Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Poren-bildende Toxine als Werkzeuge zur Untersuchung intrazellulärer Transportprozesse

Die Permeabilisierung von Zellen mit bakteriellen zytolytischen Toxinen bietet die Möglichkeit zum Studium intrazellulärer Prozesse. Sie ermöglicht eine gezielte Manipulation des intrazellulären Milleus und erlaubt das Einbringen von nicht oder nur sehr schwer membrangängigen Substanzen in das Zytosol. Mit Hilfe dieser Technik wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl von intrazellulären Prozessen untersucht. So etwa die Ca2+-abhängige Membranfusion in PC12 Zellen (Ahnert-Hilger et al., 1985), in exokrinen Zellen des Pankreas (Stecher et al., 1992) und Synaptosomen (Bhakdi et al., 1993). An permeabilisierten Zellen konnten Aspekte der Membrandynamik des Golgi-Komplexes (Mironov et al., 1997) aufgeklärt werden. Nicht zuletzt konnte die Regulation von VMAT1 durch das heterotrimere G-Protein Go2 in permeabilisierten PC12 Zellen gezeigt werden (Ahnert-Hilger et al., 1998).

Zwei Poren-bildende Toxine, alpha-Toxin und Streptolysin-O, gehören zu den experimentell etablierten Zytolysinen: alpha-Toxin wird von Staphylococcus aureus produziert und bindet als Monomer an einen bis jetzt nicht identifizierten Rezeptor der Plasmamembran. In hohen Konzentrationen (50-200 µg / ml) wird alpha-Toxin unspezifisch gebunden und bildet ringförmige Heptamere aus, die zur Porenbildung führen. Diese Poren erlauben jedoch nur die Passage von Molekülen mit einem Molekulargewicht bis zu 3 kDa (Bhakdi et al., 1993). Streptolysin-O (SLO) wird von Streptococcus pyogenes produziert und bindet an Cholesterol in der Plasmamembran. Die durch Oligomere des SLO gebildeten heterogenen Poren sind größer als die des alpha-Toxins und lassen Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 150 kDa passieren (Bhakdi und Tranum-Jensen, 1987, Bhakdi et al., 1993).

Charakterisierte Präparationen (siehe Methoden) beider Toxine wurden verwendet, um einen direkten experimentellen Zugang zur Untersuchung der vesikulären Aufnahme und Sekretion von Tritium-markierten Monoaminen in neuroendokrinen Zellinien zu erhalten. So konnte eine quantitative Analyse des in die Zellen aufgenommenen Monoamins durchgeführt werden. In der Ratten Phäochromozytom Zellinie PC12 führte die Inkubation mit alpha-Toxin oder SLO zu einer


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konzentrationsabhängigen Permeabilisierung der Zellen (Abbildung 2A, dokumentiert ist das Ergebnis eines Trypan-Blau Ausschluß-Tests nach Inkubation mit SLO). In permeabilisierten Zellen konnte im Vergleich zu nicht permeabilisierten Zellen eine deutliche Steigerung der Reserpin-sensitiven und damit vesikulären (siehe Abschnitt 3.2.1) Noradrenalinaufnahme gemessen werden (Abbildung 2B). Die Inkubation mit einer SLO Konzentration von 55 hämolytischen Einheiten ( HE ) / ml führte zu einer maximalen Erhöhung der Aufnahme um das 8-fache auf etwa 2,2 pmol / mg Protein. Nach Permeabilisierung mit beiden Toxinen wurde ebenfalls eine verstärkte Noradrenalinsekretion gemessen (Abbildung 2C): So ließ sich die Ca2+-stimulierte Sekretion von 25 % in unbehandelten Zellen in permeabilisierten Zellen auf maximal 58 % des aufgenommenen Noradrenalins um das 2 bis 3-fache steigern. Die basale Sekretion stieg nach Permeabilisierung von 13 % auf maximal 35 % ebenfalls an.

Der auch an der humanen neuroendokrinen Zellinie BON (siehe Einleitung) durchgeführte Trypan-Blau Ausschluß-Test zeigt, daß diese Zellinie ebenso durch die Inkubation mit alpha-Toxin und SLO permeabilisiert werden konnte (Abbildung 3A, dokumentiert ist das Ergebnis eines Trypan-Blau Ausschluß-Tests nach Inkubation mit SLO). In permeabilisierten Zellen konnte eine im Vergleich zu nicht permeabilisierten Zellen deutlich gesteigerte vesikuläre Serotoninaufnahme gemessen werden (Abbildung 3B). So betrug die Reserpin-sensitive Aufnahme nach Permeabilisierung mit 100 HE / ml alpha-Toxin mit 0,7 pmol / mg Protein etwa das 6-fache der in nicht permeabilisierte Zellen aufgenommenen Menge an Serotonin. Insgesamt war die Serotoninaufnahme bei Anwendung beider Toxine vergleichbar.

Für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten weiterführenden funktionellen Experimente an BON Zellen, Neuronen und Thrombozyten wurde ausschließlich SLO zur Permeabilisierung verwendet. Die Größe der in der Plasmamembran erzeugten Poren ermöglichte im Gegensatz zum alpha-Toxin auch das Einbringen von Proteinen, wie etwa G-Protein Untereinheiten oder der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin, in die Zellen.


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Abbildung 2
Aufnahme und Sekretion von [3H]Noradrenalin nach Permeabilisierung von PC12 Zellen mit alpha-Toxin und Streptolysin-O (SLO)
A: Trypan Blau Ausschluß-Test in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden gewaschen und für 5 Min mit Puffer oder 100 hämolytischen Einheiten (HE) / ml SLO bei 36°C inkubiert. Gleiche Volumina der Zellsuspension und Trypan Blau, einem nicht-membrangängigen Farbstoff, wurden vermischt und unter dem Lichmikroskop (Phasenkontrast für Kontrollzellen) betrachtet. Eine komplette Färbung war nur in den SLO permeabilisierten Zellen, nicht jedoch in den Kontrollzellen, zu erkennen.
B: [3H]Noradrenalinaufnahme in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden suspendiert und mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen mit 90 nM [3H]Noradrenalin in KG / ATP Puffer für 20 min inkubiert. In den Toxin-behandelten Zellen konnte eine deutlich höhere [3H]Noradrenalinaufnahme als in den nicht-permeabilisierten Zellen gemessen werden. Die Permeabilisierung mit SLO hatte den stärksten Effekt, die Applikation von 55 HE / ml führte zu einer Erhöhung der Aufnahme um das 8-fache.
C: [3H]Noradrenalinsekretion in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden für 2 Stunden mit 40 nM [3H]-Noradrenalin vorbeladen. Nach dem Abwaschen des Inkubationsmediums wurden die Zellen suspendiert und mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Die Stimulation erfolgte für 10 min bei 36°C in KG4 Puffer (15 µM freies Ca2+). Die Toxin-behandelten Zellen zeigten eine deutlich höhere [3H]Noradrenalinsekretion als die nicht permeabilisierten Zellen. Am stärksten war der Effekt bei der Permeabilisierung mit 100 HE / ml alpha-Toxin, die zu einer Erhöhung der Sekretion um das 5-fache führte.


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Abbildung 3
Aufnahme von [3H]Serotonin nach Permeabilisierung von BON Zellen mit Streptolysin-O (SLO) und alpha-Toxin
A: Trypan Blau Ausschluß-Test in BON Zellen
BON Zellen wurden gewaschen und für 5 Min mit Puffer oder 100 HE / ml SLO bei 36°C inkubiert. Gleiche Volumina der Zellsuspension und Trypan Blau wurden vermischt und unter dem Lichtmikroskop (Phasenkontrast für Kontroll Zellen) betrachtet. Eine komplette Färbung war nur in den SLO-permeabilisierten Zellen, nicht jedoch in den Kontrollzellen, zu erkennen.
B: [3H]Serotoninaufnahme in BON Zellen
BON Zellen wurden suspendiert und mit Puffer oder unterschiedlichen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen mit 90 nM [3H]Noradrenalin in KG / ATP Puffer für 20 min inkubiert. In den Toxin-behandelten Zellen konnte eine deutlich höhere [3H]Serotoninaufnahme als in den nicht permeabilisierten Zellen gemessen werden. Die Applikation von 100 HE / ml alpha-Toxin oder SLO führte einer maximalen Erhöhung der Aufnahme um das 4 bis 5- fache.


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3.2 Regulation der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen durch heterotrimere G-Proteine

Die Aktivierung der alpha-Untereinheit Galphao2 hemmt die Aktivität von VMAT1 in PC12 Zellen (Ahnert-Hilger et al., 1998). Im diesem Abschnitt soll die Frage geklärt werden, ob der beobachtete Effekt spezifisch für PC12 Zellen ist oder ein generelles Prinzip der Regulation vesikulärer Transportprozesse in monoaminergen Zellen darstellt. Als Modell diente die humane neuroendokrine Zellinie BON.

3.2.1 Vesikuläre Aufnahme von Serotonin

BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert und mit Tritium-markiertem Serotonin inkubiert. Unter den gewählten experimentellen Bedingungen ließ sich eine Serotoninaufname von 1,9 pmol / mg Protein messen (Abbildung 4). Um zu prüfen, ob es sich bei der beobachteten Aufnahme tatsächlich um den spezifischen Transport des Serotonins in sekretorische Vesikel handelte, wurde die Inkubation parallel mit ATP-freiem Puffer oder unter Zusatz von Reserpin als Inhibitor der beiden vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 durchgeführt. Die Abwesenheit von ATP führte zu einer stark verminderten Aufnahme des Serotonins auf etwa 0,3 pmol / mg Protein. Ebenso bewirkte Reserpin eine komplette Blockierung der ATP-abhängigen Serotoninaufnahme.


