich als Matrize dienen. Alle DNA-Moleküle liegen am Ende der Reaktion als Doppelstränge vor.

Anfängliche Schwierigkeiten dieser Methode, die zunächst eine Automatisierung der PCR und damit eine Routineanwendung verhinderten, wurden im wesentlichen durch zwei neue Technologien behoben:

  1. Durch die Entwicklung und den Einsatz von hitzestabilen DNA-Polymerasen wurde das Verfahren entscheidend vereinfacht, da die Polymerase nur noch einmal – zu Beginn der PCR - hinzugegeben werden mußte. In dieser Arbeit wurde eine DNA-Polymerase aus einem gentechnisch veränderten Bakterium, dem Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) verwendet.
  2. Durch die Entwicklung von Geräten, die die Steuerung der verschiedenen Temperaturen selbständig übernehmen, konnten Arbeitsaufwand und Fehlerquote entscheidend gesenkt werden.

Die Polymerase-Kettenreaktion vollzieht sich prinzipiell in drei Schritten:

  1. Zunächst wird die DNA-Probe aufgeschmolzen. Man spricht hierbei vom DNA-Template, welches die zu amplifizierende Ausgangs-DNA bezeichnet.
  2. Hybridisierung, also Anlagerung (=Annealing) der Primer mit dem nun einzelsträngigen DNA-Template.
  3. Verlängerung der hybridisierten Primer durch die DNA-Polymerase (= Polymerisation).

Jeder dieser Schritte findet bei einem unterschiedlichen Temperaturoptimum statt. Die Denaturierungstemperatur betrug 95°C. Sehr wichtig und unterschiedlich ist die Auswahl des Temperaturoptimums für die Anlagerung der Primer an das Template, die sogenannte Annealing-Temperatur. Je niedriger diese gewählt wird, desto leichter hybridisieren die Primer mit dem Template, so daß die Anzahl an unspezifischen Hybridisierungen dementsprechend höher ist. Daher wurde die Annealing-Temperatur am Robocycler optimiert, um einen möglichst hohen Grad an spezifischen Hybridisierungen zu erreichen.


[Seite 41↓]

Die Polymerisationstemperatur lag stets bei 72°C, da diese Temperatur das Optimum für die verwendete Taq-Polymerase und Amplitaq-Gold darstellt.

Ein Durchgang der oben genannten drei Schritte wird als Zyklus bezeichnet, wobei pro PCR die Schritte 30-40 mal wiederholt werden. Da das jeweils amplifizierte DNA-Fragment im nächsten Zyklus zugleich wieder als neue Matrize dient, führt eine solche Wiederholung der Zyklen zu einer 30-40-fachen Amplifikation des ursprünglichen DNA-Fragmentes. Eine weitere Erhöhung der Zykluszahl führt allerdings zu einer starken Vermehrung unspezifischer DNA-Fragmente, so daß hierauf verzichtet wurde.

Ein so erhaltenes PCR-Produkt konnte direkt weiterverarbeitet werden oder wurde bis zur Weiterverarbeitung bei – 4°C gekühlt.

Zusammensetzung eines Standard-PCR-Ansatzes (Mastermix):

H20

14,75 νl

Vorwärtsprimer

1 νl (Konzentration 10 νM)

Rückwärtsprimer

1 νl (Konzentration 10 νM)

10 x PCR-Puffer*

2,5 νl

dNTPs

2 νl

Taq-Polymerase**

0,15 νl

DNA-Template

2,5 νl

* Der 10 x PCR-Puffer von New England Biolabs beinhaltete:

0,67 M Tris-HCl (pH 8,8)

0,067 M MgCl2

0,166 M Ammoniumsulfat.

** Anstelle der bei der Optimierung der Methode eingesetzten Taq-Polymerase wurde später als Polymerase die gentechnisch hergestellte Amplitaq Gold von Perkin-Elmer verwendet, die Primerfehler vermindert und so zu einer höheren Ausbeute spezifischer PCR-Produkte führt. Hierbei wurde die Menge der Polymerase auf 0,1 νl je Probe reduziert. Um das Gesamtvolumen beizubehalten, wurde die Differenz mit H2O aufgefüllt.


