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5  Ergebnisse

Im folgenden Kapitel werden die Ergebnisse zu Organfunktion, Morphologie und immunhistochemischen Färbungen dargestellt. Zur besseren Übersichtlichkeit werden die Untersuchungsergebnisse entsprechend der Gruppeneinteilung der Tiere in zwei Teilen aufgeführt. In Teil A werden isogene und allogene Transplantation verglichen. Die kalte Ischämiezeit vor der Transplantation war konstant, und die Organentnahme erfolgte zu variablen Zeitpunkten postoperativ. In Teil B hingegen wurde der Einfluß ansteigender kalter Ischämiezeiten untersucht. Die Organentnahme erfolgte bei allen Tieren 24 Stunden postoperativ (siehe hierzu auch Kapitel 1.1.2).

5.1 Organfunktion

5.1.1 Nierenfunktionswerte im Serum bei konstanter kalter Ischämiezeit von 4 Stunden in isogen und allogen transplantierten Tieren (Teil A)

Die Werte für Kreatinin und Harnstoff im Serum sind in Abbildung 3 im Vergleich von allogen und isogen transplantierten Tieren je nach Zeitpunkt der Organentnahme im Verlauf dargestellt.

Abb. 3: Nierenfunktionsparameter von allogen und isogen transplantierten Tieren zum Zeitpunkt der Organentnahme. (A) Kreatinin-Konzentration im Serum. (B) Harnstoff-Konzentration im Serum. Zeichen: (■) allogen; (●) isogen. Beide Parameter sind in mg/dl als Mittelwert + SEM angegeben.

Sowohl in den allogenen als auch in den isogenen Gruppen stiegen die Werte für beide Parameter zunächst an und erreichten ihr Maximum für Kreatinin (bei [Seite 36↓]2,25mg/dl) 12h nach der Transplantation und für Harnstoff (bei 250-260 mg/dl) zwischen 12 und 24h nach der Organübertragung. Anschließend fielen sie parallel wieder bis auf das Niveau zum Zeitpunkt 2h nach Transplantation (Kreatinin: 0,5-0,9 mg/dl; Harnstoff: 50-60 mg/dl) ab, welches etwa am siebten Tag erreicht wurde. Weder bei den Werten für Kreatinin noch für Harnstoff traten signifikante Unterschiede zwischen isogen und allogen transplantierten Tieren auf.

5.1.2 Nierenfunktionswerte bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

In Abbildung 4 sind die Werte für Kreatinin und Harnstoff bei Tieren mit isogen transplantierten Organen, die einer kalten Ischämiezeit zwischen 2 und 24h ausgesetzt wurden, dargestellt.

Abb. 4: Nierenfunktionsparameter isogen transplantierter Tiere 24 h post transplantationem, deren Organe kalten Ischämiezeiten zwischen 2 und 24h ausgesetzt waren. (A) Kreatinin-Konzentration im Serum. (B) Harnstoff-Konzentration im Serum. Beide Parameter sind in mg/dl angegeben als Mittelwert + SEM.

Bei allen Tieren lagen zum Zeitpunkt der Organentnahme 24h nach der Transplantation pathologisch erhöhte Serumwerte sowohl für Kreatinin (zwischen 2,0 und 2,5 mg/dl) als auch für Harnstoff (zwischen 250 und 300 mg/dl) vor. Anders als erwartet zeigten sich jedoch in Bezug auf beide Parameter keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tiergruppen – unabhängig davon, ob die Organe kurzen oder langen kalten Ischämiezeiten ausgesetzt worden waren.


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5.2  Immunhistochemie

Die Gewebeschnitte der aus den unterschiedlichen Gruppen gewonnenen Organe wurden mit der APAAP-Methode im Hinblick auf wichtige Adhäsionsmoleküle, Membranrezeptoren und Zellpopulationen der sogenannten „Adhäsionskaskade“ im Rahmen entzündlicher Prozesse gefärbt. Das Gewebe wurde auf folgende Adhäsionsmoleküle untersucht: P-und L-Selektine, ICAM-1, VCAM-1 und PECAM-1. Zusätzlich wurde das Infiltrationsausmaß bestimmter Abwehrzellen ermittelt: dentritische Zellen (OX-62), neutrophile Granulozyten (His 48), Monozyten/Makrophagen (ED-1), aktivierte Makrophagen (ED-2). In Bezug zu diesen Zellpopulationen wurde Verteilung und Expression wichtiger Leukozytenintegrine und Membranproteine bestimmt: LFA-1-, VLA-4- und MHC-ΙΙ. Außerdem wurde die Expression des Membranrezeptors Tissue-Factor (TF) in den Organen ermittelt.

In den folgenden Abbildungen sind APAAP-positive Farbreaktionen auf die oben angeführten Antigene als rot gefärbte Areale erkennbar, während die Zellkerne blau gefärbt sind.

5.2.1 Immunhistochemische Ergebnisse bei konstanter kalter Ischämiezeit in isogen und allogen transplantierten Tieren (Teil A)

5.2.1.1 Nachweis von Selektinen

Die Proteine der Selektinfamilie gehören zu den frühesten Mediatoren innerhalb der Adhäsionskaskade, die nach einem entzündlichen Stimulus des Gewebes hochreguliert werden und den ersten Kontakt zwischen Leukozyten und Endothel vermitteln (33). Entsprechend zeigten sich in den Organen, die schon nach zwei Stunden wieder entnommen wurden, bereits deutliche Farbreaktionen für P-Selektin und für L-Selektin sowohl in allogen als auch in isogen transplantierten Tieren.

