Aus der
Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Die Trinukleotid-Expansion des Gens für zelluläre Glutathion-Peroxidase bei Patienten mit sporadischer amyotropher Lateralsklerose

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Jan M. Hille

aus Erlangen

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Stephan Mundlos
2. PD Dr. Thomas Meyer
3. PD Dr. Dietmar Benge

Datum der Promotion: 22.09.2003

Zusammenfassung: Trotz intensiver Forschung ist die Ätiologie der sporadischen amyotrophen Lateralsklerose (sALS) weiterhin unbekannt. Zahlreiche Anzeichen deuten allerdings auf eine Mitbeteiligung von oxidativem Streß an der Pathogenese der sALS hin. So fand sich eine verminderte Aktivität der zellulären Glutathion-Peroxidase (GPX-1), eines als Radikalenfänger fungierenden Enzyms, in den Gyrus praecentrales bei sALS-Patienten.
Zusätzliche Studien fanden eine Trinukleotid-Expansion des GGG-repeats im 1. Exon des für die GPX-1 kodierenden Gens. Da Trinukleotid-Expansionen bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Kennedy-Syndrom und der spinozerebellären Ataxie nachgewiesen werden konnten, war das Ziel dieser Arbeit, eine fragliche Mitbeteiligung dieser Trinkukleotid-Expansion der GPX-1 an der Pathogenese der sALS zu klären.
Nach Etablierung der Methode bestehend aus einer Kombination von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) zeigte sich, dass der Genotyp 4*5 bei einer Gruppe von 231 sALS-Patienten signifikant häufiger vertreten war, wohingegen der Genotyp 5*6 in der Kontrollgruppe signifikant überrepräsentiert war. Im Vergleich zu bisher veröffentlichten Ergebnissen ließ sich der Genotyp 4*4 in der Kontrollgruppe signifikant häufiger nachweisen.
Ursache hierfür könnte – neben einem tatsächlich erhöhten Risiko, an sALS zu erkranken – der Zusammenhang mit einem C/T-Polymorphismus der GPX-1 sein, der zu einem Austausch von Prolin zu Leucin führt. Die für Leucin kodierende Variante tritt hierbei nur zusammen mit 5 GCG-repeats auf, während die für Prolin kodierende Variante mit dem Auftreten von 4 und 6 GCG-repeats korreliert.

Eigene Schlagworte: Amyotrophe Lateralsklerose, Glutathion-Peroxidase, Trinukleotid-Expansion, Polymorphismus

Abstract: In spite of intensive research efforts the ethiology of sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS) remains unknown. Various indices indeed suggest an involvement of oxidative stress in the pathogenesis of sALS. Thus a decreased activity of the cellular glutathione peroxidase (GPX-1) in gyrus praecentrales of sALS patients could be detected, an enzym strongly participating in the clearence of free radicals.
Additional studies uncovered a trinucleotid expansion of a GCG repeat in the 1^st exon of the gene coding for GPX-1. Such trinucleotid expansions play a major role in a variety of neurodegenerative disorders like the Kennedy Syndrom and spinal-cerebellary ataxia. Goal of this work was to disclose a possible involvement of the GCG expansion in the pathogenesis of sALS.
Through the successful establishment of the methodology consisting of a combination of polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) we could demonstrate a significant decrease of the genotype 4*5 in a group of 231 sALS patients, whereas the genotype 5*6 was overrepresented in the control group. Compared to hitherto publications we detected an increased occurrence of the 4*4 genotype in the control group.
Besides an effective increased risk to contract sALS, the distribution of the GCG-repeat expansion could originate from another C/T polymorphism of GPX-1-gene leading to a substitution of proline with leucine. The leucine coding mutation occurs together with 5 GCG repeats, whereas the proline coding mutant correlates with 4 and 6 GCG-repeats.

Eigene Schlagworte: Amyotrophic lateral sclerosis, glutathione-peroxidase, trinucleotid expansion, polymorphism

Diese Arbeit ist von ganzem Herzen meinen Eltern gewidmet.

Amyotrophe Lateralsklerose, Glutathion-Peroxidase, Trinukleotid-Expansion, Polymorphismus

Abstract: In spite of intensive research efforts the ethiology of sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS) remains unknown. Various indices indeed suggest an involvement of oxidative stress in the pathogenesis of sALS. Thus a decreased activity of the cellular glutathione peroxidase (GPX-1) in gyrus praecentrales of sALS patients could be detected, an enzym strongly participating in the clearence of free radicals.
Additional studies uncovered a trinucleotid expansion of a GCG repeat in the 1^st exon of the gene coding for GPX-1. Such trinucleotid expansions play a major role in a variety of neurodegenerative disorders like the Kennedy Syndrom and spinal-cerebellary ataxia. Goal of this work was to disclose a possible involvement of the GCG expansion in the pathogenesis of sALS.
Through the successful establishment of the methodology consisting of a combination of polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) we could demonstrate a significant decrease of the genotype 4*5 in a group of 231 sALS patients, whereas the genotype 5*6 was overrepresented in the control group. Compared to hitherto publications we detected an increased occurrence of the 4*4 genotype in the control group.
Besides an effective increased risk to contract sALS, the distribution of the GCG-repeat expansion could originate from another C/T polymorphism of GPX-1-gene leading to a substitution of proline with leucine. The leucine coding mutation occurs together with 5 GCG repeats, whereas the proline coding mutant correlates with 4 and 6 GCG-repeats.