[Seite 42↓]

Der Ansatz wurde in 0,2 ml MicroAmp reaction tubes pipettiert, wobei die Taq-Polymerase erst zum Schluß direkt vor dem Starten der PCR-Zyklen hinzugegeben werden durfte.

Um Verdunstungen und Verunreinigungen des PCR-Produktes zu vermeiden, wurde der komplette PCR-Ansatz anschließend mit zwei Tropfen Bayol F Mineralöl überschichtet und in das PCR-Gerät inkubiert.

Bei der Auswahl der Primer gab es einige Punkte zu beachten. Ihre Länge sollte zwischen 20 und 30 Nukleotiden betragen, da die Spezifität in diesem Bereich am höchsten ist, die Primerpaare sollten an ihren 3´-Enden nicht komplementär sein, um die Ausbildung sogenannter Primerdimere zu vermeiden und sie sollten sich nach Möglichkeit vor oder hinter einer kodierenden Sequenz befinden, um so die Spezifität der PCR zu erhöhen.

Als Primer wurden folgende Sequenzen ausgesucht und von der Firma TIB Molbiol bezogen:

Vorwärtsprimer:

Primer F1

5´gCT TgT TCg ggg CgC TCC gCT g

Rückwärtsprimer:

Primer R1

5´ggC TCA CAg gCT CCC CgC Cg

Primer R1a

5´gCC CCg CCC CgC TCC gCC Cg

Primer R1b

5´CAg CCA CTA CTg CAC gTC CgC C

Primer R1c

5´CCg gAC CgT ggT gCC TCA gAg g

Zu Beginn der Versuchsreihe wurden die verschiedenen Primer auf ihre Funktionstüchtigkeit hin untersucht und deren optimale Annealing-Temperatur ermittelt. Hierzu wurden die Proben im Robocycler inkubiert, mit dem es möglich ist, die PCR-Zyklen zugleich unter zwölf verschiedenen Temperaturen – in diesem Fall in 2er Schritten von 50 – 72°C – ablaufen zu lassen, um die Temperatur zu ermitteln, bei der das spezifische PCR-Produkt quantitativ am größten ist und die unspezifischen Produkte nur eine geringe Ausbeute aufweisen.


[Seite 43↓]

Nach Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur wurde die PCR auf dem TRIO-Thermoblock der Firma Biometra durchgeführt.

Die Standard-PCR-Bedingungen waren hierbei:

Denaturierung

95° C

3 min

 

Denaturierung

95° C

30 sec

ù

Annealing

66° C

30 sec

ú 40 Zyklen

Polymerisation

72° C

30 sec

û

Stabilisierung

72° C

2 min

 

Lagerung

10° C

¥

 

Die so erhaltenen PCR-Produkte wurden bei -4° C gekühlt oder direkt weiterverarbeitet.

2.2.4 Polyacrylamidgele

Zur Auftrennung der DNA-Fragmente nach ihrer Größe wurden Polyacrylamidgele verwendet, die gegenüber Agarose-Gelen einige Vorteile besitzen:

  1. Sie haben eine größere Auflösung, so daß selbst kleine Unterschiede der Basenpaarlänge des PCR-Produktes noch wahrgenommen werden können. Dies war bei dieser Arbeit von besonderer Wichtigkeit, da das PCR-Produkt selbst nur eine Länge von 133 bp aufwies und sich durch die Polymorphismen nur um 3-6 bp unterschied.
  2. Die aus Polyacrylamidgelen isolierte DNA besitzt einen hohen Reinheitsgrad, so daß sie z.B. aus dem Gel herausgeschnitten, erneut eluiert und anschließend reamplifiziert werden kann, um die Herkunft unspezifischer Nebenprodukte zu analysieren.

Ein Nachteil der Polyacrylamidgele besteht in ihrer Gesundheitsgefährdung, da man zu ihrer Herstellung gelöstes Acrylamid benötigt, ein starkes Nervengift, das über die Haut aufgenommen wird. Auch das polymerisierte Acrylamid der Gele enthält noch geringe Mengen unpolymerisiertes Acrylamid.

Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgt aufgrund ihrer unterschiedlichen negativen Ladung, ist aber auch von der Konzentration – also der Porengröße – und der Menge an [Seite 44↓]Quervernetzungen der Gele abhängig, da kleine Moleküle seltener mit der Gelmatrix kollidieren und somit schneller vorankommen als große Moleküle.

Herstellung der Gele

Für diese Arbeit wurden Glasplatten in der Größe 100 mm x 260 mm x 5 mm und 200 mm x 260 mm x 5 mm verwendet, die einreihig mit 40-44 Taschen versehen waren.

Vor ihrem ersten Gebrauch wurden die Glasplatten mit Repel-Silane ES eingerieben und mit Ethanol gereinigt. Hierdurch wurde ihre Oberfläche fett-und staubfrei sowie hydrophob, so daß die Klebestreifen, die als Aussparungen für die späteren Geltaschen dienten, besser haften blieben, andererseits das fertige Gel nicht an dem Glas haften blieb.

Nach dieser Vorbehandlung war es ausreichend, die Glasplatten zwischen ihrem Gebrauch lediglich mit H2O zu reinigen.

Anschließend wurde eine GelBond-Folie mit ihrer hydrophoben Seite auf die nicht beklebte Glasplatte aufgebracht, eventuelle Luftblasen mit dem Roller ausgestrichen, die Glasplatten übereinandergelegt und mit den Glasplattenklemmen zusammengehalten.

Zur Herstellung der Gele wurde – je nach gewünschter Konzentration- folgender Ansatz vorbereitet:

1,8 g

Harnstoff

6 ml

5 x TBE-Puffer

12 ml

Acrylamidlösung

auf 30 ml

H2O

Kurz vor dem Gießen der Gele wurde noch

48 νl

40 % Ammoniumpersulfat (APS) und

24 νl

TEMED

zu dem Ansatz hinzugegeben, mittels Magnetrührer durchmischt und mit einem 50 ml Eppendorf-Combitip möglichst blasenfrei zwischen die Glasplatten verbracht. Nach circa einer Stunde waren die Gele auspolymerisiert, das Polyacrylamidgel blieb auf der GelBond-Folie haften und konnte weiterverwendet werden.


[Seite 45↓]

* Der 5 x TBE-Puffer bestand aus:

55 g

Borsäure

107,7 g

Tris-phosphat

9,3 g

EDTA

in 2 l

H2O

Um den optimalen Vernetzungsgrad der Gele herauszufinden, bei dem sich die PCR-Produkte am eindeutigsten auftrennen, wurde mit verschiedenen Ansätzen der Acrylamidlösung gearbeitet (T30C0,5; T30C2; T30C4; T12C2; T12C3; T12C4; T15C2; T15C3; T15C4).

** Für den optimalen Vernetzungsgrad T15C4 wurden 24,4 g Acrylamid und 1,2 g Bis-Acrylamid in 100 ml H2O gelöst. Bei anderen Vernetzungsgraden wurde die Konzentration des Bis-Acrylamids und des Acrylamids entsprechend verändert.

Zur Austestung der optimalen Acrylamidkonzentration wurde mit Konzentrationen von 8%, 12% und 16% gearbeitet, wobei eine optimale Konzentration von 12% ermittelt wurde.

2.2.5 Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese dient dem Auftrennen der PCR-Produkte nach ihrer Größe und ihrer Sekundärstruktur.

Zur Vorbereitung der Elektrophorese wurden die Elektrophoresekammern auf 5°C gekühlt und die Porzellanplatten der Kammern mit H2O befeuchtet. Die zuvor gegossenen und vollständig auspolymerisierten Polyacrylamidgele wurden nun möglichst blasenfrei auf die Porzellanplatte aufgebracht. Um während der Elektrophorese ein möglichst konstantes pH-Milieu zu gewährleisten, wurde sowohl an der Kathoden- als auch der Anodenseite entlang des Kontaktdrahtes ein Stapel aus 10 Lagen Filterpapier auf das Gel gelegt, der zuvor in 1 x TBE-Puffer durchtränkt wurde. Dieser Puffer wurde auch als Laufpuffer für die Elektrophorese verwendet, so daß die Elektrophoresekammer ebenfalls mit 1 x TBE-Puffer befüllt war.

