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3  Ergebnisse

3.1 Methodenetablierung

Eine Methode der Detektion von Trinukleotid-Expansionen der zellulären GPX beschrieben Shen et al.82. Sie bestimmten die Anzahl der Repeats mittels PCR und anschließender Autoradiographie, bei der Radioisotope, in diesem Fall 1νCi [a-32P]dCTP, in die Sequenzierungsprimer eingebaut wurden.

Diese Methode hat drei wesentliche Nachteile:

  1. Sie erweist sich als sehr zeitintensiv, da vier Sequenzierungsreaktionen nötig sind (je eine für jeden der dNTP-Terminatoren). Durch die hohe Anzahl an Arbeitsschritten ist die Gefahr von Meßungenauigkeiten dementsprechend erhöht.
  2. Durch die hohe Zeitintensität der Methode ist sie mit einem hohen materiellen Aufwand verbunden.
  3. Aufgrund der energiereichen β-Strahlung bei dieser Methode ist auch das gesundheitliche Risiko zu berücksichtigen.

So stand zu Beginn dieser Arbeit die Etablierung einer einfachen, kostengünstigen und weniger gesundheitsschädlichen Methode zur Detektion der Trinukleotid-repeats der GPX-1.

3.1.1 Primerwahl

Bei der Suche nach der Primerwahl entschied man sich in dieser Arbeit für einen Vorwärts- und vier Rückwärtsprimer, deren Struktur im Kapitel 2.2.3 bereits dargestellt ist. Ihre jeweiligen Schnittstellen im betroffenen 1. Exon der kodierenden Sequenz von GPX-1 ist in nachfolgender Abbildung dargestellt:


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Abb. 4: GPX-1Gensequenz von bp 2460-2899; 1. Exon grau unterlegt; Trinukleotid-Repeats fett, die verwendeten Primer sind als Pfeile eingetragen

Aus der Abbildung wird ersichtlich, daß sich für jede Primerkombinationen PCR-Produkte – je nach Anzahl der Trinukleotid-Repeats von unterschiedlicher Länge ergaben:

F1/R1:

133 bp

(bei drei GCG Repeats)

F1/R1a:

319 bp

(bei drei GCG Repeats)

F1R1b:

343 bp

(bei drei GCG Repeats)

F1/R1c:

203 bp

(bei drei GCG Repeats)


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Bei der Kombination der unterschiedlichen Primer zeigten sich folgende Ergebnisse, wobei die PCR-Produkte zunächst auf 100x260x5 mm großen Polyacrylamid-(PAA)gelen mit dem Vernetzungsgrad T30C4 in 12%iger Konzentration aufgetragen wurden:

F1/R1: Die qualitativen und quantitativen Ergebnisse der PCR waren gut, allerdings zeigte sich, daß sich die PCR-Produkte im PAA-Gel zu wenig auftrennen, so daß sie sich nicht eindeutig klassifizieren ließen. Ein Beispiel für diese Primerkombination zeigt die nachstehende Abbildung:

Abb. 5: PCR mit den Primern F1/R1 (Proben der Kontrollgruppe); Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min, aufgetragen auf kleines T12C4-Gel; Spur 1 und Spur 18: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 17: unterschiedliche DNA-Proben; das PCR-Fragment mit den Trinukleotid-Repeats befindet sich in der obersten, dicken Bande

F1/R1a/R1b/R1c: Die Kombination des funktionierenden Vorwärtsprimers mit neuen Rückwärtsprimern hatte das Ziel, das PCR-Produkt zu verlängern, um so die Spezifität der PCR zu erhöhen und die Klassifizierung der PCR-Fragmente zu erleichtern.

Trotz zahlreicher Versuche, unter verschiedenen Bedingungen die optimale Annealing-Temperatur der Primer am Robocycler herauszufinden, zeigten sich bei diesen Kombinationen keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Schon die quantitative Ausbeute der PCR-Produkte reichte nicht aus, um mit diesen Primerkombinationen aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.

So wurde anschließend wieder zu der funktionierenden Primerkombination F1/R1 zurückgegangen und versucht, das PCR-Ergebnis auf andere Art zu optimieren, um die unterschiedlichen Allele sichtbar zu machen.

