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4  Diskussion

4.1 Methodenetablierung

Zu Beginn der Arbeit stand die Aufgabe der Etablierung einer reproduzierbaren, einfachen, günstigen und ungefährlichen Methode zur quantitativen Bestimmung der Trinukleotid-Repeats im 1. Exon der GPX-1 im Vordergrund. Dies wurde mittels der Methode der PCR mit anschließendem RFLP erreicht, wobei als erfolgreiche Primerkombination die Primer F1/R1 ausgemacht wurden. Die Schnittstelle des Primers F1 lag dabei 42 bp vor dem Beginn des 1. Exons, die Schnittstelle von R1 lag 36 bp hinter dem zu untersuchenden GCG-Repeat. Die Qualitätssicherung erfolgte durch Sequenzierung nach der Methode von Sanger et al..

Bei der PCR besteht das Risiko der Generierung von Sequenzveränderungen, was auf einer in-vitro-Fehlerrate der Taq-DNA-Polymerase beruht. Bevorzugt kommt es zum Austausch einzelner Basen (v.a. Cytosin zu Thymin), nur selten treten Deletionen oder Insertionen einer Base auf. Dabei gewinnt ein solcher Fehler der Taq-Polymerase besonders dann an Bedeutung, wenn er in den ersten Reaktionszyklen auftritt, denn das veränderte Reaktionsprodukt dient in den weiteren Zyklen als Vorlage für die Amplifizierung. Tritt ein solcher falscher Baseneinbau erst in späteren Zyklen auf, so wirkt sich dies nicht mehr so schwerwiegend auf das Gesamtprodukt aus, da nun die überwiegende Mehrheit der exakt amplifizierten PCR-Produkte der vorangegangenen Zyklen als Vorlage dient. Um solche Primerfehler zu vermeiden und die Ausbeute an spezifischen PCR-Produkten zu verbessern, wurde als Taq-Polymerase Amplitaq® GOLD von Perkin Elmer Applied Biosystems eingesetzt.

Die PCR unterliegt einer Vielzahl von Einflußmöglichkeiten, die sie sowohl hemmen als auch beschleunigen können. Zu häufigen Hemmstoffen gehören z.B. Heparin, das bei der Blutgewinnung zur Gerinnungsinhibition beigefügt wird oder andere im Blut enthaltene Substanzverbindungen, wie z.B. Porphyrinverbindungen. Deren Einfluß kann durch Lyse der Erythrozyten und anschließende Abzentrifugation der Leukozyten verringert werden. Die bei der Extraktion der DNA verwendete Proteinase K führt zur Zerstörung der DNA-Polymerase, so daß sie vor Durchführung der PCR entfernt oder zumindest denaturiert werden muß. Daneben gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten von Verunreinigungen der Proben, die ebenfalls Einfluß auf die Funktionstüchtigkeit der PCR haben können.


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Da sich die durch PCR gewonnenen Ergebnisse trotz etlicher Versuche der Optimierung, sowohl der PCR als auch der nachfolgenden Gelelektrophorese, nicht ausreichend voneinander unterschieden, wurde im Anschluß an die PCR ein RFLP durchgeführt, bei dem sich schließlich der double digest mit den Restriktionsenzymen Hae II und Hae III als erfolgreich herausstellte. So konnten die einzelnen Genotypen voneinander unterschieden und deren Verteilung im Patientenkollektiv und der Kontrollgruppe ermittelt werden.

Am Ende der Methodenetablierung ließ sich demnach folgendes feststellen:

  1. Durch eine PCR mit den oben beschriebenen Primern F1/R1 läßt sich die Gensequenz mit dem gesuchten GCG-Repeat amplifizieren. Dieses Ergebnis wurde durch eine nachfolgende Sequenzierung, die als Qualitätskontrolle diente, bestätigt.
  2. Die erhaltenen PCR-Produkte lassen sich mit Hilfe einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese trotz unterschiedlicher Elektrophoresebedingungen und Geleigenschaften nur durch die während der PCR entstehenden spezifischen Zusatzbanden voneinander unterscheiden.
  3. Durch einen sich an die PCR anschließenden RFLP mit nachfolgender Polyacrylamidgel-Elektrophorese lassen sich die einzelnen Genotypen der GCG-Repeats voneinander unterscheiden.

Diese Methode unterscheidet sich von der durch Shen et al.82 veröffentlichten Methode in mehreren Punkten und weist einige Vorteile auf. Shen et al. ermittelten die betreffenden GCG-Repeats mittels PCR und anschließender Autoradiographie, bei der Radioisotope in die Sequenzierungsprimer eingebaut werden. Diese Methode erweist sich als sehr zeitintensiv, da für die Sequenzierung vier Reaktionen nötig – je eine für jeden der dNTP-Terminatoren.

