Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen
Dissertation
Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr.rer.nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität von

Markus Höltje,
geb.09.08.1969 in Braunschweig

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof.Dr.Dr.h.c. Hans Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof.Dr. Bernd Ronacher

Gutachter:
Herr Prof.Dr. Harald Saumweber
Frau Prof.Dr.Gudrun Ahnert-Hilger
Herr Priv.Doz.Dr. Klaus Buchner

eingereicht: 21.06.2000

Datum der Promotion: 12.09.2000

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 durch heterotrimere G-Proteine untersucht.

In der humanen neuroendokrinen Zellinie BON werden VMAT1 und VMAT2 exprimiert. Sie colokalisieren in diesen Zellen mit der alpha-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins Go2 vorwiegend auf großen elektronendichten Vesikeln, den LDCVs. Die Aktivität beider Transporter unterliegt einer Regulation durch Galphao2. Nach Aktivierung des G-Proteins kommt es zu einer Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme. Die Aktivität von VMAT2 wird dabei empfindlicher reguliert als die Aktivität von VMAT1.

In Primärkulturen von Rapheneuronen der Ratte wird VMAT2 als neuronale Variante des Transporters exprimiert. VMAT2 lokalisiert in diesen Neuronen überwiegend auf kleinen synaptischen Vesikeln, den SSVs. Hier kommt es zu einer Colokalisation mit Galphao2 auf diesem Vesikeltyp. Auch in Rapheneuronen wird die Aktivität von VMAT2 durch diese G-Protein Untereinheit gehemmt.

Elektronenmikroskopische Befunde belegen die Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 auf SSVs von serotonergen Axonterminalen im präfrontalen Cortex der Ratte. An einer Präparation synaptischer Vesikel aus diesem Gehirnbereich konnte ebenfalls eine Hemmung der Transportaktivität von VMAT2 durch Galphao2 nachgewiesen werden.

Auch in Thrombozyten der Maus unterliegt die vesikuläre Serotoninaufnahme einer Hemmung durch ein heterotrimeres G-Protein. In chronisch entleerten Vesikeln aus Mäusen, in denen das Gen für die periphere Tryptophanhydroxylase deletionsmutiert vorlag, konnte zunächst keine Hemmung der Serotoninaufnahme durch heterotrimere G-Proteine beobachtet werden. Nach Vorbeladung der Vesikel mit Serotonin war dies jedoch der Fall. Die Aktivierung des G-Proteins wird somit sehr wahrscheinlich über den Füllungszustand der Vesikel gesteuert.

Schlagwörter:
VMAT1, VMAT2, heterotrimere G-Proteine, Monoaminaufnahme

Abstract-English

In this study we investigated the regulation of the activity of the vesicular monoamine transporters VMAT1 and VMAT2 by heterotrimeric G-proteins.

In the human neuroendocrine cell line BON both transporters are expressed. They colocalize in these cells with the alpha-subunit of the heterotrimeric G-protein Go2 predominantely on Large Dense Core Vesicles (LDCVs). The activity of both VMAT1 and VMAT2 is regulated by Galphao2. G-protein activation results in a down-regulation of vesicular monoamine uptake. VMAT2 appears to be more sensitive towards the observed G-protein regulation than VMAT1.

Serotonergic raphe neurons in primary culture express VMAT2 as the neuronal form of the transporter. In these neurons VMAT2 predominantely localizes to Small Synaptic Vesicles (SSVs). Here, VMAT2 colocalizes with Galphao2 on SSVs. In these neurons Galphao2-dependent down-regulation of VMAT2 activity was observed, too.

Immunoelectron microscopic analysis confirmed a localization of VMAT2 and Galphao2 on SSVs from serotonergic terminals in the rat prefrontal cortex. In addition, Galphao2-dependent regulation of VMAT2 activity could also be demonstrated when using a crude synaptic vesicle preparation of this brain area.

Even in platelets obtained from mice the vesicular serotonin uptake is down-regulated by heterotrimeric G-proteins. In serotonin-depleted platelets from peripheral tryptophane-hydroxylase knockout mice no G-protein-dependent down-regulation of monoamine uptake was observed. After preincubation of the platelets with serotonin, the G-protein regulation was restored. Therefore, the vesicular transmitter content appears to be a likely factor of G-protein activation in platelets.

