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6  Diskussion

6.1 Bedeutung von Allogenität und Ischämie-/Reperfusionsschaden für die entzündlichen Vorgänge in der Frühphase nach der Transplantation

Die Ergebnisse zum zeitlichen Ablauf der entzündlichen Vorgänge nach IR und Transplantation haben gezeigt, dass innerhalb der ersten Woche nach der Organübertragung Alloantigen-abhängige Faktoren im verwendeten Tiermodell nicht beteiligt sind. Die wichtigen Phasen der funktionellen Verschlechterung nach 12 bis 48 Stunden, der anschließenden Regeneration und Erholung der Nierenfunktion zwischen 48 Stunden und einer Woche bis hin zur einsetzenden akuten Rejektion ab Tag 7 nach der Operation liefen unabhängig von den unterschiedlichen immunologischen Voraussetzungen in allogenen und isogenen Transplantaten gleich ab. In Einklang zum Verlauf der Nierenfunktion standen die morphologischen Veränderungen, die nach anfänglicher Verschlechterung regenerative Vorgänge und keine Anzeichen akuter Rejektion innerhalb der ersten 7 Tage in allogenen Gruppen erkennen ließen. Bei den immunhistologischen Ergebnissen traten fast keine Unterschiede in zeitlichem Auftreten, Intensität und Verteilung wichtiger Adhäsionsmoleküle zwischen allogen und isogen auf. Auch in Bezug auf Menge und räumliche Verteilung inflitrierender Leukozyten und den mit diesen assoziierten Integrinen zeigten sich kaum Differenzen. Die entzündlichen Vorgänge waren bestimmt durch den Einstrom von Neutrophilen ins geschädigte Gewebe unmittelbar nach der Transplantation, die wahrscheinlich vornehmlich durch Interaktion mit dem Endothel über Selektine und ICAM-1/LFA-1 aus dem Gefäßsystem austraten. Die parallel ablaufende Gewebsinfiltration durch Monozyten/Makrophagen erfolgte wahrscheinlich in erster Linie durch Adhäsionsmechanismen über Interaktion von VCAM-1 und VLA-4. Möglicherweise kamen zusätzlich auch andere Interaktionsmechanismen über bisher noch nicht bekannte Adhäsionsmoleküle zum Tragen.

6.1.1 Spezifische Mechanismen und Kinetik der Adhäsionskaskade nach IR und Transplantation

Die Beobachtungen zu Kinetik der Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen und [Seite 62↓]infiltrierenden Leukozyten an den frühen Zeitpunkten nach der Transplantation ähnelten Ergebnissen aus in vitro Studien an mit Interleukin-1 stimuliertem Endothel (99).

Das frühe Auftreten von P-Selektin 2 und 6 Stunden nach der Transplantation auf Gefäßendothel parallel zum Einstrom L-Selektin-positiver Zellen spricht dafür, dass Interaktion der Selektine für den erhöhten Einstrom neutrophiler Granulozyten in dieser Phase verantwortlich waren. Dies bestätigte sich an Färbungen von Serienschnitten, auf denen Kolokalisation innerhalb der Glomeruli zwischen P-Selektin auf kapilärem Endothel und infiltrierenden neutrophilen Granulozyten festgestellt werden konnte. Das Verteilungsmuster von P-Selektin auf dem Endothel von Arteriolen, Kapillaren und intraglomerulär entsprach dabei ähnlichen Beobachtungen an Biopsien aus kadaverischen Transplantaten unmittelbar nach Revaskularisation (27). Interessanterweise konnte in derselben Biopsiestudie durch Doppelfärbungen für P-Selektin und Thrombozyten-spezifisches CD41 zusätzlich gezeigt werden, dass P-Selektin nicht aus Endothelzellen sondern aus Thrombozyten freigesetzt worden war. Bereits zuvor konnte in einer anderen Studie in vitro gezeigt werden, dass am Endothel haftende Thrombozyten die Adhäsion von neutrophilen Granulozyten über P-Selektin unterstützen können (34). Es ist anzunehmen, dass auch in der vorliegenden Studie P-Selektin thrombozytären Ursprungs war; dies konnte allerdings nicht abschließend nachgewiesen werden, da ein rattenspezifischer Thrombozyten-Antikörper leider nicht kommerziell verfügbar war.