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Abbildung 4
Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen ist ATP-abhängig und kann durch Reserpin blockiert werden
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min bei 36°C mit [3H]Serotonin (90 nM) in KG3 Puffer inkubiert. In Abwesenheit von ATP (KG1 Puffer) war nur eine unspezifische Akkumulation von Radioaktivität meßbar. Der Zusatz von Reserpin (Endkonzentration 5 µM) führte zu einer kompletten Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme.

3.2.2 Hemmung der vesikulären Aufnahme durch Aktivatoren heterotrimerer G-Proteine

Um zu untersuchen, ob die vesikuläre Serotoninaufnahme in BON Zellen ein Prozeß ist, der durch (heterotrimere) G-Proteine reguliert wird, wurden Aktivatoren heterotrimerer G-Proteine eingesetzt. Verwendet wurden die nicht hydrolysierbaren GTP-Analoga GTPgammaS und GMppNp. Guanosintriphosphat (GTP) bindet an die alpha-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine und führt zur Aktivierung der Untereinheit. GTP-Analoga GTPgammaS und GMppNp werden von der alpha-Untereinheit als Substrat erkannt, können jedoch nicht hydrolysiert werden und stellen so eine anhaltende Aktivierung sicher.

Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp zum Inkubationsansatz hemmte die Serotoninaufnahme von etwa 6,9 pmol / mg Protein auf 3 (GTPgammaS) bzw. 3,7 (GMppNp) pmol / mg Protein um 40-50% (Abbildung 5). Die als unspezifisch zu


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betrachtende Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,6 pmol / mg Protein.

Die Inkubation mit steigenden Konzentrationen an Serotonin (5-450 nM) ergab eine konzentrationsabhängige vesikuläre Aufnahme des Serotonins (Abbildung 6), die im Konzentrationsbereich zwischen 250 und 450 nM in den Sättigungsbereich überging. Über den gesamten Konzentrationsbereich ließ sich die vesikuläre Aufnahme durch GMppNp um 50-60 % hemmen. Für sämtliche Experimente zur Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen wurde mit 90 nM eine Konzentration aus dem linearen Bereich der Transporter-Kinetik gewählt.

Abbildung 5
Die vesikuläre Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierte BON Zellen wird durch Aktivatoren heterotrimerer G-Proteine gehemmt
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min mit [3H]Serotonin und den angegebenen Zusätzen bei 36°C inkubiert. Die Zugabe der nicht-hydrolysierbaren GTP-Analoga GTPgammaS oder GMppNp zum Inkubationsansatz (Endkonzentrationen jeweils 50 µM) führte zu einer Hemmung der Aufnahme des [3H]Serotonins um 50 %. Die Aufnahme in Gegenwart von Reserpin (Endkonzentration 5 µM) repräsentiert die unspezifische Akkumulation von [3H]Serotonin.


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Abbildung 6
Hemmung der konzentrationsabhängigen [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen durch GMppNp
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min mit steigenden Konzentrationen an [3H]Serotonin bei 36°C inkubiert. Die Zugabe des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogons GMppNp zum Inkubationsansatz (Endkonzentration 50 µM) führte zu einer Hemmung der Aufnahme des [3H]Serotonins 50-60 % über den gesamten Konzentrationsbereich. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,04, 0,15, 0,58, 0,89 und 2,5 pmol / mg Protein.

3.2.3 Aufhebung der durch GTPgammaS und GMppNp induzierten Hemmung durch Pertussis Toxin

Um Hinweise auf die Identität des oder der beteiligten G-Proteine zu bekommen, wurden BON Zellen vor den Experimenten zur Serotoninaufnahme mit Pertussis Toxin inkubiert. Pertussis Toxin ist ein von Bordetella pertussis produziertes Enterotoxin, dessen Wirkmechanismus auf seiner ADP-Ribosyltransferase Aktivität beruht. Als spezifisches Substrat dienen dabei die alpha-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine der Gi/o-Klasse. Die Übertragung einer ADP-Ribosegruppe auf das Cystein352 der alpha-Untereinheit läßt die alpha-Untereinheit in der inaktiven GDP-gebundenen Form verharren. Pertussis Toxin stellt somit ein Werkzeug zur Inaktivierung bestimmter G-Proteine dar, mit dem gezielt in die transmembranöse Signaltransduktion eukaryontischer Zellen eingegriffen werden kann.

Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp zum Inkubationsansatz (Abbildung 7) führte in permeabilisierten BON Zellen zur erwarteten Hemmung der vesikulären (Reserpin-


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sensitiven) Serotoninaufnahme, sie lag bei 55 % (GTPgammaS) bzw. 60 % (GMppNp). Die Vorinkubation der Zellen für 48 h mit Pertussis Toxin hob diese Hemmung fast vollständig auf.

Abbildung 7
Die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTPgammaS und GMppNp in permeabilisierten BON Zellen läßt sich durch Vorinkubation mit Pertussis Toxin (Ptx) aufheben.
Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (50 µM) führte in SLO-permeabilisierten Zellen zu einer Hemmung von 55-60 % der [3H]Serotoninaufnahme. Die Vorbehandlung der Zellen für 48 Stunden mit Pertussis Toxin (100 ng / ml) hob diese Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch die GTP-Analoga fast vollständig auf. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin wurde abgezogen und betrug 0,93±0,05 pmol / mg Protein für unbehandelte und 0,83±0,1 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.

Die Inkubation mit steigenden Konzentrationen an GMppNp dokumentierte, daß die durch Pertussis Toxin aufgehobene Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme jedoch auch von der Konzentration des angebotenen GTP-Analogons abhängig und damit reversibel ist (Abbildung 8). So ließ sich der Pertussis Toxin Effekt, der bei

GMppNp-Konzentrationen zwischen 0,2 und 50 µM mit maximal 20 % Hemmung im Gegensatz zu 48 % in unbehandelten Zellen noch sehr deutlich ausgeprägt war, bei einer GMppNp-Konzentration von 250 µM nicht mehr so deutlich darstellen. Die


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durch GmppNp induzierte Hemmung betrug hier 40 %, im Gegensatz zu 55% in unbehandelten Zellen.

Die vorgestellten Experimente belegen, daß die vesikuläre Monoaminaufnahme in BON Zellen durch die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen der Gi/o-Klasse gehemmt wird.

Abbildung 8
Die Wirkung von Pertussis Toxin hängt von der Konzentration des angebotenen GMppNp ab
Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an GMppNp führte in SLO permeabilisierten Kontrollzellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme. Die Vorbehandlung der Zellen für 48 Stunden mit Pertussis Toxin führte zu einer partiellen Aufhebung dieser Hemmung, die aber bei einer GMppNP-Konzentration von 250 µM kaum noch vorhanden war. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 2,64±0,34 pmol / mg Protein für unbehandelte und 1,7±0,21 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.

3.2.4 Hemmung der vesikulären Aufnahme durch Galphao2

Um die für die Hemmung der Serotoninaufnahme verantwortlichen G-Proteine zu identifizieren, wurden dem Inkubationsansatz verschiedene gereinigte, AlF4-aktivierte alpha-Untereinheiten der Gi/o-Klasse zugegeben. Die aktivierende Wirkung von AlF4- beruht dabei auf einer Stabilisierung des Zustands der alpha-Untereinheit, der der GTP-gebundenen Form entspricht (Chabre, 1990).

Die Zugabe von Galphao2 zum Inkubationsansatz führte in permeabilisierten BON Zellen


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zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme von 2,9 pmol / mg Protein auf etwa 1,5 pmol / mg Protein (Abbildung 9A). Diese etwa 50 %ige Hemmung konnte durch vorhergehendes Kochen des Galphao2 fast vollständig aufgehoben werden. Die Kontrolle der Hitzedenaturierung wurde durchgeführt, um mögliche Effekte auf die Aufnahme auszuschließen, die lediglich durch das Lösungsmittel, in dem die G-Protein Untereinheiten vorlagen, verursacht wurden.

Die Zugabe von Galphao1 zum Inkubationsansatz hatte keinen Effekt auf die Serotoninaufnahme. Die Inkubation mit Galphai1 und Galphai2 führte zwar zu einer Hemmung der Serotoninaufnahme, jedoch konnte der Effekt durch Hitzedenaturierung nicht aufgehoben werden (Abbildung 9B) und mußte als unspezifisch betrachtet werden.

Abbildung 9
Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen wird durch Galphao2 gehemmt
A: Die Zugabe von gereinigtem, AlF4- aktiviertem, Galphao2 (Endkonzentration 10 nM) zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der vesikulären [3H]Serotoninaufnahme von 50 %. Die Hitzedenaturierung von gereinigtem Galphao2 (30 min bei 95°C) vor der Inkubation bewirkte eine fast vollständige Aufhebung des hemmenden Effekts. Ebenso zeigte der Zusatz von gereinigtem Galphao1 (Endkonzentration 20 nM) keinen Effekt auf die [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,83±0,1 pmol / mg Protein.
B: Die Zugabe von gereinigtem, AlF4- aktiviertem, Galphai1 oder Galphai2 (Endkonzentration jeweils 10 nM) zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von 30 %. Die Hitzedenaturierung der G-Protein Untereinheiten vor der Inkubation hatte keine Wirkung auf den hemmenden Effekt.


