[Seite 23↓]

3  Methoden

3.1 Tiermodell

3.1.1 Transplantationsmodell

Es wurden ein syngenes und ein niedrig allogenes Transplantationsmodell verwendet (80). Im allogenen Modell dienten Fischerratten (F344) als Spendertiere und durch Inzucht erzeugte Lewisratten (Lew) als Empfängertiere; im syngenen Modell waren Lewisratten sowohl Spender als auch Empfänger. Insgesamt benötigten wir für die Experimente ca. 170 Lewisratten (Harlan-Winkelmann, Sulzbach / Germany) und ca. 60 Fischerratten (Harlan-Winkelmann, Sulzbach / Germany). Alle Tiere waren männlichen Geschlechts und hatten ein Gewicht zwischen 150 und 200 Gramm. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden bei einer konstanten Temperatur von 24 Grad Celsius sowie gleichbleibenden Lichtverhältnissen (Licht an 6 Uhr morgens, Licht aus 18 Uhr abends) gehalten. Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der zuständigen Behörden (Erlaubnis G 0406/95) und entsprechend den Richtlinien der American Physiological Society durchgeführt.

Die Transplantation wurde nach einem modifizierten Protokoll von Tullius et al. durchgeführt. In der Nacht vor der Operation blieben die Tiere nüchtern. Die Spendertiere wurden mittels einer 4%igen Chloralhydratlösung (0,01ml/g Körpergewicht) narkotisiert. Anschließend wurde die Bauchseite rasiert und die Haut nach Desinfektion mit Betaisodonalösung in der abdominalen Mittellinie per Längslaparatomie mit dem Skalpell inzidiert; dann wurde die Rektusscheide vorsichtig mit der Schere durchtrennt. Das Intestinum wurde in mit isotoner NaCl-Lösung eingeweichten Kompressen eingehüllt auf dem Thorax plaziert und die linke ventrolaterale Abdominalwand mit einem Haken zur Seite gehalten, um freien Zugang zu den Nierengefäßen und deren Abgang aus Aorta bzw. Vena cava inferior zu erlangen. Für die Nephrektomie wurden nun die linke Nierenarterie und die linke Nierenvene vorsichtig mit Mikropinzetten unter Zuhilfenahme von Wattetupferstäbchen freipräpariert und voneinander getrennt. Die kollateralen Gefäße, die Nebennierenarterien und die Arteriae spermaticae wurden mit 7-0 Seide doppelt legiert und mittels Mikroelektrocauter durchtrennt. [Seite 24↓]Es folgte die Mobilisation des Ureters einschließlich periurteralen Fettgewebes und Durchtrennen desselben auf halber Strecke zwischen Niere und Blase. Die Niere wurde aus dem perirenalen Fettgewebe herausgelöst. Anschließend wurde der Ureter durchtrennt und dem Spendertier via Vena dorsalis penis 0,2 ml Natrium-Heparin (Liquemin) in einer Dosis von 10 U/ml injiziert. Die freipräparierten Nierengefäße wurden möglichst nahe ihres Abgangs von Aorta bzw. Vena cava durchtrennt, die Spenderniere wurde entnommen und auf Eis gelegt. Sofort im Anschluß wurde die Nierenarterie vorsichtig über die Spitze eines Venenverweilkatheters (20G1020, Ethicon) gestülpt und mit Seide 7-0 fixiert. Durch den Katheter erfolgte eine Perfusion der Niere mit insgesamt 5 ml University of Wisconsin Lösung (UW) in pulsartigen Gaben. Schließlich wurde der Katheter wieder entfernt und die Niere bis zur Implantation in UW-Lösung bei 4 Grad Celsius aufbewahrt. Je nach Zugehörigkeit zur entsprechenden Gruppe dauerte die Aufbewahrung in der Lösung – entsprechend der kalten Ischämiezeit – 2, 4, 6, 12, 24 oder 48 Stunden.