Amyotrophic lateral sclerosis, glutathione-peroxidase, trinucleotid expansion, polymorphism

Diese Arbeit ist von ganzem Herzen meinen Eltern gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Definition der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)
  • 1.2 Geschichte der ALS
  • 1.3 ALS-Formen
    • 1.3.1 Klassische und familiäre Form
    • 1.3.2 Bulbär- und Pseudobulbärparalyse
    • 1.3.3 ALS-Parkinson-Demenz-Komplex
    • 1.3.4 ALS-PUMNS
    • 1.3.5  Primär spastische ALS
  • 1.4 Epidemiologie der ALS
  • 1.5  Verlauf der ALS
  • 1.6 Ätiopathogenese der ALS
    • 1.6.1 Autoimmunphänomene
    • 1.6.2 Neurotrope Viren
    • 1.6.3 Exogene Neurotoxine
    • 1.6.4  Molekularbiologische Ursachen
      • 1.6.4.1 Trophische Faktoren
      • 1.6.4.2 Glutamat und andere Neurotransmitter
      • 1.6.4.3 Oxidativer Streß
      • 1.6.4.4 Cu/Zn-Superoxid-Dismutase
      • 1.6.4.5 Peroxynitrit
      • 1.6.4.6 Glutathion
      • 1.6.4.7 Glutathion-Peroxidase
      • 1.6.4.8 Sonstige genetische Ursachen
      • 1.6.4.9 Trinukleotid-Expansion
  • 1.7 Herleitung der Fragestellung
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Proben
    • 2.1.2 DNA-Extraktion
    • 2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
    • 2.1.4 Polyacrylamidgele
    • 2.1.5 Gelelektrophorese
    • 2.1.6 Silberfärbung
    • 2.1.7 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
    • 2.1.8 Sequenzierung
  • 2.2  Methoden
    • 2.2.1 Proben
    • 2.2.2 DNA-Extraktion
    • 2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
    • 2.2.4 Polyacrylamidgele
    • 2.2.5 Gelelektrophorese
    • 2.2.6 Silbernitratfärbung
    • 2.2.7 Reamplifikation des PCR-Produktes
    • 2.2.8 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
    • 2.2.9 Sequenzierung
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Methodenetablierung
    • 3.1.1 Primerwahl
    • 3.1.2 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
    • 3.1.3 Geloptimierung
    • 3.1.4 Sequenzierung
  • 3.2  Darstellung der optimierten Methode
  • 3.3 Versuchsergebnisse
    • 3.3.1 Patientenproben
    • 3.3.2 Kontrollgruppe
    • 3.3.3 Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen
    • 3.3.4 Vergleich der Kontrollgruppe mit Literaturdaten
• 4  Diskussion
  • 4.1 Methodenetablierung
  • 4.2 Pathogenetische Bedeutung freier Radikale
  • 4.3 Oxidativer Streß und Krankheiten
  • 4.4 Trinukleotid-Expansion und Krankheiten
    • 4.4.1 Krankheiten mit nicht-kodierenden Trinukleotid-Repeats
    • 4.4.2  Krankheiten mit kodierenden Trinukleotid-Repeats
  • 4.5 Schädigungsmechanismen der Trinukleotid-Expansionen
  • 4.6 Interpretation
  • 4.7 Ausblick
• 5  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Abkürzungen