Durch den hohen zeitlichen und materiellen Aufwand handelt es sich auch um eine sehr kostenintensive Methode, die somit nur schwerlich als Routinemethode Verwendung finden dürfte. Zusätzlich erschwerend dürfte hierbei die Tatsache sein, daß diese Methode durch die verwendeten Radioisotope und die damit verbundene energiereiche β-Strahlung eine erhöhte Gesundheitsgefährdung aufweist und verstärkte Schutzvorkehrungen nötig macht.

Die in dieser Arbeit etablierte Methode hat somit gegenüber der bisherigen Methode nicht nur Vorteile durch eine Zeit- und Kostenersparnis, sie zeigt sich durch den Verzicht auf radioaktive Substanzen auch als weniger strahlenintensiv.


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Nicht verschwiegen werden soll hierbei allerdings die Tatsache, daß in der hier verwendeten Methode die Benutzung von Gelen mit Polyacrylamid-Anteil ebenfalls einige Sicherheitsvorkehrungen – wie das Tragen von Mundschutz und Handschuhen und das Arbeiten unter dem Abzug- im Umgang mit gelösten Acrylamid nötig macht, da gelöstes Acrylamid eine karzinogene und neurotoxische Wirkung besitzt.

4.2 Pathogenetische Bedeutung freier Radikale

Der Einfluß von oxidativem Streß im allgemeinen und der Glutathion-Peroxidase im besonderen auf die Pathogenese vieler unterschiedlicher Erkrankungen ist durch zahlreiche Studien belegt worden, wobei die Anhäufung sog. reaktiver Sauerstoffprodukte hierbei eine große Rolle spielt.

Eine kleine Menge solcher Produkte entsteht in allen Zellen bei einer Vielzahl von Vorgängen wie der Signalübertragung, der Aufrechterhaltung des Immunsystems und der Apoptose. Zur Beseitigung der reaktiven Sauerstoffprodukte stehen dem Körper eine Vielzahl von enzymalen Mechanismen – wie z.B. die Katalase, Superoxid-Dismutase und die Glutathion-Peroxidase - und nichtenzymalen Mechanismen – wie β-Carotin, Retinol, Ascorbinsäure und α-Tocopherol - zur Verfügung. Durch erhöhte Produktion oder verringerte Beseitigung solcher reaktiven Sauerstoffprodukte kommt es zu oxidativem Streß und damit zu einer Beeinflussung einer Vielzahl von Stoffwechselvorgängen. So können reaktive Sauerstoffprodukte sowohl direkt Veränderungen an Basenpaarungen bewirken als auch die Konformation der DNA verändern und damit zur Entstehung von Mutationen beitragen. Damit können sie auch die Effektivität der DNA-Reparatur und der DNA-Polymerasen verringern.

Die möglichen Schäden müßen sich jedoch nicht nur auf der Ebene der DNA bewegen, sondern können auch direkt die Proteine betreffen. So kann oxidativer Streß zur Aktivierung von Streßproteinen führen und die Lipidperoxidation fördern, wodurch es zur Aktivierung der Signalübertragung und der Zellproliferation und damit zu einem Einfluß auf das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und den Zelltod entweder durch Apoptose oder Nekrose kommen kann.

Eine Übersicht über die vielfältigen Zusammenhänge der reaktiven Sauerstoffprodukte gibt nachstehende Graphik:


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Abb. 20: Einfluß der reaktiven Sauerstoffprodukte auf zelluläre Funktionen (oben) und genetische Mutationen (unten); nach: J.M. Matés, F. Sanchés-Jimenéz: Antioxidant enzymes and their implications on pathophysiologic processes; Frontiers in Bioscience 4, d339-345, March 15, 1999

Die Glutathion-Peroxidase gehört zu den wichtigen Enzymen bei der Beseitigung toxischer Stoffwechselprodukte und schützt somit Zellen vor oxidativem Streß. Sie katalysiert die Reduktion einer Vielzahl von Hydroperoxiden, wobei Untersuchungen gezeigt haben, daß sie eine wichtige Funktion vor allem bei der Beseitigung niedriger Konzentrationen von toxischen Sauerstoffprodukten besitzt. Bei höheren Konzentrationen und somit größerer Gefahr für eine Zellschädigung scheint die ebenfalls zur Gruppe der Radikalenfänger gehörende Katalase eine größere Rolle zu spielen88.

4.3 Oxidativer Streß und Krankheiten

Eine Zusammenhang zwischen oxidativem Streß und verschiedenen Krankheiten ist nach den oben aufgeführten Einflüssen auf pathophysiologische Vorgänge wahrscheinlich und durch zahlreiche Studien bereits beschrieben worden. Die Breite an Krankheiten reicht hierbei von [Seite 75↓]pathophysiologischen Veränderungen - wie z.B. der Verringerung der Glutamatkonzentration während des Vorganges des Alterns60-, über Allergien, benigne und maligne Tumorerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen. Alle Erkrankungen hier aufzuzählen, bei denen sich pathologische Veränderungen der Mechanismen zur Beseitigung reaktiver Sauerstoffprodukte nachweisen ließen, würde den Rahmen dieser Arbeit sprengen, daher soll hier nur kurz auf einige Zusammenhänge zwischen verschiedenen Erkrankungen und der GPX eingegangen werden.

