Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Transmitter als Botenstoffe im Organismus

Die Aufrechterhaltung sämtlicher Körperfunktionen sowie die angepaßte Reaktion des Organismus auf interne Signale und externe Reize erfordert die Kommunikation unterschiedlicher Zellen und Gewebe miteinander. Spezialisierte Zellen kommunizieren über freigesetzte Botenstoffe wie Neurotransmitter, Hormone oder Wachstumsfaktoren. Eine übergeordnete Rolle bei der Kontrolle und Steuerung der Körperfunktionen kommt dabei Gehirn und Rückenmark, dem Zentralen Nervensystem, zu. Die Struktur des menschlichen Gehirns bilden etwa einhundert Milliarden (1011) Nervenzellen sowie die zehnfache Anzahl an Gliazellen. Eine einzelne Nervenzelle, das Neuron, kann wenige Hundert bis etwa 200.000 synaptische Kontakte ausbilden, an denen die Informationsübertragung über Neurotransmitter stattfindet.

Eine Vielzahl von Substanzen, die den Kriterien eines Neurotransmitters entsprechen, sind bisher charakterisiert worden. Sie lassen eine Einteilung in drei Klassen sinnvoll erscheinen:

Einfache Aminosäuren wie Glutamat, gamma-Aminobuttersäure (GABA) oder Glyzin werden von 90 % aller Synapsen des ZNS als Neurotransmitter verwendet und sind für die schnelle synaptische Übertragung verantwortlich (Nicholls, 1994). Glutamat repräsentiert dabei den wichtigsten exzitatorischen (aktivierenden), GABA und Glyzin die wichtigsten inhibitorischen (hemmenden) Transmitter des ZNS.

Die zweite Klasse setzt sich aus den klassischen Neurotransmittern zusammen, deren Hauptvertreter Acetylcholin, die Katecholamine Dopamin, Adrenalin und Noradrenalin, sowie Serotonin und Histamin darstellen. Die durch klassische Neurotransmitter vermittelten Effekte zeichnen sich zumeist durch ihren langsamen, oft aktivitätsmodulierenden Effekt aus. Für Acetylcholin gilt dies nur bedingt. Als Transmitter der motorischen Endplatte (Katz et al., 1957) steht Acetylcholin dort beispielhaft für eine schnelle synaptische Übertragung.

Die dritte Klasse besteht aus einer Vielzahl von Neuropeptiden, wie Cholezystokinin, Substanz P oder Somatostatin, die in sehr geringen Konzentrationen im ZNS vorliegen und, überwiegend nicht-synaptisch freigesetzt, ebenfalls modulatorische


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Effekte vermitteln.

Generell können die Effekte über Ionenkanalrezeptoren (ionotrophe) oder G-Protein gekoppelte (metabotrophe) Rezeptoren übertragen werden.

Die Transmitterfreisetzung erfolgt überwiegend über den Mechanismus der Exozytose. In eukaryontischen Zellen existieren zwei unterschiedliche Formen der Exozytose: In allen Zellen findet sich eine konstitutive Sekretion, bei der Vesikel, die dem trans-Golgi Netzwerk enstammen, kontinuierlich zur Plasmamembran transportiert werden und dort mit dieser fusionieren. Dieser Prozeß dient hauptsächlich der Versorgung der Plasmamembran mit Protein- und Lipidkomponenten. Zusätzlich findet sich in vielen Zellen eine regulierte Sekretion, bei der Stoffe in sekretorischen Vesikeln gespeichert und konzentriert werden, bevor sie in die Nähe des Freisetzungsortes transportiert und nur auf einen Stimulus hin freigesetzt werden. Dieser Stimulus besteht zumeist in einer durch Depolarisation der Plasmamembran hervorgerufenen Öffnung von spannungsabhängigen Na+- und Ca2+-Kanälen, die zum Anstieg der intrazellulären Konzentration freier Ca2+-Ionen führt.