Die Empfänger wurden in gleicher Weise wie die Spender narkotisiert und das Abdomen ebenso per Längslaparatomie eröffnet. Zunächst wurde wieder der Ureter mobilisiert, und nachfolgend wurden die oft paarig angelegten Arteriae testiculares mit 7-0 Prolene ligiert, um größere Blutungen zu verhindern. Arteria und Vena renalis wurden behutsam voneinander getrennt und vom umgebenden Binde- und Fettgewebe befreit. Daraufhin wurden beide Gefäße soweit wie möglich proximal zu Aorta und Vena cava mit Mikraneurysmaclips geklippt und möglichst weit distal ihres Abgangs mit der Schere durchtrennt. Anschließend erfolgte die Entnahme der linken Niere nach Durchtrennen des Ureters und der dazugehörigen Gefäße. Die entnommenen nativen Organe wurden zum späteren Vergleich konserviert, wie in einem der folgenden Abschnitte noch beschrieben wird. Nach Spülung der verbleibenden Gefäßstümpfe mit 0,9%iger NaCl-Lösung wurde die zuvor in UW-Lösung aufbewahrte Spenderniere in der anatomisch angestammten Lage im Empfängertier plaziert. Anschließend wurden die Spendergefäße nach Umspülung mit NaCl-Lösung an die Empfängergefäße approximiert. Es erfolgte zunächst mit 10-0 Prolene eine End-zu-End-Anastomose der Nierenarterien durch zehn Einzelkopfnähte und dann der Nierenvenen mit zwei fortlaufenden Nähten. Im Durchschnitt wurden 30 bis 40 Minuten für die Anastomosierung benötigt, was der warmen Ischämiezeit des [Seite 25↓]Organs entspricht. Es folgte die Verknüpfung der Ureterenden End-zu-End durch vier bis sechs Einzelknopfnähte ebenfalls mit 10-0 Prolene. Nach Entfernung der Clips wurde das transplantierte Organ während der Reperfusionsphase genau beobachtet. Auftreten von groben Störungen - beispielsweise makroskopisch sichtbare große ischämische Areale – wurden notiert, und die Tiere wurden später nicht in die Studie einbezogen. Währenddessen erfolgte die Nephrektomie der rechten Niere nach doppelter Ligatur der Nierengefäße mit 4-0 Seide und Durchtrennen des Gefäßstranges. Auch diese Organe wurden als native Kontrollen zum Vergleich konserviert. Abschließend wurde das Intestinum wieder ins Abdomen reponiert und die Bauchdecke mit 4-0 Seide durch Naht von Muskeln und Haut verschlossen.

3.1.2 Gruppeneinteilung

Um den Einfluss von Ischämiezeit, Immunreaktion bzw. Immunsuppression auf die zelluläre Infiltration und die entzündliche Gewebsreaktion zu ermitteln, wurden die Tiere in insgesamt 23 Gruppen mit je vier bis sechs Ratten unterteilt. Dabei unterschieden sich die Gruppen in Dauer der Ischämiezeit, Zeitpunkt der Organentnahme, Immunogenität des Transplantats und gegebenenfalls Gabe des Immunsuppressivums Cyclosporin A (CsA).

Im ersten Teil der Studie (Teil A) war die kalte Ischämiezeit des Organs in allen Gruppen mit vier Stunden gleich lang. Die Organe bei den isogen transplantierten Tieren wurden an sieben Zeitpunkten nach 2, 4, 6, 12, 24, 48 Stunden bzw. nach sieben Tagen entnommen; entsprechend gab es noch sieben weitere Gruppen mit allogenen Transplantaten zu diesen Zeitpunkten der Organentnahme. Vier weitere allogene Gruppen wurden zusätzlich entweder niedrig dosiert mit 1,5 mg/kg/Tag CsA oder mit Standarddosis für Ratten von 5 mg/kg/Tag CsA durch subkutane Injektion behandelt (90); die Organentnahme bei diesen Gruppen erfolgte nach sieben bzw. zehn Tagen.

Im zweiten Teil der Studie (Teil B) wurden allen Tieren nach 24 Stunden die Nieren entnommen und nur isogene Organe übertragen. Unterschiedlich war in diesen Gruppen nur die ansteigende Dauer der kalten Ischämiezeit mit 2, 6, 12, 24 bzw. 48 Stunden.


[Seite 26↓]

3.1.3  Bestimmung der Nierenfunktion

Kurz vor Entnahme der Organe wurde den Tieren ca. 1ml Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus entnommen. Unmittelbar danach wurde dieses in ein heparinisiertes Eppendorfgefäß gefüllt und zur Gewinnung des Serums zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Werte für Kreatinin und Harnstoff mit automatisierten Methoden.