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3.2.5 Spezifität der G-Protein Effekte auf die vesikuläre Aufnahme

Um experimentell zu bestätigen, daß die Zugabe der GTP-Analoga und Galphao2 nicht zu einer gesteigerten Sekretion führt, und somit die beobachtete Hemmung nicht lediglich einen “Nettoeffekt“ aus Aufnahme und Sekretion darstellte, wurden permeabilisierte BON Zellen mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin inkubiert. Tetanus Neurotoxin wird unter anaeroben Bedingungen von Clostridium tetani produziert, im menschlichen Organismus (wie auch in vielen weiteren Taxa) über periphere Nervenendigungen aufgenommen und durch retrograden axonalen Transport bis ins Rückenmark transportiert. Hier führt es durch die spezifische Spaltung von Synaptobrevin, einem Protein des für die Exozytose essentiellen SNARE-Komplexes, in inhibitorischen Interneuronen zur Blockierung der GABA- bzw. Glyzinfreisetzung. Die daraus resultierende Enthemmung von Motoneuronen führt zu tetanischen Kontraktionen der quergestreiften Muskulatur. Tetanus Neurotoxin repräsentiert ein Toxin der A / B Familie, die sich aus einer leichten (A für “active“) und einer schweren (B für “binding“) Kette zusammensetzen. Während die schwere Kette der Internalisierung des Toxins dient, stellt die leichte Kette die proteolytisch wirksame Komponente dar.

Es zeigte sich, daß eine Zwischeninkubation von permeabilisierten BON Zellen mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin keinen Einfluß auf die durch GTPgammaS und

GMppNP vermittelte Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme hatte. Sie lag in nicht behandelten Zellen bei 25 % (GTPgammaS) bzw. 45 % (GMppNp) (Abbildung 10).

In Toxin-behandelten Zellen war die Hemmung durch GTPgammaS mit 60 % sogar noch etwas stärker ausgeprägt.

Ebenso konnte in permeabilisierten BON Zellen, die mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin inkubiert worden waren, durch gereinigtes Galphao2 eine Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme um 50 % erzielt werden (Abbildung 11A). Das entsprach dem an nicht behandelten Zellen (siehe auch Abb.9A) beobachteten

Effekt. Die Hemmung konnte wiederum durch Hitzedenaturierung des Galphao2 aufgehoben werden. Um zu überprüfen, ob die eingesetzte Konzentration des Toxins (1 µM) ausreichte, um Synaptobrevin vollständig zu spalten, wurde ein Teil der Zellsuspension für die Immunoreplika-Analyse verwendet (Abbildung 11). In permeabilisierten BON Zellen führte bereits eine Konzentration von 200 nM der


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leichten Kette von Tetanus Neurotoxin zu einer spezifischen Spaltung von Synaptobrevin. In nicht permeabilisierten Zellen erfolgte keine Aufnahme der leichten Kette und damit keine Spaltung von Synaptobrevin. Synaptophysin, ein integrales Membranprotein kleiner synaptischer Vesikel und deren Analoga, wurde zur Kontrolle ebenfalls analysiert. Es wurde weder in permeabilisierten noch in nicht-permeabilisierten Zellen gespalten.

Abbildung 10
Die Inkubation von permeabilisierten BON Zellen mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin (TeNt / LC) beeinflußt die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTPgammaS und GMppNp nicht.
Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (50 µM) führte in SLO-permeabilisierten Zellen zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von etwa 35 % (GTPgammaS) bzw. 50 % (GMppNp). Wurden die Zellen für 20 min mit TeNt / LC (1 µM) inkubiert, konnte eine ähnlich starke Hemmung beobachtet werden. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,92±0,39 pmol / mg Protein für unbehandelte und 0,68±0,07 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.


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Abbildung 11
Die Inkubation von BON Zellen mit TeNt/LC hat keinen Effekt auf die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch Galphao2
A: Die Zwischeninkubation der permeabilisierten Zellen für 20 min mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin (TeNt/LC) hatte keinen Effekt auf die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch Galphao2. Die Zugabe von Galphao2 führte auch hier zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von 50 %. Die Hitzedenaturierung des Galphao2 bewirkte eine vollständige Aufhebung dieses Effekts. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,28±0,2 pmol / mg Protein.
B: Die Immunoreplika-Analyse von BON Zellen zeigt, daß unter den experimentellen Bedingungen wie in A aufgeführt die Zugabe von TeNt/LC (Endkonzentrationen 1 µM und 200 nM) zu SLO-permeabilisierten Zellen eine vollständige Spaltung von Synaptobrevin bewirkte. In nicht permeabilisierten Zellen ( n.p.) hatte das Toxin keinen Effekt. Das synaptische Protein Synaptophysin wurde weder in permeabilisierten noch in nicht permeabilisierten Zellen gespalten.

Die vorgestellten Ergebnisse belegen die Spezifität der durch GTP-Analoga und Galphao2 vermittelten Effekte allein auf die vesikuläre Monoaminaufnahme.


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3.3 Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern gegen VMAT1 und VMAT2

Ob BON Zellen VMAT1, VMAT2 oder beide Transporter exprimieren, und wie sie subzellulär lokalisieren, wurde mit Hilfe Subtyp-spezifischer polyklonaler Antikörper überprüft.

Ein Kaninchen-Antiserum, daß gegen ein Gluthation S-Transferase (GST) Fusionsprotein des c-Terminus gerichtetet war, wurde als Antikörper gegen VMAT1 eingesetzt. Für VMAT2 wurde sowohl ein Antiserum gegen ein Fusionsprotein des n-Terminus als auch ein Peptid-Antikörper gegen den c-Terminus vewendet. Um die Antikörper auf ihre Spezifität und mögliche Kreuzreaktivität zu testen, wurde die Fibroblasten Zellinie COS mit dem eukaryontischen Plasmidvektor pcDNA3, in den die cDNA von VMAT1 oder VMAT2 einkloniert worden war, transient transfiziert. Die erfolgreiche Synthese der Transporterproteine wurde immunzytochemisch überprüft. Zusätzlich konnte die Spezifität der Antikörper in der Immunoreplika-Analyse von PC12 Zellen, die nur endogenes VMAT1 besitzen, sowie durch die Präabsorption mit rekombinantem Peptid aus dem C-Terminus von VMAT1 der Ratte getestet werden.

Die Antiseren erwiesen sich in der immunzytochemischen Analyse der transfizierten COS Zellen (Abbildung 12) als spezifisch für VMAT1 oder VMAT2 (verwendet wurde hier der Peptid-Antikörper), eine Kreuzreaktivität war nicht vorhanden. In der Immunoreplika-Analyse der PC12 Zellen wurden durch das anti-VMAT1 Antiserum eine Hauptbande mit einem Molekulargewicht von 55 kDa sowie einige weitere höhermolekulare Banden detektiert (Abbildung 13). Nach Präabsorption mit dem rekombinantem Peptid war kaum noch Immunreaktivität vorhanden, lediglich eine schmale Proteinbande bei ca. 60 kDa wurde detektiert Die bei 55 kDa detektierte Proteinbande repräsentiert das Monomer, während die höhermolekularen Banden durch eine Glykosylierung oder die Dimerisierung des Transporters zu erklären sind (Liu et al., 1992a). Durch das anti-VMAT2 Antiserum wurden keine Proteinbanden detektiert.


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Abbildung 12
Die Antikörper gegen VMAT1 und VMAT2 sind spezifisch für das jeweilige Transporterprotein
Zur Untersuchung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden COS Zellen mit der DNA von VMAT1, VMAT2 oder dem eukaryontischen Plasmidvektor pcDNA3 transient transfiziert. Die Proteinexpression beider Transporter wurde immunzytochemisch überprüft. Als sekundärer Antikörper diente Texas Red markiertes Ziege anti-Kaninchen IgG. Beide Antiseren erwiesen sich als spezifisch für das jeweilige Transporterprotein, eine Kreuzreaktivität trat nicht auf. In den zur Kontrolle mit dem Plasmidvektor transfizierten Zellen wurde ebenfalls keine Immunreaktivität nachgewiesen. Der Maßstab beträgt 10 µm.


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Abbildung 13
PC12 Zellen exprimieren nur VMAT1, kein VMAT2
Ein postnukleärer Überstand von PC12 Zellen wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulose-Membran transferiert und mit polyklonalen Antiseren gegen VMAT1 und VMAT2 inkubiert. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß durch das anti-VMAT1 Antiserum eine Hauptbande bei ca. 55 kDa, sowie einige weitere höhermolekulare Banden detektiert wurden. Die Präabsorbtion mit 10 µg eines synthetisch hergestelllten Peptids aus dem c-Terminus von VMAT1 der Ratte führte zum Verschwinden fast aller Banden. Lediglich eine schmale Bande bei ca. 60 kDa wurde weiterhin deutlich detektiert. Durch das anti-VMAT2 Antiserum wurden keine Proteinbanden detektiert.

3.4 Untersuchungen zur subzellulären Verteilung von VMAT1 und VMAT2 in PC12 und BON Zellen

Nach der Charakterisierung der Antikörper konnte die Frage untersucht werden, welche Monoamintransporter in BON Zellen exprimiert werden. Hierfür wurde zunächst die Immunoreplika-Analyse eines postnukleären Überstands durchgeführt.