Dies konnte zunächst allein durch Bestimmung der optimalen Annealing-Temperatur nicht erreicht werden. Auch eine Ermittlung der optimalen Elektrophoresebedingungen (schließlich [Seite 57↓]5°C, 500 V, 50 mA, 25W, 60 min) brachte keine wesentlich bessere Auftrennung der PCR-Produkte.

So wurde schließlich versucht, auf einem anderen Weg das PCR-Produkt zu verkleinern, um eine bessere Auftrennung der unterschiedlichen Allele zu erreichen.

Hierzu bediente man sich der Methode des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP).

3.1.2 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus

Bei der Methode des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) schneiden spezifische Restriktionsendonukleasen das PCR-Produkt an bestimmten Stellen und zerteilen es somit in eine – je nach verwendetem Restriktionsenzym – unterschiedliche Anzahl von Fragmenten. Da diese Fragmente ein kleineres Molekulargewicht besitzen, fällt eine Auftrennung im PAA-Gel leichter und kleine Größenunterschiede der einzelnen Amplifikate lassen sich leichter detektieren.

In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Restriktionsenzyme verwendet, deren Endonuklease-Eigenschaften bereits in Kapitel 2.2.8 dargestellt wurden.

Nachstehende Grafik zeigt, an welchen Stellen die verwendeten Restriktionsenzyme das PCR-


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Abb. 6: PCR-Produkt F1/R1 und die Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme; Trinukleotid-Repeats fett dargestellt

Zunächst wurde ein RFLP mit dem Enzym Cfo I unternommen, wobei sich immer noch keine Unterschiede in der Basenpaargröße der verschiedenen Allele ausmachen ließ, so daß die Ergebnisse in dieser Form nicht zu verwerten waren.

Anschließend wurde ein sog. double digest unternommen, bei dem zwei verschiedene Restriktionsenzyme miteinander kombiniert werden um eine noch größere Fragmentierung des PCR-Produktes zu erreichen. Man verwendete hierzu die Restriktionsenzyme Hae I und Hae II.

Hierbei ließ sich erstmalig makroskopisch ein verändertes Laufverhalten der unterschiedlichen Allele ausmachen, allerdings waren die Unterschiede der Allele sehr klein und damit schwer zu klassifizieren. Die nachfolgende Abbildung zeigt ein Beispiel hierfür.


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Abb. 7: RFLP des PCR-Produktes von F1/R1 mit Hae II und Hae III (Proben der Kontrollgruppe); Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; aufgetragen auf kleines T12C4-Polyacrylamid-Gel; Spur 1 und Spur 23: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 22: unterschiedliche DNA-Proben; anhand der dicken unteren Banden läßt sich das unterschiedliche Laufverhalten der Genotypen erkennen

So wurde nachfolgend versucht, durch eine Veränderung der Geleigenschaften das Laufverhalten der PCR-Fragmente zu optimieren. Ziel war es hierbei, das entscheidende PCR-Fragment mit den Trinukleotid-Repeats so aufzutrennen, daß die unterschiedlichen Allele genau auszuwerten waren.

3.1.3 Geloptimierung

Das Verhalten von geladenen Teilchen wie z.B. Nukleinsäuren im elektrischen Feld ist von unterschiedlichen Faktoren abhängig.

Zunächst ist zwischen den Elektroden ein leitendes Medium notwendig, das zahlreiche negative wie positive Ionen enthält, so daß zwischen den Elektroden Strom fließen kann. Dies führt zur Elektrolyse des Wassers, so daß sich an der negativen Elektrode Wasserstoffgas und eine Base bilden, an der positiven Elektrode entstehen Sauerstoffgas und eine Säure. So kann sich die negativ geladene Nukleinsäure im elektrischen Feld zur positiven Elektrode bewegen, ein Vorgang, bei dem Energie in Form von Wärme frei wird („Joulesche Wärme“). Mit welcher Geschwindigkeit Nukleinsäuren wandern, hängt vor allem von der Spannung ab, die als „Anstoß“ für die Ladungen dient.