Keywords:
VMAT1, VMAT2, heterotrimeric G-proteins, monoamine uptake


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteRegulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen
1 Einleitung
1.1Transmitter als Botenstoffe im Organismus
1.2Transporter der Plasmamembran
1.3Vesikuläre Speicherung der Transmittersubstanzen
1.4Vesikuläre Transporter
1.5Vesikuläre Speicherung der Monoamine
1.6Regulation der vesikulären Speicherung
1.7Heterotrimere G-Proteine als Bestandteile vieler Signaltransduktions-prozesse
1.8Fragestellung
2 Material und Methoden
2.1Chemikalien und Reagenzien
2.2Puffer und Lösungen
2.3Medien für die Zellkultur
2.4Verwendete Antikörper
2.5Durchführung der Experimente
2.5.1Zellkultur
2.5.2Permeabilisierung mit alpha-Toxin und Streptolysin-O
2.5.3Monoaminaufnahme in permeabilisierte Zellen
2.5.4Monoaminsekretion
2.5.5Transfektion von COS Zellen
2.5.6Protein-Gelelektrophorese und Immunoreplika-Analyse
2.5.7Immunzytochemie
2.5.8Elektronenmikroskopie
2.5.9Subzelluläre Fraktionierung
2.5.10Bestimmung von Protein-Konzentrationen
2.5.11Präparation von synaptischen Vesikeln (LP2)
2.5.12Thrombozytenpräparartion
2.6Verwendete Geräte
3 Ergebnisse
3.1Poren-bildende Toxine als Werkzeuge zur Untersuchung intrazellulärer Transportprozesse
3.2Regulation der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen durch heterotrimere G-Proteine
3.2.1Vesikuläre Aufnahme von Serotonin
3.2.2Hemmung der vesikulären Aufnahme durch Aktivatoren heterotrimerer G-Proteine
3.2.3Aufhebung der durch GTPgammaS und GMppNp induzierten Hemmung durch Pertussis Toxin
3.2.4Hemmung der vesikulären Aufnahme durch Galphao2
3.2.5Spezifität der G-Protein Effekte auf die vesikuläre Aufnahme
3.3Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern gegen VMAT1 und VMAT2
3.4Untersuchungen zur subzellulären Verteilung von VMAT1 und VMAT2 in PC12 und BON Zellen
3.4.1In PC12 Zellen lokalisiert VMAT1 überwiegend auf LDCVs
3.4.2In BON Zellen lokalisieren VMAT1 und VMAT2 überwiegend auf LDCVs
3.5Funktionelle Differenzierung zwischen der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 in BON Zellen
3.6Unterschiedliche Empfindlichkeit der Aktivität von VMAT1 und VMAT2 gegenüber der Regulation durch Galphao2
3.7Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme in Neuronen
3.7.1Primärkulturen der Raphe als Modell zur Untersuchung der Speicherung von monoaminergen Transmittern
3.7.2Funktionelle Charakterisierung monoaminerger Neurone in Primärkultur der Raphe
3.7.3Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte Rapheneurone durch Galphao2.
3.8VMAT2 und Galphao2 auf monoaminergen synaptischen Vesikeln
3.8.1Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 auf synaptischen Vesikeln von Neuronen
3.8.2Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in synaptische Vesikel durch Galphao2
3.9Die durch GMppNp vermittelte Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in permeabilisierte Thrombozyten ist abhängig vom Füllungszustand der Vesikel
4 Diskussion
4.1BON Zellen als Modell zur Untersuchung der vesikulären Monoaminspeicherung
4.2In BON Zellen wird die vesikuläre Monoaminaufnahme durch Galphao2 gehemmt
4.3In BON Zellen lokalisieren die vesikulären Monoamintransporter überwiegend auf LDCVs
4.4Die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 wird in BON Zellen durch Galphao2 reguliert
4.5Primärkulturen der Raphe stellen ein geeignetes Modell zur Unter-suchung der vesikulären Monoaminspeicherung in Neuronen dar
4.6Die Aktivität von VMAT2 wird in permeabilisierten Rapheneuronen durch Galphao2.gehemmt
4.7VMAT2 und Galphao2 lokalisieren in kultivierten Rapheneuronen und serotonergen Axonen aus dem präfrontalen Cortex auf SSVs
4.8Funktionelle Bedeutung der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme durch Galphao2
4.9Wie kommt es zur G-Protein-Aktivierung?
4.10Ausblick
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung
Danksagung
Lebenslauf