1.2 Transporter der Plasmamembran

Synaptische Übertragung beinhaltet die Freisetzung des Transmitters in den synaptischen Spalt, die Interaktion mit einem postsynaptischen Rezeptor und die darauffolgende Entfernung des Transmitters aus dem synaptischen Spalt. Eine schnelle Wiederaufnahme in die präsynaptische Zelle oder auch in Glia Zellen durch spezifische Plasmamembrantransporter ist dabei für die Beendigung der synaptischen Transmission - und damit auch für die physiologische Wirkung - vieler Neurotransmitter essentiell. Plasmamembrantransporter sind integrale Membran-proteine. Die Energie zur Akkumulation der Substrate im Zytosol beziehen sie aus dem elektrochemischen Na+/K+-Ionengradienten über der Plasmamembran, der durch eine membranständige Na+/K+-ATPase generiert wird. Die bekannten Plasmamembrantransporter lassen sich in zwei Unterfamilien gruppieren: Die Hauptvertreter der einen Unterfamilie bilden fünf Glutamattransporter-Subtypen, die in der Genfamilie der exzitatorischen Aminosäure-Transporter (EAAT)

zusammengefaßt werden (Arriza et al., 1994). Ihnen gemeinsam ist der Cotransport von Glutamat mit Natrium und Protonen in die Zelle hinein, im Austausch wird Kalium


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hinaustransportiert. Zwei Topologiemodelle, die von 8 bzw. 10 Transmembrandomänen ausgehen, werden diskutiert (Slotboom et al., 1999). Eine weitgehende Sequenzhomologie zu den Glutamattransportern weisen zwei Transporter für neutrale Aminosäuren, ASCT1 und 2, auf (Arriza et al., 1993). In der anderen Unterfamilie sind eine Reihe von Transportern zusammengefaßt, die GABA, Glyzin, Katecholamine und andere Monoamine akkumulieren (Worrall und Williams, 1994). Hier kommt es zu einem Cotransport des Neurotransmitters mit Natrium und Chlorid in die Zelle. Diese Na+/Cl--abhängigen Transporter unterscheiden sich durch den Besitz von 12 Transmembrandomänen von der Gruppe der Glutamattransporter (Guastella et al., 1990).

1.3 Vesikuläre Speicherung der Transmittersubstanzen

Die Speicherung und Konzentrierung von Neurotransmittern oder auch Hormonen in sekretorischen Vesikeln stellt eine Voraussetzung für die Exozytose dar (Maycox et al., 1990). Eine zusätzliche Bedeutung der vesikulären Speicherung besteht im Schutz der Transmittermoleküle vor enzymatischem Um- oder Abbau, sowie dem Schutz der Zelle selbst vor toxisch wirkenden hohen Konzentrationen einiger Transmitter (Liu und Edwards, 1997).

Neurone und neuroendokrine Zellen speichern ihren Transmitter überwiegend in zwei verschiedenen Klassen von Vesikeln, die sich hinsichtlich ihrer Größe und Proteinzusammensetzung, der Biogenese und dem Mechanismus der regulierten exozytotischen Freisetzung unterscheiden.

In großen Vesikeln (> 70 nm im Durchmesser), die aufgrund ihres Proteingehalts elektronendicht erscheinen, und daher als LDCVs (Large Dense Core Vesicles) oder Granula (in neuroendokrinen Zellen) bezeichnet werden, erfolgt die Speicherung von Neuropeptiden und Hormonen. Letztere werden als Vorläufermoleküle synthetisiert, bevor sie in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums gelangen und über proteolytische Spaltungen und Transport zum Golgi-Komplex zum fertigen Transmitter modifiziert werden. Im trans-Golgi Netzwerk erfolgt die Konzentrierung und Speicherung in LDCVs (de Camilli und Jahn, 1990; Walter und Johnson, 1994).