Der Rückgang der Selektin-Expression im weiteren Zeitverlauf deutet auf einen Wechsel zu anderen Adhäsionsmechanismen hin. Zunehmende Übereinstimmung der Verteilung neutrophiler Granulozyten mit den Lokalisationen LFA-1-positiver Zellen ab etwa 6h nach der Transplantation und die gesteigerte ICAM-1-Expression lassen vermuten, dass die Interaktion dieser Adhäsionsmoleküle vermehrt an der Gewebsinfiltration durch Neutrophile beteiligt war. Diese Beobachtungen entsprechen Ergebnissen aus anderen Studien, in denen die Bedeutung der Interaktion von LFA-1 mit ICAM-1 für die Neutrophilen-Adhäsion durch Intervention mit Antikörpern oder Antisense-Oligonukleotiden gezeigt werden konnte (25, 26, 49, 100). Bei der Infiltration des Gewebes durch neutrophile Granulozyten zeigten sich leichte Unterschiede im Zeitverlauf nach isogener und allogener Transplantation. In allogenen Gruppen kam es, verglichen [Seite 63↓]mit isogenen, zu einem schnelleren Anstieg der Zellzahlen und zu einem späteren, langsameren Abfall. Überraschenderweise kam es aber trotz der größeren Menge an Neutrophilen in allogenen Transplantaten jedoch nicht zu signifikant schlechteren Nierenfunktionswerten oder größeren morphologischen Schäden, verglichen mit isogenen Transplantaten an denselben Zeitpunkten. Daneben fiel auf, dass nach Transplantation neutrophile Granulozyten sowohl in isogenen als auch in allogenen Gruppen ein anderes Verteilungsmuster zeigten als nach IR in nativen Nieren. Charakteristischerweise fanden sich Neutrophile nach Transplantation außer in perivaskulären Infiltraten vornehmlich intraglomerulär (26, 27). Dagegen liegen die Hauptlokalisationen der Granulozyten nach IR in nativen Organen vornehmlich in peritubulären Bereichen der äußeren Medulla (25, 100). Welche Ursachen diesen unterschiedlichen Verteilungsmustern zugrunde liegen, ist unklar. Möglicherweise führen veränderte rheologische Bedingungen und erhöhte Gerinnungsaktivität durch den zusätzlichen operativen Stress im transplantierten Organ zur Stase im Bereich der Kapillarschlingen der Glomeruli. Dies könnte wiederum zu einer gesteigerten Adhärenz der Leukozyten innerhalb der Glomeruli und in vorgeschalteten größeren Gefäßen führen.

Die Expression von ICAM-1 war bereits an den frühesten Zeitpunkten nach der Transplantation erhöht und zeigte im weiteren Verlauf keine Intensitätsänderungen. Dies lässt vermuten, dass ICAM-1 während des gesamten Untersuchungszeitraums in Abläufe der Leukozytenmigration involviert war. Wahrscheinlich war ICAM-1 in der frühen Phase nach der Transplantation an der Migration von Neutrophilen zum Ort der Gewebeschädigung beteiligt, während an späteren Zeitpunkten auch die Infiltration durch Monozyten/Makrophagen von ICAM-1 mitbestimmt wurde. Das Verteilungsmuster von ICAM-1 entsprach dabei Beobachtungen aus früheren Studien an autotransplantierten Rattennieren (26) und war vergleichbar mit Ergebnissen aus humanen Biopsien vor und nach der Revaskularisation (101, 102). Die fehlende Änderung in der Intensität der Expression von PECAM-1 auf Endothelzellen während des gesamten Untersuchungszeitraums in isogenen und allogenen Gruppen lässt die Schlussfolgerung zu, dass trotz heftiger Entzündungsvorgänge in den transplantierten Organen die strukturelle Integrität des Endothels weitgehend erhalten blieb. Diese Beobachtungen decken sich ebenfalls mit Untersuchungen an Biopsien aus humanen allogenen Transplantaten (101, 102).


