Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 BON Zellen als Modell zur Untersuchung der vesikulären Monoaminspeicherung

Die humane neuroendokrine Zellinie BON konnte vor einigen Jahren aus einem Tumor des Pankreas etabliert werden. BON Zellen speichern und sezernieren Serotonin, das diese Zellen als autokrinen Wachstumsfaktor benötigen (Ishizuka et al., 1992). Der Signaltransduktionsweg verläuft dabei über eine 5-HT Rezeptor-gekoppelte Hemmung der Adenylylzyklaseaktivität. Elektronenmikroskopische Analysen belegen die Existenz von elektronendichten sekretorischen Vesikeln in BON Zellen (Parekh et al., 1994). Aufgrund dieser Eigenschaften erschien die Zellinie geeignet zur Untersuchung der Regulation der vesikulären Speicherung von Monoaminen. Neben der einfachen Verfügbarkeit bieten Zellinien gegenüber einer Untersuchung im Gewebe den Vorteil einer gezielteren Manipulation der Kultur- und Versuchsbedingungen. Zudem ermöglicht ein „reduziertes“ System, wie es Zellinien darstellen, oftmals eine fokussiertere Beobachtung einzelner Prozesse.

BON Zellen ließen sich erfolgreich permeabilisieren. Dies stellte eine Voraussetzung für die Kontrolle des intrazellulären Millieus und den direkten Zugang zur Untersuchung intrazellulärer Transportprozesse dar.

4.2 In BON Zellen wird die vesikuläre Monoaminaufnahme durch Galphao2 gehemmt

In SLO-permeabilisierten BON Zellen konnte eine vesikuläre Aufnahme von Serotonin nachwiesen werden. Die Inkubation der Zellen mit GTPgammaS oder GMppNp führte zu einer deutlichen Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme. Dieser Prozeß ließ sich durch die Vorbehandlung der Zellen mit Pertussis Toxin aufheben. Damit war gezeigt, daß heterotrimere G-Proteine der Gi/o-Klasse an der Regulation der Transporteraktivität beteiligt sind. Pertussis Toxin belegt die Beteiligung von Gi/o-Proteinen im allgemeinen für Rezeptor-G-Protein Interaktionen, da die ADP-Ribosylierung den GDP/GTP Austausch verlangsamt. Darüber hinaus scheint jedoch auch die G-Protein-Effektor Interaktion aktivierter ADP-ribosylierter G-Proteine verlangsamt. Der teilweise reversible Charakter des Pertussis Toxin Effekts konnte


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durch die Inkubation mit steigenden GMppNp-Konzentrationen auch für die Transporterregulation demonstriert werden.

Die Inkubation permeabilisierter BON Zellen mit verschiedenen präaktivierten G-Protein Untereinheiten ermöglichte es, Galphao2 als die für die Hemmung verantwortliche Untereinheit zu identifizieren.

Die Spezifität der G-Protein-Effekte auf die vesikuläre Aufnahme konnte durch die Inkubation der Zellen mit Tetanus Neurotoxin demonstriert werden. Auch in Toxin-behandelten Zellen führte die Inkubation mit den GTP-Analoga und Galphao2 zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme, die der in unbehandelten Zellen vergleichbar war.

4.3 In BON Zellen lokalisieren die vesikulären Monoamintransporter überwiegend auf LDCVs

Immunoreplika- Analysen und immunzytochemische Färbungen konnten zeigen, daß in BON Zellen VMAT1 und VMAT2 exprimiert werden. Die immunzytochemische Analyse der zellulären Verteilung ergab außerdem eine Colokalisation der beiden Transporter mit Serotonin, welches in 50 % aller Zellen nachgewiesen werden konnte. Ebenfalls in etwa der Hälfte der Zellen fand sich VMAT2, während VMAT1 in fast allen Zellen exprimiert wurde. In einigen Zellen, die für VMAT1 oder VMAT2 immunpositiv waren, ließ sich kein Serotonin nachweisen. Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine zuvor erfolgte massive Serotoninfreisetzung sein. Einzelne Zellen enthielten weder Transporterprotein noch Serotonin. Die Analyse der zellulären Verteilung von Chromogranin ergab eine weitgehende Colokalisation zwischen diesem in LDCVs gespeicherten Cosekret und Serotonin.

Bei BON Zellen handelt es sich um eine unklonierte Zellinie (Townsend et al., 1993), was die beobachtete heterogene Transporterverteilung erklären könnte. Unklar ist in diesem Zusammenhang, aus welchem Anteil des Pankreas sich die Zellen zusammensetzen. Immunzytochemische Studien belegen das Vorkommen von VMAT2 ausschließlich im endokrinen Anteil des Pankreas (Erickson et al., 1996). Nicht nachgewiesen ist, ob VMAT1 möglicherweise im exokrinen Pankreas exprimiert wird.