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1
Sekundärstruktur von VMAT2 der Ratte (nach Liu und Edwards, 1997)
Abbildung 2
Aufnahme und Sekretion von [3H]Noradrenalin nach Permeabilisierung von PC12 Zellen mit alpha-Toxin und Streptolysin-O (SLO)
A: Trypan Blau Ausschluß-Test in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden gewaschen und für 5 Min mit Puffer oder 100 hämolytischen Einheiten (HE) / ml SLO bei 36°C inkubiert. Gleiche Volumina der Zellsuspension und Trypan Blau, einem nicht-membrangängigen Farbstoff, wurden vermischt und unter dem Lichmikroskop (Phasenkontrast für Kontrollzellen) betrachtet. Eine komplette Färbung war nur in den SLO permeabilisierten Zellen, nicht jedoch in den Kontrollzellen, zu erkennen.
B: [3H]Noradrenalinaufnahme in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden suspendiert und mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen mit 90 nM [3H]Noradrenalin in KG / ATP Puffer für 20 min inkubiert. In den Toxin-behandelten Zellen konnte eine deutlich höhere [3H]Noradrenalinaufnahme als in den nicht-permeabilisierten Zellen gemessen werden. Die Permeabilisierung mit SLO hatte den stärksten Effekt, die Applikation von 55 HE / ml führte zu einer Erhöhung der Aufnahme um das 8-fache.
C: [3H]Noradrenalinsekretion in PC12 Zellen
PC12 Zellen wurden für 2 Stunden mit 40 nM [3H]-Noradrenalin vorbeladen. Nach dem Abwaschen des Inkubationsmediums wurden die Zellen suspendiert und mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Die Stimulation erfolgte für 10 min bei 36°C in KG4 Puffer (15 µM freies Ca2+). Die Toxin-behandelten Zellen zeigten eine deutlich höhere [3H]Noradrenalinsekretion als die nicht permeabilisierten Zellen. Am stärksten war der Effekt bei der Permeabilisierung mit 100 HE / ml alpha-Toxin, die zu einer Erhöhung der Sekretion um das 5-fache führte.
Abbildung 3
Aufnahme von [3H]Serotonin nach Permeabilisierung von BON Zellen mit Streptolysin-O (SLO) und alpha-Toxin
A: Trypan Blau Ausschluß-Test in BON Zellen
BON Zellen wurden gewaschen und für 5 Min mit Puffer oder 100 HE / ml SLO bei 36°C inkubiert. Gleiche Volumina der Zellsuspension und Trypan Blau wurden vermischt und unter dem Lichtmikroskop (Phasenkontrast für Kontroll Zellen) betrachtet. Eine komplette Färbung war nur in den SLO-permeabilisierten Zellen, nicht jedoch in den Kontrollzellen, zu erkennen.
B: [3H]Serotoninaufnahme in BON Zellen
BON Zellen wurden suspendiert und mit Puffer oder unterschiedlichen Konzentrationen an alpha-Toxin oder SLO inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen mit 90 nM [3H]Noradrenalin in KG / ATP Puffer für 20 min inkubiert. In den Toxin-behandelten Zellen konnte eine deutlich höhere [3H]Serotoninaufnahme als in den nicht permeabilisierten Zellen gemessen werden. Die Applikation von 100 HE / ml alpha-Toxin oder SLO führte einer maximalen Erhöhung der Aufnahme um das 4 bis 5- fache.
Abbildung 4
Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen ist ATP-abhängig und kann durch Reserpin blockiert werden
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min bei 36°C mit [3H]Serotonin (90 nM) in KG3 Puffer inkubiert. In Abwesenheit von ATP (KG1 Puffer) war nur eine unspezifische Akkumulation von Radioaktivität meßbar. Der Zusatz von Reserpin (Endkonzentration 5 µM) führte zu einer kompletten Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme.
Abbildung 5
Die vesikuläre Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierte BON Zellen wird durch Aktivatoren heterotrimerer G-Proteine gehemmt
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min mit [3H]Serotonin und den angegebenen Zusätzen bei 36°C inkubiert. Die Zugabe der nicht-hydrolysierbaren GTP-Analoga GTPgammaS oder GMppNp zum Inkubationsansatz (Endkonzentrationen jeweils 50 µM) führte zu einer Hemmung der Aufnahme des [3H]Serotonins um 50 %. Die Aufnahme in Gegenwart von Reserpin (Endkonzentration 5 µM) repräsentiert die unspezifische Akkumulation von [3H]Serotonin.
Abbildung 6
Hemmung der konzentrationsabhängigen [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen durch GMppNp
BON Zellen wurden mit SLO permeabilisiert, gewaschen und für 20 min mit steigenden Konzentrationen an [3H]Serotonin bei 36°C inkubiert. Die Zugabe des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogons GMppNp zum Inkubationsansatz (Endkonzentration 50 µM) führte zu einer Hemmung der Aufnahme des [3H]Serotonins 50-60 % über den gesamten Konzentrationsbereich. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,04, 0,15, 0,58, 0,89 und 2,5 pmol / mg Protein.
