Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen

13

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Reagenzien

5-Hydroxy-[3H] Tryptamintrifluoracetat Serotonin, spez. Aktivität 3260Bq / mmol

Amersham (Dreieich)

I-[7,8-3H] Noradrenalin

spez. Aktivität 444 Bq / mmol

Amersham (Dreieich)

[2,5-3H] Histamindihydrochlorid

spez. Aktivität 1550 Bq / mmol

Amersham (Dreieich)

Agarose

Merck (Darmstadt)

Acrylamid Stammlösung (30%)

Roth (Karlsruhe)

Ammoniumpersulfat

Sigma (München)

Araldit

Serva (Heidelberg)

alpha-Toxin

Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden)

ATP

Adenosin-5´-Triphosphat

Sigma (München)

B27 Supplement

Gibco Life Technologies (Eggenstein)

BCA

Natrium Bicinchoninsäure-4,4-di- carboxy-2,2-Bichinolin

Sigma (St.Louis,. USA)

Bisacrylamid Stammlösung (30%)

Roth (Karlsruhe)

BSA

Rinderserum Albumin

Sigma (St.Louis, USA)

Diaminobenzidin (DAB)

Sigma (München)

DMEM

„Dulbecco`s Modified Eagle Medium“

Biochrom (Berlin)


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DMEM / HAM`s F12

Biochrom (Berlin)

DMSO

Dimethyl-Sulfoxid

Roth (Karlsruhe)

ECLTM Enhanced Chemiluminescence

Amersham (Buckinghamshire, England)

EDTA

Ethylendiamintetraacetat

Roth (Karlsruhe)

Fluoxetin

Hydrochlorid

Biotrend (Köln)

Formvar

Serva (Heidelberg)

Glutamin

Biochrom (Berlin)

Glutaraldehyd

Fluka (Neu-Ulm)

GMppNp

5´-Guanylylimidodiphosphat

Sigma (München)

G-Protein Untereinheiten

Galphao1, Galphao2, Galphai1, und Galphai2

Bernd Nürnberg, Institut für Pharmakologie der FU Berlin

GTPgammaS

Guanosin 5´-O-( 3-thiotriphosphat )

Sigma (München)

Heparin

Ratiopharm (Ulm)

HEPES

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-2-Ethansulfonsäure

Sigma (München)

Histamin

Hydrochlorid

Sigma (München)

Hybond C

Nitrozellulose Membran

Amersham (Buckinghamshire, England)

Kaliumglutamat

Sigma (München)

Kälberserum, fötales

Biochrom (Berlin)

Ketavet

Curamed Pharma GmbH (Karlsruhe)

Kollagen

Sigma (München)


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Lipofectin

Gibco Life Technologies (Eggenstein)

LMW

Low Molecular Weight Marker

Pharmacia Biotech (Uppsala,Schweden)

Magermilchpulver

Glücksklee (München)

Mowiol

Hoechst (Frankfurt/aM)

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Boehringer Mannheim

Neurobasal Medium (NBM)

Gibco Life Technologies (Eggenstein)

Optimem

Biochrom (Berlin)

OptiPhase ´HighSafe 3

Szintillationscocktail `

Wallac (Turku, Finnland)

Osmiumtetroxid

Merck (Darmstadt)

Penicilin / Streptomycin

Biochrom (Berlin)

Pertussis Toxin

Calbiochem / Novabiochem (Bad Soden / Taunus)

Pipes

Piperazin-N,N´-bis[2-ethansulfonsäure]

Sigma (München)

Pferdeserum

Biochrom (Berlin)

Poly-L-Lysin

Sigma (München)

Ponceau S

Sigma (St.Louis, USA)

Protease Inhibitoren:

Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin

PMSF(Phenylmethylsulfonylfluorid)

Boehringer Mannheim

Reserpin

Sigma (München)

Rompun

Bayer (Leverkusen)

Serotonin Hydrochlorid

Sigma (München)


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Streptolysin-O, Mutante 101

U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden)

TEMED

Sigma (München)

Tetanus Neurotoxin

U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden)

Tetanus Neurotoxin, leichte Kette

U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden)

Triton X-100

Roth (Karlsruhe)

Tetrabenazin

Jean Pierre Henry, Institut de Biologie Physico-Chimique (Paris)

Wasserstoffperoxid

Merck (Darmstadt)

2.2 Puffer und Lösungen

Antikörper-Lösung für Immunorepklika-Analysen

1,5% w/v

Rinderserum Albumin in TS Puffer

Block-Lösung für Immunoreplika-Analysen

5% w/v

Magermilchpulver

0,1% v/v

Tween 20 in TS Puffer

Chlornaphtolentwicklung

2 ml

3 mg / ml alpha-Chlornaphtol in DMSO

10 ml

TS

10 µl

Wasserstoffperoxid (30%)

Elektrophorese Puffer (10 X)

30 g

Tris

144 g

Glycin

10 g

SDS

 

auf 1 Liter mit dH2O auffüllen


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Kaliumglutamat Puffer I (KG1)