Wie in Abbildung 5 erkennbar ließ sich P-Selektin am stärksten im Bereich des Endothels glomerulärer und peritubulärer Kapillaren sowie der Intima kortikaler Arteriolen nachweisen, was einem ähnlichen Verteilungsmuster entspricht wie in Biopsien aus humanen allogenen Transplantaten direkt nach Revaskularisation (32). Die maximale Farbintensität war zwischen 2 und 6 Stunden nach der [Seite 38↓]Transplantation erreicht. Nach 12 bis 24 Stunden wurde die Intensität wieder schwächer, und nach 48 Stunden war P-Selektin in den Organen nicht mehr nachzuweisen. Zu allen untersuchten Zeitpunkten gab es keinen meßbaren Unterschied zwischen isogenen und allogenen Transplantaten. In Kontrolltieren trat P-Selektin weder im Bereich der Gefäße noch der Glomeruli auf.

Abb. 5: Immunhistochimischer Nachweis für P-Selektin 2 Stunden nach Transplantation. Vaskuläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. Intraglomerläre Expression: (D) isogenes Transplantat; (E) allogenes Transplantat; (F) native Niere. 400fache Vergrößerung.

Der zeitliche Verlauf von L-Selektin ähnelte dem von P-Selektin. Die maximale Intensität lag hier zwischen 2 und 12 Stunden. Im Gegensatz zur Verteilung von P-Selektin fand sich L-Selektin jedoch nicht im Bereich der Gefäßwände sondern an der Oberfläche entzündlicher Zellen in der Umgebung von peritubulären Kapillaren, Arteriolen und größeren Gefäßen. In Abbildung 6 sind repräsentativ die Hauptlokalisationen zum Zeitpunkt des Expressionsmaximums 6h nach der Transplantation im Vergleich zu nativen Organen dargestellt. Verteilungsmuster und Menge dieser L-Selektin-positiven Zellen zeigten keine Unterschiede [Seite 39↓]zwischen isogenen und allogenen Transplantaten. In unbehandelten Tieren war L-Selektin nicht nachweisbar.

Abb. 6: Immunhistochemischer Nachweis für L-Selektin 6 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 400fache Vergrößerung.


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5.2.1.2  Nachweis der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und PECAM-1

Die Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und PECAM-1 gehören zu Molekülen aus der Gruppe der Immunglobulinsuperfamilie (IgSF). Sie spielen unter anderem eine entscheidende Rolle beim Übergang der zunächst reversiblen, Selektin-vermittelten Adhärenz von verschiedenen Abwehrzellen an das Gefäßendothel in eine feste Bindung und deren Migration durch die Gefäßwand (49, 55, 58). Im Nierenparenchym der transplantierten Tiere zeigte ICAM-1 eine diffuse Verteilung auf Endothel- und Tubuluszellen. Nicht nur an der apikalen sondern auch an der basolateralen Membran der Tubuluszellen waren positive Farbreaktionen bei allogenen und isogenen Gruppen für ICAM-1 erkennbar. Auch Zellen des Niereninterstitiums zeigten deutlich positive Markierungen. Die Farbintensität war schon bei den frühesten Zeitpunkten der Organentnahme erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf waren allerdings keine eindeutigen Intensitätsunterschiede erkennbar. In Abbildung 7 ist exemplarisch die Expression von ICAM-1 24 Stunden nach der Transplantation bei allogen und isogen transplantierten Tieren im Vergleich zu nativen Organen dargestellt. Man erkennt bereits in nativen Nieren eine basale konstitutive Expression von ICAM-1 an etwa den gleichen Parenchymstrukturen wie nach der Transplantation – jedoch in wesentlich geringerer Intensität.

Abb. 7: Immunhistochemischer Nachweis für ICAM-1 24 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 200fache Vergrößerung.

Auch das Auftreten von VCAM-1 war streng auf das Endothel beschränkt. Erste [Seite 41↓]schwache Markierungen traten 6 Stunden nach Transplantation auf, und bis 24 Stunden nach Organübertragung stieg die Intensität auf ein Maximum in isogenen und allogenen Gruppen. Betroffen war vorzugsweise die Intima elastischer Gefäße wie kleinerer Arterien und Arteriolen, während auf kapillärem Endothel VCAM-1 nicht vorzufinden war. In Abbildung 8 sind die positiven Farbreaktionen in der Intima sowohl allogen als auch isogen transplantierter Nieren zum Zeitpunkt der maximalen Expression 24 Stunden nach dem Eingriff deutlich erkennbar. Auschließlich in allogenen Organen zeigte sich zu diesem Zeitpunkt an nahezu allen glomerulären Gefäßpolen VCAM-1-Positivität (siehe Abbildung 8E), die in isogenen Nieren nicht auftrat. Dieses differente Auftreten bei isogen und allogen ist mit den bisherigen Erkenntnissen nicht erklärbar. In Kontrollorganen konnte VCAM-1 nicht nachgewiesen werden.

Abb. 8: Immunhistochemischer Nachweis für VCAM-1 24 Stunden nach Transplantation. Vaskuläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. Intraglomeruläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 400fache Vergrößerung.

In Abbildung 9 sieht man, dass die Verteilung von PECAM-1 im Gegensatz zu [Seite 42↓]ICAM-1 auf das Endothel der Gefäße beschränkt war. PECAM-1 ist unter anderem an der Zell-Zell-Verbindung von Endothelzellen beteiligt und wird deshalb von der Endothelschicht in gesunden Nieren in hohem Maße exprimiert (siehe Abbildung 9c) und gilt deshalb auch als Marker für ein intaktes Gefäßendothel. In Abbildung 9A und 9B ist gut erkennbar, dass es trotz deutlicher Parenchymschädigung 24 Stunden nach der Transplantation nicht zu einer deutlichen Änderung der PECAM-1-Expression kam. Auch im weiteren zeitlichen Verlauf waren in allen isogenen und allogenen Gruppen keine eindeutigen Intensitätsunterschiede auszumachen.