Weiterhin konnte an PC12 und BON Zellen mittels subzellulärer Fraktionierung untersucht werden, auf welchen Vesikeltypen, LDCVs oder SLMVs, die Transporter lokalisieren. Eine immunzytochemische Analyse der BON Zellen sollte die Verteilung von Serotonin sowie den exprimierten Monoamintransportern in der Zellkultur darstellen.

3.4.1 In PC12 Zellen lokalisiert VMAT1 überwiegend auf LDCVs

Die subzelluläre Fraktionierung eines postnukleären Überstandes von PC12 Zellen


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dokumentierte das Vorkommen von VMAT1 hauptsächlich in den schweren Membranfraktionen (Abbildung 14). Die Analyse der Membranfraktionen mit Antikörpern gegen Cytochrom b561 und Dopamin-ß-Hydroxylase als Markerproteine für LDCVs zeigte, daß in den schweren Fraktionen hauptsächlich Membranen dieses Vesikeltyps sedimentierten. Die partielle Überschneidung mit Synaptophysin als Markerprotein der SLMVs deutete auf eine unvollständige Trennung von LDCVs und SLMVs in einem kleinen Bereich des Gradienten hin. Dies läßt eine Lokalisation von VMAT1 in geringerem Umfang auch auf SLMVs möglich erscheinen. Ausschließlich in den schweren Membranfraktionen fand sich Galphao1, während Galphao2 in allen Fraktionen des Gradienten verteilt, jedoch hauptsächlich mit den LDCV Fraktionen assoziiert war. Bestätigt wurde diese Verteilung der G-Protein Untereinheiten durch die Analyse mit einem Antiserum, das gegen beide Untereinheiten (Galphaoc) gerichtet war, und den Hauptanteil des gesamten Galphao in den schwereren Membranfraktionen nachwies. Synaptobrevin, ein Membranprotein sowohl der LDCVs als auch der SSVs, ließ sich in allen Fraktionen nachweisen.

Abbildung 14
In PC12 Zellen kommt VMAT1 bevorzugt auf elektronendichten, großen Vesikeln ( LDCVs vor)
Aus einem Homogenat von PC12 Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2 M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Membranen. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß VMAT1 in den schweren Membranfraktionen vorkommt. Die parallele Analyse der Membranfraktionen mit Antikörpern gegen Cytochrom b561 und Dopamin-beta-Hydroxylase zeigte, daß sich VMAT1 hauptsächlich auf Membranen von LDCVs befand. Eine partielle Überschneidung von VMAT1 mit Synaptophysin, einem Markerprotein für SSVs und deren Analoga, war ebenfalls vorhanden. Ausschließlich in den schweren Fraktionen fand sich Galphao1 während Galphao2 über den gesamten Gradienten verteilt, hauptsächlich jedoch ebenfalls mit den Fraktionen der LDCVs assoziiert war. Ein gegen beide G-Protein Untereinheiten gerichtetes Antiserum (Galphaoc) belegt, daß sich der Hauptanteil des gesamten Galphao in den schweren Fraktionen anreicherte. Synaptobrevin, als Membranprotein beider Vesikeltypen, fand sich sowohl in den schweren als auch den leichten Fraktionen des Gradienten.


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3.4.2 In BON Zellen lokalisieren VMAT1 und VMAT2 überwiegend auf LDCVs

In der Immunoreplika-Analyse eines postnukleären Überstandes von BON Zellen (Abbildung 15) detektierten sowohl das anti-VMAT1 Antiserum als auch das anti-VMAT2 Antiserum Proteinbanden. Das Bandenmuster von VMAT1 entsprach dabei dem für PC12 Zellen beschriebenen. Durch das anti-VMAT2 Antiserum wurde lediglich eine Proteinbande bei 50-55 kDa detektiert.

Abbildung 15
BON Zellen exprimieren die vesikulären Monoamin-transporter VMAT1 und VMAT2
Ein postnukleärer Überstand von BON Zellen wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulose-Membran transferiert und mit polyklonalen Antiseren gegen VMAT1 und VMAT2 inkubiert. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß beide Antiseren eine Proteinbande bei ca. 55 kDa detektierten. Durch das anti-VMAT1 Antiserum wurden zusätzlich noch weitere höhermolekulare Banden (siehe PC12 Zellen) detektiert.


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Die subzelluläre Fraktionierung des postnukleären Überstands von BON Zellen (Abbildung 16) dokumentierte eine Proteinverteilung, die der für PC12 Zellen beschriebenen ähnlich war. VMAT1 und VMAT2 waren hauptsächlich in den schweren Membranfraktionen lokalisiert. Die Analyse der Membranfraktionen mit einem Antikörper gegen Cytochrom b561 ließ erkennen, daß sich die schweren Fraktionen hauptsächlich aus Membranen der LDCVs zusammensetzten. Die partielle Überschneidung mit Synaptophysin deutete wie in der subzellulären Fraktionierung der PC12 Zellen auf eine unvollständige Trennung von LDCVs und SLMVs in einem kleinen Bereich des Gradienten hin. Ausschließlich in den schweren Membranfraktionen fand sich Galphao1, während Galphao2 in allen Fraktionen, überwiegend aber in den LDCV Fraktionen lokalisierte. Synaptobrevin ließ sich in den Fraktionen beider Vesikeltypen nachweisen.


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Abbildung 16:
In BON Zellen kommen VMAT1 und VMAT2 bevorzugt auf elektronendichten, großen Vesikeln (LDCVs) vor
Aus einem Homogenat von BON Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Membranen. Die Immunoreplika-Analyse dokumentiert die Lokalisation von VMAT1 und VMAT2 in den schweren Fraktionen. Die parallele Analyse der Membranfraktionen mit Antikörpern gegen Cytochrom b561 belegt, daß sich VMAT1 und VMAT2 hauptsächlich auf Membranen von LDCVs befinden. Eine partielle Überschneidung der beiden Transporter mit Synaptophysin, einem Markerprotein für SSVs und deren Analoga in neuroendokrinen Zellen, war ebenfalls vorhanden, jedoch geringer als bei PC12 Zellen. Ausschließlich in den schweren Fraktionen fand sich Galphao1, während Galphao2 über den gesamten Gradienten verteilt, hauptsächlich jedoch ebenfalls mit den LDCV-Fraktionen assoziiert war. Synaptobrevin fand sich sowohl in den schweren als auch den leichten Fraktionen des Gradienten.

Die Verteilung von VMAT1, VMAT2 und Serotonin in BON Zellen wurde zusätzlich immunzytochemisch untersucht (Abbildung 17). Eine Immunreaktivität für Serotonin ließ sich in 40-50 % aller Zellen nachweisen. In der Doppelimmunfluoreszenz wurde dabei die Colokalisation mit VMAT1 und VMAT2 deutlich. VMAT1 wurde in nahezu allen Zellen exprimiert, während VMAT2 nur in etwa 50 % der Zellen nachgewiesen werden konnte. Die Analyse der Verteilung von Chromogranin (der Antikörper war gegen die Subtypen A und B gerichtet), als Markerprotein für LDCVs, und Serotonin demonstrierte eine weitgehende Colokalisation in den Zellen. In wenigen Zellen ließ sich eine Immunreaktivität für Chromogranin, nicht jedoch für Serotonin nachweisen.


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Abbildung 17
Serotonin colokalisiert in BON Zellen mit VMAT1, VMAT2 und Chromogranin
BON Zellen wurden gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert und mit einem anti-Serotonin Antikörper aus dem Huhn, sowie Antiseren aus dem Kaninchen gegen VMAT1, VMAT2 oder Chromogranin A/B inkubiert. Als sekundäre Antikörper dienten Oregon Green-markiertes anti-Huhn IgG sowie Texas Red-markiertes anti-Kaninchen IgG. Die Aufnahmen der linken Spalte zeigen die Serotonin-Immunreaktivität in 40-50 % der BON Zellen. In der Doppelimmunfluoreszenz wird die fast vollständige Colokalisation des Serotonins mit VMAT1 (obere Reihe), VMAT2 (mittlere Reihe) und Chromogranin A/B als Markerprotein für LDCVs (untere Reihe) deutlich. Der Maßstab beträgt 10 µm.

3.5 Funktionelle Differenzierung zwischen der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 in BON Zellen

Um die Frage zu klären, ob der beobachteten Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme durch Galphao2 (siehe 3.2.4) eine Regulation von VMAT1, VMAT2 oder von beiden Transportern zugrunde liegt, mußte funktionell zwischen der Aktivität


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von VMAT1 und VMAT2 unterschieden werden.

VMAT2 wird durch Tetrabenazin (TBZ) wesentlich effektiver gehemmt als VMAT1. Besonders ausgeprägt ist dieser Unterschied zwischen den beiden humanen Varianten des Transporters: Hier hemmt TBZ den Serotonin Transport durch VMAT2 mit einem Ki-Wert von ~100 nM (Serotonin Konzentration 90 nM), während eine TBZ Konzentration von 20 µM keinen Effekt auf die Aktivität von VMAT1 hat (Erickson et al., 1996). Im Gegensatz zu den geringen Unterschieden in der Substrataffinität von VMAT1 und VMAT2 gegenüber Serotonin und den Katecholaminen (siehe Einleitung) weist VMAT2 eine etwa 30-fach höhere Affinität für Histamin als VMAT1 auf (Erickson et al., 1996).