Im Gegensatz zu Peptiden oder Hormonen werden die klassischen Neurotransmitter entweder im Zytoplasma neu synthetisiert oder über spezifische Transporter der Plasmamembran (s.o.) nach erfolgter exozytotischer Freisetzung wieder aus dem


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Extrazellulärraum aufgenommen (Schloss et al., 1994). Ausschließlich in kleinen (40-50 nm im Durchmesser), elektronenmikroskopisch klaren, und in Neuronen als SSVs (Small Synaptic Vesicles) bezeichneten Vesikeln wird Acetylcholin, GABA, Glyzin oder Glutamat gespeichert (Südhof und Jahn, 1991; Edwards, 1992). Analoga dieses Vesikeltyps, die SLMVs (Synaptic-Like Microvesicles) existieren in neuroendokrinen Zellen. Während LDCVs dem trans-Golgi Netzwerk im Zellkörper entstammen und nach erfolgter Freisetzung des Sekrets für eine erneute Beladung auch dorthin zurücktransportiert werden müssen, entstammen SSVs einem lokalen „Recycling“ aus dem endosomalen Kompartiment in der synaptischen Endigung. Als Auslöser für die regulierte exozytotische Membranfusion der SSVs mit der Plasmamembran fungiert eine sehr schnelle, durch Membrandepolarisation hervorgerufene, starke lokale Erhöhung der Ca2+ Konzentration. Es besteht hier eine sehr enge zeitliche Kopplung zwischen extrazellulärem Signal und Transmitterfreisetzung an den sogenannten „aktiven Zonen“. Im Gegensatz dazu kommt es bei den LDCVs nicht zu einer verstärkten Akkumulation von Vesikeln an den aktiven Zonen, und nur vereinzelt wurden dort exozytotische Ereignisse nachgewiesen. Hauptsächlich findet die Exozytose von LDCVs nicht-synaptisch statt. Es kommt somit nicht zu einer schnellen Bindung des Transmitters an einen postsynaptischen Rezeptor. Die durch Neuropeptide oder Hormone vermittelten langsamen und eher modulatorischen Effekte sind auch in Übereinstimmung mit einer längeren Diffusionsstrecke zu sehen. Die Exozytose von LDCVs ist, anders als bei SSVs, weniger genau an einzelne Aktionspotentiale gekoppelt. Sie erfolgt aufgrund der größeren räumlichen Distanz der Vesikel zu den Ca2+-Kanälen nach höherfrequenter Stimulation mit vergleichsweise langer zeitlicher Latenz auf den Stimulus (Neher, 1998).

In noradrenergen Neuronen findet sich ein weiterer Vesikeltyp, der in der Größe den SSVs entspricht, jedoch nach Behandlung des Gewebes mit Permanganat elektronendicht erscheint. Die Membran dieser SDCVs (Small Dense Core Vesicles) enthält Proteine, die Membrankomponenten sowohl von SSVs als auch von LDCVs darstellen. Die Frage, ob es sich um eine Art Hybrid aus SSVs und LDCVs handelt, wird diskutiert (Bauerfeind et al., 1995).

1.4 Vesikuläre Transporter

Vier verschiedene vesikuläre Transporteraktivitäten sind charakterisiert und die


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verantwortlichen Transporterproteine teilweise kloniert: Die Transporterproteine für Acetylcholin (Parsons et al., 1993) und Glutamat (Naito und Ueda, 1983) erwiesen sich als spezifisch für den jeweiligen Transmitter. Der Acetylcholintransporter VAChT (Vesicular Acetylcholine Transporter) ist kloniert (Roghani et al., 1994). Für die vesikuläre Speicherung von GABA und Glyzin existiert mit dem VIAAT (Vesicular Inhibitory Amino Acid Transporter) ein gemeinsamer Transporter (Burger et al., 1991; Dumoulin et al., 1999). Zusätzlich existieren zwei Transporter für die vesikuläre Speicherung von Monoaminen, also Katecholamine, Serotonin und Histamin.