Daneben hängt die Geschwindigkeit der geladenen Moleküle zusätzlich von der Gesamtzahl der Ladungen und der Masse der einzelnen Moleküle ab. Je mehr negative Ladungen das Molekül besitzt, desto schneller ist seine Wanderungsgeschwindigkeit und je größer das Molekül ist, desto langsamer kommt es voran. Bei Nukleinsäuren führt das konstante Verhältnis von Ladung [Seite 60↓]und Größe – eine negative Ladung pro Phosphat in der Kette- zu einer konstanten Geschwindigkeit großer und kleiner Nukleinsäuren. So muß auf andere Weise versucht werden, unterschiedlich große Nukleinsäuren voneinander zu trennen. Dazu bedient man sich eines Molekularsiebes, in dem große Moleküle langsamer wandern als Kleine, da sie häufiger mit der Siebmatrix kollidieren. Als eine solche Siebmatrix dienen die PAA-Gele.

Polyacrylamid polymerisiert nach Zugabe eines Katalysators zu langen Ketten, die durch Zugabe eines Quervernetzers die oben beschriebene Siebmatrix bilden. Die Porengröße dieses Siebes läßt sich demnach durch eine Veränderung der Polyacrylamidkonzentration und der Quervernetzung beeinflussen.

In dieser Arbeit wurden Gele mit einer 12%, 15% und 30%igen Polyacrylamidkonzentration, sowie einer 0,5%, 2% und 4%igen Bis-Acrylamid-Konzentration als Quervernetzer verwendet.

Anhand der Abbildung 6 läßt sich erkennen, daß eine eindeutige Auftrennung der PCR-Produkte nicht möglich ist. Die hieraus gewonnenen Ergebnisse ließen sich für eine wissenschaftliche Verwertung nicht exakt genug bestimmen.

So bestand der nächste Versuch darin, durch Veränderungen der Geleigenschaften und der Laufzeiten der Elektrophorese eine bessere Auftrennung zu erhalten, da sich so der Abstand zwischen den in der Gelmatrix hängengebliebenen Nukleinsäuren vergrößern wurde.

Die bis zu diesem Zeitpunkt für diese Arbeit verwendeten Gele wiesen jedoch nur eine Länge von 100 mm auf, so daß bei einer Verlängerung der Laufzeit die entscheidenden Fragmente am Gelende kumulieren würden und so eine Unterscheidung unmöglich wäre. Daher wurden nun Gele mit einer Länge von 200 mm verwendet, bei denen die Elektrophoresedauer von anfangs 60 min auf 1 h 40 min verlängert werden konnte.

Hierbei zeigte sich erstmalig die Möglichkeit einer exakten Zuordnung der gewonnenen PCR-Produkte. Die Genauigkeit ließ sich nun abermals durch eine Veränderung der PAA-Konzentration und der Quervernetzung optimieren, so daß schließlich die einzelnen Allele eindeutig zu bestimmen waren und die Ergebnisse verwertet werden konnten.

Die folgende Abbildung zeigt ein Beispiel für das optimale Ergebnis der PCR und macht die Beurteilung der Ergebnisse deutlich.


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Abb. 8: PCR mit den Primern F1/R1 (Proben der Kontrollgruppe); aufgetragen auf ein großes T15C4-PAA-Gel Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; äußere Spuren: 100 bp-DNA-Leiter, dazwischen: unterschiedliche DNA-Proben; Unterscheidung erfolgt durch die Zusatzbanden, die für jeden Genotyp spezifisch sind

Analog hierzu zeigt die nachfolgende Abbildung die optimierten Bedingungen der Elektrophorese und der Polyacrylamidgele für den RFLP.


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Abb. 9: RFLP des PCR-Produktes F1/R1 mit Hae II und Hae III (Proben der Kontrollgruppe); aufgetragen auf ein großes T15C4-PAA-Gel Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; Spur 1 und Spur 26: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 25: unterschiedliche DNA-Proben; die Unterscheidung ist durch das für jeden Genotyp spezifische Laufverhalten der kräftigsten Banden möglich

3.1.4 Sequenzierung

Die durch die PCR mit den Primern F1/R1 gewonnenen Amplikons wurden anschließend aus Gründen der Qualitätssicherung sequenziert. Hierbei wurde überprüft, ob durch die verwendeten Primer wirklich das gesuchte Fragment des 1. Exons der GPX-1 amplifiziert wurde oder ob die Primer an irgendeiner anderen Stelle des Genoms schneiden und somit ein völlig anderes Produkt amplifizieren, das zufällig eine ähnliche Länge aufweist wie das in dieser Arbeit gesuchte Fragment.