Die subzelluläre Fraktionierung von BON Zellen ergab, daß beide Transporter sowie


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Galphao1 und Galphao2 auf den schweren Membranfraktionen der LDCVs zu finden waren. Die partielle Überschneidung beider Transporter mit Fraktionen der SLMVs ließ jedoch in geringerem Umfang auch eine Lokalisation von VMAT1 und VMAT2 auf diesem Vesikeltyp möglich erscheinen. Zusätzlich fand sich Galphao2 auch in den Fraktionen, die sich aus SLMVs und (vermutlich) Fragmenten der Plasmamembran zusammensetzten. Ausschließlich in den LDCV-Fraktionen konnte Galphao1 nachgewiesen werden.

Die Analyse der subzellulären Proteinverteilung in PC 12 Zellen dokumentierte ein Muster, das dem für BON Zellen nachgewiesenen sehr ähnlich war.

Neuroendokrine Zellen und die aus neuroendokrinen Tumoren abstammenden Zellinien enthalten sowohl LDCVs als auch SLMVs (Navone et al., 1986; Wiedenmann et al., 1989). Während die Speicherung von Hormonen und anderen biogenen Peptiden in LDCVs erfolgt, werden in SLMVs hauptsächlich Aminosäuretransmitter wie GABA, Glyzin oder Glutamat gespeichert (Reetz et al., 1991; Ahnert-Hilger et al., 1996).

In den chromaffinen Granula der Zellen des Nebennierenmarks erfolgt die Speicherung der Katecholamine Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin (Johnson, 1988). Die o.a. Ergebnisse zur Lokalisation von VMAT1 hauptsächlich auf den Membranen der LDCVs von PC 12 Zellen stimmen mit elektronenmikroskopischen Befunden an dieser Zellinie überein. Sie wiesen VMAT1 ebenfalls überwiegend auf LDCVs, in geringem Ausmaß jedoch auch auf SLMVs nach (Liu et al., 1994).

Die subzelluläre Fraktionierung der BON Zellen verdeutlichte, daß die Speicherung von Monoaminen in dieser neuroendokrinen Zellinie vorwiegend in LDCVs erfolgt.

Untersuchungen dokumentieren eine differentielle Lokalisation von Galphao1 und Galphao2 auf Membranen der LDCVs und SSVs (Ahnert-Hilger et al., 1994). Während die Verteilung der beta- und gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine der Gi/o-Klasse für beide Vesikeltypen ähnlich war, ergaben sich Unterschiede in der Verteilung der alpha-

Untereinheiten: Auf SSVs von Gehirnhomogenaten der Ratte konnten Galphao1, Galphao2 sowie Galphai1 und Galphai2 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu fand sich auf

chromaffinen Granula aus dem Rind lediglich Galphao2. Generell kommen Go-Untereinheiten in Neuronen und neuroendokrinen Zellen in hohen Konzentrationen vor. Sie können in diesen Zelltypen bis zu 2 % des Gesamtproteins ausmachen


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(Sternweis und Robishaw, 1984).

Für BON Zellen konnte in dieser Arbeit die Existenz von Galphao2 und Galphao1 überwiegend auf der Membran von LDCVs dokumentiert werden. Welche Funktion Galphao1 auf der Vesikelmembran ausübt, ist nicht bekannt. An der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme ist diese Untereinheit jedoch nicht beteiligt.

4.4 Die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 wird in BON Zellen durch Galphao2 reguliert

Das gemeinsame Vorkommen von VMAT1 und VMAT2 in BON Zellen auf LDCVs ermöglichte es, die Regulation beider Transporter vergleichend unter denselben experimentellen Bedingungen zu untersuchen.

Die vorhandenen Unterschiede bezüglich der Affinität für Histamin sowie der Sensitivität gegenüber Tetrabenazin eigneten sich sehr gut für eine experimentelle Differenzierung zwischen der Aktivität von VMAT1 und VMAT2. Die alternative Methode der Transfektion einer Fibroblasten-Zellinie mit der jeweiligen Transporter-DNA hätte den Nachteil von Spezies- und Gewebeunterschieden, sowie mögliche Probleme durch das „Sortieren“ der Transporter auf unterschiedliche Zellkompartimente beinhaltet.

Beide Transporter weisen für Histamin eine im Vergleich zu den übrigen Monoaminen geringe Affinität auf, jedoch besitzt VMAT2 noch eine deutlich höhere Affinität für dieses Substrat als VMAT1. In Übereinstimmung damit repräsentiert VMAT2 auch den in Histamin-produzierenden Zellen exprimierten Transportertyp (Dimaline und Struthers, 1996). Im Gegensatz zu den Katecholaminen und dem Indolamin Serotonin weist Histamin einen unsubstituierten aromatischen Ring auf. Dies scheint verantwortlich für die schlechteren Transporteigenschaften und die Unterschiede in der Affinität zu beiden Transportern zu sein (Schuldiner et al., 1995).

PC12 Zellen, die nur VMAT1 exprimieren, dienten zur Überprüfung der Ansätze. Erwartungsgemäß konnte hier keine vesikuläre Histaminaufnahme gemessen

werden. Dies konnte als Beleg dafür genommen werden, daß Histamin in der angebotenen geringen Konzentration nicht als Substrat für VMAT1 diente.