Die Energie zur Akkumulation von Transmittern in sekretorischen Speicherorganellen beziehen alle bekannten vesikulären Transporter aus einem von innen nach außen gerichteten elektrochemischen Protonengradienten über der Vesikelmembran. Generiert wird dieser Gradient durch eine vesikelständige H+-ATPase, die unter ATP-Spaltung Protonen in das Lumen des Vesikels pumpt und so zu einer Ansäuerung führt (Njus et al., 1986; Nelson, 1992). Sowohl die elektrische Komponente Deltapsi als auch der pH Gradient DeltapH können in unterschiedlichem Ausmaß als treibende Kraft für den Transport der verschiedenen Transmitter in das Speicherorganell dienen.

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Untersuchung der vesikulären Speicherung von Monoaminen sowie die Regulation dieses Transportprozesses, sie wird daher nachfolgend genauer behandelt werden.

1.5 Vesikuläre Speicherung der Monoamine

Im Säugerorganismus sind zwei strukturell sehr ähnliche vesikuläre Monoamintransporter bekannt. Sie unterscheiden sich jedoch bezüglich des Substratspektrums, der Gewebeverteilung und ihrer pharmakologischen Beeinflußbarkeit. Die vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 der Ratte konnten vor einigen Jahren kloniert werden (Liu et al., 1992a/b; Erickson et al., 1992). Zunächst fiel auf, daß sich PC12 Zellen, nicht jedoch CHO Zellen als resistent gegen das Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenylpyridin (MPP+) erwiesen. Durch Selektion von CHO Zellen, die sich nach Transfektion mit einer cDNA Bank aus PC12 Zellen als resistent gegen MPP+ erwiesen, konnte VMAT1 kloniert werden. Die Sequenzanalyse ergab ein Protein, das aus 521 Aminosäuren besteht. Die Analyse einer Gehirn cDNA-Bande ergab ein Protein mit 515 Aminosäuren. Beide Transporter besitzen ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa und weisen 12


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Transmembrandomänen auf (Abbildung 1).

Abbildung 1
Sekundärstruktur von VMAT2 der Ratte (nach Liu und Edwards, 1997)

Sie entsprechen damit einem Topologiemodell, das für alle vesikulären Transporter postuliert wird. Entsprechend diesem Modell besitzen VMAT1 und VMAT2 eine hydrophile Schleife zwischen den Transmembrandomänen (TMD) 1 und 2, die in das Lumen des Vesikels gerichtet ist. Sie enthält für VMAT1 drei, für VMAT2 vier mögliche Glykosylierungsstellen. Sowohl der n-Terminus als auch der c-Terminus befinden sich im Zytoplasma. Der Sequenzvergleich zwischen VMAT1 und VMAT2 ergab eine 78 %ige Homologie der beiden Transporter auf Aminosäureebene (Schuldiner et al., 1995). Die größte Divergenz existiert dabei in der luminalen Schleife.

Interessanterweise existieren starke strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zu einer Gruppe von bakteriellen Transportern, die für die Vermittlung von Antibiotika-Resistenzen verantwortlich sind (Schuldiner et al., 1995). Diese Tatsache läßt den evolutionären Ursprung der vesikulären Monoaminspeicherung in einem phylogenetisch alten „Entgiftungssystem“ vermuten.