Abbildung 7
Die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTPgammaS und GMppNp in permeabilisierten BON Zellen läßt sich durch Vorinkubation mit Pertussis Toxin (Ptx) aufheben.
Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (50 µM) führte in SLO-permeabilisierten Zellen zu einer Hemmung von 55-60 % der [3H]Serotoninaufnahme. Die Vorbehandlung der Zellen für 48 Stunden mit Pertussis Toxin (100 ng / ml) hob diese Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch die GTP-Analoga fast vollständig auf. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin wurde abgezogen und betrug 0,93±0,05 pmol / mg Protein für unbehandelte und 0,83±0,1 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.
Abbildung 8
Die Wirkung von Pertussis Toxin hängt von der Konzentration des angebotenen GMppNp ab
Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an GMppNp führte in SLO permeabilisierten Kontrollzellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme. Die Vorbehandlung der Zellen für 48 Stunden mit Pertussis Toxin führte zu einer partiellen Aufhebung dieser Hemmung, die aber bei einer GMppNP-Konzentration von 250 µM kaum noch vorhanden war. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 2,64±0,34 pmol / mg Protein für unbehandelte und 1,7±0,21 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.
Abbildung 9
Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen wird durch Galphao2 gehemmt
A: Die Zugabe von gereinigtem, AlF4- aktiviertem, Galphao2 (Endkonzentration 10 nM) zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der vesikulären [3H]Serotoninaufnahme von 50 %. Die Hitzedenaturierung von gereinigtem Galphao2 (30 min bei 95°C) vor der Inkubation bewirkte eine fast vollständige Aufhebung des hemmenden Effekts. Ebenso zeigte der Zusatz von gereinigtem Galphao1 (Endkonzentration 20 nM) keinen Effekt auf die [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,83±0,1 pmol / mg Protein.
B: Die Zugabe von gereinigtem, AlF4- aktiviertem, Galphai1 oder Galphai2 (Endkonzentration jeweils 10 nM) zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von 30 %. Die Hitzedenaturierung der G-Protein Untereinheiten vor der Inkubation hatte keine Wirkung auf den hemmenden Effekt.
Abbildung 10
Die Inkubation von permeabilisierten BON Zellen mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin (TeNt / LC) beeinflußt die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTPgammaS und GMppNp nicht.
Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (50 µM) führte in SLO-permeabilisierten Zellen zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von etwa 35 % (GTPgammaS) bzw. 50 % (GMppNp). Wurden die Zellen für 20 min mit TeNt / LC (1 µM) inkubiert, konnte eine ähnlich starke Hemmung beobachtet werden. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,92±0,39 pmol / mg Protein für unbehandelte und 0,68±0,07 pmol / mg Protein für Toxin-behandelte Zellen.
Abbildung 11
Die Inkubation von BON Zellen mit TeNt/LC hat keinen Effekt auf die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch Galphao2
A: Die Zwischeninkubation der permeabilisierten Zellen für 20 min mit der leichten Kette von Tetanus Neurotoxin (TeNt/LC) hatte keinen Effekt auf die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch Galphao2. Die Zugabe von Galphao2 führte auch hier zu einer Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme von 50 %. Die Hitzedenaturierung des Galphao2 bewirkte eine vollständige Aufhebung dieses Effekts. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,28±0,2 pmol / mg Protein.
B: Die Immunoreplika-Analyse von BON Zellen zeigt, daß unter den experimentellen Bedingungen wie in A aufgeführt die Zugabe von TeNt/LC (Endkonzentrationen 1 µM und 200 nM) zu SLO-permeabilisierten Zellen eine vollständige Spaltung von Synaptobrevin bewirkte. In nicht permeabilisierten Zellen ( n.p.) hatte das Toxin keinen Effekt. Das synaptische Protein Synaptophysin wurde weder in permeabilisierten noch in nicht permeabilisierten Zellen gespalten.
Abbildung 12
Die Antikörper gegen VMAT1 und VMAT2 sind spezifisch für das jeweilige Transporterprotein