Die beschriebenen Unterschiede bezüglich der Pharmakologie und des Substratspektrums boten Ansatzpunkte für die experimentelle Differenzierung zwischen der Aktivität von VMAT1 und VMAT2.

Zunächst wurde die Monoaminaufnahme in permeabilisierte PC12 Zellen, die nur endogenes VMAT1 exprimieren, anhand der Substrate Serotonin, Noradrenalin oder Histamin gemessen. Es zeigte sich, daß lediglich Serotonin und Noradrenalin spezifisch in die Vesikel aufgenommen wurden (Abbildung 18). Die Aufnahme von Histamin konnte durch die Zugabe von Reserpin nicht signifikant blockiert werden, und mußte daher als unspezifisch betrachtet werden. Das belegt, daß Histamin in der angebotenen Konzentration von 200 nM nicht als Substrat für VMAT1 dient.


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Abbildung 18
Permeabilisierte PC12 Zellen nehmen nur [3H]Serotonin und [3H]Noradrenalin, nicht aber [3H]Histamin spezifisch auf.
Die Monoaminaufnahme in permeabilisierte PC12 Zellen wurde anhand der drei Substrate [3H]Serotonin (90 nM), [3H]Noradrenalin (90 nM) und [3H]Histamin (200 nM) gemessen. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin zeigt, daß nur Serotonin und Noradrenalin in die Vesikel der Zellen aufgenommen wurden. Die höchste spezifische Aufnahme von 2,5 pmol / mg Protein wurde mit [3H]Serotonin erzielt, [3H]Noradrenalin wurde mit 1 pmol / mg Protein aufgenommen. Die [3H]Histaminaufnahme von 1 pmol / mg Protein konnte mit Reserpin nicht signifikant blockiert werden und ist daher unspezifisch.

Um die spezifische Wirkung von TBZ auf die Aktivität von VMAT2 nachzuweisen, wurde die Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON und PC12 Zellen gemessen. In BON Zellen konnte die Reserpin-sensitive Aufnahme von 2,6 pmol / mg Protein

durch TBZ um 30 % auf 1,7 pmol / mg Protein gehemmt werden (Abbildung 19). Unter denselben experimentellen Bedingungen konnte in PC 12 Zellen die durch VMAT1 vermittelte Reserpin-sensitive Serotoninaufnahme von 4,7 pmol / mg Protein nicht durch TBZ blockiert werden.

Um die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 experimentell getrennt darstellen zu können, wurde an permeabilisierten BON Zellen zum einen die Serotoninaufnahme in Gegenwart einer hohen Histamin-Konzentration (2 mM, nicht radioaktiv markiert),

zum anderen die Aufnahme von Histamin (200 nM, Tritium-markiert) gemessen. Unter der zuerst genannten Bedingung konnte davon ausgegangen werden, daß die


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Abbildung 19
Tetrabenazin (TBZ) hemmt die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen
In permeabilisierten BON Zellen konnte die Reserpin-sensitive [3H]Serotoninaufnahme durch die Zugabe von TBZ (Endkonzentration 1 µM) zum Teil blockiert werden. Wurden dieselben experimentellen Bedingungen auf permeabilisierte PC12 Zellen übertragen, zeigte sich, daß die Reserpin-sensitive [3H]Serotoninaufnahme nicht durch Zugabe von TBZ blockiert werden konnte.

hohe Histamin-Konzentration zu einer kompetitiven Verdrängung des Serotonins aus der Bindung mit VMAT2 führt und somit die gemessene Serotoninaufnahme nur die Aktivität von VMAT1 darstellt. Unter der zweiten experimentellen Bedingung sollte sich, wie bereits in Abbildung 18 demonstriert, nur die Aktivität von VMAT2 messen lassen, da Histamin in der geringen Konzentration von 200 nM nicht als Substrat für VMAT1 dient.

Die experimentellen Befunde bestätigten diese Annahmen: Die Reserpin-sensitive Serotoninaufnahme von 2,5 pmol / mg Protein konnte in Gegenwart von 2 mM Histamin nicht mehr durch TBZ gehemmt werden (Abbildung 20A) und charakterisierte die gemessene Aufnahme als VMAT1 Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte die Reserpin-sensitive Histaminaufnahme von 0,4 pmol / mg Protein durch TBZ fast vollständig blockiert werden (Abbildung 20B), was die gemessene Aufnahme als VMAT2 Aktivität charakterisierte.


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Abbildung 20
In permeabilisierten BON Zellen kann funktionell zwischen der Monoaminaufnahme durch VMAT1 und VMAT2 differenziert werden.
A: Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen wurde in Gegenwart von Histamin (2 mM) als Substrat für den VMAT2 durchgeführt. Es zeigte sich, daß unter diesen Bedingungen eine Reserpin-sensitive Aufnahme stattfand, die jedoch nicht mehr durch TBZ blockierbar war. B: Wurde ausschließlich [3H]Histamin als Substrat angeboten, konnte die Reserpin-sensitive Aufnahme durch TBZ zu 80 % blockiert werden. Die unspezifische Aufnahme von [3H]Serotonin in Gegenwart von Reserpin betrug 2,2±1,3 pmol / mg Protein, die unspezifische Aufnahme [3H]Histamin 1,23±0,006 pmol / mg Protein.

3.6 Unterschiedliche Empfindlichkeit der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 gegenüber der Regulation durch Galphao2

Unter den beiden vorgestellten experimentellen Bedingungen konnte jetzt selektiv der Effekt von Galphao2 auf die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 untersucht werden.

Zunächst wurde der Effekt auf die Aktivität von VMAT1 untersucht: Die Reserpin-sensitive Serotoninaufnahme (in Gegenwart von 2 mM Histamin) von 1,3 pmol / mg Protein wurde durch die Zugabe von Galphao2 um ca. 45 % auf 0,7 pmol / mg Protein gehemmt (Abbildung 21A). Um den Effekt von Galphao2 auf die Aktivität von VMAT2 darzustellen, wurde die vesikuläre Histaminaufnahme gemessen: Die Reserpin-sensitive Histaminaufnahme von 0,27 pmol / mg Protein wurde durch die Zugabe von Galphao2 um 70 % auf 0,08 pmol / mg Protein gehemmt (Abbildung 21B). Die Hitzedenaturierung von Galphao2 hob diese Hemmung vollständig auf.


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Abbildung 21
Die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 in permeabilisierten BON Zellen wird durch Galphao2 gehemmt
Die [3H]Serotoninaufnahme wurde in Gegenwart von 2 mM Histamin (VMAT1 Aktivität) durchgeführt. A: Die Zugabe von gereinigtem Galphao2 (10 nM) führte zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven Aufnahme auf 55 % des Kontrollniveaus. B: Wurde [3H]Histamin (200 nM, VMAT2 Aktivität) als Substrat benutzt, führte die Zugabe von Galphao2 zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven Aufnahme auf etwa 30 % des Kontrollniveaus. Die Hitzedenaturierung des Galphao2 bewirkte eine vollständige Aufhebung dieses Effekts. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,42±0,035 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,33±0,001 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.

Um die beobachtete unterschiedliche Empfindlichkeit von VMAT1 und VMAT2 gegenüber der Regulation durch Galphao2 genauer darzustellen, wurden permeabilisierte BON Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Galphao2 und GMppNp inkubiert. Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an Galphao2 (0,23-6 nM) führte zu einer dosisabhängigen Hemmung beider Transporteraktivitäten (Abbildung 22A). Im Bereich zwischen 0,7 und 6 nM wurde die VMAT2 Aktivität (Histaminaufnahme) stärker gehemmt als die VMAT1 Aktivität (Serotoninaufnahme). So führte Galphao2 in einer Konzentration von 0,7 nM bereits zu einer Hemmung der VMAT2 Aktivität um 50 %, während die Aktivität von VMAT1 erst bei einer Galphao2 Konzentration von 6 nM um 50 % gehemmt wurde.

Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an GMppNp (5-100 µM) führte ebenfalls zu einer dosisabhängigen Hemmung der beiden Transporteraktivitäten (Abbildung 22B). Beide Transporteraktivitäten wurden über


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den gesamten Konzentrationsbereich durch GMppNp gehemmt. Auch hier zeigte sich eine höhere Empfindlichkeit von VMAT2 gegenüber der Regulation durch G-Proteine.

Abbildung 22
In permeabilisierten BON Zellen ist VMAT2 empfindlicher gegenüber einer Hemmung durch Galphao2 oder GMppNp
A: Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an Galphao2 führte in permeabilisierten BON Zellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Monoaminaufnahme. Beide Transporteraktivitäten wurden in Konzentrationen zwischen 0,2 und 6 nM der G-Protein Untereinheit gehemmt. Im Bereich zwischen 0,7 und 6 nM wurde die [3H]Histaminaufnahme stärker gehemmt als die [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 1,86±0,2 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,33±0,03 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.
B:. Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an GMppNp führte in permeabilisierten BON Zellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Monoaminaufnahme. Beide Transporteraktivitäten wurden in Konzentrationen zwischen 5 und 100 µM des GTP-Analogons gehemmt. Dabei war die Hemmung der [3H]Histaminaufnahme in Konzentrationen zwischen 10 und 100 µM sehr viel stärker ausgeprägt, als die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 1,03±0,2 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,53±0,01 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.