Abb. 9: Immunhistochemischer Nachweis für PECAM-1 24 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 200fache Vergrößerung.

5.2.1.3 Nachweis von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sowie der Integrine VLA-4 und LFA-1

Die erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen und Integrinen auf Endothelzellen und Leukozyten nach Ischämie-/ Reperfusionsschaden ist mit einer verstärkten Adhäsion und Migration entzündlicher Zellen aus dem Gefäßsystem ins Gewebe des transplantierten Organs verbunden. Die Interaktion von ICAM-1 und VCAM-1 auf Endothelzellen mit den korrespondierenden Liganden LFA-1 und VLA-4 an der Leukozytenoberfläche hat bei diesen Abläufen wichtigen Einfluss (38, 49, 53). Unter dieser Voraussetzung untersuchten wir die Stärke der Gewebsinfiltration durch neutrophile Granulozyten und monozytäre Zellen in Zusammenhang mit der Ausprägung der Oberflächenintegrine LFA-1 und VLA-4. [Seite 43↓]In Abbildung 10 ist der zeitliche Verlauf dieser Zellpopulationen nach der Transplantation zwischen isogenen und allogenen Gruppen dargestellt.

Abb. 10: Zeitverlauf verschiedener Populationen von Abwehrzellen nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF in Gewebeschnitten allogener (■) und isogener (●) Organe. (A) neutrophile Granulozyten (HIS-48), (B) LFA-1-positive Zellen, (C) ED-1-positive Monozyten/Makrophagen, (D) VLA-4-positive Zellen. ٭P = 0,01.

Unter den Mediatoren, die zu einer Verschlechterung der Organfunktion nach Ischämie-/Reperfusionsschaden führen, wird den neutrophilen Granulozyten wesentlicher Einfluss zugeschrieben (91, 92). In Abbildung 10A erkennt man, dass die Gewebsinfiltration durch Granulozyten parallel zur gesteigerten Expression von P-Selektin bereits 2 Stunden nach der Transplantation begann und im weiteren Verlauf bis auf ein Maximum zwischen 12 und 24 Stunden [Seite 44↓]deutlich anstieg. Anschließend nahm ihre Zahl ab, um nach 7 Tagen in etwa wieder auf dem Niveau von 2 Stunden anzulangen. Ein ähnlicher Verlauf spiegelt sich auch in der Verschlechterung der Nierenfunktion wieder (siehe hierzu Abbildung 3). 2, 24 und 48 Stunden nach der Transplantation zeigten sich in allogenen Gruppen im Vergleich zu isogenen signifikant höhere Zellzahlen; zu diesen Zeitpunkten lag in den entsprechenden Gruppen jedoch kein signifikanter Unterschied in der Organfunktion vor. In Abbildung 11 A-D sind die Hauptlokalisationen der Neutrophilen im Nierenparenchym isogen und allogen übertragener Organe repräsentativ zum Zeitpunkt 24 nach Transplantation dargestellt: In erster Linie befanden sich die Zellen innerhalb der Glomeruli und in perivaskulären Bereichen, vereinzelt auch im Interstitium.

Abb. 11: Immunhistochemischer Nachweis für neutrophile Granulozyten und LFA-1-positive Zellen in isogenen und allogenen Transplantaten 24 Stunden nach Transplantation. Perivaskuläre neutrophile Infiltrate: (A) isogen; (B) allogen. Intraglomeruläre neutrophile Infiltrate: (C) isogen; (D) allogen. Perivaskuläre LFA-1-positive Infiltrate: (E) isogen; (F) allogen. Intraglomeruläre LFA-1-positive Infiltrate: (G) isogen; (H) allogen. 400fache Vergrößerung.

Eines der hauptverantwortlichen Integrine für Adhäsion und Transmigration nach Schädigung durch IR in der Zellmembran neutrophiler Granulozyten ist LFA-1, dessen korrespondierender Ligand ICAM-1 auf Endothelzellen ist (41, 93). In [Seite 45↓] Abbildung 10B sieht man, dass bereits zwischen 2 und 6 Stunden nach der Transplantation vermehrt LFA-1-positive Zellen im Nierengewebe auftraten. Die maximale Zellzahl wurde nach 24h erreicht. Anschließend ging ihre Zahl bis 48 Stunden nach der Operation zunächst wieder zurück, um danach auf einen zweiten Höhepunkt nach einer Woche anzusteigen. Signifikant höhere Werte als bei isogenen Tieren fanden sich für LFA-1 in allogenen Gruppen lediglich nach 6 Stunden. Die positiv markierten Zellen waren in allogenem ebenso wie in isogenem Nierengewebe hauptsächlich perivaskulär und intraglomerulär lokalisiert – vereinzelt auch interstitiell (siehe Abbildung 11 E-H). An den früheren Zeitpunkten bis etwa 48 Stunden nach der Transplantation korrelierte diese Verteilung mit der Lokalisation neutrophiler Granulozyten im Gewebe; danach entsprach sie eher der Verteilung von Monozyten/Makrophagen im Nierenparenchym. Bei unbehandelten Kontrolltieren fanden sich nur vereinzelt im Interstitium LFA-1-positive Zellen - jedoch nicht in perivaskulären Arealen oder Glomeruli.