Zur Untersuchung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden COS Zellen mit der DNA von VMAT1, VMAT2 oder dem eukaryontischen Plasmidvektor pcDNA3 transient transfiziert. Die Proteinexpression beider Transporter wurde immunzytochemisch überprüft. Als sekundärer Antikörper diente Texas Red markiertes Ziege anti-Kaninchen IgG. Beide Antiseren erwiesen sich als spezifisch für das jeweilige Transporterprotein, eine Kreuzreaktivität trat nicht auf. In den zur Kontrolle mit dem Plasmidvektor transfizierten Zellen wurde ebenfalls keine Immunreaktivität nachgewiesen. Der Maßstab beträgt 10 µm.
Abbildung 13
PC12 Zellen exprimieren nur VMAT1, kein VMAT2
Ein postnukleärer Überstand von PC12 Zellen wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulose-Membran transferiert und mit polyklonalen Antiseren gegen VMAT1 und VMAT2 inkubiert. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß durch das anti-VMAT1 Antiserum eine Hauptbande bei ca. 55 kDa, sowie einige weitere höhermolekulare Banden detektiert wurden. Die Präabsorbtion mit 10 µg eines synthetisch hergestelllten Peptids aus dem c-Terminus von VMAT1 der Ratte führte zum Verschwinden fast aller Banden. Lediglich eine schmale Bande bei ca. 60 kDa wurde weiterhin deutlich detektiert. Durch das anti-VMAT2 Antiserum wurden keine Proteinbanden detektiert.
Abbildung 14
In PC12 Zellen kommt VMAT1 bevorzugt auf elektronendichten, großen Vesikeln ( LDCVs vor)
Aus einem Homogenat von PC12 Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2 M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Membranen. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß VMAT1 in den schweren Membranfraktionen vorkommt. Die parallele Analyse der Membranfraktionen mit Antikörpern gegen Cytochrom b561 und Dopamin-beta-Hydroxylase zeigte, daß sich VMAT1 hauptsächlich auf Membranen von LDCVs befand. Eine partielle Überschneidung von VMAT1 mit Synaptophysin, einem Markerprotein für SSVs und deren Analoga, war ebenfalls vorhanden. Ausschließlich in den schweren Fraktionen fand sich Galphao1 während Galphao2 über den gesamten Gradienten verteilt, hauptsächlich jedoch ebenfalls mit den Fraktionen der LDCVs assoziiert war. Ein gegen beide G-Protein Untereinheiten gerichtetes Antiserum (Galphaoc) belegt, daß sich der Hauptanteil des gesamten Galphao in den schweren Fraktionen anreicherte. Synaptobrevin, als Membranprotein beider Vesikeltypen, fand sich sowohl in den schweren als auch den leichten Fraktionen des Gradienten.
Abbildung 15
BON Zellen exprimieren die vesikulären Monoamin-transporter VMAT1 und VMAT2
Ein postnukleärer Überstand von BON Zellen wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulose-Membran transferiert und mit polyklonalen Antiseren gegen VMAT1 und VMAT2 inkubiert. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß beide Antiseren eine Proteinbande bei ca. 55 kDa detektierten. Durch das anti-VMAT1 Antiserum wurden zusätzlich noch weitere höhermolekulare Banden (siehe PC12 Zellen) detektiert.
Abbildung 16:
In BON Zellen kommen VMAT1 und VMAT2 bevorzugt auf elektronendichten, großen Vesikeln (LDCVs) vor
Aus einem Homogenat von BON Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Membranen. Die Immunoreplika-Analyse dokumentiert die Lokalisation von VMAT1 und VMAT2 in den schweren Fraktionen. Die parallele Analyse der Membranfraktionen mit Antikörpern gegen Cytochrom b561 belegt, daß sich VMAT1 und VMAT2 hauptsächlich auf Membranen von LDCVs befinden. Eine partielle Überschneidung der beiden Transporter mit Synaptophysin, einem Markerprotein für SSVs und deren Analoga in neuroendokrinen Zellen, war ebenfalls vorhanden, jedoch geringer als bei PC12 Zellen. Ausschließlich in den schweren Fraktionen fand sich Galphao1, während Galphao2 über den gesamten Gradienten verteilt, hauptsächlich jedoch ebenfalls mit den LDCV-Fraktionen assoziiert war. Synaptobrevin fand sich sowohl in den schweren als auch den leichten Fraktionen des Gradienten.
Abbildung 17
Serotonin colokalisiert in BON Zellen mit VMAT1, VMAT2 und Chromogranin
BON Zellen wurden gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert und mit einem anti-Serotonin Antikörper aus dem Huhn, sowie Antiseren aus dem Kaninchen gegen VMAT1, VMAT2 oder Chromogranin A/B inkubiert. Als sekundäre Antikörper dienten Oregon Green-markiertes anti-Huhn IgG sowie Texas Red-markiertes anti-Kaninchen IgG. Die Aufnahmen der linken Spalte zeigen die Serotonin-Immunreaktivität in 40-50 % der BON Zellen. In der Doppelimmunfluoreszenz wird die fast vollständige Colokalisation des Serotonins mit VMAT1 (obere Reihe), VMAT2 (mittlere Reihe) und Chromogranin A/B als Markerprotein für LDCVs (untere Reihe) deutlich. Der Maßstab beträgt 10 µm.