3.1.4 Organentnahme

Zum entsprechenden Zeitpunkt der Organentnahme wurden die Tiere erneut mit 4%igem Chloralhydrat narkotisiert. Nach Eröffnung des Abdomens entlang der Linea Alba wurde die transplantierte Niere entnommen, von umgebendem Fett und Bindegewebe befreit und gewogen. Anschließend wurde das Organ in drei Teile geteilt. Eine Hälfte wurde in - 40 Grad Celsius kaltem Methylbutan für die Immunhistologie, ein Viertel in 4%iger gepufferter Paraformaldehydlösung für die konventionelle Histologie und ein Viertel in flüssigem Stickstoff für eventuelle weitere molekularbiologische Methoden konserviert. Die Lagerung des tiefgefrorenen Materials erfolgte bei – 80 Grad Celsius.

3.2 Immunhistologie

Das bei – 40 Grad Celsius in Methylbutan tiefgefrorene Gewebe aus den Tierversuchen wurde immunhistologisch untersucht.

Es wurde die Alkalische-Phosphatase-anti-Alkalische-Phosphatase Methode (APAAP) nach Cordell (1984) angewandt, die ursprünglich Mason und Sammons (1978) entwickelt hatten. Bei diesem Verfahren werden sogenannte Brückenantikörper als sekundäre Antikörper verwendet. Dabei bindet eines der Fab-Fragmente des Brückenantikörpers an das Fc-Fragment des Primärantikörpers. Das andere verbindet sich mit dem Fc-Fragment eines Immunkomplexes aus monoklonalem Antikörper und alkalischer Phosphatase. Dieser lösliche Immunkomplex wird anschließend durch eine Enzymreaktion sichtbar gemacht.

Zunächst wurde das Gewebe in einem Kryostaten (Leica CM 3000) bei einer Gewebetemperatur von – 18 Grad Celsius in 6 µm dicke Schnitte mit einem Mikrotom geschnitten. Diese Schnitte wurden vom Mikrotommesser direkt auf [Seite 27↓]zimmerwarme Objektträger übertragen, die zuvor mit 2%igem 3-Aminopropyltriethoxysilane (APES) beschichtet worden waren, um eine bessere Gewebehaftung zu erreichen. Anschließend wurden die Kryoschnitte über Nacht bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Daraufhin folgte die Fixation in – 20 Grad kaltem Aceton. Danach wurden die Schnitte für die weitere Lagerung erst bei – 80 Grad tiefgefroren und dann bei – 20 Grad aufbewahrt. Bei Bedarf wurden sie wieder aufgetaut und erneut für zehn Minuten mit Aceton fixiert und luftgetrocknet.

Pro Organ wurden mindestens fünfzehn Schnitte pro Region aus verschiedenen Bereichen der Nieren immunhistologisch untersucht.

Die Färbungen nach der APAAP-Methode erfolgten in einer Feuchtkammer auf einer Färbebank. Zuerst wurden die Präparate über dreißig Minuten bei Raumtemperatur (RT) mit fetalem Kälberserum (FCS) inkubiert, um Bindungen von unspezifischen Proteinen an das Gewebe zu verhindern. Nach Entfernen des überschüssigen Serums wurden die Gewebeschnitte mit 100 µl der in RPMI-Verdünnungsmedium gelösten Primärantikörper eine Stunde lang bei RT inkubiert. Die optimale Antikörperkonzentration war zuvor durch zahlreiche Vorversuche ermittelt worden. In Tabelle 1 sind die verwendetenAntikörper und ihreoptimale Konzentration aufgelistet. Nach Inkubation mit dem Primärantikörper folgte erst eine dreißigminütige Inkubation mit einem Kaninchen-anti-Maus IgG Brückenantikörper und im Anschluß wiederum dreißig Minuten Inkubation mit dem APAAP-Komplex bei RT. Zwischen den Inkubationsschritten wurden die Präparate jeweils dreimal über fünf Minuten mit TBS-Pufferlösung gespült. Für ein besseres Färbeergebnis wurde die Inkubation mit Brückenantikörper und APAAP-Komplex jeweils über eine Dauer von zehn Minuten wiederholt. Abschließend wurden die Präparate zur enzymatischen Darstellung der alkalischen Phosphatase mit einer Neufuchsin-Naphtol-Substratlösung in vertikalen Küvetten (Hellendahl) auf einem Schüttler dreißig Minuten bei RT inkubiert. Nach vorsichtiger Spülung mit TBS wurden sie mit Hämalaun gegengefärbt und schließlich unter fließendem Leitungswasser gebläut. Die fertig gefärbten Präparate wurden mit einem vorgewärmten Einschlußmedium (Kaiser´s Glycerin Gelantine) eingedeckt.