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Auch VCAM-1 zeigte ein charakteristisches Expressionsmuster nach ischämischer Schädigung in transplantierten Nieren und fand sich in isogenen und allogenen Gruppen vornehmlich auf dem Endothel größerer elastischer Gefäße und Arteriolen. Im Gegensatz dazu wurde in Biopsien bei anderen entzündlichen Erkrankungen der Niere verstärkte Expression von VCAM-1 hauptsächlich im basolateralen Bereich der Tubuluszellen bzw. im vaskulären Bereich auf kleineren Gefäßen und postkapillären Venolen beobachtet (103, 104). Möglicherweise bedingen neben ischämischer Schädigung des Endothels und Aktivierung durch operativen Stress im Rahmen der Transplantation auch hier veränderte rheologische Bedingungen die erhöhte Expression von VCAM-1 auf größeren, elastischen Gefäßen und den damit verbundenen vermehrten subendothelialen Austritt von Leukozyten in diesen Bereichen. Obstruktion im Bereich der glomerulären Kapillarschlingen nach Reperfusion des Organs könnte durch Stase in den vorgeschalteten Arterien und Arteriolen zu erhöhter Aktivierung des Endothels in diesen Gefäßen führen. Andere Untersuchungen an transplantierten Nieren zeigten im Gegensatz dazu, dass während akuter Rejektion die Mehrheit der Leukozyten aus peritubulären Kapillaren in das Organ einströmt (105). Dabei kamen ähnliche Mechanismen wie in den sogenannten „high endothelial venules“ von Lymphknoten und Milz bei Adhäsion und Austritt der Lymphozyten zum Tragen. Diese differenten Beobachtungen machen deutlich, dass unterschiedliche Bedingungen im selben Organ auch zu großen Unterschieden bei den Mechanismen der Adhäsion und Infiltration von Abwehrzellen führen können und diese Vorgänge entscheidend von der Art der vorausgegangenen Schädigung abhängen. Die beobachteten leichten Unterschiede in der Lokalisation von VCAM-1 zwischen isogenen und allogenen Gruppen sind mit den bisherigen Erkenntnissen jedoch nicht hinreichend zu erklären. Die zusätzliche Expression von VCAM-1 auf Endothelzellen des vaskulären Pols in allogenen Gruppen ist möglicherweise eine Reaktion auf die leicht erhöhte Infiltration durch neutrophile Granulozyten in allogenen Organen verbunden mit einer dezent verstärkten Endothelaktivierung. Allerdings zog diese differente Expression keine vermehrte Infiltration durch Monozyten in allogen transplantierten Tieren nach sich.


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6.1.2  Mögliche Einflüsse der vorherrschenden Entzündungszellen auf morphologische und funktionelle Veränderungen des Transplantats