Abbildung 18
Permeabilisierte PC12 Zellen nehmen nur [3H]Serotonin und [3H]Noradrenalin, nicht aber [3H]Histamin spezifisch auf.
Die Monoaminaufnahme in permeabilisierte PC12 Zellen wurde anhand der drei Substrate [3H]Serotonin (90 nM), [3H]Noradrenalin (90 nM) und [3H]Histamin (200 nM) gemessen. Die unspezifische Aufnahme in Gegenwart von Reserpin zeigt, daß nur Serotonin und Noradrenalin in die Vesikel der Zellen aufgenommen wurden. Die höchste spezifische Aufnahme von 2,5 pmol / mg Protein wurde mit [3H]Serotonin erzielt, [3H]Noradrenalin wurde mit 1 pmol / mg Protein aufgenommen. Die [3H]Histaminaufnahme von 1 pmol / mg Protein konnte mit Reserpin nicht signifikant blockiert werden und ist daher unspezifisch.
Abbildung 19
Tetrabenazin (TBZ) hemmt die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen
In permeabilisierten BON Zellen konnte die Reserpin-sensitive [3H]Serotoninaufnahme durch die Zugabe von TBZ (Endkonzentration 1 µM) zum Teil blockiert werden. Wurden dieselben experimentellen Bedingungen auf permeabilisierte PC12 Zellen übertragen, zeigte sich, daß die Reserpin-sensitive [3H]Serotoninaufnahme nicht durch Zugabe von TBZ blockiert werden konnte.
Abbildung 20
In permeabilisierten BON Zellen kann funktionell zwischen der Monoaminaufnahme durch VMAT1 und VMAT2 differenziert werden.
A: Die [3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte BON Zellen wurde in Gegenwart von Histamin (2 mM) als Substrat für den VMAT2 durchgeführt. Es zeigte sich, daß unter diesen Bedingungen eine Reserpin-sensitive Aufnahme stattfand, die jedoch nicht mehr durch TBZ blockierbar war. B: Wurde ausschließlich [3H]Histamin als Substrat angeboten, konnte die Reserpin-sensitive Aufnahme durch TBZ zu 80 % blockiert werden. Die unspezifische Aufnahme von [3H]Serotonin in Gegenwart von Reserpin betrug 2,2±1,3 pmol / mg Protein, die unspezifische Aufnahme [3H]Histamin 1,23±0,006 pmol / mg Protein.
Abbildung 21
Die Aktivität von VMAT1 und VMAT2 in permeabilisierten BON Zellen wird durch Galphao2 gehemmt
Die [3H]Serotoninaufnahme wurde in Gegenwart von 2 mM Histamin (VMAT1 Aktivität) durchgeführt. A: Die Zugabe von gereinigtem Galphao2 (10 nM) führte zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven Aufnahme auf 55 % des Kontrollniveaus. B: Wurde [3H]Histamin (200 nM, VMAT2 Aktivität) als Substrat benutzt, führte die Zugabe von Galphao2 zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven Aufnahme auf etwa 30 % des Kontrollniveaus. Die Hitzedenaturierung des Galphao2 bewirkte eine vollständige Aufhebung dieses Effekts. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 0,42±0,035 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,33±0,001 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.
Abbildung 22
In permeabilisierten BON Zellen ist VMAT2 empfindlicher gegenüber einer Hemmung durch Galphao2 oder GMppNp
A: Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an Galphao2 führte in permeabilisierten BON Zellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Monoaminaufnahme. Beide Transporteraktivitäten wurden in Konzentrationen zwischen 0,2 und 6 nM der G-Protein Untereinheit gehemmt. Im Bereich zwischen 0,7 und 6 nM wurde die [3H]Histaminaufnahme stärker gehemmt als die [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 1,86±0,2 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,33±0,03 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.
B:. Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an GMppNp führte in permeabilisierten BON Zellen zu einer dosisabhängigen Hemmung der [3H]Monoaminaufnahme. Beide Transporteraktivitäten wurden in Konzentrationen zwischen 5 und 100 µM des GTP-Analogons gehemmt. Dabei war die Hemmung der [3H]Histaminaufnahme in Konzentrationen zwischen 10 und 100 µM sehr viel stärker ausgeprägt, als die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme. Die unspezifische Monoaminaufnahme in Gegenwart von Reserpin betrug 1,03±0,2 pmol / mg Protein unter der VMAT1 Bedingung sowie 0,53±0,01 pmol / mg Protein unter der VMAT2 Bedingung.
Abbildung 23
Entwicklung serotonerger Neurone in Primärkultur aus der Raphe