Welchen konkreten Anteil Monozyten/Makrophagen an den entzündlichen Abläufen nach Ischämie-/Reperfusionsschäden haben, ist noch nicht ausreichend geklärt. Ihre Fähigkeit, bestimmte Zytokine und Wachstumsfaktoren freizusetzen, lässt allerdings vermuten, dass diese Zellen unter anderem auch an regenerativen Prozessen im Nierenparenchym beteiligt sind (94). In Abbildung 10C ist der parallele Verlauf der Zellzahlen zwischen isogenen und allogenen Tieren innerhalb der ersten Woche nach der Transplantation sehr deutlich erkennbar. Die Migration der ED-1-positiven Zellen begann nach 2 Stunden und zeigte im weiteren Verlauf einen sehr raschen Anstieg, so dass diese Zellpopulation nach 24 Stunden mit bis zu 27 Zellen pro Gesichtsfeld (GF) bereits den Großteil der infiltrierenden Zellen ausmachte. Dieser Umstand legt die Vermutung nahe, dass nicht ausschließlich neutrophile Granulozyten für die Verschlechterung der Nierenfunktion verantwortlich waren. Zwischen 24 und 48 Stunden hielt sich die Zahl ED-1-positiver Zellen auf gleichbleibend hohem Niveau. Daraufhin kam es zu einem weiteren Anstieg bis zum Zeitpunkt 7 Tage nach der Transplantation. Signifikante Unterschiede zwischen isogenen und allogenen Transplantaten traten zu keinem der untersuchten Zeitpunkte auf. Abbildung 12 A-D zeigt die Hauptlokalisationen ED-1-positiver Zellen in peritubulären Bereichen und in der Umgebung elastischer Gefäße exemplarisch 24h nach der Transplantation. In erster Linie fanden sich [Seite 46↓]diese Zellinfiltrate in der Nähe von Gefäßen, die auch positive Farbreaktionen für VCAM-1 aufwiesen. Auch innerhalb der Glomeruli fanden sich ED-1-positive Zellen. In Kontrolltieren traten lediglich vereinzelt positiv markierte Zellen auf, die vermutlich zu den gewebsständigen Makrophagen zu zählen sind.

Abb. 12: : Immunhistochemischer Nachweis für ED-1-positive Monozyten/Makrophagen und VLA-4-positive Zellen in isogenen und allogenen Transplantaten 24 Stunden nach Transplantation. Perivaskuläre ED-1-positive Infiltrate: (A) isogen; (B) allogen. Intraglomeruläre ED-1-positive Infiltrate: (C) isogen; (D) allogen. Perivaskuläre VLA-4-positive Infiltrate: (E) isogen; (F) allogen. Intraglomeruläre VLA-4-positive Infiltrate: (G) isogen; (H) allogen. 400fache Vergrößerung.

Mit VLA-4 wurde das Auftreten eines der Leukozytenintegrine untersucht, das hauptsächlich mit Adhäsion und Transmigration von Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten durch die Gefäßwand assoziiert wird (40, 53). Wie in Abbildung 10D dargestellt war die Gewebsinfiltration durch VLA-4-positive Zellen zunächst weniger stark als durch ED-1-positive. Bis 24 Stunden nach der Transplantation erhöhten sich die Zellzahlen zunächst nur langsam bis auf 8-10 Zellen/GF. Zwischen 24 und 48 Stunden blieben die Werte auf diesem Niveau, um erst danach bis zum Zeitpunkt von 1 Woche nach dem Eingriff auf deutlich höhere Werte von 20-23 Zellen/GF anzusteigen. Dabei war die zeitliche Dynamik bei isogen und allogen transplantierten Tieren nahezu identisch, so dass an [Seite 47↓]keinem der Zeitpunkte signifikante Unterschiede zwischen den entsprechenden Gruppen auftraten. In Abbildung 12 E-H sind die Lokalisationen VLA-4-positiver Zellen repräsentativ zum Zeitpunkt 24h nach der Transplantation bei isogenen und allogenen Transplantaten in perivaskulären und peritubulären Bereichen sowie in den Glomeruli gut erkennbar. In nativen Organen traten nur einzelne VLA-4-positive Zellen auf.

5.2.1.4 Nachweis von ED-1- und ED-2-positiven Zellen in allogen transplantierten Tieren 10 Tage nach Transplantation ohne versus 1,5 mg/kg bzw.5 mg/kg immunsuppressiver Behandlung mit Cyclosporin-A (CsA)

Monozyten/Makrophagen zeigten die größten Infiltrationszahlen unter den untersuchten Zellpopulationen in isogenen und allogenen Transplantaten. Für diesen Zelltyp wurde der Untersuchungszeitraum deshalb bis auf 10 Tage nach dem Eingriff ausgeweitet, weil es dann in allogen übertragenen Organen ohne Immunsuppression nach vorausgegangener Regeneration zu zellulärer und vaskulärer Rejektion kommt. Um den Einfluß immunsuppressiver Behandlung mit CsA auf den Einstrom von Entzündungszellen in das Nierenparenchym zu ermitteln, untersuchten wir drei weitere allogene Tiergruppen mit niedrig dosierter Behandlung (1,5 mg/kg CsA), Standarddosis (5 mg/kg CsA) bzw. ohne Gabe von Immunsuppressiva während der ersten Woche nach der Operation. In Abbildung 13 sieht man, dass es bei Tieren ohne immunsuppressive Behandlung nach 10 Tagen im Vergleich zum Wert nach 7 Tagen zu einem weiteren heftigen Anstieg ED-1-positiver Zellen auf bis zu 60 Zellen/GF kam. Diese massiven Zellinfiltrate waren mit dem Bild der akuten Transplantatabstoßung vereinbar. Während es nach Gabe von 1,5 mg/kg CsA zunächst zu einer mäßigen Reduktion der Zahl ED-1-positiver Zellen kam, wurden deutlich niedrigere Inflitrationszahlen erst unter der Therapie mit 5 mg/kg CsA erreicht. Einen speziellen Subtyp differenzierter antigenpräsentierender Makrophagen stellt der Klon ED-2 dar. In weiteren Färbungen für diesen Zellklon zeigte sich, dass der Anteil ED-2-positiver Zellen durch die immunsuppressive Behandlung nicht beeinflußt wurde.