In die Auftragstaschen wurden nun jeweils 5 νl des PCR-Produktes überführt, wobei meist die zwei obersten und untersten Taschen nicht für die PCR-Produkte zur Verfügung standen. Hierein wurde je zweimal als Ablesehilfe für die Größe des PCR-Produktes 5 νl eines 1%igen 10 bp DNA-Leiters verbracht. Die restlichen zwei Taschen wurden mit 5 νl Blaumarker (Bromphenolblau in 1 x TBE-Puffer) befüllt, mit dem das Laufverhalten der Proben während der [Seite 46↓]Elektrophorese kontrolliert werden konnte. Nach Anschließen der Kontakte und Aufbringen der Schutzvorrichtung konnte die Elektrophorese nun gestartet werden, wobei als Energiequelle ein Power Supply 200 der Firma Bio-Rad verwendet wurde.

Die Elektrophorese-Bedingungen waren:

Temperatur

5 ° C

Spannung

1000 V

Stromstärke

150 mA

Leistung

60 W

Dauer

2 h

Nach erfolgter Elektrophorese konnten die DNA-Fragmente durch eine Silbernitratfärbung sichtbar gemacht werden oder das Hauptprodukt der PCR aus dem Gel isoliert werden, um es einer Reamplifikation zuzuführen und damit von anderen Amplifikaten zu trennen, bzw. die Herkunft der PCR-Nebenprodukte zu detektieren.

So lassen sich anhand der PCR verschiedene Informationen ableiten:

  1. Der Nachweis, daß die gesuchte DNA in der Probe vorhanden ist und ob sie verändert ist.
  2. Eine ungefähre Abschätzung der quantitativen Ausbeute der PCR.
  3. Eine Sequenzanalyse

2.2.6 Silbernitratfärbung

Die Silbernitratfärbung dient der Visualisierung der gelelektrophoretisch aufgetrennten PCR-Produkte.

Nach Ablauf der Gelelektrophorese und Abschaltung der Stromzufuhr wurde das Gel kurz mit H2O gespült und in eine Entwicklerschale verbracht, die durch einen Tischshaker mit niedriger Geschwindigkeit geschüttelt wurde. Die Entwicklerschale war mit 200 ml Fixierlösung gefüllt. Nach 5-10 minütiger Inkubation des Gels in der Fixierlösung und anschließendem kurzen Waschen in H2O wurde das Gel in eine lichtdichte Färbeschale überführt, die mit 200 ml [Seite 47↓]gekühlter 0,2 % AgNO3-Lösung gefüllt war. Unter abermaligen Schütteln wurde das Gel hier für 20 min gefärbt, wonach es gründlich unter H2O gewaschen wurde und abermals für 10-15 min in die Entwicklerschale überführt wurde, die mit 200 ml Entwicklerlösung gefüllt war. Nachdem die Färbung ausreichend entwickelt war, wurden die Gele unter H2O gewaschen, in eine Plastikfolie eingeschweißt, beschriftet und mittels Scanner dokumentiert.

Herstellung der Lösungen für die Silbernitratfärbung:

Fixierlösung:

  

200 ml

Ethanol

   

40 ml

Hac (Eisessig)

   

auf 2 l

H2O

     

Färbelösung:

  

4 g

AgNO3

   

auf 2 l

H2O

     

Entwicklerlösung:

  

30 g

NaOH

   

200 mg

NaBH4

   

auf 2 l

H20

 

kurz vor

Verwendung

1 ml

37 % Formaldehyd

2.2.7 Reamplifikation des PCR-Produktes

Das Ergebnis einer PCR kann durch viele verschiedene Faktoren – positiv wie negativ – beeinflußt werden. Diese Einflüße können sich entweder in der quantitativen Ausbeute des PCR-Hauptproduktes oder in der zusätzlichen Ausbeute von Nebenprodukten äußern. Häufigste Ursache hierfür ist die Einschleppung von inhibitorischen bzw. verunreinigenden Substanzen in die Probe. Dies kann bereits bei der Gewinnung des Blutes in Heparin-haltige Monovetten erfolgen, da Heparin die PCR stark hemmt, aber auch bei der DNA-Extraktion z.B. durch ungenügende Inaktivierung von Proteinase K erfolgen.