Rapheneurone aus der Region R1 wurden am Embryonaltag 13 (E13) präpariert und über die angegebenen Tage in Kultur genommen. Die immunfluoreszenzmikroskopische Analyse der serotonergen Neurone erfolgte über ein polyklonales anti-Serotonin Antiserum, der sekundäre Antikörper war an den Fluoreszenzfarbstoff Oregon Green gekoppelt. Bereits am zweiten Kulturtag (DIV: ´days in vitro`) war in wenigen Zellen eine positive Immunreaktivität sichtbar. Die Aufnahmen auf der linken Seite lassen eine deutliche Zunahme der Anzahl der serotonergen Neurone über den Zeitraum von 14 Tagen erkennen. Die bei stärkerer Vergrößerung aufgenommenen Bilder der rechten Seite verdeutlichen, daß auch das Verzweigungsmuster dieser Neurone über den beobachteten Zeitraum intensiver wurde. Der Maßstab beträgt jeweils 10 µm.
Abbildung 24
Quantitative Analyse der Anzahl serotonerger Neurone in Primärkulturen aus drei unterschiedlichen Regionen (R1-R3) der embryonalen Raphe
Die Neurone wurden am Tag E13 präpariert und für die angegebenen Tage in Kultur genommen. Der Anteil der serotonergen Neurone ist in Prozent der Gesamtzellzahl angegeben.
Abbildung 25
Serotonerge Rapheneurone in Primärkultur exprimieren funktionelles VMAT2
A: Die Doppelimmunfluoreszenz zeigt die Colokalisation von Serotonin (sekundärer Antikörper Oregon Green-markiert) und VMAT2 (sekundärer Antikörper Texas Red-markiert) in einzelnen Neuronen aus dem Gebiet R2 nach zwei Tagen (DIV 2) in Kultur. Der Maßstab beträgt 10 µm.
B: Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert, in Kultur genommen und nach zwei Tagen mit [3H]Serotonin (4 Stunden, 40 nM) inkubiert. In den Regionen R1, R2 und R3 war eine [3H]Serotoninaufnahme meßbar, die in allen drei Fällen durch die Zugabe von TBZ (10 µM) zu 40-50 % blockiert werden konnte.
Um die Fähigkeit der Neurone zur Serotoninspeicherung und Sekretion auch nach längeren Kultivierungszeiten zu überprüfen, wurden Aufnahme- und Sekretions-experimente an Tag 7 und Tag 21 der Kultur durchgeführt (Abbildung 26).
Abbildung 27
Die Vorinkubation von Rapheneuronen in Primärkultur mit TeNt blockiert die Kalium-stimulierte Sekretion von [3H]Serotonin
Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert und für 14 Tage in Kultur genommen. Ein Teil der Neurone wurde vor der Messung für 48 Stunden mit TeNt (10 nM) inkubiert.
Nach der Inkubation der Zellen mit [3H]Serotonin erfolgte die Kalium-Stimulation. Deutlich wird, daß in den Toxin-behandelten Zellen die stimulierte Sekretion sehr stark reduziert war. Die basale Sekretion wurde ebenfalls mäßig gehemmt.
Abbildung 28
Aufnahme von [3H]Serotonin nach Permeabilisierung von Rapheneuronen mit SLO
Rapheneurone in Primärkultur wurden mit PBS gewaschen und für 2 min mit 100 HE / ml SLO auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 10 min mit [3H]Serotonin inkubiert. In permeabilisierten Neuronen konnte eine deutlich höhere vesikuläre (TBZ-sensitive) Aufnahme als in nicht permeabilisierten Neuronen nachgewiesen werden.
Abbildung 29
Die Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierten Rapheneuronen wird durch GTPgammaS und GMppNp gehemmt
A: Rapheneurone (E14) wurden für 24 Tage in Kultur genommen und vor dem Experiment für 48 Stunden mit Puffer oder Ptx (100 ng / ml) behandelt. Vor der Inkubation mit [3H]Serotonin (90 nM, 10 min) erfolgte die SLO-Permeabilisierung mit 100 HE / ml für 2 min. Die Zugabe von GTPgammaS oder GMppNp (jeweils 50 µM) führte zu einer Hemmung der Reserpin-sensitiven [3H]Serotoninaufnahme von etwa 40 % in den Kontrollzellen. Die Vorbehandlung mit Ptx verhinderte diese Hemmung vollständig.
B: Nach Vorinkubation für 48 h mit TeNt (1 nM) konnte die Hemmung der [3H]Serotoninaufnahme durch GTP-Analoga nicht aufgehoben werden.
Abbildung 30
Die Aufnahme von [3H]Serotonin in permeabilisierte Rapheneurone wird durch Galphao2 gehemmt
Das Experiment wurde ähnlich wie in Abb. 29 durchgeführt, jedoch wurde [3H]Noradrenalin als Substrat verwendet, und TBZ (10 µM) als spezifischer Inhibitor von VMAT2 eingesetzt. Die Zugabe von AlF4- aktiviertem Galphao2 (10 nM ) führt zu einer Hemmung der vesikulären Aufnahme, die dem der durch GTPgammas vermittelten entsprach.
Abbildung 31
Der neuronale Monoamintransporter VMAT2 ist mit Galphao2 auf kleinen synaptischen Vesikeln von Rapheneuronen colokalisiert.
Rapheneurone wurden am Tag E14 präpariert und über 14 Tage in Kultur genommen. Aus einem Homogenat der Zellen wurde ein postnukleärer Überstand hergestellt und auf einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten (0,35-2 M) aufgetragen. Über eine Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte die subzelluläre Fraktionierung der Zellmembranen. Die Immunoreplika-Analyse zeigt, daß VMAT2 hauptsächlich auf Membranfraktionen lokalisiert ist, die den SSVs zuzurechnen sind. Dies wird durch die weitgehende Colokalisation mit Synaptophysin als Markerprotein für kleine synaptische Vesikel deutlich.