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Abb. 13: Einfluß der Behandlung mit Cyclosporin A (CsA) in niedriger Dosis oder Standarddosis auf die Zahl ED-1- bzw. ED-2-positiver Monozyten/Makrophagen in Organen allogen transplantierter Tiere 7 und 10 Tage nach dem Eingriff. (■) ED-1-positive Zellen, (□) ED-2-positive Zellen. Alle Werte sind als Mittelwert + SEM dargestellt. ٭P = 0,001

5.2.2 Immunhistochemische Ergebnisse bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

Im folgenden Kapitel sind die immunhistochemischen Ergebnisse für isogen transplantierte Tiere 24 Stunden nach der Operation aufgeführt, deren Organe 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden kalter Ischämiezeit ausgesetzt waren. Nach 48 Stunden kalter Ischämiezeit waren alle entsprechenden Nieren komplett nekrotisch und deshalb für weitere immunhistochemische Untersuchungen nicht mehr verwendbar.

5.2.2.1 Nachweis der Adhäsionsmoleküle PECAM-1 und VCAM-1

Das Adhäsionsmolekül PECAM-1 spielt - wie bereits in Kapitel 1.2.4 ausführlich beschrieben wurde - eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Verbindung zwischen intakten Endothelzellen und bei der Transmigration von Leukozyten aus dem Gefäßsystem durch diese Barriere (57, 58). Weil in enzündetem oder geschädigtem Endothel die Struktur dieser Zell-Zell-Verbindungen erheblich [Seite 49↓]verändert ist, kommt es dort unter anderem zu erhöhter Permeabilität der Endothelbarriere und verstärkter Migration zahlreicher Abwehrzellen ins umliegende Gewebe.

Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis für PECAM-1 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach (A) 2h, (B) 6h, (C) 12h und (D) 24h vorausgegangener kalter Ischämiezeit. 200fache Vergrößerung.

In nativen Kontrollorganen zeigte sich wie bereits beschrieben beim Nachweis für PECAM-1 eine hohe Farbintensität und gleichmäßige Verteilung auf das Endothel intraglomerulärer und peritubulärer Kapillaren sowie größerer Gefäße. Zwischen Kontrollnieren und Organen aus Gruppen mit kürzeren kalten Ischämiezeiten bis zu 4 h waren keine Unterschiede in Intensität und Verteilung der positiv markierten Areale erkennbar. Dagegen wurde die Färbung in Organen, die langen kalten Ischämiezeiten von 12 h bis 24 h ausgesetzt waren, deutlich schwächer und offenbarte im Verteilungsmuster Lücken in der Integrität der Endothelbarriere. Abbildung 14 zeigt die Verteilung von PECAM-1 in den Nieren nach 2h (Abb.14A) bzw. 6h (Abb.14B) vorausgegangener kalter Ischämiezeit im Vergleich zu 12h (Abb. 14C) bzw. 24h (Abb.14D) Ischämiezeit. Man erkennt, dass [Seite 50↓]insbesondere in den stärker geschädigten Arealen die Intensität der PECAM-1-Färbung abnahm und die Verteilung nicht mehr streng auf die Endothelschicht beschränkt war, sondern sich auch auf angrenzende Bereiche des Interstitiums ausweitete. Der Intensitätsverlust betraf größere arterielle Gefäße in gleichem Ausmaß wie peritubuläres und glomeruläres kapilläres Endothel.

Analog zu den Ergebnissen aus dem ersten Teil der Studie (Teil A) war die Verteilung von VCAM-1 auch in Gruppen mit variierten kalten Ischämiezeiten auf die Endothelschicht beschränkt.

Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis für VCAM-1 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach (A) 2h, und (B) 6h vorausgegangener kalter Ischämiezeit. 400fache Vergrößerung.

In erster Linie waren elastische Gefäße wie kleinere Arterien und Arteriolen betroffen. Abbildung 15 zeigt exemplarisch den Nachweis für VCAM-1 auf dem Endothel kleinerer elastischer Gefäße nach 2h (Abb. 15A) und nach 6h (Abb.15B) vorausgegangener kalter Ischämiezeit. Die Intensität der positiv markierten Bereiche war in Organen, die kürzeren kalten Ischämiezeiten von 4 - 6 Stunden ausgesetzt waren, geringer ausgeprägt als nach Exposition mit langen [Seite 51↓]Ischämiezeiten von 12 - 24 h.

5.2.2.2 Nachweis von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sowie der Integrine LFA-1 und VLA-4

Im ersten Teil der Studie (Teil A) hatte sich bereits gezeigt, dass sowohl neutrophile Granulozyten als auch Monozyten/Makrophagen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation wesentliche Anteile der infiltrierenden Zellpopulationen ausmachen. Anhand zeitlicher Verteilungsmuster und charakteristischer Lokalisationen im Nierengewebe ergaben sich Korellationen in Bezug auf LFA-1 und VLA-4 als mögliche Integrine an der Oberffläche dieser Zellen. Deshalb wurden auch im zweiten Teil (Teil B) der Studie Färbungen für diese vier Parameter durchgeführt, um den Einfluss der Dauer der kalten Ischämiezeit zu ermitteln. In Abbildung 16 sind die Zellzahlen für neutrophile Granulozyten (HIS-48), LFA-1-positive Zellen, Monozyten/Makrophagen (ED-1) und VLA-4-positive Zellen dargestellt.