Bilder

• Abb. 1: Substanzen mit Einfluß auf oxidativen Streß und deren Gegenspieler; nach: F. Facchinetti, V.L. Dawson, T.M. Dawson: Free radicals as mediators of neuronal injury; Cell Mol Neurobiol 18(6); 667-682; 1998
• Abb.2:Glutathion-Stoffwechsel
• Abb. 3: Allel-Häufigkeiten der GPX-1 ermittelt nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz durch Shen et al. in Genomics 1994; 23, 292-294
• Abb. 4: GPX-1Gensequenz von bp 2460-2899; 1. Exon grau unterlegt; Trinukleotid-Repeats fett, die verwendeten Primer sind als Pfeile eingetragen
• Abb. 5: PCR mit den Primern F1/R1 (Proben der Kontrollgruppe); Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min, aufgetragen auf kleines T12C4-Gel; Spur 1 und Spur 18: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 17: unterschiedliche DNA-Proben; das PCR-Fragment mit den Trinukleotid-Repeats befindet sich in der obersten, dicken Bande
• Abb. 6: PCR-Produkt F1/R1 und die Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme; Trinukleotid-Repeats fett dargestellt
• Abb. 7: RFLP des PCR-Produktes von F1/R1 mit Hae II und Hae III (Proben der Kontrollgruppe); Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; aufgetragen auf kleines T12C4-Polyacrylamid-Gel; Spur 1 und Spur 23: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 22: unterschiedliche DNA-Proben; anhand der dicken unteren Banden läßt sich das unterschiedliche Laufverhalten der Genotypen erkennen
• Abb. 8: PCR mit den Primern F1/R1 (Proben der Kontrollgruppe); aufgetragen auf ein großes T15C4-PAA-Gel Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; äußere Spuren: 100 bp-DNA-Leiter, dazwischen: unterschiedliche DNA-Proben; Unterscheidung erfolgt durch die Zusatzbanden, die für jeden Genotyp spezifisch sind
• Abb. 9: RFLP des PCR-Produktes F1/R1 mit Hae II und Hae III (Proben der Kontrollgruppe); aufgetragen auf ein großes T15C4-PAA-Gel Elektrophoresebedingungen 5° C, 60 W, 1000 V, 100 mA, 1 h 40 min; Spur 1 und Spur 26: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2 bis Spur 25: unterschiedliche DNA-Proben; die Unterscheidung ist durch das für jeden Genotyp spezifische Laufverhalten der kräftigsten Banden möglich
• Abb. 10:Allel-Häufigkeiten der GPX-1 ermittelt nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz durch Shen et al. in Genomics 1994; 23, 292-294
• Abb. 11: PCR aller GPX-Genotypen; aufgetragen auf T15C4-Gel; Spur 1: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 3: Genotyp 5*5; Spur 3: Genotyp 4*5; Spur 4: Genotyp 6*6; Spur 5: Genotyp 4*5, Spur 6: Genotyp 5*5; Spur 7: Genotyp 4*6; Spur 8: Genotyp 4*6; Spur 9: Genotyp 4*4; Spur 10: Genotyp 4*5; Spur 11: Genotyp 5*6; Spur 12: Genotyp 4*6; Spur 13: Genotyp 4*4; Spur 14: Genotyp 4*5; Spur 15: Genotyp 4*6; Spur 16: Genotyp 4*6; Spur 17: Genotyp 6*6; Spur 18: Genotyp 4*6; Spur 19: Genotyp 4*5; Spur 20: Genotyp 4*4; Spur 21: Genotyp 4*5; Spur 22: Genotyp 5*5; Spur 23: Genotyp 4*6; Spur 24: Genotyp 4*4; Spur 24: 100 bp-DNA-Leiter
• Abb. 12: RFLP aller GPX-Genotypen; aufgetragen auf T15C4-Gel; Spur 1: 100 bp-DNA-Leiter; Spur 2: Genotyp 6*6; Spur 3: Genotyp 4*4; Spur 4: Genotyp 4*6; Spur 5: Genotyp 5*5; Spur 6: Genotyp 4*5; Spur 7 und 8: Genotyp 4*6; Spur 9: Genotyp 4*5; Spur 10: Genotyp 4*4; Spur 11: Genotyp: 5*6; Spur 13: 100 bp-DNA-Leiter
• Abb. 13: Übersicht der gefundenen GPX-1-Genotypen und -Allele bei den untersuchten ALS-Patienten; der p-Wert gibt die Überprüfung der statistischen Signifikanz an
• Abb. 14: Übersicht der gefundenen GPX-1-Genotypen und -Allele bei der untersuchten Kontrollgruppe, der p-Wert gibt die Überprüfung der statistischen Signifikanz an
• Abb. 15:Vergleich der Ergebnisse des ALS-Kollektiv mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe; der p-Wert des Chi2-Test befindet sich im Bereich der statistischen Signifikanzgrenze
• Abb. 16: Allelfrequenzen der GPX-1 von ALS-Patienten und Kontrollgruppe
• Abb. 17:Genotypfrequenzen der GPX-1 von ALS-Patienten und Kontrollgruppe
• Abb. 18:GPX-1-Allelfrequenzen im Vergleich mit bisher veröffentlichten Literaturdaten
• Abb. 19: GPX-1-Genotypen der Kontrollgruppe im Vergleich mit bisher veröffentlichten Literaturdaten
• Abb. 20: Einfluß der reaktiven Sauerstoffprodukte auf zelluläre Funktionen (oben) und genetische Mutationen (unten); nach: J.M. Matés, F. Sanchés-Jimenéz: Antioxidant enzymes and their implications on pathophysiologic processes; Frontiers in Bioscience 4, d339-345, March 15, 1999
• Abb. 21: Zwei Modelle zur Entstehung von Trinukleotid-Expansionen; (a) Expansion als Folge einer Verschiebung der DNA-Polymerase:(1) Die DNA-Stränge dissoziieren während der Replikation (2) Während der Wiederanlagerung entsteht ein hairpin im Tochterstrang (3) Wenn der loop nicht repariert wird, kommt es zur Expansion; (b) Expansion als Folge einer Verschiebung des Okazaki-Fragmentes: (1´) Synthese verschiebt sich am 5´-Ende des benachbarten Okazaki-Fragmentes (2´) Der entfernte Strang klappt aufeinander und bildet ein hairpin (3´) Während der Synthese und Ligation der Stränge kommt es zur Trinukleotid-Expansion