150 mM

Kaliumglutamat

20 mM

Pipes

4 mM

EGTA

1 mM

Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer

 

mit KOH auf pH 7,0 eingestellt

Kaliumglutamat Puffer III (KG3)

150 mM

Kaliumglutamat

20 mM

Pipes

4 mM

EGTA

2 mM

ATP

1 mM

Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer

 

mit KOH auf pH 7,0 eingestellt

Kaliumglutamat Puffer IV (KG4)

150 mM

Kaliumglutamat

20 mM

Pipes

4 mM

EGTA

2 mM

ATP

1 mM

Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer

15 µM

Ca2+ (freies), durch Zusatz von 78,28 µl 1 M CaCl2 / 20 ml Puffer

 

mit KOH auf pH 7,0 eingestellt

Krebs-Hepes Puffer (KR)

140 mM

NaCl

4,7 mM

KCl

2,5 mM

CaCl2

15 mM

Hepes


18

1,2 mM

MgSO4

6,5 mM

Glucose

 

auf pH 7,4 eingestellt

Phosphatpuffer (PBS)

140 mM

NaCl

2,7 mM

KCl

10 mM

Na2HPO4

1,8mM

KH2PO4

Ponceau-S Lösung

0,5% w/v

Ponceau S

3% v/v

Trichloressigsäure

Probenpuffer (Laemmli)

12,48 ml

Sammelgel-Puffer ( 4 X )

5 ml

1,5 M DTT

15 g

Sacharose

1,5 ml

0,1 M EDTA ( Na-Salz ) pH 7.0

 

auffüllen auf 1 Liter mit dH2O

Sammelgel-Puffer (4 X)

60,5 g

Tris pH 6,8

4 g

SDS

 

auffüllen auf 1 Liter mit dH2O

Trenngel-Puffer (4 X)

181,7 g

Tris pH 8,8

4 g

SDS

 

auffüllen auf 1 Liter mit dH2O

Tris-Puffer (TS)


19

20 mM

Tris

150 mM

NaCl

Tyrode-Hepes Puffer

1 34 mM

NaCl

0,34 mM

Na2HPO4

2,9 mM

KCl

12 mM

NaHCO3

20 mM

Hepes

5 mM

Glucose

1 mM

MgCl2

 

auf pH 7,3 eingestellt

Immunoreplika Puffer (Semi Dry)

48 mM

Tris

385 mM

Glycin

3,7 g/ml

SDS 10 %

800 ml

dH2O

200 ml

Methanol

2.3 Medien für die Zellkultur

Kulturmedium für BON Zellen

45 ml

DMEM

45 ml

DMEM / HAM`S F12

10 ml

fötales Kälberserum

1 ml

Glutamin

1 ml

Penicillin / Streptomycin

Kulturmedium für PC12 Zellen


20

85 ml

DMEM

10 ml

Pferdeserum

5 ml

fötales Kälberserum

1 ml

Glutamin

1 ml

Penicillin / Streptomycin

Dissoziationsmedium für Rapheneurone

50 ml

fötales Kälberserum

5 ml

Hepes 1 M

5 ml

Glutamin

50 IE

Insulin

4 g

Glucose

 

auffüllen auf 500 ml mit DMEM

Startermedium für Rapheneurone

5 ml

Glutamat 2,5 mM

 

auffüllen auf 500 ml mit Kulturmedium

Kulturmedium für Rapheneurone

10 ml

B27

1,25 ml

Glutamin

5 ml

Penicillin / Streptomycin

 

auffüllen auf 500 ml mit NBM

2.4 Verwendete Antikörper

Primäre Antikörper

Antikörper

Bezugsquelle und Publikation

VMAT1

polyklonal, Kaninchen

R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen

VMAT2

polyklonal, Kaninchen

R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen


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Synaptobrevin II (Klon 69.1)

monoklonal, Maus

Synaptic Systems, Göttingen

Edelmann et al. (1995)

Synaptophysin (Klon 7.2)

monoklonal, Maus

Synaptic Systems, Göttingen

Jahn et al. (1985 )

Chromogranin A / B

polyklonal, Kaninchen

Quartett, Berlin

Chromogranin B

polyklonal, Kaninchen

R.Fischer-Colbrie, Universität Innsbruck

Kroesen et al. (1996)

Cytochrom b561

monoklonal, Maus

B.Wiedenmann, Universitätsklinikum Charité, Berlin

Ahnert-Hilger et al. (1993)

Dopamin-beta-Hydroxylase

polyklonal, Kaninchen

B.Wiedenmann, Universitätsklinikum Charité, Berlin

Ahnert-Hilger et al. (1993)

Serotonin

polyklonal, Kaninchen und Huhn

R.W.Veh, Institut für Anatomie der Charité, Berlin

Galphaoc AS 6

polyklonal, Kaninchen

G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin

Spicher et al. (1992)

Galphao1 AS 248

polyklonal, Kaninchen

G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin

Spicher et al. (1992)

Galphao2 AS 371

Polyklonal, Kaninchen

Monoklonal, Maus (Klon 94.1)