Um herauszufinden, ob das Ausmaß der entzündlichen Antwort auf Reperfusionsschäden nach Exposition mit längeren kalten Ischämiezeiten ansteigt, wurden zunächst Menge und räumliche Verteilung der neutrophilen Granulozyten in Organen, die ansteigenden kalten Ischämiezeiten ausgesetzt waren, untersucht. Bei allen Gruppen befanden sich die granulozytären Infiltrate hauptsächlich innerhalb der Glomeruli und in perivaskulären sowie interstitiellen Bereichen. Dies entsprach den Lokalisationen in den Gruppen aus Teil A. Längere kalte Ischämiezeiten (12 – 24h) führten im Vergleich zu kürzeren (2 – 6h) nicht zu signifikant höheren Zellzahlen bei neutrophilen Granulozyten (siehe Abbildung 16A). Diese Ergebnisse standen im Einklang mit der Nierenfunktion bei diesen Tieren, die sich ebenfalls zwischen Gruppen mit längeren und kürzeren Ischämiezeiten nicht wesentlich unterschied (siehe Kapitel 3.1.2).


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Abb. 16: Verschiedene Populationen von Abwehrzellen in Gruppen mit variablen kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF pro Gewebeschnitt. ٭ P = 0,01. (A) neutrophile Granulozyten, (B) LFA-1-positive Zellen, (C) ED-1-positive Monozyten/Makrophagen, (D) VLA-4-positive Zellen.

Da LFA-1 wie bereits beschrieben einen wichtigen Beitrag zu Adhäsion und Migration neutrophiler Granulozyten durch die Gefäßwand leistet (93), wurde untersucht, ob es in Verteilungsmuster und Zellzahl LFA-1-positiver Zellen zu Parallelitäten mit neutrophilen Granulozyten bei Tieren mit ansteigenden kalten Ischämiezeiten kam. In Abbildung 16B sieht man, dass die Zahl LFA-1-positiver Zellen im Gewebe bei einer Verlängerung von 2h vorausgegangener kalter Ischämiezeit auf 4h signifikant anstieg. Darüber hinaus verlängerte Ischämiezeiten von 6h bis hin zu lang andauernder Ischämie von 12h bzw. 24h führten jedoch nicht zu einer weiteren Verstärkung der Zellinfiltration. Anhand von Untersuchungen an Serienschnitten zeigte sich, dass die Hauptlokalisationen in Glomeruli, im Interstitium und in perivaskulären Arealen bei kürzeren Ischämiezeiten von 2h nahezu identisch mit denen der Granulozyten waren. Nach längeren Ischämiezeiten fanden sich aber auch Übereinstimmungen mit der Verteilung von Monozyten/Makrophagen.


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Bereits in Teil A der Studie hatten sich Monozyten/Makrophagen als eine der vorherrschenden infiltrierenden Zellpopulationen im Gewebe herausgestellt und die Vermutung nahegelegt, dass diese Zellen unter anderem auch wesentlichen Anteil an der Gewebeschädigung in der Akutphase nach der Transplantation haben. In Abbildung 16C erkennt man deutlich, dass ED-1-positive Zellen in allen Gruppen mit ansteigenden Ischämiezeiten der vorherrschende Zelltyp in den Organen waren. Entsprechend den Ergebnissen aus Teil A befanden sich ED-1-positive Zellen wiederum hauptsächlich in der Nähe elastischer Gefäße, peritubulär und intraglomerulär. Insbesondere nach kürzeren Ischämiezeiten (2-6h) befand sich die Mehrzahl der Infiltrate im Bereich von Gefäßen, die auch VCAM-1-positiv waren. Der Einstrom ED-1-positiver Zellen zeigte signifikante Anstiege von 20-25 Zellen/GF nach kürzeren Ischämiezeiten von 2-6h auf nahezu doppelt so hohe Werte in transplantierten Organen, die längeren Ischämiezeiten von 12-24h ausgesetzt waren. Im Wesentlichen war dieser Anstieg in perivaskuläre und peritubulären Bereichen zu verzeichnen, während in den Glomeruli die Zellzahl nicht zunahm.

Analog zum ersten Teil der Studie wurde auch in Organen, die ansteigenden kalten Ischämiezeiten ausgesetzt waren, Verteilung und Menge VLA-4-positiver Zellen bestimmt. Weil VLA-4 unter anderem in Adhäsionsprozesse von Monozyten/Makrophagen involviert ist (40), wurden Parallelitäten in Bezug auf Verteilung und Infiltrationsmenge durch Untersuchungen von Serienschnitten überprüft. In Abbildung 16D sieht man, dass die Zellzahlen im Vergleich zu ED-1 deutlich geringer ausfielen. Nach kürzeren kalten Ischämiezeiten (2-6h) zeigte sich zunächst nur ein dezenter Anstieg der Infiltration des Gewebes mit VLA-4-positiven Zellen auf 8-10 Zellen/GF, während nach langen Ischämiezeiten (12-24h) signifikant höhere Zellzahlen von bis zu 20 Zellen/GF in den Nieren auftraten. Die Verteilung der Zellen in den Organen verhielt sich analog zu den Ergebnissen für VLA-4 in Teil A. Hauptsächlich fanden sich Infiltrationen in perivaskulären, peritubulären und intraglomerulären Bereichen. Nach langen kalten Ischämiezeiten war in den Transplantaten in erster Linie die peritubuläre Fraktion VLA-4-positiver Zellen erhöht.