Für die Sequenzierung bediente man sich der in Kapitel 2.2.9 bereits beschriebenen Methode nach Sanger, wobei stellvertretend für die anderen Proben ein homozygotes PCR-Produkt sequenziert wurde.

Bei der Auswertung des sequenzierten PCR-Produktes zeigte sich, daß es sich zweifelsfrei um das gesuchte Fragment im 1.Exons des GPX-1-Gens handelt.

So wurde nachgewiesen, daß es sich bei dem PCR-Produkt um die gesuchte Gensequenz mit dem zu untersuchenden Trinukleotid-Repeat handelt.


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3.2  Darstellung der optimierten Methode

So lassen sich abschließend folgende methodische Bedingungen für die optimale Auswertung des GCG-Repeats im 1. Exon der GPX-1 formulieren:

  1. Ansatz des PCR-Mastermixes mit den oben beschriebenen Primern F1/R1 mit folgenden Konzentrationen:

H20

14,75 νl

 

Vorwärtsprimer

1 νl

(Konzentration 10 νM)

Rückwärtsprimer

1 νl

(Konzentration 10 νM)

10 x PCR-Puffer

2,5 νl

 

DNTPs

2 νl

 

Taq-Polymerase

0,15 νl

 

DNA-Template

2,5 νl

 

  1. PCR des Ansatzes unter folgenden Bedingungen:

95° C

3 min

 

95° C

30 sec

ù

66° C

30 sec

ú 40 Zyklen

72° C

30 sec

û

10° C

¥

 

  1. RFLP des PCR-Produktes mit Hae II und Hae III für 2 h 30 min bei 37° C.

  1. Elektrophorese der gewonnenen Produkte auf T15C4-PAA-Gelen unter folgenden Bedingungen:

Temperatur

5 ° C

Spannung

1000 V

Stromstärke

150 mA

Leistung

60 W

Dauer

2 h

  1. Visualisierung der Ergebnisse mittels Silberfärbung.

3.3 Versuchsergebnisse

3.3.1 Patientenproben

Shen et al.82 ermittelten die Verteilung ihrer im Jahre 1994 bei 55 zufällig ausgewählten Proben gefundenen Trinukleotid-Expansion nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz. Sie fanden für die einzelnen Repeats folgende Häufigkeiten:

Abb. 10:Allel-Häufigkeiten der GPX-1 ermittelt nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz durch Shen et al. in Genomics 1994; 23, 292-294

So war das nächste Ziel dieser Arbeit nach der erfolgreichen Methodenetablierung die Überprüfung dieses durch Shen et al. ermittelten Verteilungsmusters. Hierzu wurde das Patientenkollektiv mittels der oben genannten PCR-Methode und anschließendem RFLP durchuntersucht.

Folgende Abbildung zeigt den Ausschnitt eines Gels einer PCR, auf dem alle Genotypen der GPX-1 dargestellt sind. Die Unterscheidung erfolgt anhand der spezifischen Zusatzbanden, auf deren Herkunft in der Diskussion noch eingegangen wird.


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Abb. 11: PCR aller GPX-Genotypen; aufgetragen auf T15C4-Gel; Spur 1: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 3: Genotyp 5*5; Spur 3: Genotyp 4*5; Spur 4: Genotyp 6*6; Spur 5: Genotyp 4*5, Spur 6: Genotyp 5*5; Spur 7: Genotyp 4*6; Spur 8: Genotyp 4*6; Spur 9: Genotyp 4*4; Spur 10: Genotyp 4*5; Spur 11: Genotyp 5*6; Spur 12: Genotyp 4*6; Spur 13: Genotyp 4*4; Spur 14: Genotyp 4*5; Spur 15: Genotyp 4*6; Spur 16: Genotyp 4*6; Spur 17: Genotyp 6*6; Spur 18: Genotyp 4*6; Spur 19: Genotyp 4*5; Spur 20: Genotyp 4*4; Spur 21: Genotyp 4*5; Spur 22: Genotyp 5*5; Spur 23: Genotyp 4*6; Spur 24: Genotyp 4*4; Spur 24: 100 bp-DNA-Leiter

Analog hierzu zeigt nachstehende Abbildung das Gel eines RFLP, auf dem alle unterschiedlichen Genotypen der GPX-1 dargestellt sind. Die Unterscheidung der einzelnen Genotypen erfolgt anhand des unterschiedlichen Laufverhaltens der, die Trinukleotide beinhaltenden Fragmente.