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Im Gegensatz zu den spezifischen Transportern der Plasmamembran akzeptieren beide vesikulären Transporter sämtliche Monoamin-Transmitter als physiologische Substrate (Peter et al., 1994). Sowohl VMAT1 als auch VMAT2 besitzen die höchste Affinität für Serotonin, während die Katecholamine Dopamin, Adrenalin und Noradrenalin mit in dieser Reihenfolge abnehmender Affinität als Substrat erkannt werden. Die vesikuläre Speicherung dieser Monoamine stellt mit niedrigen Km-Werten im Bereich zwischen ca. 0,1 bis 2 µM für die humanen VMATs (Schuldiner et al., 1995) einen hochaffinen Transportprozeß dar. Insgesamt weist VMAT2 eine 2 bis 3-fach höhere Affinität für Serotonin und die Katecholamine auf als VMAT1. Ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Transportern besteht in der Fähigkeit, Histamin als Substrat zu verwenden. Sowohl VMAT1 als auch VMAT2 besitzen für Histamin die geringste Affinität, jedoch zeigt VMAT2 noch eine je nach Spezies 30 bis 100-fach höhere Affinität für Histamin als VMAT1 (Schuldiner et al., 1995).

Während für die vesikuläre Speicherung von GABA und Glyzin sowohl die elektrische als auch die chemische Komponente des Protonengradienten nötig sind (Liu und Edwards, 1997), ist für den Monoamintransport lediglich der pH-Gradient von Bedeutung. So kommt es zum Austausch von einem zytoplasmatischen Subtratmolekül gegen zwei Protonen aus dem Lumen des Vesikels (Knoth et al., 1981).

Unterschiede ergeben sich in der Gewebeverteilung zwischen beiden Transportern, ebenso variiert die Verteilung zwischen den untersuchten Spezies. Den überwiegenden Typ des im peripheren Nervensystem und neuroendokrinen Zellen der Ratte exprimierten Transporters stellt VMAT1 dar (Liu et al., 1994; Peter et al., 1995). Die ursprüngliche Bezeichnung CGAT (Chromaffine Granule Amine Transporter) verweist dabei auf das Vorkommen von VMAT1 auf chromaffinen Granula der Zellen des Nebennierenmarks. Im Gegensatz dazu ist VMAT2 der vorwiegend im ZNS exprimierte Transportertyp (Liu et al., 1994; Peter et al., 1995; Erickson et al., 1996). Die ursprüngliche Bezeichnung SVAT (Synaptic Vesicle Amine Transporter) deutet auf diese neuronale Variante des Transporters hin.

Zusätzlich ließ sich VMAT2 ebenfalls in den Histamin-produzierenden ECL- (enterochromaffine-like) Zellen des Magens nachweisen (Dimaline und Struthers, 1996). Im Rind hingegen scheint VMAT2, neben seinem Vorkommen im ZNS, der Transporter des Nebennierenmarks zu sein (Krejci et al., 1993). Die


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immunzytochemische Analyse der Verteilung von VMAT1 und VMAT2 im menschlichen Gewebe (Erickson et al., 1996) belegt das Vorkommen von VMAT1 in einigen Zellen symphatischer Ganglien, in praktisch allen Zellen des Nebennierenmarks sowie den enterochromaffinen Zellen des Duodenums. Im Gegensatz dazu ließ sich VMAT2 besonders stark im ZNS in den dopaminergen Neuronen der Substantia nigra nachweisen. VMAT1 kommt dagegen in allen Zellen des Nebennierenmarks, den ECL-Zellen der Mucosa des Magens und den endokrinen Zellen des Pankreas vor.

Anders als die übrigen klassischen Transmitter werden Monoamine sowohl in LDCVs als auch in SSVs und deren Analoga gespeichert (Johnson, 1988). Die Analyse der subzellulären Verteilung von VMAT1 in chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks der Ratte und der davon abstammenden Phäochromozytom Zellinie PC12 belegt das Vorkommen des Transporters hauptsächlich auf LDCVs (Liu et al., 1994). Die immunzytochemische Untersuchung eines Kerngebietes des Gehirns, des Nucleus tractus solitarius, wies VMAT2 auf SSVs, häufiger jedoch auf „tubovesikulären“ Strukturen und LDCVs katecholaminerger Neurone nach (Nirenberg et al., 1995).