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5.2.2.3  Nachweis von MHC-ΙΙ-positiven Zellen, dendritischen Zellen (OX-62) und ED-2-positiven Zellen

Nach der „Response–to-Injury“-Hypothese (95, 96) wird vermutet, dass der Schweregrad der spezifischen Immunantwort und das Auftreten von Rejektionsereignissen nach Transplantationen mit dem Ausmaß der Gewebeschädigung vor und während der Transplantation korreliert. In Kapitel 1.4.1 wurde bereits erläutert, dass so genannte Antigen-präsentierende Zellen (APC) durch Präsentation von Fremdantigen in Verbindung mit MHC-ΙΙ-Molekülen T-Helferzellen aktivieren und eine entscheidende Rolle bei Initiation und Ablauf der spezifischen Immunantwort haben (70, 71, 72).

Abb. 17: Verschiedene Populationen von Abwehrzellen in Gruppen mit variablen kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF pro Gewebeschnitt. (A) MHC-ΙΙ-positive Zellen, (B) Dendritische Zellen (OX-62), (C) ED-2-positive Zellen.

Das Wissen über den Einfuß der Dauer der kalten Ischämiezeit auf Ausmaß und Mechanismen der Immunantwort des Empfängers ist bisher noch sehr unvollständig. Deshalb wurden im zweiten Teil der Studie Infiltrationsausmaß und [Seite 55↓]Hauptlokalisationen von MHC-ΙΙ-positiven Zellen, dendritischen Zellen (OX-62) und ED-2-positiven Makrophagen vom dendritischen Phänotyp nach ansteigenden kalten Ischämiezeiten untersucht. In Abbildung 17 sind die Zellzahlen im Nierengewebe für diese Zellpopulationen dargestellt.

Schädigung durch IR führt in der Niere zur Hochregulation immunologischer Marker wie dem Membranprotein MHC-Klasse-ΙΙ insbesondere an der basolateralen Seite von Tubuluszellen. Außerdem können aktivierte Makrophagen und dendritische Zellen MHC-ΙΙ-Moleküle zusammen mit Fremdantigen an der Zelloberfläche exprimieren. Deshalb wurde untersucht, ob die Menge infiltrierender MHC-ΙΙ-positiver Zellen im isogenen Transplantat und die Expression auf Parenchymzellen durch die Dauer der kalten Ischämiezeit beeinflusst wurde.

Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis für MHC-ΙΙ-positive Zellen nach 12 h kalter Ischämiezeit 24 Stunden nach Transplantation im Vergleich zum nativen Organ. 200fache Vergrößerung.

In Abbildung 17A erkennt man, dass die Zellzahl nach langen kalten Ischämiezeiten (12-24 h) im Vergleich zu kürzeren (2-6 h) numerisch leicht erhöht war. Es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied. In Abbildung 18 [Seite 56↓]ist die Verteilung MHC-ΙΙ-positiver Zellen nach 12h kalter Ischämiezeit im Vergleich zum nativen Organ zu erkennen. Infiltrierende Zellen befanden sich hauptsächlich peritubulär – vereinzelt auch in der Umgebung größerer Gefäße. Auch in nativen Organen traten vereinzelt MHC-ΙΙ-positiver Zellen vorwiegend im Interstitium in peritubulären Bereichen.

Dendritische Zellen (OX-62) haben wie bereits ausführlich beschrieben eine entscheidende Funktion bei der direkten und indirekten Antigenpräsentation im afferenten Arm der Immunantwort (71, 72). In Abbildung 17B sieht man deutlich, dass durch ansteigende kalte Ischämiezeiten und den anschließenden Reperfusionsschaden keine verstärkte Migration von dendritischen Zellen ins Gewebe im Vergleich zu nativen Organen induziert wurde.

Um mehr Aufschluss über die Zusammensetzung der vorherrschenden Zellpopulation Monozyten/Makrophagen (ED-1) in den transplantierten Nieren zu gewinnen, wurden zusätzliche Färbungen für die Subpopulation ED-2 durchgeführt. Dabei handelt es sich um einen aktivierten Subtyp von Makrophagen mit dendritischem Phänotyp. Aktivierte Makrophagen haben genau wie dendritische Zellen wichtige Bedeutung für die Präsentation von Antigenen an T-Helferzellen im Rahmen immunologischer Prozesse der Transplantatabstoßung. Vergleicht man Abbildung 17C und 16C wird deutlich, dass ED-2-positive Makrophagen nur etwa 1/3 der Gesamtzahl an Monozyten/Makrophagen ausmachten. Außerdem kam es in Organen auch nach langen kalten Ischämiezeiten im Vergleich zu kürzeren nicht zu einem signifikanten Anstieg ED-2-positiver Zellen.

5.2.2.4 Nachweis von Tissue Factor (TF)

Das membranständige Glykoprotein Tissue Factor (TF) übernimmt nach Gewebeschädigung eine regulierende Funktion in der Aktivierung der Gerinnungskaskade und beeinflusst durch die veränderten Endotheleigenschaften auch die entzündliche Anwort. Unter physiologischen Bedingungen wird TF nicht von Zellen mit direktem Blutkontakt gebildet sondern von Mesenchym- und Epithelzellen der Gefäßadventitia (61). Wird TF unter pathologischen Bedingungen wie nach Ischämie-Reperfusionsschäden auch von Endothelzellen generiert (62), kommt es durch die gesteigerte intravasale Gerinnung zu Gefäßverschlüssen (63). Außerdem ist TF an der Migration und Adhäsion von [Seite 57↓]Leukozyten beteiligt (64).

Abb. 19: Immunhistochemischer Nachweis für Tissue Factor 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach vorausgegangener kalter Ischämiezeit von 2h (A) vaskuläre, (B) glomeruläre und 6h (C) vaskuläre und (D) glomeruläre Expression. 200fache Vergrößerung.