Tetrabenazin wurde benutzt, um VMAT2 zu hemmen. Da dieser Inhibitor für VMAT1 generell eine sehr geringe, für die humane Variante des Transporters praktisch keine


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Affinität besitzt, konnte VMAT2 sehr selektiv gehemmt werden.

So konnten zwei verschiedene Versuchsbedingungen erarbeitet werden, die es gestatteten, die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 in BON Zellen getrennt zu untersuchen:

Zur Untersuchung der Aktivität von VMAT1 wurde die Serotoninaufnahme in Gegenwart einer hohen Histamin-Konzentration (nicht radioaktiv markiert) gemessen. Hier sollte das in dieser Konzentration angebotene Histamin zu einer kompetitiven Verdrängung des Serotonins aus der Bindung mit VMAT2 führen. Die Zugabe von Tetrabenazin zum Inkubationsansatz bestätigte diese Annahme: Die vesikuläre Serotoninaufnahme konnte nicht mehr durch diesen Inhibitor blockiert werden, was die Aufnahme als VMAT1-Aktivität charakterisierte.

Um die Aktivität von VMAT2 experimentell darzustellen, wurde die vesikuläre Aufnahme von Histamin als Substrat für diesen Transportertyp gemessen (s.o.). Hier führte die Inkubation mit Tetrabenazin zu einer annähernd vollständigen Blockierung der Histaminaufnahme. Dies kennzeichnete die gemessene Aufnahme als VMAT2 Aktivität. Ausgehend von diesen Ergebnissen konnte nun selektiv der Effekt von G?o2 auf die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 untersucht werden.

Die Zugabe von Galphao2 zum Inkubationsansatz führte unter beiden experimentellen Bedingungen zu einer Hemmung der Monoaminaufnahme. Dabei erwies sich VMAT2 jedoch empfindlicher gegenüber der Hemmung durch Galphao2 als VMAT1. Bestätigt wurde die höhere Empfindlichkeit von VMAT2 gegenüber der G-Protein Regulation auch durch die Inkubation mit GMppNp, wobei endogenes Galphao2 aktiviert wurde.

Die Ergebnisse zur Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme in BON Zellen können wie folgt zusammengefaßt werden:

In der humanen neuroendokrinen Zellinie BON wird die vesikuläre Monoaminaufname durch Galphao2 reguliert.

Es kommt hier zu einer Hemmung der Aktivität der beiden in dieser Zellinie exprimierten vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 durch diese G-Protein Untereinheit.

Diese Regulation gilt vorwiegend für LDCVs.

Eine Beteiligung von SLMVs an der Serotoninspeicherung und damit auch eine


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Regulation der SLMV-ständigen Transporteraktivität kann aufgrund der geringen, jedoch vorhandenen Colokalisation von VMAT1, VMAT2 und Galphao2 auch auf diesem Vesikeltyp nicht ausgeschlossen werden.

Die Aktivität von VMAT2 erwies sich als empfindlicher gegenüber der Regulation durch die G-Protein Untereinheit.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die bisher nur für die Zellinie PC12 nachgewiesene Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme (Ahnert-Hilger et al., 1998) ein Prinzip darstellt, welches zumindest in neuroendokrinen Zellinien aus unterschiedlichen sekretorischen Geweben verwirklicht ist. Sie zeigen weiterhin, daß diese Regulation auch in verschiedenen Spezies - PC 12 Zellen stammen aus der Ratte, BON Zellen repräsentieren eine menschliche Zellinie - existiert. Ein weiterer wichtiger Aspekt, auch im Hinblick auf einen ähnlichen Mechanismus im Zentralen Nervensystem, war die Erkenntnis, daß die Interaktion zwischen Transporter und G-Protein Untereinheit nicht auf VMAT1 beschränkt bleibt, sondern auch für VMAT2 besteht. Die im Vergleich zu VMAT1 erhöhte Sensitivität von VMAT2 gegenüber der Hemmung durch Galphao2 könnte im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Gewebeverteilung beider Transporter zu sehen sein. VMAT2 stellt die überwiegend im ZNS exprimierte neuronale Variante des Transporters dar (Peter et al., 1995; Erickson et al., 1996). Es ist vorstellbar, daß die Transmitterspeicherung dort einer empfindlicheren Regulation als in peripheren sekretorischen Geweben unterliegt. In diesem Zusammenhang ist möglicherweise auch die Tatsache zu sehen, daß nur VMAT2, nicht jedoch VMAT1, konstitutiv phosphoryliert wird (Krantz et al., 1997).

4.5 Primärkulturen der Raphe stellen ein geeignetes Modell zur Unter-suchung der vesikulären Monoaminspeicherung in Neuronen dar

Die vorangehend diskutierten Ergebnisse dokumentieren eine Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme, die vorwiegend auf die Speicherung der Monoamine in LDCVs beschränkt sein dürfte. Daraus ergab sich die Frage, ob ein ähnlicher Mechanismus auch für die Monoaminaufnahme in SSVs von Neuronen erfolgt.