Während in früheren Studien neutrophile Granulozyten als Hauptmediatoren der Gewebeschädigung nach IR angesehen wurden (91, 92), traten in neueren Untersuchungen sowohl im Tiermodell nach Schädigung durch IR (106) wie auch an humanen allogenen Transplantaten unmittelbar nach Reperfusion (107) zunehmend Monozyten/Makrophagen in den Mittelpunkt. Die Bedeutung monozytärer Zellen nach ischämischer Schädigung wurde vermutlich auch deshalb unterschätzt, weil Neutrophilen-Marker wie die Myeloperoxidase auch Bestandteil von Monozyten/Makrophagen sind. Auch der monoklonale Antikörper HIS-48 ist kein hochspezifischer Nachweis für Granulozyten sondern mit Monozyten/Makrophagen kreuzreaktiv (106). Auch in der vorliegenden Studie zeigten sich Überschneidungen bei Lokalisationen von ED-1+- und HIS-48+-Zellen, sodass ein zusätzlicher Anteil von Monozyten an der Gesamtzahl infiltrierender Zellen angenommen werden kann. Daneben konnte in weiteren neueren Studien eine größere Bedeutung von CD4+-T-Helferzellen und kostimulatorischen Signalen wie dem Protein B7-1 bei der Pathogenese des IR-Schadens und der Extravasation von Monozyten/Makrophagen nachgewiesen werden (108, 109). Diese neuen Erkenntnisse stehen im Einklang mit den vorliegenden Ergebnissen, bei denen sich Monozyten/Makrophagen als vorherrschende Zellpopulation unter den infiltrierenden Zellen in allogenen und isogenen Gruppen herausgestellt hatten. Die Topographie im Gewebe und die zeitliche Dynamik von Zellinfiltration und Adhäsionsmolekülen unterstützten die Vermutung, dass Monozyten/Makrophagen an den späteren Zeitpunkten nach der Transplantation über Interaktion von VCAM-1 und VLA-4 aus dem Gefäßsystem austraten. Dies korreliert mit Ergebnissen aus Studien in vitro (40, 55) und in vivo bei Modellen zu akuten, subakuten und chronischen Entzündungsvorgängen (110). Der frühe Anstieg von Monozyten/Makrophagen in den transplantierten Organen, die bereits 6 Stunden nach Reperfusion des Organs genauso hohe Zellzahlen wie Neutrophile im Gewebe erreichten, spricht für eine Beteiligung dieser Zellpopulation an der Gewebeschädigung. Die zwischen 24 und 48 Stunden nach der Transplantation einsetzende Erholung der Nierenfunktion unter zunehmendem Einstrom von Monozyten/Makrophagen in das Organ legt die [Seite 66↓]unmittelbare Beteiligung dieser Zellen an den regenerativen Abläufen in dieser Phase nahe. Diese Fähigkeit der Monozyten/Makrophagen je nach vorherrschenden Bedingungen in der unmittelbaren Umgebung entweder weitere Gewebeschäden hervorzurufen oder reparative Mechanismen zu steuern wird auch „macrophage programming“ genannt und ist in neueren Untersuchungen immer mehr in den Vordergrund getreten (111). Schließlich kam es in allogen transplantierten Tieren nach etwa 10 Tagen ohne Immunsuppression unter maximaler Infiltration von Monozyten/Makrophagen zur akuten Rejektion. Inwieweit die massiven Infiltrate von ED-1+- Monozyten/Makrophagen Auslösung und Fortgang der spezifischen Immunantwort beeinflussten ist jedoch unklar. In weiteren allogenen Gruppen konnte gezeigt werden, dass immunsuppressive Therapie mit CyclosporinA (CsA) zwar zu einer dosisabhängigen Reduktion ED1-positiver Monozyten/Makrophagen zum Zeitpunkt der akuten Rejektion führte. Allerdings wurde der Anteil ED2-postiver Makrophagen – eines aktivierten Subtyps vom dendritischen Phänotyp - durch Gabe von CsA nicht beeinflusst. Die genaue Funktion aktivierter Makrophagen nach IR und im Rahmen der Transplantationsimmunologie ist noch weitgehend unerforscht. Interessant in diesem Zusammenhang ist jedoch eine Protokollbiopsiestudie bei der Unterschiede zwischen klinischer und subklinischer Rejektion untersucht wurden. Unter den untersuchten Zellpopulationen waren lediglich die Zahlen für einen aktivierten Makrophagen-Subtyp beim Auftreten klinischer Rejektion signifikant erhöht (112). Möglicherweise spielen also aktivierte Makrophagenformen oder von diesen freigesetzte Stoffe eine bedeutende Rolle für die Manifestation klinisch apparenter Rejektionsereignisse.