Im Bereich der SSV-Fraktionen fand sich ebenfalls der Großteil des Galphao2, das jedoch auch in den übrigen Membranfraktionen, wie etwa denen der LDCVs, markiert durch Chromogranin B, zu finden war. Synaptobrevin fand sich sowohl in den LDCV- als auch in den SSV- Fraktionen des Gradienten.
Abbildung 32
Immunelektronenmikroskopische Lokalisation von VMAT2 und Galphao2 in serotonergen synaptischen Terminalen aus dem präfrontalen Cortex
A: Die lichtmikroskopische Aufnahme eines Vibratomschnitts aus dem präfrontalen Cortex einer adulten Ratte zeigt die mit einem anti-Serotonin Antiserum aus dem Huhn markierten, mit der DAB Methode sichtbar gemachten, serotonergen Endigungen (Pfeilspitzen). Ausgehend von diesem Gewebe wurden Ultra-Dünnschnitte für die ´post-embedding` -Technik angefertigt. Verwendet wurden hierfür Antikörper gegen VMAT2, Galphao2, Synaptophysin sowie anti-Kaninchen IgG, konjugiert mit 5 nm Goldpartikeln, als sekundärer Antikörper.
B: Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt zwei Terminalen, von denen eine durch das DAB Präzipitat als serotonerg identifiziert werden konnte. Synaptophysin befand sich auf SSVs sowohl der serotonergen (Pfeile) als auch der anderen Terminale (Pfeilspitzen). C, C`: Die Aufnahmen stellen die elektronenmikroskopischen Details zweier serotonerger Terminalen dar. Auf einigen der SSVs dieser Terminalen war VMAT2 lokalisiert (Pfeile). VMAT2 fand sich ebenso auf einigen SSVs benachbarter monoaminerger Terminalen (Pfeilspitzen).
D, D`: Die elektronenmikroskopische Aufnahme in D zeigt die Lokalisation von Galphao2 auf SSVs einer serotonergen Varikosität (Pfeile). Die Aufnahme in D` zeigt, dass Galphao2 auch auf synaptischen Vesikeln nicht-serotonerger Terminalen zu finden war. Maßstab: A 1µm; B-D 150 nm
Die Aufnahme wurde freundlicherweise von Dr. Ingrid Pahner zur Verfügung gestellt.
Abbildung 33
Nachweis von Galphao2, VMAT2 und Synaptophysin auf synaptischen Vesikeln aus dem präfrontalen Cortex (LP2 Präparation).
Die in der Immunoreplika-Analyse verwendeten Antikörper gegen Galphao2 (371/4 polyklonal, 94.1 monoklonal), VMAT2 und Synaptophysin detektierten Proteinbanden, die den jeweiligen Molekulargewichten entsprachen. AK: Antikörper
Abbildung 34
Galphao2 hemmt die [3H]Serotoninaufnahme in synaptische Vesikel aus dem präfrontalen Cortex
A: Synaptische Vesikel (LP2) aus dem präfrontalen Cortex adulter Ratten wurden für 10 Minuten mit KG3 Puffer, der [3H]Serotonin (90 nM) und entweder Galphao2 (10 nM), GMppNp (50 µM) oder TBZ (10 µM) enthielt, inkubiert. Die Zugabe von Galphao2, wie auch GMppNp führte zu einer Hemmung der TBZ sensitiven [3H]Serotoninaufnahme von 40-45 %. B: In einem ähnlichen Experiment wurden die Vesikel entweder mit gereinigtem, AlF4- aktiviertem Galphao1 oder Galphao2 inkubiert. Nur Galphao2 aber nicht Galphao1 führten zu einer Hemmung der vesikulären TBZ-sensitiven Aufnahme.
Abbildung 35
[3H]Serotoninaufnahme in permeabilisierte Thrombozyten aus Wildtyp und Tryptophanhydroxylase-deletionsmutierten (TPH -/-) Mäusen
Thrombozyten wurden mit SLO permeabilisiert und für 15 min bei 36°C mit 90 nM [3H]Serotonin inkubiert. A: Die vesikuläre Serotoninaufnahme in die Thrombozyten der Deletionsmutante übertraf die Aufnahme in die Wildtyp-Thrombozyten um 40 % (Wildtyp-Aufnahme auf 100 % gesetzt). B: Die Inkubation mit GMppNp führte im Wildtyp zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme von 38 %. In den Thrombozyten der Deletionsmutante hatte die Inkubation mit GMppNp jedoch keinen Effekt.
Abbildung 36
Die Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme in Thrombozyten aus TPH -/- Mäusen kann durch die Vorinkubation mit Serotonin konzentrationsabhängig induziert werden.
Thrombozyten der Tryptophanhydroxylase-Deletionsmutante wurden vor den Experimenten zur [3H]Serotoninaufnahme mit steigenden Konzentrationen an Serotonin (1,5 bis 150 µM, nicht radioaktiv markiert) vorinkubiert. Anschließend wurden die Thrombozyten permeabilisiert und gewaschen. Die Zugabe von GMppNp zum Inkubationsansatz führte zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme. Sie stieg zwischen 1,5 und 15 µM Serotonin auf maximal ca. 35 % an, um bei 150 µM Serotonin auf 22 % abzunehmen.

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Fri May 11 16:02:46 2001