Bei etlichen DNA-Proben kam es nach der PCR zu Amplifikaten unterschiedlicher Größe, wobei das erwartete Fragment quantitativ zwar stets den größten Anteil ausmachte, es jedoch bei einigen Proben zur Entstehung von Nebenprodukten kam, deren Herkunft durch folgende Kontrollen detektiert werden sollte:

  1. PCR ohne DNA, um die Verunreinigung der Zutaten mit DNA auszuschließen
  2. PCR mit weniger Zyklen
  3. Austestung verschiedener Hybridisierungstemperaturen
  4. Negativkontrollen
  5. Wiederholung der PCR unter gleichen Bedingungen
  6. Reamplifikation des PCR-Produktes, um herauszufinden, ob die Nebenprodukte während der PCR entstehen

Ursache solcher Nebenprodukte können Verunreinigungen der DNA-Probe oder des PCR-Ansatzes sein, sie können genauso gut aber auch während der PCR z.B. durch die Ausbildung von Primerdimeren entstehen, also Artefakten, die auftreten, wenn die Polymerase den einen Primer komplementär zum anderen Primer oder zu sich selbst synthetisiert.

Hierzu wurde die entsprechende Bande des PCR-Hauptproduktes nach erfolgter Gelelektrophorese noch vor der Silbernitratfärbung mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA zusammen mit der herausgetrennten Gelsubstanz in 50 νl H2O für mindestens drei Stunden bei 65°C im UNO inkubiert. Von der Lösung wurden 2,5 νl als neues DNA-Template für einen PCR-Mastermixansatz verwendet und einer abermaligen PCR zugeführt. Das Ergebnis dieser Reamplifikation wurde wie oben beschrieben mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Silberfärbung sichtbar gemacht.

2.2.8 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus

Mit Hilfe des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) kann ein PCR-Produkt in kleinere Fragmente aufgespalten werden, um geringe Veränderungen der DNA-Primärstruktur noch detektieren zu können. Hierbei erkennen bakterielle Restriktionsendonukleasen spezifische DNA-Sequenzen und hydrolysieren an definierten Stellen die Phosphodiester-Bindungen der DNA-Stränge. Bis heute wurde eine Vielzahl von Restriktionsenzymen gereinigt und charakterisiert, ihre Namen bestehen aus einer Abkürzung des Wirtsorganismus (z.B. Hae für Haemophilus aegypticus) und einer römischen Zahl, falls mehr als ein Restriktionsenzym produziert wird126.

Der Ansatz für den RFLP war wie folgt:


[Seite 49↓]

Restriktionspuffer

9,4 νl

Restriktionsenzym

0,6 νl

PCR-Produkt

10 νl

Als Restriktionsenzyme dienten Cfo I, Hae I und Hae II, wobei die letzten beiden in Form eines double-digest kombiniert wurden. Hierbei wurde soviel beider Enzyme hinzugegeben, daß die Gesamtmenge an Enzym die Menge im obengenannten Ansatz nicht überstieg.

Der Ansatz wurde in ein TRIO-Thermoblock verbracht, mit dem Heizdeckel, der eine Temperatur von 85°C hatte, verschlossen und für 2 h 30 min bei 37°C inkubiert.