So führte GMppNp in einer Konzentration von 50 µM bereits zu einer Hemmung der VMAT2 Aktivität um ca. 90 %, während die Aktivität von VMAT1 bei einer GMppNp


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Konzentration von 100 µM lediglich um 60 % gehemmt wurde.

3.7 Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme in Neuronen

Die in den Abschnitten 3.2 bis 3.6 vorgestellen Ergebnisse dokumentieren eine Regulation (Hemmung) der vesikulären Monoaminaufnahme in der neuro-endokrinen Zellinie BON, die sich vorwiegend auf die Speicherung von Monoaminen in LDCVs beschränkt. Weitere Experimente sollten klären, ob die vesikuläre Transmitterspeicherung in monoaminergen Neuronen ebenfalls einer solchen Regulation, möglicherweise auf der Ebene der SSVs, unterliegt.

3.7.1 Primärkulturen der Raphe als Modell zur Untersuchung der Speicherung von monoaminergen Transmittern

Die o.a. Fragestellung wurde an Primärkulturen der Raphe aus der Ratte untersucht. Die serotonergen Neurone der Raphekerne innervieren im adulten Gehirn das Vorderhirn, Cerebellum und Rückenmark. Sie beeinflussen komplexe physiologische Funktionen wie Schlaf, Appetit und Verhalten (siehe Diskussion). Neben den serotonergen Neuronen befinden sich in den Raphekernen auch noch dopaminerge Neurone als weitere monoaminerge Zellpopulationen.

Die Präparation von drei unterschiedlichen Regionen der embryonalen Raphe (siehe Material und Methoden) sollte Aufschluß über regionale Unterschiede bezüglich des Gehalts an serotonergen Neuronen geben, um so Primärkulturen mit einem möglichst hohen Anteil an serotonergen Neuronen zu erhalten. Die Raphekulturen wurden dafür zu unterschiedlichen Kulturzeitpunkten immunzytochemisch analysiert. Ein serotonerger Phänotyp war bereits am Kulturtag 2 in einzelnen Neuronen der Regionen R1 (Abbildung 23) und R2 ausgebildet. Das Verzweigungsmuster dieser Neurone war zu diesem frühen Zeitpunkt in der Kultur noch wenig entwickelt. Innerhalb eines Zeitraums von 14 Tagen stieg die Anzahl der serotonergen Neurone an. Ebenso wurde die Morphologie der Zellen durch ein vermehrtes Aussprossen der neuronalen Fortsätze deutlich komplexer. Die quantitative Analyse (Abbildung 24) belegt, daß sich die Anzahl der serotonergen Neurone, bezogen auf die Gesamtzellzahl, in den Regionen R1 und R2 innerhalb von 14 Tagen etwa verdoppelte, sie lag dann bei 2,23 % (R1) bzw. 1,22 % (R2). In der am weitesten


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caudal gelegenen Region R3 waren am Kulturtag 2 noch keine serotonergen Neurone zu identifizieren, nach 14 Tagen betrug der Anteil 0,96 %.

Abbildung 23
Entwicklung serotonerger Neurone in Primärkultur aus der Raphe
Rapheneurone aus der Region R1 wurden am Embryonaltag 13 (E13) präpariert und über die angegebenen Tage in Kultur genommen. Die immunfluoreszenzmikroskopische Analyse der serotonergen Neurone erfolgte über ein polyklonales anti-Serotonin Antiserum, der sekundäre Antikörper war an den Fluoreszenzfarbstoff Oregon Green gekoppelt. Bereits am zweiten Kulturtag (DIV: ´days in vitro`) war in wenigen Zellen eine positive Immunreaktivität sichtbar. Die Aufnahmen auf der linken Seite lassen eine deutliche Zunahme der Anzahl der serotonergen Neurone über den Zeitraum von 14 Tagen erkennen. Die bei stärkerer Vergrößerung aufgenommenen Bilder der rechten Seite verdeutlichen, daß auch das Verzweigungsmuster dieser Neurone über den beobachteten Zeitraum intensiver wurde. Der Maßstab beträgt jeweils 10 µm.


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Abbildung 24
Quantitative Analyse der Anzahl serotonerger Neurone in Primärkulturen aus drei unterschiedlichen Regionen (R1-R3) der embryonalen Raphe
Die Neurone wurden am Tag E13 präpariert und für die angegebenen Tage in Kultur genommen. Der Anteil der serotonergen Neurone ist in Prozent der Gesamtzellzahl angegeben.

3.7.2 Funktionelle Charakterisierung monoaminerger Neurone in Primärkultur der Raphe

Zunächst wurde untersucht, ob die verwendeten Raphekulturen ein geeignetes Modell für die vesikuläre Monoaminaufnahme in Neuronen darstellten. Hierfür wurde die Expression von VMAT2 in den kultivierten Neuronen immunzytochemisch überprüft. Experimente zur vesikulären Serotoninspeicherung und Sekretion an nicht permeabilisierten Zellen dienten der funktionellen Charakterisierung der Neurone. Die immunzytochemische Analyse der Raphekulturen machte deutlich, daß Serotonin mit VMAT2 kolokalisierte (Abbildung 25A, dargestellt ist eine Mischkultur aus allen drei Regionen am Kulturtag 2, präpariert am Tag E 14). Einige nicht serotonerge Neurone waren immunpositiv für VMAT2, was sie ebenfalls als monoaminerge Neurone, vermutlich dopaminerge, auswies (s.o.). In Kulturen aus allen drei Regionen der Raphe (präpariert am Tag E 14) ließ sich bereits am Tag 2 der Kultur eine Serotoninaufnahme messen, die durch TBZ um 40-50 % gehemmt werden konnte (Abbildung 25B). Diese vesikuläre Aufnahme betrug in den drei Regionen 0,2-0,4 pmol / mg Protein.


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Abbildung 25
Serotonerge Rapheneurone in Primärkultur exprimieren funktionelles VMAT2
A: Die Doppelimmunfluoreszenz zeigt die Colokalisation von Serotonin (sekundärer Antikörper Oregon Green-markiert) und VMAT2 (sekundärer Antikörper Texas Red-markiert) in einzelnen Neuronen aus dem Gebiet R2 nach zwei Tagen (DIV 2) in Kultur. Der Maßstab beträgt 10 µm.
B: Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert, in Kultur genommen und nach zwei Tagen mit [3H]Serotonin (4 Stunden, 40 nM) inkubiert. In den Regionen R1, R2 und R3 war eine [3H]Serotoninaufnahme meßbar, die in allen drei Fällen durch die Zugabe von TBZ (10 µM) zu 40-50 % blockiert werden konnte.
Um die Fähigkeit der Neurone zur Serotoninspeicherung und Sekretion auch nach längeren Kultivierungszeiten zu überprüfen, wurden Aufnahme- und Sekretions-experimente an Tag 7 und Tag 21 der Kultur durchgeführt (Abbildung 26).


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Abbildung 26
Funktionelle Charakteristika der [3H]Serotoninaufnahme und -sekretion von Rapheneuronen in Primärkultur.
A: Rapheneurone aus den drei Regionen R1, R2 und R3 wurden am Tag E14 präpariert und bis zu 21 Tage in Kultur genommen. Jeweils am 7. und am 21. Kulturtag wurden die Neurone mit [3H]Serotonin (4 Stunden, 40 nM) inkubiert und die vesikuläre Aufnahme gemessen. In allen drei Regionen war zu beiden untersuchten Zeitpunkten eine TBZ-sensitive (10 µM) Aufnahme zu messen. B: Parallel zu den Aufnahmemessungen wurde ebenfalls die Kalium-stimulierte Sekretion des zuvor aufgenommenen [3H]Serotonins gemessen. In allen drei Regionen konnte zu beiden Zeitpunkten eine Steigerung der Sekretion auf das 2 bis 3-fache der basalen Werte durch die Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration auf 50 mM (5 min) erzielt werden.

In allen drei Regionen konnte zu beiden untersuchten Zeitpunkten eine vesikuläre (TBZ-sensitive) Aufnahme gemessen werden (Abbildung 26A). Die höchste Serotoninaufnahme wurde am Tag 7 in der Region R1 mit etwa 4,2 pmol / mg Protein gemessen, gegenüber einer Aufnahme von 0,8 bzw. 1,5 pmol / mg Protein für die Regionen R2 und R3. Dieser deutliche Unterschied ließ sich nach 21 Kulturtagen


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nicht mehr darstellen, die Werte für die vesikuläre Aufnahme lagen hier zwischen 0,6 und 1,5 pmol / mg Protein. Die parallel zu den Aufnahmemessungen durchgeführten Experimente zur Sekretion (Abbildung 26B) ergaben, daß sich in den Kulturen aus allen drei Bereichen zu beiden Zeitpunkten eine Freisetzung von Serotonin messen ließ, die durch eine Erhöhung der extrazellulären Kalium-Konzentration auf 50 mM auf das 2 bis 3-fache (maximal 55 % des aufgenommenen Serotonins in Region R1 am Tag 7) der basalen Werte gesteigert werden konnte.

Wie erwartet, blockierte die Vorinkubation einer Mischkultur aus allen drei Regionen mit Tetanus Toxin (Abbildung 27) die Kalium-stimulierte Sekretion fast vollständig, die basale Sekretion wurde ebenfalls teilweise gehemmt.