6.2 Auswirkungen der Dauer der kalten Ischämiezeit auf Gewebeschädigung, Immunogenität und Adhäsions-mechanismen

Im zweiten Teil der Studie wurden die Auswirkungen ansteigender kalter Ischämiezeiten auf Morphologie, Funktion, inflammatorische Antwort und Immunogenität des Transplantats untersucht. Dabei zeigte sich, dass längere Aufbewahrungszeiten (12-24 Stunden) im Vergleich zu kürzeren (2-6 Stunden) nicht zu einer weiteren Verschlechterung der Nierenfunktion führten, obwohl bei [Seite 67↓]ansteigender Ischämiezeit die für ATN typischen morphologischen Schäden linear zunahmen. Trotz verstärkter Gewebeschädigung, aber in Einklang mit der gleich bleibend schlechten Nierenfunktion zeigte sich immunhistochemisch keine vermehrte Infiltration neutrophiler Granulozyten in den Organen nach längeren Ischämiezeiten. Auch der Einstrom von APCs wie dendritischen Zellen (OX-62), aktivierten Makrophagen (ED2) und MHC-Klasse-ΙΙ-positiven Zellen in das Transplantat blieb von längeren Ischämiezeiten, verglichen mit kürzeren unbeeinflusst, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die Traumatisierung des Gewebes nach langer kalter Ischämie - zumindest 24 Stunden nach der Transplantation - noch nicht mit einer erhöhten „Antigenität“ des Transplantats verbunden war. Die wichtigsten Veränderungen nach Ischämiezeiten von mehr als 6 Stunden waren eine massive Zunahme des Einstroms ED-1-positiver Monozyten/Makrophagen bis auf doppelt so hohe Werte. Diese vornehmlich perivaskulären Zellinflitrate gingen mit einer deutlich gesteigerten endothelialen Expression von VCAM-1 einher, während die Intensität von PECAM-1 auf dem Gefäßendothel zunehmend lückenhafter wurde und Interstitialzellen in der Nähe von Gefäßen ebenfalls positive Farbereaktionen zeigten. Zu diesen deutlichen Anzeichen der Endothelschädigung kamen außerdem Anzeichen erhöhter prothrombotischer Aktivität, die sich in gesteigerter Expression von Tissue Factor (TF) auf Endothel und infiltrierenden Zellen äußerte. Die geschädigten Gefäße zeigten zusammen mit einwandernden Leukozyten in deren Umgebung eine deutlich gesteigerte TF-Expression insbesondere auf Endothelzellen aber zum Teil auch auf Gefäßmuskelzellen.

Retrospektive Studien nach Nierentransplantation mit uni- und multivariaten Analysemethoden haben immer wieder gezeigt, dass zunehmende Dauer der kalten Aufbewahrungszeit des Organs vor der Transplantation einer der wichtigsten Prädiktoren für das Auftreten von verzögerter Organfunktion, akutem Organversagen und verkürzter Überlebenszeit des Transplantats sind (11, 88, 113, 114). Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang eine interessante klinische Studie, bei der jeweils beide Nieren eines kadaverischen Spenders nacheinander durch dasselbe Chirurgenteam verpflanzt wurden (115). Bei ausgeglichenem Matching für HLA, Panel-reaktive Antikörper, Geschlecht und Alter war lediglich die kalte Ischämiezeit der beiden Organe unterschiedlich. Trotz relativ geringer Unterschiede der kalten Aufbewahrungszeit von durchschnittlich 5 [Seite 68↓]Stunden, kam es nach längerer Ischämiezeit in den Organen signifikant häufiger zum Auftreten verzögerter Organfunktion und akuter Tubulusnekrose mit der Notwendigkeit von Dialysemaßnahmen. Unter anderen Bedingungen ist es in klinischen Studien allerdings kaum möglich, Aussagen über die tatsächlichen Auswirkungen der Ischämiezeit zu machen und den Anteil an Gewebeschädigung und Entzündungsreaktion zu messen, weil neben vielen anderen unspezifischen Faktoren zusätzlich spezifische alloreaktive Abstoßungsmechanismen zum Tragen kommen. Tierexperimentelle Untersuchungen zu den veränderten Auswirkungen ansteigender kalter Aufbewahrungszeiten auf das transplantierte Organ gibt es bisher nur wenige. Nur vereinzelt wurden Ischämiezeiten von mehr als 6 Stunden getestet (116), und 2 Stunden kalte Ischämiezeit wurden teilweise bereits als verlängerte Aufbewahrungszeit für die Spezies Ratte bewertet (117, 118).

Da sich beim verwendeten Tiermodell keine wesentlichen Unterschiede für die entzündlichen Vorgänge zwischen allogenen und isogenen Transplantaten während der ersten Woche nach Transplantation gezeigt hatten, wurden die Auswirkungen ansteigender kalter Ischämiezeiten nur in isogen transplantierten Organen untersucht. Während des Aufbewahrungszeitraums zwischen 2 und 48 Stunden wurden die Nieren bei 4° C in UW-Lösung gelagert, weil dieses Medium in der humanen Nierentransplantation am verbreitetsten ist und sich gegenüber anderen in klinischen Studien durchsetzen konnte (119). Um mögliche Änderungen der Antigenität des Transplantats zu ermitteln, wurden zusätzlich zu den Adhäsionsparametern und infiltrierenden Zellen, die im Zeitverlauf in isogenen und allogenen Transplantaten überprüft worden waren, der Einstrom bestimmter Antigen-präsentierender Zellen (APC) untersucht. Alle Organe wurden 24 Stunden nach der Transplantation wieder entnommen, weil im ersten Teil der Studie zu diesem Zeitpunkt ein Höhepunkt der funktionellen Verschlechterung verbunden mit prominenter Entzündungsreaktion festgestellt worden war.