 

G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin

Laugwitz et al. (1996)

R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen

Sekundäre Antikörper

Antikörper

Bezugsquelle

Pferd anti-Maus IgG

Peroxidase-gekoppelt

Vector Laboratories, Burlingham (USA)


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Ziege anti-Kaninchen IgG

Peroxidase-gekoppelt

Vector Laboratories, Burlingham (USA)

Esel anti-Maus IgG

Texas Red-gekoppelt

Jackson Laboratories, West Grove

(USA)

Ziege anti-Kaninchen IgG

Texas Red-gekoppelt

Jackson Laboratories, West Grove

(USA)

Ziege anti Kaninchen IgG

Oregon Green-gekoppelt

Molecular Probes, Eugene

(USA)

Ziege anti-Huhn IgG

Alexa Green-gekoppelt

Molecular Probes, Eugene

(USA)

2.5 Durchführung der Experimente

2.5.1 Zellkultur

PC12 Zellen

PC 12 Zellen wurden in Kollagen-beschichteten Kulturschalen (Durchmesser 100 mm) bei 37 °C und 10 % CO2 Gehalt in der Atmosphäre kultiviert. Zunächst wurde in einem Ansatz für 10 Schalen ein Gemisch aus 32 ml 30 %igem Ethanol und 1 ml Kollagen mit Hilfe eines Falcon 7107 Einmalfilter-Systems sterilfiltriert. Danach wurden jeweils 3 ml in eine Schale pipettiert und kurz geschwenkt. Die Flüssigkeit wurde dann über mehrere Stunden unter der eingeschalteten Steril-Arbeitsbank eingetrocknet. Die so vorbehandelten Schalen wurden im Brutschrank bei 37°C aufbewahrt. PC12 Zellen wurden mit einer Dichte von 2-2,5 x 106 je 100 mm Schale in Kulturmedium ausplattiert und einmal in der Woche zum Ausdünnen umgesetzt. Zum Umsetzen wurde das Medium abgesaugt und die Schale mit 5 ml PBS gespült. Darauf wurden die Zellen für 1 min mit 1 ml Trypsin-Lösung (1:10) überspült und anschließend für 2 min im Brutschrank stehen gelassen. Die Zellen wurden dann mit 2 ml PBS von der Schale gespült und für 2 min bei 1000 xg abzentrifugiert. Die sedimentierten Zellen wurden in 1 ml Medium aufgenommen, gut resuspendiert und


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in einer Dichte von 1-2 x 106 je Schale mit je 8,5 ml Kulturmedium ausplattiert.

BON Zellen

BON Zellen wurden in unbehandelten Schalen (100 mm Durchmesser) bei 37°C und 5 % CO2 Gehalt in der Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2,2-2,5 x 106 je Schale in Kulturmedium für BON Zellen ausplattiert und einmal in der Woche zum Ausdünnen (wie für PC12 Zellen beschrieben) umgesetzt.

Rapheneurone in Primärkultur

Die Gehirne von embryonalen Wistar Ratten wurden am Embryonaltag (E)13 oder 14 präpariert. Das Alter der Embryonen wurde dabei über morphologische Kriterien der Extremitätenanlagen und des Kopfes nach Butler et al. (1987) bestimmt. Die Gehirne wurden in Dissoziationsmedium aufgenommen und die Meningen wurden vorsichtig vom Mittelhirn und Hirnstamm entfernt. Die dorsale Sutur des Neuralrohres wurde eröffnet und ein Gewebestreifen von 0,25-0,5 mm Breite wurde entlang der Mittellinie des Mes- und Rhombenzephalons freipräpariert. Von diesem Streifen konnten drei verschiedene Regionen präpariert werden. Die am weitesten rostral gelegene Region wurde als R1 bezeichnet und erstreckte sich vom Isthmus des Rhombenzephalons 1,5 mm nach rostral. Die zweite Region, R2, wurde weiter caudal zwischen dem Isthmus und der Austrittsstelle der Hirnnerven aus der Pons präpariert. Die dritte Region, R3, wurde definiert als die Region, die sich 1,5 mm von der Austrittsstelle der Hirnnerven nach caudal erstreckte.

Primärkulturen von Rapheneuronen wurden nach einem modifizierten Protokoll von Brewer (1995) für Serum-freie Kulturen angelegt. Definierte Bereiche aus der Raphe (s.o.) wurden präpariert, 2X mit PBS gewaschen und für 15 min bei 37°C in einem Trypsin / EDTA Gemisch (0,05 % / 0,02 % w/v in PBS) inkubiert. Darauf wurden die Zellen 1X mit PBS und 1X mit Dissoziationsmedium gewaschen, bevor sie mechanisch mit Hilfe einer Feuer-polierten Pasteur-Pipette vereinzelt wurden. Die Zellen wurden dann für 2 min bei 210 xg und 21°C abzentrifugiert, in Startermedium redissoziiert und nach der Zählung in einer Neubauer-Kammer mit einer Dichte von 85000 Zellen / cm2 auf 48-Loch Platten ausplattiert. Die Platten waren vorher mit poly-L-Lysin (0,5 % in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur behandelt worden. Die Primärkulturen wurden bei 36,5°C und 5 % CO2 Gehalt bis zu 5 Wochen kultiviert.