Als Modellsystem zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden Primärkulturen der


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Raphe aus der Ratte verwendet. Als nicht-karzinoid transformierte Zellen können sie den Zellinien BON und PC12 gegenübergestellt werden. Die Raphekerne enthalten Populationen von serotonergen Neuronen, die entlang der Mittellinie des Hirnstamms vom Mittelhirn zum verlängerten Rückenmark lokalisiert sind. Von dort projizieren sie diffus in fast alle Bereiche des ZNS. Das serotonerge System übt eine wichtige Funktion bei der Kontrolle komplexer physiologischer Verhaltensfunktionen wie Schlaf (Jouvet, 1999), Appetit (Leibowitz et al., 1998) oder auch Aggressionssteuerung (Kavoussi et al., 1997; Ferris et al., 1999) aus. Zudem trägt Serotonin entscheidend zur Differenzierung des Gehirns während der Embryonalentwicklung bei (Lauder und Krebs, 1978; Chubakov et al., 1986).

Für Serotonin konnte die Speicherung in SSVs serotonerger Projektionen im Rückenmark nachgewiesen werden (Fried et al., 1988; Iverfeldt et al., 1989). Elektronenmikroskopische Analysen bestätigen dies für serotonerge Axone aus dem präfrontalen Cortex von Affen (Smiley et al., 1996).

Um die Primärkulturen auf ihren Gehalt an serotonergen Neuronen zu untersuchten, wurden die Zellen immunzytochemisch analysiert. Bereits nach zwei Tagen in der Kultur ließ sich Serotonin in einzelnen Neuronen nachweisen. Dies kann in Übereinstimmung mit der Tatsache gesehen werden, daß das serotonerge System zu den am frühesten in der Embryonalentwicklung vorhandenen Transmittersystemen gehört (Aitken und Törk, 1988). Innerhalb des beobachteten Kulturzeitraums erhöhte sich der Anteil der serotonergen Neurone. Ebenfalls ab Tag 2 in der Kultur ließ sich VMAT2 in den serotonergen Neuronen nachweisen. Das verstärkte Aussprossen der neuronalen Fortsätze mit zunehmender Kulturdauer kann als „Reifen“ der Zellen interpretiert werden. Die funktionelle Charakterisierung

der Rapheneurone dokumentierte, daß ab Kulturtag 2 über mehrere Wochen eine vesikuläre Serotoninaufnahme, ebenso wie eine Kalium-stimulierte und durch Tetanus Neurotoxin blockierbare Serotoninfreisetzung gemessen werden konnte.

Die Voraussetzungen für eine vesikuläre Speicherung und Freisetzung von Monoaminen scheint somit in Rapheneuronen ähnlich früh wie die Fähigkeit zur Serotonin-Synthese entwickelt zu sein. Diese funktionellen Eigenschaften können offensichtlich auch über einen längeren Zeitraum in Kultur aufrecht erhalten werden.


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4.6 Die Aktivität von VMAT2 wird in permeabilisierten Rapheneuronen durch Galphao2.gehemmt

Um die Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme in Rapheneuronen zu untersuchen, wurde die an BON und PC 12 Zellen angewandte Permeabilisierungstechnik auch an den Primärkulturen aus der Raphe eingesetzt. Funktionelle Untersuchungen an permeabilisierten Neuronen sind bisher wenig etabliert. Eingesetzt wurde diese Technik zumeist lediglich in immunzytochemischen Studien an Primärkulturen von Neuronen (Noel et al., 1999) oder Neuroblastoma-Zellinien (Chambaut-Guerin et al., 1997).

Nach Permeabilisierung der Rapheneurone mit SLO ließ sich eine gegenüber nicht-permeabilisierten Zellen deutlich gesteigerte Serotoninaufnahme messen, die durch die Inkubation mit Tetrabenazin blockiert werden konnte. Aufgrund der Umgehung der substratspezifischen Plasmamembrantransporter repräsentierte die gemessene Serotoninakkumulation nun den vesikulären Transport aller in der Kultur vorhandenen monoaminergen, also auch dopaminergen, Neurone.

In Analogie zu den an BON Zellen durchgeführten Experimenten konnten permeabilisierte Rapheneurone jetzt mit G-Protein Aktivatoren inkubiert werden. Die Ergebnisse ließen auf eine Beteiligung heterotrimerer G-Proteine bei der Regulation der vesikulären Monoaminspeicherung auch in Rapheneuronen schließen: So kam es nach Inkubation der Zellen mit GTPgammaS oder GMppNp zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme. Die Vorbehandlung der Raphekulturen mit Pertussis Toxin verhinderte diese Hemmung vollständig und erlaubte die Einordnung des verantwortlichen G-Proteins in die Pertussis Toxin sensitive Gi/o-Klasse. Die

Spezifität der Effekte auf die vesikuläre Aufnahme wurde wie in BON Zellen durch Vorinkubation der Zellen mit Tetanus Neurotoxin sichergestellt.

Um zu klären, ob die Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme in Rapheneuronen auf der Regulation von VMAT2 durch Galphao2 beruht, wurde die Wirkung dieser Untereinheit auf die Aufnahme untersucht. Durch die Inkubation mit Galphao2 konnte die vesikuläre Monoaminaufnahme ebenfalls gehemmt werden.