So ist der Einfluß der SOD und GPX auf unterschiedlichste Varianten von Nahrungs- und Arzneimittelallergien beschrieben worden89,90,91,101. Genauso spielt sie eine Rolle bei der Entstehung der arteriellen Hypertonie und anderer kardiovaskulärer Erkrankungen92,93, bei denen sich auch eine verminderte Aktivität der GPX-3 nachweisen ließ94,95. Es ließ sich auch ein Zusammenhang zwischen Helicobacter pylori assoziierten Gastritiden herstellen96 und man fand eine Erhöhung der SOD- und GPX-Aktivität bei intermittierender akuter Porphyrie97, bei benignen und malignen Mamma-Tumoren98,102 und bei einer Vielzahl an Funktionsstörungen der Schilddrüse, wie dem follikulären Adenom und dem papillären oder follikulären Karzinom99. Auch etliche Erkrankungen des glomerulären Apparates der Niere stehen in Zusammenhang mit oxidativem Streß100.

Nicht zuletzt konnte auch bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen, wie M. Alzheimer1 03, M. Huntington104 und M. Parkinson105 ein Zusammenhang zwischen der Pathophysiologie und GPX bzw. SOD hergestellt werden.

4.4 Trinukleotid-Expansion und Krankheiten

Nach der Entdeckung von Trinukleotid-Repeats im Genom wurden diese zunächst für Normvarianten ohne Einfluß auf Struktur und Funktion der DNA gehalten. Dies änderte sich jedoch, als man herausfand, daß solche Trinukleotid-Repeats expandieren können und so zur Entstehung von verschiedenen Krankheiten beitragen können. Trotz der unterschiedlichen Krankheiten, die sie hervorrufen können, haben sich einige Gemeinsamkeiten der Repeats herausgestellt.

Zunächst verhält sich ein mutierter Repeat sowohl in somatischen Zellen als auch in Keimzellen instabil und er neigt in nachfolgenden Replikationen eher zu Expansionen als zu Verkürzungen. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß sich ein kurzer Repeat noch relativ stabil verhält und nur zu geringen Expansionen neigt, er aber ab einer bestimmten Länge instabil wird, wobei dieser [Seite 76↓]Expansionsschwellenwert nicht automatisch für die Manifestation der Erkrankung erforderlich ist113. Außerdem korreliert eine zunehmende Länge des Repeats mit einem früheren Krankheitsbeginn und einer schwereren Krankheitsausprägung. Man entdeckte auch die Tendenz, daß die Repeats, die mit einem Funktionsverlust (loss of function) des kodierten Proteins einhergehen, länger sind als diejenigen Repeats, die mit einem zusätzlichen Funktionsgewinn (gain of function) einhergehen. Als Beispiel gilt hier die Expansion des CGG-Repeats bei dem fragilen X-Syndrom auf über 1000 Repeats mit nachfolgendem Funktionsverlust, wohingegen der CAG-Repeat bei spinocerebellärer Ataxie Typ I nur auf 40-81 Repeats expandiert. Hieraus resultiert ein pathologischer Funktionsgewinn113.

Erkrankungen, an deren Pathophysiologie Trinukleotid-Repeats beteiligt sind, können in zwei Untergruppen eingeteilt werden: zunächst die Gruppe, deren Repeat sich im nicht-kodierenden Intron der DNA befindet und die Gruppe, deren Repeat sich im kodierenden Exon befindet.

4.4.1 Krankheiten mit nicht-kodierenden Trinukleotid-Repeats

Die Trinukleotid-Repeats dieser Krankheiten sind charakterisiert durch lange und variable Expansionen. Abgesehen von dieser Gemeinsamkeit unterscheiden sich die Repeats in ihrer Sequenz und in ihrer Lokalisation im jeweiligen Gen, was offensichtlich einen entscheidenden Einfluß auf die unterschiedliche Pathogenese der von ihnen hervorgerufenen Erkrankungen zu haben scheint.

So scheint die Expansion eines CGG-Repeats auf mehr als 230 Tripletts beim fragilen-X-Syndrom zu einer Hypermethylierung im Bereich der Promoter-Region des für die geistige Retardierung verantwortlichen Gens zu führen, wodurch es zu einer verminderten Transkription und damit zu einer verringerten Ausbeute des Genproduktes kommt.

Bei der Friedreich-Ataxie scheint der lange GAA-Repeat Interferenzen während der Transkription zu verursachen, indem er die DNA in einer Triplex-Struktur stabilisiert.

Die Expansion eines CTG-Repeats im Intron des Gens für eine Protein-Kinase bei myotoner Dystrophie könnte deren Transkription und/oder Translation oder auch die Expression benachbarter Gene beeinflussen. Ähnlich verhält es sich bei der CTG-Repeat-Expansion bei spinocerebellärer Ataxie Typ VIII oder der CAG-Expansion bei Typ XII106.