Der ausbleibende Anstieg neutrophiler Granulozyten nach langen kalten Ischämiezeiten zeigte zwar Parallelität mit der gleichbleibenden Nierenfunktion; dieser Verlauf stand jedoch nicht in Einklang mit der Zunahme der morphologischen Schäden. Folglich waren neutrophile Granulozyten vermutlich nicht die hauptverantwortlichen Zellen für die ansteigende Gewebeschädigung. Diese Erkenntnisse stehen im Gegensatz zu früheren Studien, in denen [Seite 69↓]Neutrophile als zentrale Mediatoren der Schädigung nach IR in nativen und transplantierten Nieren eingeschätzt wurden (27, 91, 92, 120). Die zunehmende Traumatisierung der Organe nach längeren kalten Ischämiezeiten, verglichen mit kürzeren führte auch nicht zum vermehrten Einstrom von APCs und somit nicht zu einer erhöhten Antigenität im Sinne von Hallorans „Response–to-Injury“-Hypothese. Möglicherweise war der Zeitpunkt 24 Stunden nach der Transplantation aber noch zu früh, um eine erhöhte Antigenität des stärker geschädigten Transplantats nachzuweisen, und es kommt erst im weiteren Verlauf zu vermehrter Rekrutierung von APCs. In einer anderen Studie an syngen transplantierten Ratten konnte beispielsweise ein Anstieg dendritischer Zellen erst eine Woche nach der Transplantation aufzeigt werden (121). Zahlreiche neuere Untersuchungen konnten außerdem einen wesentlichen Anteil von APCs an der Initiierung spezifischer Abstoßungsreaktionen aufzeigen (70, 71). Der massive Anstieg ED-1+-Monozyten/Makrophagen nach langen kalten Ischämiezeiten spricht - wie sich bereits im ersten Teil der Studie angedeutet hatte - für eine wesentliche Beteiligung dieser Zellen an der steigenden Gewebeschädigung.

Der Anstieg der VCAM-1-Expression im Bereich der perivaskulären Infiltrate von Monozyten/Makrophagen weist wiederum auf die Bedeutung von VCAM-1 für den Gefäßaustritt dieser Zellen hin. Der parallel dazu eintretende Intensitätsverlust von PECAM-1 auf dem Gefäßendothel nach langen Ischämiezeiten und Übergang in eine lückenhaftere Verteilung zeigt einen Anstieg vaskulärer Schäden auf. Lange kalte Ischämiezeiten von mehr als 6 Stunden waren vermutlich entscheidender Auslöser für die vaskulären Läsionen, während unter anderen Bedingungen bei humanen Transplantationen und im Rahmen entzündlicher Nierenerkrankungen die Expression von PECAM-1 unbeeinflusst blieb (101, 104). Interessant sind in diesem Zusammenhang neuere Untersuchungen zur Gefäßdichte und Angiogenese, die zeigen konnten, dass es nach ischämischer Schädigung in nativen Nieren zum Verlust peritubulärer Kapillaren und anschließender Fibrosierung in diesen Bereichen kommen kann (122). Möglicherweise können derartige Schäden auch entscheidend zur Progression der chronischen allogenen Nephropathie beitragen (123).