Die Verfügbarkeit verschiedener potenter Inhibitoren der vesikulären Monoamintransporter hat wesentlich zum Verständnis ihrer Aktivität und Bedeutung beigetragen. Das Alkaloid Reserpin wurde als hochwirksames Antihypertensivum eingesetzt, jedoch aufgrund seiner depressionsfördernden Nebenwirkung vom Markt genommen. Reserpin bindet in nanomolaren Konzentrationen nahezu irreversibel an die zytoplasmatische Substratbindungsstelle von VMAT1 und VMAT2 (Darchen et al., 1989; Scherman und Henry, 1984), und führt so zu einer Entleerung zentralnervöser und peripherer Speicherorganellen. Tetrabenazin repräsentiert dagegen einen Inhibitor, der VMAT2 ähnlich stark inhibiert wie Reserpin, jedoch nur eine sehr geringe, im Fall der humanen Variante des Transporters praktisch keine Affinität für VMAT1 besitzt (Erickson et al., 1996). Tetrabenazin bindet nicht an der zytoplasmatischen Substratbindungstelle, sondern vermutlich an einer in das Vesikellumen gerichteten Bindungsstelle (Liu et al., 1994). Radioaktiv markiertes Dihydrotetrabenazin wird in funktionellen PET-Studien (PET: Positronen-Emissions-Tomographie) als Markersubstanz für die Verteilung von VMAT2 im Gehirn eingesetzt. Es besitzt damit eine große Bedeutung für das Studium und die Diagnose


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des Parkinson-Syndroms, indem es den Untergang von dopaminergen Neuronen dokumentiert.

1.6 Regulation der vesikulären Speicherung

Über die Regulation der Aufnahme von Neurotransmittern in sekretorische Vesikel ist noch wenig bekannt. Eine Regulation der vesikulären Transportaktivität bietet die Möglichkeit, die Menge an gespeichertem Transmitter pro Vesikel zu variieren. Eine daraus resultierende variable quantale Freisetzung aus SSVs könnte damit die Aktivität einer Synapse beeinflussen. Ebenso sind Phasen in der Biosynthese sekretorischer Vesikel oder auch im metabolischen Zustand der Zelle denkbar, die eine Regulation der Beladung mit Transmittern erforderlich machen. Einige Arbeiten belegen die Variabilität der gespeicherten und freigesetzten Transmittermenge. So führt die Überexpression des vesikulären Acetylcholintransporters zu einer aktivitätsabhängigen Erhöhung des Acetylcholingehalts im Vesikel (Song et al., 1997). In PC12 Zellen hingegen führt die Aktivierung von Dopamin D2-Autorezeptoren zu einer Reduzierung der quantalen Freisetzung von Dopamin (Photos et al., 1998a). Die Tatsache, daß Monoamine und Acetylcholin, im Gegensatz zu Aminosäuretransmittern, auch in Puffern unterschiedlicher Ionen-Zusammensetzungen und -Konzentrationen stabil gespeichert bleiben (Johnson, 1988), schließt eine Regulation des Transmittergehalts allein durch einen Gleichgewichtsmechanismus, der sich zwischen zytoplasmatischem Milieu und Vesikelinhalt einstellt, weitgehend aus.

Hinweise auf eine differenzielle Genexpression der vesikulären Monoamintransporter ergeben Befunde an chromaffinen Zellen, in denen es während einer Dauerstimulation durch Depolarisierung zwar zu einer Verringerung der Anzahl an Granula, jedoch zu einer Erhöhung der Anzahl an Transportermolekülen pro Granulum kommt (Desnos et al., 1995). In PC12 Zellen führt die Stimulation von c-AMP abhängigen Signalkaskaden zu einer Hemmung der vesikulären Aufnahme von Serotonin (Nakanishi et al., 1995). Jedoch konnte nicht eindeutig gezeigt werden, ob diese Hemmung auf einer Regulation des Transporters oder dem Katecholamin-Metabolismus beruht. Die Tatsache, daß VMAT2, nicht jedoch VMAT1, konstitutiv phosphoryliert wird (Krantz et al., 1997), deutet auf eine mögliche unterschiedliche Regulation der beiden Transporter hin.