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4.4.2  Krankheiten mit kodierenden Trinukleotid-Repeats

Bei diesen Erkrankungen befinden sich die Expansionen der Trinukleotid-Repeats im Exon und sind deutlich kürzer als die nicht-kodierenden Trinukleotid-Expansionen. Alle Erkrankungen sind durch progressive neuronale Dysfunktion geprägt, die typischerweise im mittleren Lebensalter beginnt und in einer schweren Neurodegeneration endet. Man vermutet als pathogenetische Ursache eine Destabilisierung der ursprünglichen Proteinkonformation und eine Bildung von Proteinaggregaten, die sich beispielsweise bei. M. Huntington als Kerneinschlüsse im Neuropil nachweisen lassen oder mit anderen Proteinen, wie z.B. Caspasen, in Interaktion treten können107.

So ließ sich beim Kennedy-Syndrom (= spinale und bulbäre Muskelatrophie) eine CAG-Repeat-Expansion im 1. Exon des Androgen-Rezeptor-Gens ermitteln, wobei die Anzahl der Repeats von 11-33 bei Gesunden auf 38-62 bei Erkrankten anstieg108. Auch bei M. Huntington, spinozerebellärer Ataxie Typ I, II, VI und VII und der dentatorubralen pallidolusysianen Atrophie ließ sich eine CAG-Expansion in unterschiedlichen Genen ausmachen109,110.

Eine GCG-Expansion in einem Exon, wie sie auch in dieser Arbeit vorliegt und die in Polyalanin-Ketten übersetzt wird, fand sich bisher bei der Synpolydaktilie, der cleido-cranialen Dysplasie und der oculo-pharyngealen muskulären Dystrophie113.

4.5 Schädigungsmechanismen der Trinukleotid-Expansionen

Wie können solche Trinukleotid-Expansionen nun Einfluß auf die Pathogenese dieser unterschiedlichen Erkrankungen nehmen? Hierzu gibt es bis heute einige theoretische Ansätze, wobei sich herauszustellen scheint, daß die Mechanismen verschieden sind. Dafür spricht die Tatsache, daß sich Trinukleotid-Expansionen sowohl an 5´- und 3´-Enden der DNA (sog. UTR´s = untranslated regions) finden lassen, die nicht übersetzt werden, als auch in kodierenden Exons110.

Eine Theorie zur Entstehung der Trinukleotid-Expansionen ist die Verschiebung der Insertionsstellen der DNA-Polymerase. Hierbei folgt der vorübergehenden Trennung der beiden DNA-Stränge eine fehlerhafte Wiederverknüpfung der Stränge während der Replikation der DNA mit der Bildung einer kleinen Schlinge (loop). Wenn diese Schlinge nicht durch Exo-, Endonukleasen und DNA-Polymerasen repariert wird, kommt es entweder zu einer Verlängerung (wenn sie in dem Strang entsteht, der verlängert wird), oder zu einer Verkürzung [Seite 78↓]der DNA (wenn sich die Schlinge in dem Strang befindet, der als Muster zur Replikation zur Verfügung steht)114.

In einer anderen Theorie treten die Expansionen während der Bildung der sog. Okazaki-Fragmente auf mit der Folge einer fehlerhaften DNA-Verschiebung. Okazaki-Fragmente entstehen während der Replikation am DNA-Folgestrang, der hierbei mit Hilfe von RNA-Primern an verschiedenen Stellen gleichzeitig synthetisiert wird. Die einzelnen Replikationsfragmente bezeichnet man als Okazaki-Fragmente. Obwohl eine solche Verschiebung einen Angriffsort für Endonukleasen mit dem Ziel der Reparatur darstellen würde, könnte die DNA durch die Bildung einer sog. Haarnadel (hairpin) resistent gegenüber Endonukleasen sein.

Nachfolgende Graphik soll die Entstehungsmechanismen von Trinukleotid-Expansionen verdeutlichen:

Abb. 21: Zwei Modelle zur Entstehung von Trinukleotid-Expansionen; (a) Expansion als Folge einer Verschiebung der DNA-Polymerase:(1) Die DNA-Stränge dissoziieren während der Replikation (2) Während der Wiederanlagerung entsteht ein hairpin im Tochterstrang (3) Wenn der loop nicht repariert wird, kommt es zur Expansion; (b) Expansion als Folge einer Verschiebung des Okazaki-Fragmentes: (1´) Synthese verschiebt sich am 5´-Ende des benachbarten Okazaki-Fragmentes (2´) Der entfernte Strang klappt aufeinander und bildet ein hairpin (3´) Während der Synthese und Ligation der Stränge kommt es zur Trinukleotid-Expansion