24

Ab Tag 4 der Kultur wurde die Hälfte des Mediums 2X in der Woche durch frisches Kulturmedium ersetzt.

2.5.2 Permeabilisierung mit alpha-Toxin und Streptolysin-O

Zur Permeabilisierung der Zellen wurden die bakteriellen Zytolysine alpha-Toxin und Streptolysin-O (SLO), Mutante 101, verwendet. Für alle Experimente, die nicht der Vorstellung der Permeabilisierungstechnik (siehe 3.1) dienten, wurde ausschließlich SLO verwendet.

Die zytolytische Aktivität beider Toxine wurde nach Lind et al. (1987) und Ahnert-Hilger et al. (1989) an Kaninchen-Erythrozyten bestimmt. Hierfür wurde eine Erythrozyten Suspension (2,5 % in PBS) mit verschiedenen Verdünnungen der Toxine versetzt. Nach Inkubation für 40 min bei 37°C wurde der hämolytische Effekt photometrisch bei 412 nm bestimmt. Der Kehrwert der Verdünnung des Toxins, bei der 50 % der Erythrozyten hämolysiert wurden, ergab die Anzahl der hämolytischen Einheiten (HE) / ml der unverdünnten Toxinpräparation.

PC12 und BON Zellen

Das Medium wurde entfernt und die semikonfluent gewachsenen Zellen wurden zunächst 2 X mit PBS, dann 1 X mit KG1 Puffer gewaschen. Darauf wurden sie mit 1 ml KG1 Puffer je Kulturschale suspendiert und bei 2000 xg für 2 min bei 4°C abzentrifugiert. Anschließend wurden die sedimentierten Zellen in 100 µl KG1 Puffer je Kulturschale aufgenommen und resuspendiert. Zur Permeabilisierung mit alpha-Toxin wurde die Zellsuspension mit dem gleichen Volumen an Toxin in einer Aktivität von 50-100 HE / ml (in KG1 Puffer) für 20 min bei 36°C inkubiert. Um ungebundenes Toxin zu entfernen, wurde die Zellen bei 2000 xg für 2 min bei 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme oder Sekretion in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen aufgenommen.

Zur Permeabilisierung mit SLO wurde die Zellsuspension (s.o.) mit dem gleichen Volumen an Toxin-Verdünnung in einer Aktivität von 50-100 HE / ml ( in KG1 Puffer, der als Reduktionsmittel 1 mM DTT enthielt ) für 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden bei 2000 xg für 2 min bei 4 °C abzentrifugiert und in 100 µl KG1 Puffer / Ansatz resuspendiert. Zur Porenbildung durch das an das Cholesterol in der


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Plasmamembran gebundene SLO wurden die Zellen für 10 min bei 36°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit 500 µl eiskaltem KG1 Puffer gewaschen und für 2 min bei 2000 xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme oder Sekretion in KG3 bzw. KG4 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen aufgenommen.

Primärkulturen der Raphe

Rapheneurone in Primärkultur wurden 1X mit PBS und 1X mit KG1 Puffer gewaschen, bevor sie mit 100 HE / ml SLO in KG1 Puffer (versetzt mit 0,1 % BSA) für 5 min auf Eis inkubiert wurden. Anschließend wurde die SLO-Lösung abgesaugt und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen inkubiert.

Thrombozyten

Die sedimentierten Trombozyten wurden in 50 µl Tyrode-Hepes Puffer je Tier suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 20-30 HE / ml SLO (ebenfalls in Tyrode-Hepes Puffer) für 5 min auf Eis inkubiert. Die Thrombozyten wurden darauf bei 1000 xg für 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Nach dem Absaugen der SLO-Lösung wurden die Thrombozyten für Experimente zur Serotonin Aufnahme in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen inkubiert .

2.5.3 Monoaminaufnahme in permeabilisierte Zellen

Die Monoamin Aufnahme in permeabilisierte PC12 und BON Zellen (s.o.) wurde durch die Zugabe von 100 µl KG3 Puffer / Ansatz, der entweder 90 nM [3H]Noradrenalin, 90 nM [3H]Serotonin oder 200 nM [3H]Histamin enthielt, gestartet. Der Ansatz enthielt zusätzlich 1 mM Ascorbinsäure als Antioxidanz. Die Inkubation


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wurde normalerweise für 20 min bei 36°C durchgeführt. Die zu untersuchenden Substanzen, wie GTP-Analoga oder G-Protein Untereinheiten wurden diesem Inkubationsansatz zugefügt. Gestoppt wurde die Monoamin Aufnahme durch die Zugabe von 1 ml eiskaltem KG1 Puffer und die anschliessende Zentrifugation bei 15000 xg. Die sedimentierten Zellen wurden in 100 µl Triton X-100 (0,4 %) aufgenommen und für 10 min bei 42°C unter heftigem Schütteln im Thermomixer lysiert. Von dem Lysat wurden 50 µl abgenommen, mit 4 ml Flüssigszintillator OptiPhase versetzt und für die Szintillationsmessung der aufgenommen Radioaktivität in einem Beckman LS 6500 Zählautomat verwendet. Die übrigen 50 µl wurden zur Bestimmung des Proteingehalts mit der BCA Methode verwendet. Die aufgenommenen Mengen an [3H]Monoamin sind in pmol / mg Protein angegeben. Berechnet wurde die aufgenommene Menge der Monoamine über die Anzahl der Zerfälle (DPM) / min und die spezifische Aktivität des jeweiligen eingesetzten Tritium-markierten Monoamins.