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Eine bis dahin unbekannte Form der Regulation vesikulärer Transporter wurde in PC12 Zellen für VMAT1 nachgewiesen: Es kommt dort zu einer Regulation der Aktivität durch ein G-Protein. So hemmt die alpha-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins Go2 die vesikuläre Noradrenalinaufnahme in diese Zellinie. Dabei handelt es sich um eine Interaktion des G-Proteins mit dem Transporter selbst, und nicht um eine durch die Veränderung des Protonengradienten hervorgerufene Modifikation der Transporteraktivität (Ahnert-Hilger et al., 1998).

1.7 Heterotrimere G-Proteine als Bestandteile vieler Signaltransduktions-prozesse

Heterotrimere G-Proteine sind Bestandteile von Signaltransduktionsprozessen in einer Vielzahl von Zellen. Zusammen mit den „kleinen“ monomeren G-Proteinen stellen sie eine Klasse von Guanin-Nukleotid bindenden, membranassoziierten Proteinen dar. Das Heterotrimer setzt sich aus einer alpha-, einer beta- und einer gamma-Untereinheit zusammen. Bekannt sind zur Zeit 23 verschiedene alpha-, 6 verschiedenen beta- und 11 verschiedene gamma-Untereinheiten. Die alpha-Untereinheiten werden auf der Basis ihrer Aminosäuresequenzen und der durch sie vermittelten Effekte in die vier Klassen Gs, Gi/o, Gq und G12 eingruppiert. Die Nomenklatur des Heterotrimers folgt der Identität der alpha-Untereinheit. Die Vielzahl an möglichen Kombinationen der Untereinheiten trägt zur Spezifität und Diversität sowohl der Interaktion zwischen Rezeptor und G-Protein als auch zwischen G-Protein und Effektor bei. Tatsächlich scheinen einige Rezeptortypen für bestimmte Kombinationen von G-Protein Untereinheiten spezifisch zu sein (Kalkbrenner et al., 1996). Alle heterotrimeren G-Proteine folgen einem gemeinsamen Aktivierungs-/ Inaktivierungszyklus, der eine reversible und spezifische Signaltransduktion erlaubt: Der erste Schritt der Aktivierung besteht in der Interaktion des G-Proteins mit einer zytoplasmatischen Domäne eines meist Liganden-aktivierten, heptahelikalen Rezeptors (Gudermann et al., 1995), aus der ein Austausch von an die alpha-Untereinheit gebundenem GDP gegen GTP resultiert. Die so aktivierte alpha-Untereinheit dissoziiert daraufhin vom betagamma-Komplex ab. Sowohl die alpha-Untereinheit als auch der betagamma-Komplex können nun zu einer Modulation verschiedener Effektor-Proteine führen. Die Inaktivierung erfolgt durch eine intrinsische GTPase Aktivität der alpha-Untereinheit, die zur hydrolytischen Spaltung


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von GTP zu GDP und freiem Phosphat führt. Die inaktivierte alpha-Untereinheit löst sich vom Effektor und kann mit einem betagamma-Komplex wieder zu einem Heterotrimer reassoziieren, welches dann erneut für eine Aktivierung zur Verfügung steht. Diese Form der reversiblen Kopplung der einzelnen Komponenten der Signaltransduktion bietet den Vorteil einer vielfachen Verstärkung des extrazellulären Signals bereits auf der Ebene des G-Proteins. So aktiviert allein ein Rhodopsin-Lichtrezeptor der Retina bis zu 3000 G-Proteine in einer Sekunde (Hargrave et al., 1993).