Die an Primärkulturen der Raphe durchgeführten Experimente konnten demonstrieren, daß es auch in monoaminergen Neuronen zu einer Regulation der Transmitterspeicherung durch Galphao2 kommt. Die Tatsache, daß es sich um die


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gleiche Untereinheit handelt, die auch in BON und PC12 Zellen für eine Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme verantwortlich ist, dokumentiert deutlich eine generelle Funktion dieser G-Protein Untereinheit auf intrazellulären Speicherorganellen.

4.7 VMAT2 und Galphao2 lokalisieren in kultivierten Rapheneuronen und serotonergen Axonen aus dem präfrontalen Cortex auf SSVs

Unterschiedliche experimentelle Ansätze wurden verwendet, um die Frage zu klären, auf welchem Vesikeltyp VMAT2 und Galphao2 lokalisieren. Zunächst sollte wiederum die subzelluläre Fraktionierung der Rapheneurone Hinweise auf die Verteilung des Transporters und der G-Protein Untereinheit auf SSVs oder LDCVs liefern.

Monoamine können in Neuronen in unterschiedlichen Zellorganellen gespeichert werden: In Neuronen der Substantia nigra scheint die Dopaminspeicherung nur zu einem geringen Teil in SSVs oder LDCVs zu erfolgen. Der Großteil wird in tubovesikulären Strukturen, die vermutlich dem glatten endoplasmatischem Retikulum zuzurechnen sind, gespeichert. Zumindest müssen die Befunde zur Lokalisation von VMAT2 auf diesen Endomembrankompartimenten so interpretiert werden (Nirenberg et al., 1996). Für Serotonin konnte, wie erwähnt, die Speicherung in SSVs nachgeweisen werden. Ultrastrukturelle Untersuchungen belegen jedoch auch die Existenz von LDCVs in serotonergen Axon-Terminalen des Striatums (Soghomonian et al., 1989). Eine Besonderheit stellt die Noradrenalinspeicherung dar. In noradrenergen Neuronen kann die Speicherung in kleinen elektronendichten

Vesikeln erfolgen, die möglicherweise einen Mischtyp aus SSVs und LDCVs repräsentieren (Bauerfeind, 1995).

Die subzelluläre Fraktionierung der kultivierten Rapheneurone ergab ein Verteilungsmuster von VMAT2 und Galphao2, das sich deutlich von dem in BON und PC12 Zellen vorgefundenen unterschied: So fand sich VMAT2 überwiegend auf Membranen der SSVs. Membranfraktionen der LDCVs wiesen nur sehr geringe Mengen des Transporters auf. Ebenfalls in den leichten Membranfraktionen fand sich der Großteil des Galphao2. Geringere Mengen der G-Protein Untereinheit konnten auch in den LDCV- Fraktionen nachgewiesen werden.

Um die Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 auf sekretorischen Vesikeln serotonerger


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Neurone genauer analysieren zu können, wurde der präfrontale Cortex der Ratte als Projektionsgebiet der Rapheneurone immunelekronenmikroskopisch untersucht.

Die Analyse des Vesikeltypen dokumentierte, daß die serotonergen Endigungen ausschließlich mit SSVs angefüllt waren. Auf diesen Vesikeln konnte sowohl VMAT2 als auch Galphao2 nachgewiesen werden. Auf den SSVs einiger nicht identifizierter Neurone fanden sich ebenfalls VMAT2 und Galphao2. Vermutlich handelte es sich bei diesen offensichtlich ebenfalls monoaminergen Zellen um dopaminerge Endigungen.

Diese Ergebnisse dokumentieren die Lokalisation von VMAT2 und G?o2 in serotonergen Projektionen im präfrontalen Cortex ausschließlich auf SSVs. Sie bestätigen damit die Ergebnisse zur subzellulären Verteilung in kultivierten Rapheneuronen. Im Gegensatz dazu ist die vorwiegende Lokalisation der VMATs in PC12 und BON Zellen auf LDCVs zu sehen.

Um diese morphologischen Ergebnisse auch funktionell zu bestätigen, wurde versucht, die Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme durch Galphao2 auch an isolierten synaptischen Vesikeln nachzuweisen. Hierfür wurde aus dem präfrontalen Cortex eine Vesikelpräparation (LP2) hergestellt, die sich hauptsächlich aus SSVs zusammensetzt (Huttner, 1983). Eine vollständige Aufreinigung der LP2 Präparation in Richtung kleiner synaptischer Vesikel war durch Immunisolation über Synaptophysin möglich. Dies erschien jedoch nicht geeignet, da bei dieser Methode mit dem Verlust von regulatorischen Membrankomponenten, z.B. G-Protein Untereinheiten, zu rechnen ist (Ahnert-Hilger et al., 1994).