Abb. 12: RFLP aller GPX-Genotypen; aufgetragen auf T15C4-Gel; Spur 1: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2: Genotyp 6*6; Spur 3: Genotyp 4*4; Spur 4: Genotyp 4*6; Spur 5: Genotyp 5*5; Spur 6: Genotyp 4*5; Spur 7 und 8: Genotyp 4*6; Spur 9: Genotyp 4*5; Spur 10: Genotyp 4*4; Spur 11: Genotyp: 5*6; Spur 13: 100 bp-DNA-Leiter


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Nach dem Screening der Patientenproben wurde die absolute Allelanzahl, die Allelfrequenz, die Genotypanzahl und die Genotypfrequenz jeweils nach PCR und nach RFLP ermittelt. Hierbei ergaben sich folgende Häufigkeiten, wobei die Bezeichnung „Erwartet“ die anhand der Allelfrequenzen nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz errechneten Genotypfrequenzen bezeichnet:

Abb. 13: Übersicht der gefundenen GPX-1-Genotypen und -Allele bei den untersuchten ALS-Patienten; der p-Wert gibt die Überprüfung der statistischen Signifikanz an

3.3.2 Kontrollgruppe

Nachdem die Allel-Häufigkeiten für die Patientenproben ermittelt waren, wurde die gleiche Versuchsreihe auf eine Kontrollgruppe angewendet, um die bisher gewonnenen Daten miteinander vergleichen zu können.

Nachfolgend sind – analog zu der Patientengruppe- die gewonnenen Daten der Kontrollgruppe aufgeführt.


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Abb. 14: Übersicht der gefundenen GPX-1-Genotypen und -Allele bei der untersuchten Kontrollgruppe, der p-Wert gibt die Überprüfung der statistischen Signifikanz an

3.3.3 Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen

Die nachfolgende Tabelle zeigt zum besseren Vergleich eine Zusammenfassung der Ergebnisse beider Kollektive. Anhand der statistischen Auswertung läßt sich erkennen, daß der p-Wert des Chi2-Testes –je nach Rundung- im Bereich der Signifikanz liegt.


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Abb. 15:Vergleich der Ergebnisse des ALS-Kollektiv mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe; der p-Wert des Chi2-Test befindet sich im Bereich der statistischen Signifikanzgrenze

Bei nachfolgendem Diagramm sind die Allelfrequenzen der Patienten- und Kontrollgruppe nach erfolgtem RFLP miteinander aufgetragen. Eine Aussage über die absoluten Häufigkeiten der Allele und der Genotypen war wegen der unterschiedlichen quantitativen Größe beider Gruppen nicht wissenschaftlich verwertbar.

Abb. 16: Allelfrequenzen der GPX-1 von ALS-Patienten und Kontrollgruppe

In folgender Abbildung sind die Genotypfrequenzen der Patienten- und Kontrollgruppe zum besseren Vergleich graphisch gegeneinander aufgetragen.


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Abb. 17:Genotypfrequenzen der GPX-1 von ALS-Patienten und Kontrollgruppe

3.3.4 Vergleich der Kontrollgruppe mit Literaturdaten

Analog zu den vorherigen Darstellungen zeigt das nachstehende Diagramm den Vergleich der Allelfrequenzen der Kontrollgruppe mit den bisher veröffentlichten Literaturdaten.

Abb. 18:GPX-1-Allelfrequenzen im Vergleich mit bisher veröffentlichten Literaturdaten

Der Vergleich zwischen den Häufigkeiten der Genotypen der Kontrollgruppe mit den Literaturdaten ergab folgendes Diagramm.


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Abb. 19: GPX-1-Genotypen der Kontrollgruppe im Vergleich mit bisher veröffentlichten Literaturdaten


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25.11.2003