Die durch heterotrimere G-Proteine der Plasmamembran vermittelten Effekte sind vielfältig. So aktivieren die alpha-Untereinheiten der GS -Unterklasse Adenylylzyklasen und Calcium-Kanäle (Iyengar, 1993). Die Aktivierung von Galphai2, einem Mitglied der Gi Unterklasse, führt dagegen zu einer Hemmung der Adenylylzyklase-Aktivität (Nürnberg et al., 1995). Hauptsächlich im Gehirn und neuroendokrinen Zellen werden die beiden Subtypen Galphao1 und Galphao2 exprimiert. Sie stellen alternative Splicing-Varianten des Galphai2 Gens dar und vermitteln unter anderem die Hemmung von spannungsgesteuerten Calcium-Kanälen (Nürnberg et al., 1994). Die ubiquitär exprimierten alpha-Untereinheiten der Gq Unterklasse führen hauptsächlich zu einer Stimulation der Aktivität von Phospholipasen des Typs C-beta (Sternweis et al., 1992). Auf sehr niedrigem Niveau erfolgt die Expression von alpha-Untereinheiten der G12 Unterklasse, die unter anderem ein Rolle bei der Tumorgenese zu spielen (Xu et al., 1994).

Plasmamembranständigen Gbetagamma Untereinheiten konnten Interaktionen etwa mit spannungsgesteuerten Calcium-Kanälen (Ikeda, 1996), Kalium-Kanälen (Cohen et al., 1996) oder Phosphoinositol-3-Kinasen (Leopoldt et al., 1998) nachgewiesen werden.

Neben ihrer Existenz auf der Plasmamembran konnten G-Proteine ebenfalls auf Membranen intrazellulärer Organellen nachgewiesen werden. Über ihre Funktion auf diesen Kompartimenten ist wenig bekannt. Die Ausbildung verschiedener Hüll-Proteine von Vesikeln des Golgi-Komplexes scheint der Regulation durch ein heterotrimeres G-Protein der Pertussis Toxin sensitiven Gi/o-Klasse zu unterliegen (Ktistakis et al., 1992). Ebenso existieren Befunde, die auf eine Regulation der Synthese von Vesikeln des trans-Golgi Netzwerks durch ein extra großes G-Protein hinweisen (Kehlenbach et al., 1994). Immunzytochemische Untersuchungen konnten


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komplette Sets heterotrimerer G-Proteine sowohl auf chromaffinen Granula von Nebennierenmarkszellen als auch auf SSVs von Neuronen nachweisen (Ahnert-Hilger et al., 1994). Aus diesen Beobachtungen ergeben sich Fragen nach weiteren Funktionen von G-Protein Untereinheiten auf sekretorischen Speicherorganellen. Wie erwähnt, belegen erste Ergebnisse die Beteiligung eines heterotrimeren G-Proteins bei der Kontrolle der Aktivität von VMAT1 in PC12 Zellen. Da diese Ergebnisse lediglich von einer einzelnen Zellinie stammen, ist unklar, ob ein solcher Mechanismus generell in monoaminergen Zellsystemen und Geweben existiert.

1.8 Fragestellung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Regulation der Aktivität vesikulärer Monoamintransporter durch heterotrimere G-Proteine in verschiedenen Systemen untersucht werden. Im einzelnen standen folgende Fragen im Mittelpunkt:

Stellt die Regulation vesikulärer Monoamintransporter durch heterotrimere G-Proteine ein allgemeines Prinzip in neuroendokrinen Zellen und Neuronen dar?

Wird ausschließlich die Aktivität von VMAT1 reguliert oder unterliegt VMAT2 ebenfalls einer Regulation durch heterotrimere G-Proteine?

Ist die Regulation auf einen Typ sekretorischer Vesikel beschränkt, oder gilt sie für die Monoaminspeicherung in LDCVs und SSVs?

Welche G-Proteine sind an der Regulation beteiligt?

Wie kommt es zur Aktivierung der G-Proteine?


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