Abbildung 27
Die Vorinkubation von Rapheneuronen in Primärkultur mit TeNt blockiert die Kalium-stimulierte Sekretion von [3H]Serotonin
Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert und für 14 Tage in Kultur genommen. Ein Teil der Neurone wurde vor der Messung für 48 Stunden mit TeNt (10 nM) inkubiert.
Nach der Inkubation der Zellen mit [3H]Serotonin erfolgte die Kalium-Stimulation. Deutlich wird, daß in den Toxin-behandelten Zellen die stimulierte Sekretion sehr stark reduziert war. Die basale Sekretion wurde ebenfalls mäßig gehemmt.

3.7.3 Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte Rapheneurone durch Galphao2.

Die Permeabilisierung von Neuronen ist experimentell wenig etabliert. Um die Frage


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zu klären, ob die vesikuläre Monoaminaufnahme durch VMAT2 ein Transportprozeß ist, der auch in Neuronen einer Regulation durch heterotrimere G-Proteine unterliegt, wurde die an den neuroendokrinen Zellinien PC12 und BON verwendete Permeabilisierungstechnik auf die Primärkulturen der Raphe übertragen. Dieser methodische Ansatz sollte, in Analogie zu den Experimenten an BON Zellen, über die Inkubation mit GTP-Analoga und gereinigten G-Protein Untereinheiten auch in Neuronen einen Zugang zur Untersuchung der Transporterregulation durch G-Proteine liefern. In den verwendeten Raphekulturen konnte nach Permeabilisierung mit SLO eine Aufnahme von Serotonin gemessen werden, die durch TBZ fast vollständig blockiert werden konnte. Sie übertraf mit 15 pmol / mg Protein die Aufnahme in nicht permeabilisierte Neurone um das 15-fache (Abbildung 28).

Abbildung 28
Aufnahme von [3H]Serotonin nach Permeabilisierung von Rapheneuronen mit SLO
Rapheneurone in Primärkultur wurden mit PBS gewaschen und für 2 min mit 100 HE / ml SLO auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 10 min mit [3H]Serotonin inkubiert. In permeabilisierten Neuronen konnte eine deutlich höhere vesikuläre (TBZ-sensitive) Aufnahme als in nicht permeabilisierten Neuronen nachgewiesen werden.

Permeabilisierte Rapheneurone konnten nun mit den GTP-Analoga GTPgammaS und GMppNp inkubiert werden. Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp zum Inkubationsansatz führte in den permeabilisierten Neuronen (Abbildung 29A) zu


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einer Hemmung der Reserpin-sensitiven Serotoninaufnahme von 5,5 pmol / mg Protein um 35 % (GTPgammaS) bzw. 40 % (GMppNp). Die Vorbehandlung der Zellen mit Pertussis Toxin verhinderte die Hemmung der vesikulären Aufnahme von 3,7 pmol / mg Protein durch GTPgammaS und GMppNp vollständig. Eine Vorbehandlung der Zellen mit Tetanus Neurotoxin (Abbildung 29B) hatte dagegen keinen Effekt auf die Hemmung der Serotoninaufnahme durch die beiden GTP-Analoga und bestätigte eine spezifische Wirkung von GTPgammaS und GMppNp auf die vesikuläre Aufnahme.

Die Toxin-Experimente belegen, daß die Aktivität von VMAT2 auch in monoaminergen Neuronen einer Hemmung durch ein G-Protein der Gi/o-Klasse unterliegt (siehe auch Abschnitt 3.2.3 und 3.2.5). In einem folgenden Experiment wurde die Wirkung von Galphao2 auf die Monoaminaufnahme in permeabilisierte Rapheneurone untersucht (Abbildung 30). Gereinigtes Galphao2 führte zu einer Hemmung der vesikulären Noradrenalinaufnahme von 7,8 pmol / mg Protein um 35 %. Die parallel durchgeführte Inkubation mit GMppNp hatte den gleichen Effekt.

Die in Abschnitt 3.7 vorgestellten Ergebnisse dokumentieren eine Hemmung der Aktivität von VMAT2 durch Galphao2 auch in monoaminergen Rapheneuronen.


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Abbildung 29
Die Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierten Rapheneuronen wird durch GTPgammaS und GMppNp gehemmt
A: Rapheneurone (E14) wurden für 24 Tage in Kultur genommen und vor dem Experiment für 48 Stunden mit Puffer oder Ptx (100 ng / ml) behandelt. Vor der Inkubation mit [3H]Serotonin (90 nM, 10 min) erfolgte die SLO-Permeabilisierung mit 100 HE / ml für 2 min. Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (jeweils 50 µM) führte zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven [3H]Serotoninaufnahme von etwa 40 % in den Kontrollzellen. Die Vorbehandlung mit Ptx verhinderte diese Hemmung vollständig.
B: Nach Vorinkubation für 48 h mit TeNt (1 nM) konnte die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTP-Analoga nicht aufgehoben werden.


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Abbildung 30
Die Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierte Rapheneurone wird durch Galphao2 gehemmt
Das Experiment wurde ähnlich wie in Abb. 29 durchgeführt, jedoch wurde [3H]Noradrenalin als Substrat verwendet, und TBZ (10 µM) als spezifischer Inhibitor von VMAT2 eingesetzt. Die Zugabe von AlF4- aktiviertem Galphao2 (10 nM ) führt zu einer Hemmung der vesikulären Aufnahme, die dem der durch GTPgammas vermittelten entsprach.

3.8 VMAT2 und Galphao2 auf monoaminergen synaptischen Vesikeln

Um zu klären, auf welchem Vesikeltyp VMAT2 und Galphao2 in monoaminergen Neuronen lokalisieren, wurden unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet. Zum einen sollte die subzelluläre Fraktionierung der Raphekulturen Hinweise auf die Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 in diesen Neuronen liefern. Zum anderen wurden Areale aus dem präfrontalen Cortex der Ratte mit Hilfe der Immun-elektronenmikroskopie hinsichtlich der Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 auf einzelnen Membrankompartimenten untersucht. Um die Transporter-G-Protein Interaktion funktionell auf isolierten Vesikeln nachzuweisen, wurden die Effekte von gereinigten G-Protein Untereinheiten und GMppNp auf die Serotoninaufnahme an Präparationen synaptischer Vesikel gemessen.


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3.8.1 Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 auf synaptischen Vesikeln von Neuronen

Zur Untersuchung der subzellulären Verteilung von VMAT2 und Galphao2 wurde ein postnukleärer Überstand von 14 Tage alten Raphekulturen mittels einer Dichtegradienten-Zentrifugation analysiert. Die Immunoreplika-Analyse (Abbildung 31) zeigt, daß VMAT2 hauptsächlich auf Membranfraktionen lokalisierte, die sich aus SSVs zusammensetzten. Deutlich wurde dies durch die weitgehende Colokalisation mit Synaptophysin. Ebenfalls in den leichten Membranfraktionen, hauptsächlich den SSV Fraktionen, fand sich der Großteil des Galphao2. Geringere Mengen der G-Protein Untereinheit lokalisierten auch auf schweren Membranfraktionen, die sich, markiert durch ihren Chromogranin B Gehalt, aus LDCVs zusammensetzten, sie enthielten praktisch kein VMAT2. Synaptobrevin fand sich als Membranprotein beider Vesikeltypen sowohl in den Fraktionen der LDCVs als auch der SSVs.

Abbildung 31
Der neuronale Monoamintransporter VMAT2 ist mit Galphao2 auf kleinen synaptischen Vesikeln von Rapheneuronen colokalisiert.
Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert und über 14 Tage in Kultur genommen. Aus einem Homogenat der Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2 M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Zellmembranen. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß VMAT2 hauptsächlich auf Membranfraktionen lokalisiert ist, die den SSVs zuzurechnen sind. Dies wird durch die weitgehende Colokalisation mit Synaptophysin als Markerprotein für kleine synaptische Vesikel deutlich.
Im Bereich der SSV-Fraktionen fand sich ebenfalls der Großteil des Galphao2, das jedoch auch in den übrigen Membranfraktionen, wie etwa denen der LDCVs, markiert durch Chromogranin B, zu finden war. Synaptobrevin fand sich sowohl in den LDCV- als auch in den SSV- Fraktionen des Gradienten.


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Um genauere Aussagen über die subzelluläre Verteilung von VMAT2 und Galphao2 in monoaminergen Neuronen machen zu können, wurden Areale aus dem präfrontalen Cortex der Ratte immunelektronenmikroskopisch untersucht.

Zunächst wurden serotonerge Fasern, die aus der Raphe in den präfrontalen Cortex projezieren, nach Immunfärbung lichtmikroskopisch identifiziert (Abbildung 32A). Die elektronenmikroskopische Analyse dieser serotonergen Projektionen (identifiziert durch das DAB Präzipitat, siehe Methoden) zeigte, daß die Endigungen ausschließlich mit Vesikeln eines Typs, den SSVs, gefüllt waren (Abbildung 32B,C,D). Auf den SSVs sowohl der serotonergen als auch einiger nicht-identifizierter Endigungen fand sich, wie erwartet, Synaptophysin (Abbildung 32B ). VMAT2 fand sich auf SSVs sowohl der serotonergen als auch anderer monoaminerger, vermutlich dopaminerger, Endigungen (Abbildung 32C, C`). Die Analyse der Verteilung von Galphao2 machte deutlich, daß Galphao2 ebenfalls auf SSVs serotonerger sowie nicht serotonerger Endigungen lokalisierte (Abbildung 32D, D`). Zusätzlich konnte Galphao2 auch auf anderen Membranen, etwa der Plasmamembran, gefunden werden (nicht gezeigt).