Die verwendeten Restriktionspuffer L und M von Boehringer Ingelheim sowie NEB 2 von New England Biolabs hatten folgende Eigenschaften:

Restriktionspuffer L:

100 mM

NaCl

 

10 mM

Tris-Hcl

 

10 mM

MgCl2

 

1 mM

2-Mercaptoethanol

Restriktionspuffer M und NEB 2:

50 mM

NaCl

 

10 mM

Tris-HCl

 

10 mM

MgCl2

 

1 mM

DTT

Eigenschaften der Restriktionenzyme

Cfo I

5´ CGCG 3´

oder

3´ GCGC 5´

Hae II

5´ GCGC

oder

CGCG 5´

Hae III

5´ GGCC 3´

oder

3´ CC GG 5´


[Seite 50↓]

Nach Inkubation im TRIO-Thermoblock wurden die Proben erneut einer Polyacrylamidgelelektrophorese zugeführt und - wie unter 2.2.6 beschrieben - mit Hilfe der Silberfärbung visualisiert.

2.2.9 Sequenzierung

Zur Qualitätssicherung wurde beispielhaft eine Patientenprobe sequenziert, um sicherzustellen, daß das erhaltene PCR-Produkt auch das gewünschte DNA-Fragment darstellt, da Primer auch an anderen gleich konfigurierten DNA-Abschnitten schneiden können.

In dieser Arbeit benutzte man für die Sequenzierung die Methode des basenspezifischen Kettenabbruches nach Sanger. Die Sequenzierung beinhaltet verschiedene Schritte:

Aufreinigung

Cycle Sequencing

Nukleotid-Entfernung

Elektrophorese

Aufreinigung

Hierbei wird das PCR-Produkt von überschüssigen Nukleotiden, von den Primern und der Taq-Polymerase gereinigt, damit die gereinigte DNA später der Sequenzierung zugeführt werden kann. Zunächst wird das PCR-Produkt vom überschichteten Bayol-Öl getrennt.

Die eigentliche Aufreinigung des gewonnenen PCR-Produktes erfolgte mit Hilfe des PCR-Purifikation-Kits von Quiagen.

Hierzu wurde das PCR-Produkt mit dem PB-Puffer im Verhältnis 1:5 gemischt und in eine QIA-quick-Säule überführt, die in einer Sammeltube steht. Das Reaktionsgemisch wurde nun für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Die Silica Gel Membran der QIAquick-Säule adsorbiert bei der Zentrifugation die DNA bis zu einer Menge von 10 νg, so daß sich in der Sammeltube der abzentrifugierte Rest aus PCR-Ansatz ohne DNA und PB-Puffer befindet, der verworfen wird. Die QIAquick-Säule wurde nun in eine neue Sammeltube gestellt.

In einem weiteren Reinigungsschritt wurden 750 νl PE-Puffer, der zuvor mit Ethanol aufgefüllt worden war, auf die Säule gegeben und zweimal für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert, wonach die Sammeltube abermals verworfen wurde. Nun wurde die QIAquick-Säule in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Zur Elution der aufgereinigten DNA aus der Membran der [Seite 51↓]QIAquick-Säule wurde vorsichtig 50 νl PE-Puffer in das Zentrum der Säule pipettiert, für 1 min inkubiert und abermals für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Die aufgereinigte DNA befand sich nun im Eppendorf-Gefäß, die QIAquick-Säule wurde verworfen.

Cycle Sequencing

Das Cycle Sequencing entspricht einer linearen Amplifizierung der DNA, da man nur einen einzigen Primer verwendet, wobei die Sequenzabschnitte nicht vollständig amplifiziert werden, sondern der Vorgang mit Hilfe von Didesoxynukleotiden während ihrer Verlängerung durch die Taq-Polymerase bei statistisch berechenbarer, unterschiedlicher Sequenzlänge abgebrochen wird. Die Konzentration der Didesoxynukleotide muß so gewählt werden, daß am Ende der Reaktion alle verschiedenen Sequenzlängen in für die anschließende Auswertung ausreichender Menge vorliegen. Im Gegensatz zur PCR kann hier allerdings das entstehende Tochtermolekül nicht als neues Template zur Verfügung stehen.

Für das Cycle Sequencing wurden 2,5 νl aufgereinigtes PCR-Produkt in eine GeneAmp-Tube pipettiert und jeweils 0,5 νl des Vorwärts- und des Rückwärtsprimers hinzugegeben. Das Gemisch wurde jeweils mit 2 νl Ready-to-use-Dye-Terminator-Mix versehen und in den TRIO-Thermoblock überführt.