Auf den Vesikel der LP2 Präparation ließen sich VMAT2 und Galphao2 ebenso wie das zur Kontrolle untersuchte Synaptophysin in der Immunoreplika-Analyse nachweisen. An den isolierten Vesikeln konnte schließlich direkt eine vesikuläre Serotoninaufnahme gemessen werden, die durch die Inkubation mit GMppNp oder Galphao2 stark gehemmt werden konnte.

Diese Daten belegen, daß die Regulation von VMAT2 durch Galphao2 auch für SSVs des ZNS zutrifft


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4.8 Funktionelle Bedeutung der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme durch Galphao2

Die vorgestellten Ergebnisse der an der neuroendokrinen Zellinie BON, neuronalen Primärkulturen der Raphe und Präparationen aus dem präfrontalen Cortex durchgeführten Experimente dokumentieren die Funktion von vesikelständigem Galphao2 bei der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme. In diesen monoaminergen Zellsystemen und Geweben existiert somit ein G-Protein-Effektor System, bei dem es zu einer Hemmung der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 durch die alpha-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins Go2 kommt. Die Regulation der Transporteraktivität bleibt dabei nicht auf die Monoaminaufnahme in LDCVs beschränkt, sondern erfolgt auch auf SSVs von Neuronen.

Die Daten zur Histaminaufnahme in BON Zellen und Noradrenalinaufnahme in Rapheneurone bestätigten, daß es sich bei den untersuchten Transportvorgängen ausschließlich um die spezifische Akkumulation in sekretorischen Vesikeln handelte. Hiermit konnte ausgeschlossen werden, daß es nach Inkubation mit dem Tritium-markierten Transmitter zu einem Austausch mit dem bereits in den Vesikeln gespeicherten Transmitter (Serotonin) über den Transporter kam.

Die Hemmung der Aktivität vesikulärer Monoamintransporter durch Galphao2 repräsentiert somit ein allgemeines Prinzip der Regulation dieses Transportprozesses durch ein Element der intrazellulären Signaltransduktion in peripheren neuroendokrinen Geweben und zentralnervösen Neuronen. Dieser Mechanismus reguliert in verschiedenen Spezies die Monoaminspeicherung in LDCVs und SSVs bzw. deren Analoga.

Unterschiedliche Funktionen der durch G-Proteine vermittelten Hemmung der Aktivität vesikulärer Monoamintransporter sind denkbar.

Eine wichtige Funktion könnte darin bestehen, über die Aktivität der Transporter den Füllungszustand der Vesikel zu beeinflussen. Die freigesetzte Transmittermenge bestimmt die postsynaptische oder hormonelle Antwort auf einen Stimulus. Sie stellt somit einen entscheidenden Parameter dar, der die Aktivität einer Synapse oder sekretorischen Zelle bestimmt. Die Variabilität des freigesetzten Transmitter-quantums konnte bereits für monoaminerge sekretorische Vesikel nachgewiesen werden. So steigert der neurotrophe Faktor GDNF (glial-derived neurotrophic factor)


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die quantale Freisetzung aus dopaminergen Neuronen etwa um das 4-fache (Pothos et al., 1998b). Durch die zusätzliche Gabe von L-DOPA, einer Vorstufe in der Dopamin-Synthese, konnte eine ähnlich starke Erhöhung der quantalen Freisetzung erzielt werden. In PC 12 Zellen dagegen führte die über D2-Autorezeptoren vermittelte Hemmung der Tyrosinhydroxylase-Aktivität zu einer verminderten quantalen Freisetzung (siehe Einleitung). Die präsynaptische Regulation der freigesetzten Transmittermenge dürfte besonders in neuromodulatorischen Systemen eine große Bedeutung besitzen, in denen es durch die sehr weiträumige Diffusion des Transmitters zu einer Beeinflussung einer hohen Anzahl postsynaptischer Neurone kommt. Ein Beispiel für eine solche für viele monoaminerge Systeme zutreffende „Überflutung“ postsynaptischer Zellen ist die Dopamin-Freisetzung aus den Neuronen des Nucleus accumbens (Garris et al., 1994). Auch die in nicht-monoaminergen Vesikeln gespeicherte Transmittermenge kann moduliert werden. So kommt es durch die Überexpression des Acetylcholintransporters auf SSVs zu einer deutlichen Steigerung des vesikulären Acetylcholingehalts bis auf das 10-fache (Song et al., 1997).

An der neuromuskulären Endplatte der Schlange (Thamnophis sirtalis) erfolgt eine aktivitätsabhängige Modifikation des Transmitterquantums. Nach andauernder Stimulation motorischer Nerven kam es in einer Population sekretorischer Vesikel zu einer Verringerung des freigesetzten Transmitterquantums, während die Transmittermenge einer anderen Population unverändert blieb (Searl et al., 1990). Interpretiert werden könnten die zwei unterschiedlich beladenen Vesikelpopulationen als zum Zeitpunkt der Stimulation bereits „fertige“ (gleichbleibender

Acetylcholingehalt) bzw. im Verlauf der Stimulation neu gebildete (verringerter Acetylcholingehalt) Vesikel.