Rapheneurone

Permeabilisierte Neurone wurden auf den Kulturplatten mit je 100 µl KG3 Puffer je Ansatz, der 1 mM Ascorbinsäure, 90 nM [3H]Serotonin oder [3H]Noradrenalin sowie die zu untersuchenden Substanzen enthielt, für 10 min bei 36°C inkubiert. Die Monoamin Aufnahme wurde durch die Zugabe von 500 µl eiskaltem KG1 gestoppt. Die Inkubations-Lösung wurde abgesaugt und die Neurone wurden noch einmal mit 500 µl eiskaltem KG1 Puffer gewaschen. Die anschließende Lyse der Zellen erfolgte durch die Inkubation für 10 min bei 42°C mit 100 µl Triton X -100 (0,4 %). Die

Bestimmung der aufgenommenen Menge an [3H]Monoamin sowie des Proteingehalts erfolgte wie für PC12 und BON Zellen beschrieben.

Thrombozyten

Die Experimente zur Serotoninaufnahme wurden nach Permeabilisierung ebenso wie in BON und PC12 Zellen durchgeführt

Die Inkubation neuroendokriner Zellen und Neurone mit Pertussis Toxin (100 ng / ml) oder Tetanus Neurotoxin (10 nM) erfolgte für 48 Stunden in Kulturmedium. In einigen Experimenten wurden die Zellen nach der Permeabilisierung für 20 min bei 36°C in KG1 Puffer inkubiert, der die leichte Kette von Tetanus Neurotoxin (1 µM bzw. 200 nM) enthielt.

2.5.4 Monoaminsekretion

PC12 Zellen

PC12 Zellen wurden in serumfreiem DMEM, versetzt mit 20 nM [3H]Noradrenalin und 1 mM Ascorbinsäure für 2 h im Brutschrank vorbeladen. Danach wurde das Medium abgesaugt und die Zellen noch einmal für 1-2 h in DMEM im Brutschrank belassen. Anschließend wurde das DMEM abgesaugt und die Zellen 3X mit Krebs-Hepes Puffer, sowie 1X mit KG1 Puffer gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden mit


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500 µl KG1 Puffer / Schale abgeschwemmt und zur Permeabilisierung mit alpha-Toxin oder SLO (Mutante 101) inkubiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen nur mit KG1 Puffer inkubiert. Die Zellen wurden dann für 2 min bei 2000 xg abzentrifugiert, wieder in KG1 Puffer (100 µl / Ansatz) resuspendiert und für 10 min bei 36°C inkubiert. Darauf wurden die Zellen erneut für 2 min bei 3000 xg abzentrifugiert, mit 100 µl KG4 Puffer (15 µM freies Ca2+) je Ansatz resuspendiert und zur Stimulation der Sekretion für 10 min bei 36°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen bei 15.000 xg sedimentiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die Bestimmung des [3H]Noradrenalingehalts mit der Methode der Flüssigkeits-Szintillationsmessung verwendet. Die Zellen selbst wurden mit 100 µl Triton X-100 versetzt und für 10 min bei 42°C lysiert. Das Lysat wurde dann ebenfalls zur Bestimmung der Menge des in den Zellen verbliebenen [3H]Noradrenalins mit der Methode der Flüssigkeits-Szintillationsmessung benutzt. Die Angaben des sezernierten [3H]Noradrenalins sind in Prozent des zu Beginn der Stimulation in den Zellen vorhandenen [3H]Noradrenalins gemacht.

Primärkulturen der Raphe

Primärkulturen der Rapheneurone wurden zu unterschiedlichen Kulturzeitpunkten in DMEM, versetzt mit 20 nM [3H]Serotonin und 1 mM Ascorbinsäure für 4 h im Brutschrank vorbeladen. Die Inkubations-Lösung wurde abgesaugt und die Zellen 3X mit Krebs-Hepes Puffer gewaschen. Darauf erfolgte eine Zwischeninkubation für 10 min bei 36°C mit Krebs-Hepes Puffer, der 0,1 % BSA enthielt. Der Puffer wurde abgesaugt und durch frischen Krebs-Hepes Puffer ersetzt, der für die Stimulation der Sekretion einen auf 50 mM erhöhten K+-Gehalt besaß. Die Stimulation erfolgte mit 100 µl des Puffers für 5 min bei 36°C. Die Bestimmung des [3H]Serotoningehalts im Überstand sowie in den Zellen erfolgte wie zuvor beschrieben.