Bei jeder Färbung wurden obligatorisch sowohl Positivkontrollen (Primärantikörper gegen α-Aktin) als auch Negativkontrollen (Waschpuffer oder RPMI-Medium ohne Primärantikörper) mitgeführt, um falsch negative bzw. falsch positive Reaktionen auszuschließen.


[Seite 28↓]

Tabelle 1 : Verwendete Antikörper

Antikörper

Klon

Verdünnung

Konzentration

Hersteller

Anti-Ratte ICAM -1

1A29

1 : 1000

1 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte PECAM - 1

TLD-4E8

1 : 1000

1 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte L-Selectin

OX-85

1 : 100

10 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte LFA-1

WT.1

1 : 100

10 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte α4-Integrin

TA-2

1 : 50

20 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte Granulozyten

His 48

1 : 100

10 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte Monozyten/ Makrophagen

ED-1

1 : 1000

1 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte

aktivierte Makrophagen

ED-2

1 : 1000

1 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte dendrit. Zellen

OX-62

1 : 100

10 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte MHC Klasse ΙΙ

OX-18

1 : 100

10 µg/ml

Serotec

 

Anti-Ratte VCAM 1

51 bis 1069

1 : 100

10 µg/ml

Pharmingen

 

Anti-Ratte P-Selectin

Polyklonal

1 : 100

10 µg/ml

Pharmingen

 

Anti-Ratte Tissue Factor (TF)

 

1 : 50

20 µg/ml

Dr. Dominik Müller, FVK

 

Anti-Ratte α-Aktin / glatte Muskulatur

asm-1

1 : 10

5 µg/ml

Boeringer M.

 

Kaninchen-anti-Maus Immunglobulin G

 

1 : 50

3,2 µg/ml

DAKO

 

Anti-Alkalische-Phosphatase

AP7/6/7

1 : 40

2,25 µg/ml

DAKO

 

3.2.1 Semiquantitative Analyse der immunhistologischen Präparate

Das Ausmaß der Zellinfiltration in den unterschiedlichen Gruppen wurde für [Seite 29↓]Granulozyten, LFA-1-positive Zellen, VLA-4-positive Zellen, Monozyten/Makrophagen, aktivierte Makrophagen, dendritische Zellen und MHC-Klasse-ΙΙ positive Zellen semiquantitativ analysiert. Hierzu wurden mittels eines Axioplan-2-Mikroskops (Zeiss, Jena, BRD), einer Farbvideokamera (Sony 3 CCD, Tokyo, Japan) und der Auswertungssoftware KS 300 3.0 Imaging System (Zeiss, Jena, BRD) die entsprechenden Präparate bearbeitet. In den gefärbten Gewebeschnitten aus unterschiedlichen Regionen der Organe wurden die positiv markierten Zellen in fünfzehn zufällig gewählten Gesichtsfeldern (Fläche: 75274 µm²) ausgezählt. Anschließend wurden Mittelwert und Standardabweichung für alle Ratten aus einer Gruppe gebildet.

3.3 Histologie

Die in 4%iger Paraformaldehydlösung konservierten Organe wurden schrittweise dehydriert. Hierfür wurden sie nacheinander jeweils zwei Stunden erst in 70 prozentigen und dann 90 prozentigen Ethylalkohol gelegt. Anschließend kamen sie über Nacht in 96 prozentigen und dann dreimal für zwei Stunden in 100 prozentigen Ethylalkohol. Abschließend wurden sie noch zweimal für 20 Minuten in Xylol gegeben. Das dehydrierte Gewebe wurde zweimal über zwei Stunden zunächst in weiches Paraffin und anschließend über Nacht in hartes Paraffin eingebettet. Mit einem Mikrotom (Leitz 1512) wurde das Material dann zwei bis vier µm dick geschnitten und die Präparate mit Hematoxylin / Eosin und PAS gefärbt.

3.4 Statistische Methoden

Die statistische Analyse der Ergebnisse wurde auf einem G3 Macintosh Computer (Apple Inc., Cupertino, Kalifornien, USA) mit einem entsprechenden Computerprogramm (Statview; Cricket Software Inc., Philadelphia, PA, USA) durchgeführt. Alle angegeben Werte sind Mittelwerte einschließlich des Standardfehlers (SEM = „Standard Error of Means“). Die Mittelwerte der entsprechenden Gruppen untereinander wurden auf signifikante Unterschiede mit Hilfe des parameterfreien Kruskal-Wallis- und Mann-Whitney-U-Tests untersucht. Die statistisch signifikante Grenze wurde bei P = 0,001 festgesetzt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
17.05.2005