Nach: Proc Natl Acad Sci USA Vol. 96, Issue 4, 1504-1509, February 16, 1999


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Die Entstehung solcher loops oder hairpins könnte nicht nur zu einer erhöhten Instabilität des Repeats beitragen, sie könnte auch Veränderungen der Sekundär- und Tertiärstruktur der DNA bewirken110, also die räumliche Struktur der DNA beeinflussen, und damit neue Interaktionen mit anderen Proteinen ermöglichen. So zeigten lineare DNA-Sequenzen mit Trinukleotid-Expansionen ein anormales Laufverhalten während der Polyacrylamidgel-Elektrophorese, was auf neue bzw. veränderte biophysikalische Eigenschaften zurückgeführt werden könnte115. CTG-Repeats lassen sich z.B. leichter in Nukleosomen organisieren als DNA mit Mischsequenzen, CGG-Repeats lassen sich dagegen nur schlecht in Nukleosomen integrieren, was u.a. an ihrer veränderten Flexibilität zu liegen scheint und für die Regulation der Genexpression und Transkription von wichtiger Bedeutung ist117.

Chastain et al. zeigten, daß selbst kurze Trinukleotid-Sequenzen eine große Fähigkeit besitzen, die Rotationsfähigkeit der DNA deutlich zu erhöhen116. Hinsichtlich der Flexibilität hat sich gezeigt, daß der GCG-Repeat im Vergleich zu anderen Repeats am flexibelsten ist und somit am ehesten zur Deformierung der Sekundärstruktur führen kann110. Dies wiederum hat einen direkten Einfluß auf die Aktivität der DNase I, die wesentlich eher an geknickter als an linearer DNA bindet und schneidet118.

So fanden Moore et al. heraus, daß DNA-loops mit CNG (N steht hierbei für eine beliebige Purin- oder Pyrimidinbase) während der Meiose nur sehr unzureichend repariert werden, AGT/ACT-Repeats durchschnittlich und AAG/CTT- sowie CAA/TTG-Repeats sofort repariert werden. Sie folgerten hieraus, daß CTG, CAG, CCG oder CGG, aber nicht AAG oder CTT in der Lage sind, in vivo hairpins zu bilden114, wobei sie die Eigenschaften der Basenpaarung und nicht so sehr die eigentliche DNA-Sequenz für die Ineffizienz der DNA-Reparatur verantwortlich machten.

So könnte die Expansion von Trinukleotid-Repeats auf unterschiedliche Weise auf die Sekundärstruktur der DNA einwirken. Zum Einen könnten hairpin-Strukturen der DNA eine Verschiebung der DNA-Polymerase bewirken, was die Bildung von DNA-loops und damit die zusätzliche Instabilität zur Folge hätte.

Zum Zweiten könnten hairpins auch resistenter gegenüber Endonukleasen sein und damit zur weiteren Expansion beitragen. Zuletzt könnte die Änderung der DNA-Sekundärstruktur zu einer verringerten Aktivität der DNA-Polymerase führen, was wiederum die Wahrscheinlichkeit von Basenverschiebungen oder Rekombinationen erhöhen würde.

Weitere Unterschiede der Repeats gibt es hinsichtlich ihrer sog. hotspot-Aktivität. Hierunter versteht man ihre Fähigkeit, während der Meiose DNA-Rekombinationen zu ermöglichen. Solche hotspots finden sich in der DNA häufig an Sequenzwiederholungen, also an einzelnen [Seite 80↓]Nukleotidketten, Di-, Tri- oder Tetranukleotid-Repeats, die eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für Spontanmutationen aufweisen115.

4.6 Interpretation

Die durch diese Arbeit gewonnenen Ergebnisse bedürfen einer ausführlichen Interpretation, um sie in den Zusammenhang mit bereits erworbenen Erkenntnissen zu setzen und neue Forschungsansätze zu formulieren, wobei die Ausführungen zur Etablierung der Methode bereits in Kapitel 4.1 dargelegt wurden.

In Anlehnung an Kapitel 3.3.3 sollen zunächst die gewonnenen Patientendaten in Bezug auf die Kontrollgruppe analysiert werden. Hierbei zeigt sich hinsichtlich der Allelfrequenz ein –statistisch gesehen - nur grenzwertig signifikanter Unterschied, die Genotypfrequenzen unterscheiden sich jedoch deutlich: In der Patientengruppe ist der Genotyp 4*5 signifikant häufiger vertreten als in der Kontrollgruppe, in der dagegen der Genotyp 5*6 deutlich häufiger vertreten ist. Da in beiden Gruppen nach der identischen Methode vorgegangen wurde, kann die Ursache dieser Differenzen nicht an der Methodik liegen. Neben der Möglichkeit, daß der Genotyp 4*5 mit einem erhöhten sALS-Erkrankungsrisiko behaftet ist, könnten diese Unterschiede auch andere Ursachen haben.