2.5.5 Transfektion von COS Zellen

Um die Spezifität und mögliche Kreuzreaktivität der verwendeten polyklonalen Antikörper gegen VMAT1 und VMAT2 zu testen, wurden COS Zellen mit der DNA des jeweiligen Transporters transient transfiziert. COS Zellen wurden in 35 mm Kulturschalen auf Glasplättchen bis zu 40 % Konfluenz kultiviert. Für die Transfektion einer Schale wurden 1-2 µg DNA (Transporter DNA im Plasmidvektor pcDNA3) in 100 µl serumfreiem Medium (Optimem) aufgenommen, 30 min bei Raumtemperatur


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inkubiert, und dann mit 5 µl Lipofectin (ebenfalls in 100 µl Optimem) vermischt. Zur Ausbildung des DNA-Liposomen Komplexes wurde das Gemisch für weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Kulturmedium wurde abgenommen und die Zellen wurden 1X mit 2 ml Optimem gewaschen. Zur Transfektion wurden die Zellen mit dem DNA-Lipofectin Gemisch und 0,8 ml Optimem für 8 h im Brutschrank inkubiert. Darauf wurde das DNA-Lipofectin Gemisch durch Wachstumsmedium (DMEM) ersetzt, und die Zellen für 48h zur Proteinsynthese im Brutschrank belassen. Die erfolgreiche Synthese der Transporterproteine wurde immunzytochemisch überprüft.

2.5.6 Protein-Gelelektrophorese und Immunoreplika-Analyse

Protein Proben wurde elektrophoretisch in einem denaturierenden Natrium-Dodecylsulfat Polyacrylamid Gel-System (SDS-Page) nach der Methode von Laemmli (1970) aufgetrennt. Verwendet wurden 10 %ige Gele der Dicke von 0,75

mm. Die Protein-Proben wurden vor dem Aufbringen auf das Gel für 5 min bei 95°C zur Denaturierung erhitzt. Standard Marker-Proteine (LMW) von 14,4 bis 94 kDa wurden bei jedem Lauf des Gels mit aufgetragen.

Zusammensetzung der Gele:

Trenngel 10 %

 

Sammelgel 3,75 %

 

Trenngel Puffer

1,5 ml

Sammelgel Puffer

500 µl

Acrylamid Stammlösung

2 ml

Acrylamid Stammlösung

250 µl

Bisacryamid Stammlösung

0,8 ml

Bisacrylamid Stammlösung

100 µl

H2O

1,7 ml

H2O

1,15 ml

TEMED

8 µl

TEMED

2,6 µl

10 % Ammoniumpersulfat

75 µl

10 % Ammoniumpersulfat

20 µl

Die Elektrophorese wurde bei 20 mA / Gel für 80 min durchgeführt.


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Die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch vom Gel auf Hybond C Nitrozellulose Membranen transferiert und so immobilisiert. Die Stromstärke betrug 300 mA / Gel im ´semi-dry` Verfahren in einer Bio-Rad Trans Blot® SD Kammer unter Verwendung von ´semi-dry` Puffer. Nach dem Blot Verfahren wurden die Membranen in Ponceau-S Lösung gebracht, um die Banden der Marker-Proteine sichtbar zu machen und die Integrität der übrigen Proteine zu testen. Überschüssiges Ponceau-S wurde mit H2O abgewaschen. Die Membranen wurden getrocknet und, falls benötigt, mit dem Skalpell in horizontale oder vertikale Streifen geschnitten, wobei die Banden der Marker-Proteine als Anhaltspunkte für das apparente Molekulargewicht der Proteine dienten. Die Membranstreifen wurden mit einem Bleistift markiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Block-Lösung inkubiert. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte bei 4°C über Nacht in Antikörper-Lösung. Danach wurden die Membranstreifen 4X für 15 min in Block-Lösung gewaschen. Die Inkubation mit dem an Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper erfogte bei Raumtemperatur für 1 h in Antikörper-Lösung. Anschließend wurden die Membranstreifen 3 X für 10 min in TS Puffer gewaschen. Alle Inkubations- und Wasch-Schritte wurden auf einem Schüttler durchgeführt. Zur Detektion der Meerrettich-Peroxidase Aktivität wurden die Membranstreifen für 1 min mit ECL-Lösung benetzt und zur Belichtung auf ECL-Film aufgelegt. Die Membranstreifen konnten anschließend noch zur Nachfärbung mit alpha-Chlornaphthol verwendet werden.