Die Regulation der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 durch Galphao2 könnte der Faktor sein, der den Füllungszustand monoaminerger Vesikel aktivitätsabhängig steuert und somit auch zur synaptischen Plastizität beiträgt.

Die generelle Bedeutung der Aktivität vesikulärer Monoamintransporter für den Füllungszustand sekretorischer Vesikel zeigt sich in transgenen Tieren, in denen die Gene für die Transporter funktionell ausgeschaltet worden sind. An isolierten Mastzellen aus Mäusen, die homozygot für die VMAT2 Deletionsmutante waren, ließ sich nach exozytotischer Mebranfusion amperometrisch keine Monoaminsekretion


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nachweisen (Travis et al., 2000). Zellen aus heterozygoten Tieren sezernierten eine geringere Menge an Histamin und Serotonin als die Wildtyp-Zellen. Während homozygote Tiere nach wenigen Tagen sterben, zeigen sich heterozygote Tiere sensibler gegenüber einigen Neurotoxinen oder Pharmaka, erreichen jedoch ohne gravierende Störungen das Erwachsenenalter (Takahashi et al., 1997).

Im Zusammenhang mit einer schnellen Wiederbeladung besonders der SSVs - hier erfolgt das lokale Recycling innerhalb von 1-2 min (Betz und Bewick, 1992) - könnte eine durch Galphao2 bewirkte Erhöhung der Km-Werte der Transporter gesehen werden: Die vesikuläre Speicherung von Monoaminen repräsentiert einen hochaffinen Transportprozeß. Die Km-Werte als Maß für die Affinität der Transporter zu den einzelnen Substraten liegen im niedrigen mikromolaren Bereich (siehe Einleitung). Sie stehen damit im Gegensatz zu den im millimolaren Bereich liegenden Km-Werten der vesikulären Transportaktivitäten für Acetylcholin (Parson et al., 1993), Glutamat und GABA / Glyzin (Maycox et al., 1988; Burger et al., 1991). Als funktionelle Konsequenz dieser hohen Affinität geht die vesikuläre Monoaminspeicherung bereits bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen in Sättigung über. Darin dürfte ein limitierender Schritt für die schnelle Wiederbeladung der SSVs bestehen. Eine Verringerung der Substrataffinität besonders von VMAT2 durch G?o2 könnte den Mechanismus darstellen, der eine schnelle Wiederbeladung synaptischer Vesikel bei hohem Monoaminangebot ermöglicht.

Ein essentieller Aspekt der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme kann im Zusammenhang mit dem Schutz der Zelle vor toxisch wirkenden Substanzen gesehen werden. Da vor allem hohe Dopamin-Konzentrationen bzw. dessen oxidative Abbauprodukte toxisch auf mitochondriale ATPasen wirken (Rosenberg 1988), ist die Aufrechterhaltung einer niedrigen zyoplasmatischen Konzentration dieses Transmitters entscheidend für das Überleben der Zelle. Auch bezüglich anderer, pathophysiologisch bedeutsamer Substanzen wie Amphetamine, MPP+, Ethidium oder Rhodamin konnte für VMAT1 und VMAT2 eine Transportaktivität nachgewiesen werden (Yelin und Schuldiner, 1995). Das Substratspektrum ähnelt somit dem der phylogenetisch eng verwandten bakteriellen Toxin-exportierenden Transporterproteine (Schuldiner et al., 1995). Die Abwesenheit vesikulärer Monoamintransporter in periglomerulären dopaminergen Zellen des Bulbus


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olfactorius (Peter et al., 1995) macht diese Neurone vermutlich zu den ersten vom Parkinson-Syndrom betroffenen Zellen (Daniel und Hawkes, 1992).

Eine durch Galphao2 bewirkte Erhöhung der Km-Werte der VMATs könnte die Zelle dazu befähigen, selbst hohe Konzentrationen toxischer Substanzen effektiv aus dem Zytoplasma zu entfernen.

Der Effekt einer selektiven Ausschaltung der Aktivität von vesikelständigem Galphao2 auf den Organismus konnte bislang nicht demonstriert werden. Die Deletionsmutation des Galphao Gens führte zu einer verringerten Lebenserwartung der Mäuse (Jiang et al., 1998). Auffällig sind dabei unterschiedliche neurologische Störungen, die zum teilweisen Verlust der motorischen Steuerung oder einer erhöhten Schmerzempfindlichkeit der homozygoten Tiere führen.

4.9 Wie kommt es zur G-Protein-Aktivierung?

Verschiedene Mechanismen, die zu einer Aktivierung von Go2, und damit zu einer Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme führen, sind denkbar.

Möglicherweise existiert ein Sensor im Vesikelinneren, der den Transmittergehalt registriert und den Transportprozeß herunterreguliert, etwa wenn ein bestimmter Füllungszustand erreicht ist. Als Sensor könnte dabei ein vesikelständiger Transmembranrezeptor dienen, der ähnlich den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren der Plasmamembran über eine Interaktion mit einem Liganden (aus dem Vesikellumen) zur Aktivierung des G-Proteins führt. Bis jetzt ist lediglich ein Beispiel für ein Protein auf dem Endomembransystem bekannt, dessen Topologie dem eines heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptors entspricht. Der KDEL-Rezeptor auf Membranen des Golgi-Apparates ist am Rücktransport löslicher Proteine zum endoplasmatischen Retikulum beteiligt (Scheel und Pelham, 1998).