Die Bedingungen für das cycle sequencing:

95° C

2 min

 

95° C

15 sec

ù

60° C

20 sec

ú30 Zyklen

60° C

30 sec

û

4° C

¥

 

Nukleotid-Entfernung

Die Entfernung überschüssiger Nukleotide wurde mit Hilfe des Nucleotide Removal Kit von Quiagen durchgeführt. Hierzu wurden 5 νl PCR-Produkt mit 50 νl PN-Puffer durchmischt, in eine QIAquick-Säule, die in einem Sammeltube steht, überführt und für eine Minute bei 6000 [Seite 52↓]rpm zentrifugiert. Nach Überführung der QIAquick-Säule in eine neue Sammeltube wurden 750 νl PE-Puffer zugegeben und abermals bei 6000 rpm eine Minute lang zentrifugiert. In einer neuen Sammeltube wurde das Gemisch danach für eine Minute bei 13000 rpm zentrifugiert. Hiernach wurde die Säule in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gestellt, 100 νl H2O in das Zentrum der Säule pipettiert und nach einer einminütigen Inkubation für eine weitere Minute bei 13000 rpm zentrifugiert.

In einer Speed Vacuum Schleuder („Centrivac“) wurde das Produkt anschließend für mindestens zwei Stunden eingedampft.

Das eingedampfte Reaktionsprodukt wurde in 6 νl Formamid EDTA (bestehend aus 5 νl Formamid und 1 νl 50 mM EDTA) aufgenommen, für zwei Minuten bei 95° C erhitzt und sofort im Eisbad abgekühlt. Anschließend wurden die Proben aufgetragen.

Sequenziergel

Zunächst wurden die Gelplatten mit Leitungswasser und Spülmittel (Alconox) gereinigt und mit Kimwipes trockengerieben. Zur Entfernung von Harnstoffresten wurden die Platten hiernach mit H2O dest. abgespült. Anschließend wurden die Platten in korrekter Weise aufeinandergelegt und mittels Glasplattenklemmen zusammengehalten.

Für die Sequenzierung wurde ein 6 % Polyacrylamidgel nach folgender Rezeptur hergestellt:

Ansatz:

33,0 g

Harnstoff

 

14,0 ml

5 x TBE-Puffer

 

19,0 ml

H20

 

10,0 ml

Acrylamidlösung

Der Ansatz wurde in ein Bechergefäß überführt und unter mäßigem Rühren auf 50° C erhitzt. Kurz vor dem Gießen des Gels wurden noch 28 νl TEMED und 175 νl 10% Ammoniumpersulfat hinzugegeben und das Gel möglichst blasenfrei zwischen den Glasplatten gegossen. Zur Bildung einer geraden Kante an der Plattenoberseite wurde ein Vorkamm eingesetzt und das Gel in ca. 1 Stunde auspolymerisiert.


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Nachdem das Gel auspolymerisiert war, wurden die Klemmen entfernt und die Glasplatten in den Sequenzer 373 A eingesetzt. In Ablesehöhe des Lasers wurden die Glasplatten abermals mit H2O gereinigt, um letzte Verunreinigungen zu entfernen. Die Reinheit der Glasplatten wurde anschließend mit Hilfe des Rechners überprüft und die Reinigung solange wiederholt, bis am Rechner kein Hintergrund mehr erkennbar war.

Als Laufpuffer wurde TBE-Puffer von GIBCO verwendet und nach Einsetzen der oberen Pufferkammer beide Pufferkammern eingefüllt. Der Vorkamm wurde gezogen und der Haifischkamm unter Beachtung der Kerbe mittig eingesetzt. Nach Spülen der so gebildeten Taschen mit TBE-Puffer wurden je 2 νl der Proben in die Taschen aufgetragen.

Der Vorlauf erfolgte über eine Stunde, die Elektrophorese über Nacht für 10 h bei konstant 40 W.

Die Ergebnisse der Sequenzierung wurden mit Hilfe der Tetra Analyze Software von SoftGene ausgewertet.


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25.11.2003