2.5.7 Immunzytochemie

BON und COS Zellen sowie Rapheneurone in Primärkultur wurden auf Glasplättchen in 35 mm Kulturschalen kultiviert und 2X für 5 min mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie für 15 min in eiskaltem Formalin (4 % in PBS) fixiert. Die fixierten Zellen wurden dann 2X für 10 min mit PBS gewaschen. Zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen wurden die Zellen für 1 h mit PBS, das 2 % BSA, 5 % NGS und 0,1 % Triton X-100 enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte in der Absättigungs-Lösung für 1,5 h bei 37°C in einer feuchten Kammer. Im Anschluß daran wurden die Zellen 2X für 10 min mit PBS gewaschen. Als sekundäre Antikörper dienten Oregon Green-fluoreszenzmarkiertes anti-Huhn bzw. anti-Kaninchen IgG, sowie Texas Red-


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fluoreszenzmarkiertes anti-Kaninchen IgG. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper erfolgte in PBS, versetzt mit 2 % BSA, für 1,5 h bei Raumtemperatur in der abgedunkelten feuchten Kammer. Ungebundene Antikörper wurden 2X für 10 min mit PBS abgewaschen und die Zellen in jeweils 10 µl Mowiol auf Objektträgern eingebettet. Ausgewertet wurden die Färbungen mit einem Leica DMLB Epifluoreszenz-Mikroskop. Die Bilder wurden mit einer SPOT Kamera der Firma INTAS, Göttingen, digital aufgenommen.

2.5.8 Elektronenmikroskopie

Bereiche aus dem präfrontalen Cortex adulter Ratten wurden präpariert, in eiskaltem PBS aufgenommen, und in kleine Würfel von ca. 8 mm3 geschnitten. Diese wurden zuerst für 2 h auf Eis und dann für 2 h bei Raumtemperatur in PBS, versetzt mit 4 % Formalin, 0,05 % Glutaraldehyd sowie 0,2 % Pikrinsäure, fixiert. Anschließend wurde das fixierte Gewebe für 2 h in PBS gewaschen und in 3 % Agarose (in PBS) zur Anfertigung von 50 µM dicken Vibratomschnitten eingebettet. Um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte für 30 min in 0,5 % H2O2 inkubiert. Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen und für 30 min in Block-Lösung inkubiert. Die Inkubation mit einem polyklonalen anti-Serotonin Antikörper aus dem Huhn wurde für 24 h bei 4°C in Antikörper-Lösung durchgeführt. Die Detektion der Immunreaktivität erfolgte mit einem Kit von Vectastain, wobei Diaminobenzidin (DAB) als Chromogen verwendet wurde. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte für 30 min mit 1 % OsO4 (in PBS) inkubiert, in aufsteigender Alkoholreihe dehydratisiert und in Araldit flach-eingebettet. Ultradünnschnitte von 70 nm wurden auf Formvar-behandelten (in 0,3 % Dichlorethan) Nickel-Objekthaltern 2 X für 7 min in 1 % Perjodat angeätzt, 2 X mit doppelt destilliertem H2O gewaschen und nach der ´post-embedding`Methode (Wenzel et al., 1997) weiterbehandelt. Verwendet wurden hierfür polyklonale Antikörper gegen VMAT2, Galphao2 und Synaptophysin sowie an 5 nM Goldpartikel gekoppeltes anti-Kaninchen IgG als sekundärer Antikörper.

2.5.9 Subzelluläre Fraktionierung

Zur subzellulären Fraktionierung wurden 4-5 60 mm Kulturschalen semikonfluent gewachsener BON Zellen oder Rapheneurone 2X mit eiskaltem PBS gewaschen.


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Die Zellen wurden mit 1 ml PBS pro Kulturschale abgeschwemmt und bei 2000 xg abzentrifugiert. Sämtliche folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt: Die Zellen wurden in 400 µl Homogenisierungs-Puffer aufgenommen, dem zuvor Leupeptin (2 µg / ml), Aprotinin (1 µg / ml) sowie PMSF (1 mM) als Protease-Inhibitoren zugesetzt worden waren. Die Zellsuspension wurde durch die 20-fache Passage durch eine 27G Kanüle homogenisiert. Das Homogenat wurde für 15 min bei 4000 xg zentrifugiert und der resultierende postnukleäre Überstand (PNÜ) wurde abgenommen. Während der Zentrifugation wurden mit einem Hoefer SG 15 Gradienten-Mischer mindestens 2 kontinuierliche Saccharose-Gradienten in den Konzentrationen von 0,35-2 M mit einem Volumen von 1,8 ml hergestellt. Der PNÜ von etwa 350 µl wurde vorsichtig auf den Gradienten aufgetragen und für 3 h in einem Beckman TLS 55 Rotor bei 86.000 xg zentrifugiert. Der zweite Gradient wurde dabei als Gegengewicht verwendet. Die Fraktionen von jeweils 60 µl wurden mit einer Kanüle über eine Schlauchpumpe vom Boden des Gradienten her abgesaugt und aufgefangen. Anschließend wurden die aufgefangenen Fraktionen noch einmal mit 1 ml 4 mM Hepes Puffer, pH 7,3, verdünnt und für 30 min bei 65.000 xg in einem Beckman TLA 100.4 Rotor abzentrifugiert. Die sedimentierten Membranen wurden dann in 50 µl 1X Laemmli Puffer aufgenommen und der Gelelektrophorese mit anschließender Immunoreplika-Analyse unterzogen.