Eine Möglichkeit liegt im Altersunterschied der beiden Gruppen. Der Altersdurchschnitt der Patientengruppe war nicht bekannt, ist jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach in mittleren bis höheren Altersabschnitten anzusiedeln, da es sich bei ALS um eine Erkrankung des mittleren und höheren Lebensalters handelt. Der Altersdurchschnitt der Kontrollgruppe ist ebenfalls nicht bekannt, da es sich jedoch um eine randomisierte Auswahl an Medizinstudenten handelt, ist zu erwarten, daß sich der Altersunterschied deutlich unterhalb dem der Patientengruppe befinden dürfte. Die Gefahr, daß sich in dieser Gruppe potentielle Patienten mit genetischer Prädisposition befinden dürften, bei denen aufgrund ihres niedrigen Lebensalters die ALS klinisch noch nicht manifest geworden ist und die so zu einer Verfälschung der Ergebnisse beitragen würden, dürfte bei einer ALS-Inzidenz von ca. 1 zu 100000 als gering betrachtet werden und so die unterschiedlichen Ergebnisse nicht ausreichend erklären.

Ähnlich verhält sich die Problematik durch eventuelle Rassenunterschiede. Sowohl bei der Patienten- als auch bei der Kontrollgruppe dürfte es sich um einen Querschnitt der deutschen [Seite 81↓]Bevölkerung gehandelt haben, wobei Unterschiede der Genotypen auch hierin begründet sein könnten.

Forsberg et al.119 beschrieben kürzlich einen weiteren Polymorphismus im Gen der GPX-1. Sie beschrieben eine Prolin/Leucin-Variante an Position 197, die durch einen C/T-Austausch an Position 3428 des GPX-1-Gens zustande kommt. Trotz des Polymorphismus fanden sie keine veränderte GPX-Aktivität bei 315 Individuen und keine Häufung des Polymorphismus bei 101 Patienten mit cerebralem Insult. Die Verteilung des Polymorphismus unterschied sich jedoch im Vergleich von finnischer mit schwedischer Bevölkerung. Ferner stellten sie folgenden Zusammenhang zwischen dem gefundenen Polymorphismus und den hier untersuchten Trinukleotid-Repeats fest: Das Allel, das für Leucin kodiert, tritt zusammen mit 5 GCG-Repeats auf, wohingegen das Allel, das für Prolin kodiert, mit dem Auftreten von 4 und 6 GCG-Repeats korreliert.

Somit könnten die unterschiedlichen Genotypfrequenzen in vorliegender Arbeit auch auf eine unterschiedliche Verteilung des durch Forsberg et al. beschriebenen Polymorphismus zurückzuführen sein. Hierzu wäre es von Interesse, die Verteilung dieses Polymorphismus sowohl in einem Querschnitt der deutschen Bevölkerung zu bestimmen, da sich hinsichtlich dessen Verteilung bereits signifikante Unterschiede zwischen schwedischer und finnischer Bevölkerung ergeben haben, als auch dessen Verteilung bei den vorliegenden Proben der ALS-Patienten zu bestimmen. Dazu müßten die vorliegenden Proben mittels single-stranded-conformational-polymorphism-Elektrophorese (SSCP) untersucht werden, womit sich einzelne Punktmutationen mit geringem Aufwand detektieren lassen. Hiernach würden sich folgende Rückschlüsse ziehen lassen:

  1. Wie verteilt sich der Prolin/Leucin-Polymorphismus im Querschnitt der deutschen Bevölkerung ?
  2. Wie verteilt sich der Prolin/Leucin-Polymorphismus bei ALS-Patienten und ist bei dieser Verteilung ein Unterschied zwischen ALS-Patienten und Kontrollgruppe festzustellen?
  3. Besteht ein Zusammenhang zwischen dem gefundenen Polymorphismus und der Verteilung der GCG-Repeats bei ALS-Patienten und in der Kontrollgruppe?

In diesem Zusammenhang wäre es von Interesse, das GPX-1-Gen mittels oben erwähnter SSCP bzw. Sequenzierung auf weitere Polymorphismen hin zu untersuchen. Im Anschluß hieran müßte [Seite 82↓]erforscht werden, ob sich auch bei etwaigen weiteren Polymorphismen ein Zusammenhang mit der Verteilung der GCG-Repeats bestimmen läßt.

Beim Vergleich der Verteilung der GCG-Repeats zwischen der gesunden Kontrollgruppe und der durch Shen et al. beschriebenen Verteilung der GCG-Repeats in zufällig ausgewählten Proben ergab sich folgendes Ergebnis: wie in Kapitel 3.3.5 graphisch dargestellt, ließ sich kein signifikanter Unterschied der in der Literatur beschriebenen Verteilung des GCG-Repeats im Vergleich zu der hier verwendeten gesunden Kontrollgruppe darstellen, allerdings war bei der verwendeten Kontrolle der Genotyp 4*4 signifikant häufiger vertreten, wohingegen in der Literatur die Genotypen 4*5 und 4*6 häufiger beschrieben wurden. Worin könnten die Ursachen dieser unterschiedlichen Verteilung liegen?