Ein Auslöser für die Hemmung der vesikulären Aufnahme könnte sowohl ein volles, aber auch ein leeres Vesikel sein. Die Hemmung der Transporteraktivität eines leeren Vesikels könnte während der Biosynthese oder dem endozytotischen Recycling-Prozeß sekretorischer Vesikel sinnvoll sein. In beiden Fällen dürfte sich die Zusammensetzung des Vesikelinneren von dem eines „reifen“ Vesikels unterscheiden. Eine Beteiligung von vesikelständigen alpha-Untereinheiten von Go zumindest bei der Regulation der exozytotischen Membranfusion konnte in


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chromaffinen und PC 12 Zellen nachgewiesen werden (Vitale et al., 1994; Ahnert-Hilger et al., 1998).

Alternativ dazu könnte es auch zu einer Aktivierung des G-Proteins durch zytoplasmatische Faktoren kommen. Denkbar wäre im bereits diskutierten Zusammenhang eine Abhängkeit von der zytoplasmatischen Substratkonzentration. Interessanterweise erfolgt die Aktivierung plasmamembranständiger G-Proteine der Go-Klasse nicht ausschließlich über Membranrezeptoren. Mit GAP43, einem in Wachstumskegeln von Neuriten aktiven Protein (Strittmatter et al., 1990), sowie dem Alzheimer Amyloid-Vorläufer Protein (Nishimoto et al., 1993) existieren zwei weitere bekannte Aktivatoren für Go.

Zwei verschiedene Modelle der Regulation des Füllungszustandes sekretorischer Vesikel werden diskutiert (Williams, 1997): Das „set point“ Modell geht von einem festgelegten Füllungsgrad des Vesikels aus, der nicht überschritten wird. Eine Veränderung der Aktivität vesikulärer Transporter würde demnach lediglich zu einer schnelleren oder langsameren Vesikelfüllung, nicht jedoch zu einer Veränderung der gespeicherten Transmittermenge führen. Das „steady state“ Modell geht hingegen von einem Fließgleichgewicht aus, das sich zwischen Transmitteraufnahme und einem Leck-Mechanismus der Vesikelmembran einstellt. In diesem Fall würde sich

der Füllungsgrad des Vesikels abhängig von der Aktivität der Transporter auf unterschiedlichem Niveau einstellen. Die Ergebnisse, die eine Erhöhung des freigesetzten Transmitterquantums belegen (s.o.), würden sich unter der Annahme, daß die Größe des Vesikels unverändert bleibt, also nur mit dem „steady state“ Modell erklären lassen. Kommt es jedoch zu einer - möglicherweise aktivitätsabhängigen - Veränderung der Vesikelgröße, könnten diese Befunde jedoch auch mit dem „set point“ Modell erklärt werden.

Die in den Experimenten an Thrombozyten erhaltenen Befunde sprechen für eine Regulation der Transporteraktivität über den Füllungszustand des Vesikels:

In Thrombozyten der Tryptophanhydroxylase-Deletionsmutante konnte zunächst keine Hemmung der Serotoninaufnahme durch GMppNp gemessen werden. Nach Vorinkubation der Thrombozyten mit Serotonin ließ sich jedoch eine Hemmung nachweisen, die der im Wildtyp beobachteten entsprach. Vermutlich kommt es in der Deletionsmutante über die Verarmung des Serotonin-Angebots zu einer chronischen


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Entleerung der Speicherorganellen, die eine Hemmung der Transporteraktivität über den G-Protein-Mechanismus verhindert. Durch die Vorbeladung der Vesikel mit Serotonin, wodurch das System wieder in Richtung Wildtyp verschoben wurde, konnte also ein Zustand geschaffen werden, in dem die Regulation der Transporteraktivität durch Galphao2 einsetzte. Eine Beteiligung zytoplasmatischer Faktoren bzw. der Substratkonzentration an der Regulation ist in diesem System durch die Permeabilisierung und das Waschen nach Vorinkubation mit Serotonin unwahrscheinlich.

4.10 Ausblick

Zu klären bleibt, ob es sich bei der Regulation der Transporteraktivität um eine direkte Interaktion der G-Protein Untereinheit mit dem Transporter handelt, oder ob die Hemmung über die Aktivierung zusätzliche Faktoren - möglicherweise Kinasen oder Phospholipasen - erfolgt. Experimente mit Methoden der Immunpräzipitation sowie chemischem „Crosslinking“ lieferten noch keine eindeutigen Ergebnisse.Ein weiterer interessanter Aspekt liegt in der Frage, ob die beschriebene Regulation durch Galphao2 auch für die vesikuläre Speicherung anderer Transmitterstoffe, wie Acetylcholin, Glutamat oder GABA und Glyzin zutrifft.


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Fri May 11 16:02:46 2001