Die in Abschnitt 3.8.1 vorgestellten experimentellen Befunde belegen eine Lokalisation von VMAT2 in serotonergen Neuronen ausschließlich auf SSVs.


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Abbildung 32
Immunelektronenmikroskopische Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 in serotonergen synaptischen Terminalen aus dem präfrontalen Cortex
A: Die lichtmikroskopische Aufnahme eines Vibratomschnitts aus dem präfrontalen Cortex einer adulten Ratte zeigt die mit einem anti-Serotonin Antiserum aus dem Huhn markierten, mit der DAB Methode sichtbar gemachten, serotonergen Endigungen (Pfeilspitzen). Ausgehend von diesem Gewebe wurden Ultra-Dünnschnitte für die ´post-embedding` -Technik angefertigt. Verwendet wurden hierfür Antikörper gegen VMAT2, Galphao2, Synaptophysin sowie anti-Kaninchen IgG, konjugiert mit 5 nm Goldpartikeln, als sekundärer Antikörper.
B: Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt zwei Terminalen, von denen eine durch das DAB Präzipitat als serotonerg identifiziert werden konnte. Synaptophysin befand sich auf SSVs sowohl der serotonergen (Pfeile) als auch der anderen Terminale (Pfeilspitzen). C, C`: Die Aufnahmen stellen die elektronenmikroskopischen Details zweier serotonerger Terminalen dar. Auf einigen der SSVs dieser Terminalen war VMAT2 lokalisiert (Pfeile). VMAT2 fand sich ebenso auf einigen SSVs benachbarter monoaminerger Terminalen (Pfeilspitzen).
D, D`: Die elektronenmikroskopische Aufnahme in D zeigt die Lokalisation von Galphao2 auf SSVs einer serotonergen Varikosität (Pfeile). Die Aufnahme in D` zeigt, dass Galphao2 auch auf synaptischen Vesikeln nicht-serotonerger Terminalen zu finden war. Maßstab: A 1µm; B-D 150 nm
Die Aufnahme wurde freundlicherweise von Dr. Ingrid Pahner zur Verfügung gestellt.


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3.8.2 Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in synaptische Vesikel durch Galphao2

Für die funktionelle Analyse wurde aus dem präfrontalen Cortex eine Vesikelpräparation (LP2) hergestellt, die sich hauptsächlich aus SSVs zusammensetzt (Huttner et al. 1983).

Über die Immunoreplika-Analyse einer LP2 Vesikelpräparation (Abbildung 33) konnte nachgewiesen werden, daß VMAT2 und Galphao2 auf den Membranen vorhanden waren. Wie für synaptischer Vesikel zu erwarten, ergab sich ein sehr intensives Immunsignal für Synaptophysin.

Um die Regulation der Monoaminaufnahme in synaptische Vesikel durch Galphao2 nachzuweisen, wurde die Serotoninaufnahme unter Zugabe von gereinigten G-Protein Untereinheiten oder GMppNp gemessen (Abbildung 34). Die Zugabe von Galphao2 zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der TBZ-sensitiven Serotoninaufnahme von 5,5 pmol / mg Protein um 45% (Abbildung 34A) . Die Zugabe von GMppNp führte zu einer Hemmung von 50%. In einem ähnlichen Experiment wurde auch gereinigtes Galphao1 zugegeben (Abbildung 34B). Nur Galphao2, nicht jedoch Galphao1 führte zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme.


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Abbildung 33
Nachweis von Galphao2, VMAT2 und Synaptophysin auf synaptischen Vesikeln aus dem präfrontalen Cortex (LP2 Präparation).
Die in der Immunoreplika-Analyse verwendeten Antikörper gegen Galphao2 (371/4 polyklonal, 94.1 monoklonal), VMAT2 und Synaptophysin detektierten Proteinbanden, die den jeweiligen Molekulargewichten entsprachen. AK: Antikörper

Abbildung 34
Galphao2 hemmt die [3H]Serotoninaufnahme in synaptische Vesikel aus dem präfrontalen Cortex
A: Synaptische Vesikel (LP2) aus dem präfrontalen Cortex adulter Ratten wurden für 10 Minuten mit KG3 Puffer, der [3H]Serotonin (90 nM) und entweder Galphao2 (10 nM), GMppNp (50 µM) oder TBZ (10 µM) enthielt, inkubiert. Die Zugabe von Galphao2, wie auch GMppNp führte zu einer Hemmung der TBZ sensitiven [3H]Serotoninaufnahme von 40-45 %. B: In einem ähnlichen Experiment wurden die Vesikel entweder mit gereinigtem, AlF4- aktiviertem Galphao1 oder Galphao2 inkubiert. Nur Galphao2 aber nicht Galphao1 führten zu einer Hemmung der vesikulären TBZ-sensitiven Aufnahme.


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3.9 Die durch GMppNp vermittelte Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte Thrombozyten ist abhängig vom Füllungszustand der Vesikel

Blutplättchen oder Thrombozyten besitzen eine entscheidende Funktion bei der Blutgerinnung. Serotonin wird von ihnen über den Plasmamembrantransporter aufgenommen und in elektronendichten Granula gespeichert. Die Freisetzung des Serotonins trägt über die Bindung an 5HT2-Rezeptoren entscheidend zur Thrombozytenaggregation und Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur bei. In peripheren Geweben wird Serotonin hauptsächlich durch die enterochromaffinen Zellen des Verdauungstraktes synthetisiert und in die Blutbahn abgegeben (Racke et al., 1991). Die Aktivität der Tryptophan-Hydroxylase stellt dabei den Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt bei der Serotonin-Synthese dar.

Die Verfügbarkeit genetisch modifizierter Mäuse, in denen eine Deletionsmutation für das Gen der peripheren Tryptophanhydroxylase vorlag, bot die Möglichkeit, die Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme in Abhängigkeit von der vorhandenen Substratkonzentration, und damit vermutlich auch dem Füllungszustand der Vesikel, zu untersuchen.

Nach Permeabilisierung der Thrombozyten ließ sich sowohl für den Wildtyp als auch für die Mutante eine Serotoninaufnahme messen, die durch Inkubation mit Reserpin oder Tetrabenazin vollständig blockiert werden konnte. Deutlich wurde dabei, daß die Thrombozyten der Deletionsmutanten eine gegenüber dem Wildtyp um etwa 40 % gesteigerte vesikuläre Serotoninaufnahme aufwiesen (Abbildung 35 A). Ein weiterer auffälliger Unterschied bestand in der Empfindlichkeit der Serotoninaufname gegenüber der Inkubation mit GMppNp: Die Inkubation mit dem GTP-Analogon führte in den Wildtyp-Thrombozyten zu einer Hemmung der vesikulären Aufnahme von fast 40% (Abbildung 35 B). Die Serotoninaufnahme in Thrombozyten der


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Deletionsmutante konnte dagegen nicht durch GMppNp gehemmt werden.

Um zu untersuchen, ob dieser offensichtliche Verlust der Regulation ein Resultat des stark verminderten Serotonin Angebots, und damit auch höchstwahrscheinlich des Füllungszustands der Vesikel darstellt, wurden die Thrombozyten der Deletionsmutante vor den Aufnahme-Experimenten mit steigenden Serotonin Konzentrationen (nicht radioaktiv markiert) zwischen 1,5 und 150 µM vorbeladen.

Die vesikuläre Serotoninaufnahme konnte jetzt in Abhängigkeit von der zuvor angebotenen Serotonin-Konzentration durch GMppNp gehemmt werden (Abbildung 36). Die Hemmung stieg zwischen 1,5 und 15 µM Serotonin auf maximal ca. 35 % an, um bei 150 µM Serotonin wieder auf 22 % abzunehmen

Abbildung 35
[3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte Thrombozyten aus Wildtyp und Tryptophanhydroxylase-deletionsmutierten (TPH -/-) Mäusen
Thrombozyten wurden mit SLO permeabilisiert und für 15 min bei 36°C mit 90 nM [3H]Serotonin inkubiert. A: Die vesikuläre Serotoninaufnahme in die Thrombozyten der Deletionsmutante übertraf die Aufnahme in die Wildtyp-Thrombozyten um 40 % (Wildtyp-Aufnahme auf 100 % gesetzt). B: Die Inkubation mit GMppNp führte im Wildtyp zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme von 38 %. In den Thrombozyten der Deletionsmutante hatte die Inkubation mit GMppNp jedoch keinen Effekt.


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Abbildung 36
Die Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in Thrombozyten aus TPH -/- Mäusen kann durch die Vorinkubation mit Serotonin konzentrationsabhängig induziert werden.
Thrombozyten der Tryptophanhydroxylase-Deletionsmutante wurden vor den Experimenten zur [3H]Serotoninaufnahme mit steigenden Konzentrationen an Serotonin (1,5 bis 150 µM, nicht radioaktiv markiert) vorinkubiert. Anschließend wurden die Thrombozyten permeabilisiert und gewaschen. Die Zugabe von GMppNp zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme. Sie stieg zwischen 1,5 und 15 µM Serotonin auf maximal ca. 35 % an, um bei 150 µM Serotonin auf 22 % abzunehmen.


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Fri May 11 16:02:46 2001