Zunächst kann man hier methodische Aspekte in Erwägung ziehen. Shen et al. entdeckten damals die Expansion des GCG-Repeats mittels PCR, die allerdings mit Hilfe unterschiedlicher Primer durchgeführt wurde, und anschließender Autoradiographie. Sie ermittelten die Allelhäufigkeit nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz, wodurch sich die unterschiedlichen Ergebnisse erklären ließen. Sie errechneten also die einzelnen Genotyp-Häufigkeiten anhand der wahrscheinlichen Verteilung der Allel-Häufigkeiten, ohne jede einzelne Probe nach der Häufigkeit der Repeats zu untersuchen. Ein Grund für diese Vorgehensweise mag darin liegen, daß ihr Kollektiv lediglich aus 55 zufällig ausgewählten DNA-Proben bestand.

Ein weiterer Unterschied könnte in der Auswahl des untersuchten Kollektivs zu finden sein. In der Studie von Shen et al. wird nicht erwähnt, welchen Altersdurchschnitt das ausgewählte Kollektiv hatte. Genauso wenig wird die ethnische Herkunft des Kollektivs berücksichtigt, also aus welchen Bevölkerungsgruppen es sich rekrutierte. Da die Studie in Massachusetts durchgeführt wurde, ist jedoch davon auszugehen, daß es sich nicht um einen Querschnitt der deutschen Bevölkerung handelt wie in vorliegender Arbeit. Die unterschiedliche ethnische Verteilung des durch Forsberg entdeckten Prolin/Leucin-Polymorphismus mit dem oben beschriebenen Zusammenhang des GCG-Repeats würde Vermutungen auf eine unterschiedliche ethnische Verteilung des GCG-Repeats zulassen. Anlaß für solche Vermutungen würde auch die Entdeckung geben, daß afro-amerikanische Kinder eine höhere Aktivität der GPX-1 aufweisen als kaukasische Kinder120. Bei einem elektrophoretisch durch Beutler et al.121 nachgewiesenen Polymorphismus der GPX-1 wurden durch Meera Khan et al. unterschiedliche Verteilungen [Seite 83↓]zwischen afro-jamaikanischen, indischen und holländischen Populationen gefunden122. Diese Ergebnisse stützen die Vermutung einer unterschiedlichen ethnischen Verteilung des GCG-Repeats, was die Differenzen zu den Ergebnissen der Shen-Studie erklären könnte. Dies würde jedoch eine weitere Abklärung nötig machen. Ein Ansatz wäre, in zukünftigen Studien die ethnische Verteilung des GCG-Repeats zu bestimmen und einen eventuellen Zusammenhang mit dem durch Forsberg et al. ermittelten Polymorphismus herzustellen, genauso wie die ethnische Verteilung eventuell noch zu entdeckender GPX-1-Polymorphismen zu klären.

Shen et al. konnten in ihrer Studie keine Unterschiede der GPX-1-Aktivität trotz unterschiedlicher GCG-Repeats feststellen, wobei sie die Aktivität spektrophotometrisch bestimmten. Die verwirrenden und zum Teil widersprüchlichen Ergebnisse zur GPX-Aktivität, die bereits in Kapitel 1.6.4.7 ausführlich dargestellt wurden, geben jedoch Anlaß, das Ergebnis von Shen et al. zu hinterfragen. Wodurch lassen sich so unterschiedliche Befunde erklären und welche Rückschlüsse für zukünftige Studien lassen sich hieraus ziehen?

Die Aktivität eines Enzyms stellt stets eine Mischung aus alleiniger spezifischer Enzymaktivität und der entsprechenden Expressionsrate des dazugehörigen Gens dar. Um daher zu einem aussagekräftigen Ergebnis der Enzymaktivität zu kommen, müßte bei jeder durchgeführten Aktivitätsbestimmung gleichzeitig auch die genaue Molekülmenge erfasst werden, was z.B. mit Hilfe eines Immunoassays mittels spezifischer Antikörper bzw. der quantitativen Bestimmung der mRNA möglich wäre. So könnte eine Änderung der Enzymaktivität aufgrund einer veränderten spezifischen Aktivität von derjenigen abgegrenzt werden, die aufgrund einer veränderten Expressionsrate zustande kommt. Obwohl dies zu aussagekräftigeren Ergebnissen führen würde, wurde dieser Tatsache von den meisten Autoren nicht Rechnung getragen.

So läßt sich im nachhinein nicht nachvollziehen, ob die durch Shen et al. gemessene unveränderte Enzymaktivität wirklich ihre Ursache in einer Unabhängigkeit von der Expansion der GCG-Repeats findet, oder ob sie durch eine Veränderung des Verhältnisses der spezifischen Aktivität zur Expressionsrate zustande gekommen ist. Ähnlich verhält es sich in der Studie von Forsberg et al., die trotz des Prolin/Leucin-Polymorphismus keine veränderte Enzymaktivität ermittelten, hierbei aber ebenfalls nicht den Einfluß der Genexpression berücksichtigten.