2.5.10 Bestimmung von Protein-Konzentrationen

Die Bestimmung von Protein-Konzentrationen erfolgte mit der Bicinchoninsäure (BCA) Methode nach Smith et al. (1985). Über Verdünnungsreihen wurde eine Standardkurve von 50 bis 400 µg / ml BSA hergestellt. Das BSA wurde üblicher-weise in 0,4 % Triton-X100 angesetzt.

Die Standardwerte sowie die Proben wurden in Duplikaten in die Löcher einer 96-Loch Mikrotiter Platte (20 µl / Loch) pipettiert. Dazu wurden pro Loch 200 µl der BCA Reaktionslösung gegeben (eine Mischung aus Lösung A und B im Verhältnis 50:1, v / v). Die Mikrotiter Platte wurde dann für 30 min bei 60°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde die Platte für 10 min zum Abkühlen stehen gelassen, bevor die Absorption bei 550 nm in einem Elisa-Reader gemessen wurde. Die Protein-Konzentrationen der Proben wurden anhand der Standardkurve bestimmt.


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2.5.11 Präparation von synaptischen Vesikeln (LP2)

Synaptische Vesikel wurden von adulten Wistar Ratten beiden Geschlechts nach einem von Huttner et al. (1983) beschriebenem Protokoll präpariert. Alle Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt.

Zumeist wurde ein Tier für eine Präparation von synaptischen Vesikeln benötigt.

Die Ratte wurde mit Ether betäubt und dann dekapitiert. Das Gehirn wurde so schnell wie möglich entnommen und in 15 ml eiskalter Saccharose-Lösung (320 mM) aufgenommen, der folgende Protease-Inhibitoren zugesetzt worden waren: Aprotinin (1 µg / ml), Leupeptin (2 µg / ml), Pepstatin (2 µg / ml) und PMSF (0,1 mM). In einem Dounce-Homogenisator (900 rpm, 10X) wurde das Gehirn homogenisiert. Das Homogenat wurde darauf für 10 min bei 800 xg in einem Beckman Ti 70 Rotor zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde für 15 min bei 9200 xg zentrifugiert. Die sedimentierten Membranen wurden in 10 ml der Saccharose-Lösung resuspendiert und erneut für 15 min bei 9200 xg zentrifugiert. Das resultierende synaptosomale Pellet wurde in 1-1,5 ml der Saccharose-Lösung suspendiert, durch die Zugabe von 9 Volumenanteilen destilliertem H2O lysiert, und im Dounce-Homogenisator (2000 rpm, 3X) homogenisiert. Das Lysat wurde durch die Zugabe von Hepes (Endkonzentration 10 mM) auf einem pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die folgende Zentrifugation für 20 min bei 25000 xg führte zum 1. Pellet des Lysats (LP1), das sich hauptsächlich aus Fragmenten der Plasmamembran zusammensetzt, sowie zum Überstand des 1. Lysats (LS1). Der Überstand wurde dann aufgeteilt und in einem Beckman TLA 100.4 Rotor (Röhrchenvolumen 3,5 ml) für 30 min bei 350.000 xg zentrifugiert. Diese letzte Zentrifugation führte zum 2. Pellet des Lysats (LP2), das sich haupsächlich aus kleinen synaptischen Vesikeln zusammensetzt. Zur Resuspendierung des Pellets diente die 5-fache Passage durch eine 27 G Kanüle.

2.5.12 Thrombozytenpräparartion

Die Mäuse wurden zunächst mit 50 µl Ketavet und 50 µl Rompun je 10 g Körpergewicht intraperitoneal narkotisiert. Danach wurde die Bauchhöhle eröffnet und die Vena cava freigelegt. Aus dieser wurde etwa 1 ml Blut mit einer Spritze abgenommen, in der 30 IU Heparin vorgelegt waren. Das abgenommene Blut wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, mit dem halben Volumen an Tyrode-Hepes


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Puffer vermischt, und bei 200 xg für 7,5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das thrombozytenreiche Plasma wurde abgenommen und erneut bei 1000 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die sedimentierten Thrombozyten wurden darauf in Tyrode-Hepes Puffer resuspendiert und zur Vorbereitung der Serotoninaufnahme mit SLO permeabilisiert.

2.6 Verwendete Geräte

Zentrifugen

Beckman L-70 Ultrazentrifuge

Beckman OptimaTM TL Ultrazentrifuge

Rotoren: TLS 55, TLA 100.4

Rotoren: Ti 70, SW 40

Beckman J2-HS

Eppendorf Zentrifuge 5402

Rotor: JA 14

Elektrophorese

Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)

Power Pac 200 Netzgerät (Bio-Rad)

Mini-Protean® II Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad)

Photometer

Dynatech MR 500 Elisa Reader (Dynatech)

UV 1202 UV-VIS Spektrophotometer (Shimadzu)

Mikroskop

Leica DMLB Epifluoreszenz-Mikroskop mit Durchlichteinrichtung

Szintillationsmessungen

Beckman LS 6500, Liquid Szintillation Counter


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Fri May 11 16:02:46 2001