In Abbildung 19 sind die Lokalisationen von TF in Organen, die unterschiedlich langen kalten Ischämiezeiten ausgesetzt waren, dargestellt. TF zeigte ein ähnliches Verteilungsmuster wie VCAM-1 und befand sich bei allen Gruppen auf dem Endothel sowohl größerer Gefäße aber auch peritubulärer Kapillaren. Ausserdem reagierten teilweise auch Zellinfiltrate in der Umgebung dieser Gefäße positiv mit dem TF-Antikörper. Der Intensitätsgrad der Färbung für TF war umso höher, je länger die vorausgegange kalte Ischämiezeit war.

5.3 Pathohistologische Analyse

Die mit Hematoxylin/Eosin gefärbten Präparate der in Paraffin eingebetteten Organanteile wurden im Hinblick auf typische Veränderungen in der Akutphase nach Ischämie-Reperfusionsschäden sowie morphologische Zeichen der akuten Tubulusschädigung und der akuten Rejektion untersucht (97, 98). Dies beinhaltete [Seite 58↓]thrombotische Gefäßverschlüsse gefolgt von Stauungszeichen und kollabierten Glomeruli sowie tubuläre Schädigungen, die nach dem „Acute Tubular Necrosis Score“ (ATN-Score) quantifiziert wurden. In dieser Einteilung werden Zeichen wie Lumenausformungen durch hyaline Proteinablagerungen, Zelldetritus oder Leukozyten, aufgetriebenes Tubuluslumen, Schädigung des Bürstensaums, Volumenverlust des Tubulusepithels bis hin zu Vakuolisierung und fokalen Nekrosen der Tubuluszellen beurteilt. Die Einteilung erfolgt in vier Schweregrade von milden (Grad 1, bis zu 20%) über mäßigen (Grad 2, 20-40%) und schweren Veränderungen (Grad 3, 40-60%) bis hin zu totaler Nekrose von mehr als 80% der Nierenparenchymfläche (Grad 4).

5.3.1 Morphologische Veränderungen bei konstanter kalter Ischämiezeit in isogen und allogen transplantierten Tieren innerhalb der ersten 10 Tage nach Transplantation (Teil A)

Die morphologischen Veränderungen im Nierengewebe zu den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation korrelierten mit den entsprechenden Nierenfunktionswerten der Tiere. Die frühesten Veränderungen sowohl bei isogenen als auch bei allogenen Gruppen traten 6 Stunden nach der Organübertragung auf und äußerten sich in gestauten Vasa recta, vereinzelten weißen Thromben in Venolen sowie einigen wenigen kollabierten Glomeruli. Im weiteren Verlauf traten zunehmend auch tubuläre Schädigungen auf. 12 Stunden nach der Transplantation stieg die Zahl an Ausformungen der Tubuli mit hyalinen Proteinablagerungen deutlich an, um nach 24 Stunden ihr Maximum zu erreichen. Hinzu kamen als weitere Anzeichen zunehmender Tubulusschädigung deutlich dilatierte Tubuli mit vakuolisierten Zellen und Arealen fokaler Nekrosen. Diese für akute tubuläre Nekrose (ATN) typischen Veränderungen in Organen 24 Stunden nach der Operation sind in Abbildung 20 A und B dargestellt. Parallel zum klinischen Verlauf bildeten sich die Gewebeschäden anschließend zurück, und bis 7 Tage nach dem Eingriff liefen zunächst regenerative Vorgänge in den Organen ab. Bis zu diesem Zeitpunkt waren keine signifikanten Unterschiede zwischen allogenen und isogenen Organen erkennbar. In den zusätzlich durchgeführten Gruppen kam es nach 10 Tagen in allogenen Organen ohne Immunsuppression zu akuter zellulärer und vaskulärer Rejektion des Transplantats mit massiven [Seite 59↓]Zellinfiltraten und Zerstörung des Nierenparenchyms (siehe Abbildung 20c).

Abb. 20: Histologische Färbung des Nierenparenchyms mit Hämatoxylin/Eosin: Deutliche Zeichen Akuter Tubulärer Nekrose (ATN) in isogen (A) und allogen (B) transplantierten Tieren 24 Stunden nach der Transplantation. Akute Rejektion in allogen transplantierten Tieren ohne Immunsuppression 10 Tage nach der Transplantation (C).

5.3.2 Morphologische Veränderungen bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

In Teil A der Studie hatte sich bereits gezeigt, dass innerhalb der ersten Woche bereits 24 Stunden nach der Transplantation die morphologischen Schädigungen einen Höhepunkt erreichten. Folglich fanden sich in allen Gruppen mit ansteigender kalter Ischämiezeit 24 Stunden nach dem Eingriff analoge Veränderungen im Nierenparenchym. In Abbildung 21 sieht man allerdings, dass die Schäden gemäß dem ATN-Score umso größer waren, je länger die vorausgegangene Ischämiezeit angedauert hatte. Die Nierenfunktion verschlechterte sich entgegen den morphologischen Beobachtungen nach längeren Ischämiezeiten jedoch nicht weiter. Organe nach 2 Stunden kalter Ischämiezeit zeigten nur milde (Grad 1), nach 4-6 Stunden mäßige (1,8 bis 2,3 = Grad 2) und nach langen Ischämiezeiten von 12-24 Stunden schwere (3,6 = Grad 3-4) Veränderungen an den Tubuli. Alle Transplantate nach vorausgeganger kalter Ischämiezeit von 48 Stunden waren vollständig nekrotisch.


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Abb. 21: ATN-Score für Gruppen mit ansteigenden kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Alle Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM.


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17.05.2005