Die oben beschriebenen unterschiedlichen Einflüsse von Trinukleotid-Repeats auf die Sekundär- und Tertiärstruktur der DNA können zu deutlichen Veränderungen der Expression des jeweiligen Gens führen. So kann durch solche Expansionen die Integrationsfähigkeit der DNA in [Seite 84↓]Nukleosomen und Histonen beeinflußt werden. Dies führt zu einer Veränderung der Genaktivität, da die Transkription nur in histonfreien DNA-Abschnitten erfolgen kann.

Durch die Veränderung der dreidimensionalen DNA-Struktur kann auch die Bindungsfähigkeit verschiedener Replikations- und Translationsenzyme beeinflusst werden und so eine Veränderung der Genexpression bewirken.

Nicht zuletzt kann durch die Entstehung von loops oder hairpins die räumliche Struktur der DNA in einem solchen Maße beeinflußt werden, daß es zu neuen Interaktionen mit anderen Proteinen kommt. Diese Proteine können wiederum zu einer Veränderung der Genexpression als auch zu einer Veränderung der Enzymaktivität führen.

Die Enzymaktivität kann jedoch nicht nur durch die oben beschriebenen Faktoren der Genexpression und die Interaktion mit Proteinen, die als Aktivatoren oder Inhibitoren wirken können, verändert werden, sondern unterliegt auch noch anderen Einflüssen.

Die Substrate der GPX können - neben den oben beschriebenen Wechselwirkungen mit der DNA - genauso wie die Produkte Einfluß auf die Aktivität der GPX nehmen.

So kann es durch einen Überschuß von Hydroperoxiden zu einer sog. Substrathemmung der GPX kommen. Hierbei kommt es durch an Überangebot von Substrat zur Bildung von sog. Enzym-Substrat-Substrat-Komplexen, die das aktive Zentrum des Enzyms blockieren können und so zu einer Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms führen können.

Genauso kann das Produkt der katalysierten Reaktion auf unterschiedliche Weise die Enzymaktivität hemmen (neg. Rückkopplung), ein Mechanismus, der im Organismus vorzugsweise der Selbstregulation von Enzymen dient.

Diese Tatsachen machen folgende zukünftige Vorgehensweise zum Erhalt aussagekräftiger Ergebnisse erforderlich:

  1. Die Messung der Enzymaktivität sollte immer zusammen mit einer Messung der Genexpression erfolgen.
  2. Die Messung der Enzymaktivität sollte immer zusammen mit einer Konzentrationsmessung der Substrate und Produkte der katalysierten Reaktion erfolgen.

In diesem Kontext sollten auch die Ergebnisse von Przedborski et al. gesehen werden, die in den von ALS betroffenen Hirnregionen verstorbener ALS-Patienten eine signifikante [Seite 85↓]Aktivitätsminderung der GPX feststellten66, aber ebenfalls die obengenannten Einflußmöglichkeiten nicht berücksichtigten.

4.7 Ausblick

Die bisherigen Erkenntnisse zur Pathogenese der ALS machen eine Mitbeteiligung von oxidativem Streß an ihrer Entstehung wahrscheinlich. Dies kann seine Ursache in genetischen Veränderungen der, an der Beseitigung reaktiver Sauerstoffprodukte beteiligten Substanzen haben, kann jedoch auch durch eine vermehrte Produktion solcher Produkte bedingt sein. Genauso können andere – oben beschriebene - Faktoren Einfluß auf die Fähigkeit des Organismus nehmen, solche reaktiven Sauerstoffprodukte rechtzeitig und in ausreichendem Maße zu beseitigen.

Aus den Erkenntnissen dieser Arbeit und den oben beschriebenen multiplen Wechselwirkungen des komplizierten Systems der Entgiftung reaktiver Sauerstoffprodukte ergeben sich für weitere Studien vielfältige Ansatzpunkte, die die Untersuchung weiterer Kandidatengene und die Etablierung von Risikoprofilen zur Folge haben und so hoffentlich die Erkenntnisse zur Pathogenese der ALS vermehren

Ich halte folgende Ansätze für sinnvoll:

  1. Ermittlung der Verteilung des Prolin/Leucin-Polymorphismus der GPX-1 bei den untersuchten ALS-Patienten und der Kontrollgruppe. Danach kann überprüft werden, ob die beschriebene Korrelation zwischen diesem Polymorphismus und den GCG-Repeat-Expansionen auch bei den in dieser Arbeit verwendeten Proben reproduzierbar ist.
  2. Ermittlung der GPX-Aktivität bei vorliegenden ALS-Proben zusammen mit der Ermittlung der Genexpression und der Konzentrationsmessung reaktiver Sauerstoffprodukte, um aussagefähige Ergebnisse über die spezifische GPX-Aktivität, die Genexpression und die Konzentration reaktiver Sauerstoffprodukte in Zusammenhang mit der Trinukleotid-Expansion zu erhalten.
  3. Mutationsscreening im GPX-1-Gen, um weitere Mutationen und deren Einfluß auf die Trinukleotid-Expansion bzw. GPX-Aktivität zu eruieren.


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