Zusätzliche Hinweise für eine Endothelschädigung ergaben sich auch aus der vermehrten Expression von TF insbesondere auf Endothelzellen aber auch im Bereich der Media und auf infiltrierenden Leukozyten in der Umgebung dieser [Seite 70↓]Gefäße. Ähnliche Verteilungsmuster für TF waren auch in anderen experimentellen und klinischen Studien nach IR in nativen und transplantierten Nieren beobachtet worden (66, 67, 68). Dabei konnte mit Antisense-ODN gegen TF eine deutliche Reduktion der Schädigung nach IR in Ratten erzielt werden (67). Auch in der Xenotransplantation von Herzen, bei der die vaskuläre Rejektion mit Ablagerung von Fibrin während der hyperakuten Abstoßung im Vordergrund steht, konnte eine deutliche Hochregulation von TF auf Endothel und infiltrierenden Zellen nachgewiesen werden (124). Neben prothrombotischen Effekten ist die Beteiligung von TF an Adhäsion und Migration der Entzündungszellen nach langen kalten Ischämiezeiten von besonderer Bedeutung. In vitro konnte gezeigt werden, dass Monozyten/Makrophagen über TF mit Endothel interagieren. Dabei stellte sich heraus, dass aktivierte Monozyten mittels TF durch reverse Transmigration den Ort der Schädigung wieder verlassen können und so zu den lokalen Lymphknoten gelangen (64). Daraus ergibt sich möglicherweise auch ein wichtiger Anteil von TF an Vorgängen der indirekten Antigenpräsentation. Da auch nach langen kalten Ischämiezeiten nicht vermehrt Fribrinthromben in den Transplantaten auftraten, ist anzunehmen, dass TF 24 Stunden nach der Transplantation weniger in thrombotische Prozesse, sondern eher in Abläufe der Monozytenmigration involviert war.

Der deutliche Anstieg von Monozyten/Makrophagen in Abhängigkeit von der kalten Aufbewahrungsdauer der Organe parallel zur Verstärkung der Schäden unterstreicht die Bedeutung dieser Zellen nicht nur für regenerative, sondern auch für schädigende Prozesse nach IR. Für eine führende Rolle der Monozyten in der frühen entzündlichen Antwort auf ischämische Schädigung nach Transplantation spricht auch der ausbleibende Anstieg neutrophiler Zellinfiltrate trotz zunehmender Traumatisierung der Organe nach langen Ischämiezeiten. Welche genauen Mechanismen bei der durch Monozyten vermittelten Schädigung nach IR und Transplantation zum Tragen kommen, muss allerdings noch näher untersucht werden. In vitro konnte gezeigt werden, dass Monozyten bei Kontakt mit Endothelzellen vermehrt Metalloproteinasen sezernieren können und so unter anderem zur Zerstörung der extrazellulären Matrix beitragen können (125). Einige klinische und experimentelle Untersuchungen konnten bereits die wesentliche Bedeutung der Monozyten/Makrophagen für die Entstehung von chronischer Allograft Nephropathie und Transplantatversagen aufzeigen (126, 127). Dabei [Seite 71↓]ergab die Auswertung der Erstbiopsien nach der Transplantation, dass schon in diesen frühen Biopsien signifikant höhere monozytäre Infiltrationsraten mit einem späteren Auftreten progredient chronischer Rejektion vergesellschaftet waren (127).

Die Zunahme vaskulärer Schäden in Kombination mit massiven monozytären Infiltraten und das Ausbleiben anderer entzündlicher Reaktion legen die Vermutung nahe, dass diese Faktoren hauptverantwortlich für die resultierenden tubulären Schäden und den vermutlich anschließenden Verlust von Nephronen nach langen kalten Ischämiezeiten waren.

6.3 Vaskuläre Schädigung im Kontext der „Response to injury“-Hypothese

Ergebnisse aus tierexperimentellen Studien und zahlreichen klinischen Untersuchungen lassen einen Zusammenhang zwischen unspezifischer Schädigung des transplantierten Organs durch Ischämie/Reperfusion und dem Auftreten verzögert einsetzender Transplantatfunktion (DGF) (9, 77) und akuter Rejektionen (78) in der Frühphase nach Transplantation sowie indirekt zur Entstehung der chronischen Transplantatnephropathie (117, 118, 128) vermuten. Den negativen Effekt unspezifischer Organschädigung auf Kurz- und Langzeitüberleben des transplantierten Organs erklärte Philip Halloran durch die „Response–to-Injury“-Hypothese (95), die von vielen anderen Untersuchern übernommen wurde (96). Danach wird vermutet, dass die Schädigung durch IR zu erhöhter Antigenität des Transplantats und amplifizierter alloreaktiver Abstoßungsreaktion führt. Ausgelöst durch die Gewebeschädigung kommt es zunächst zur Freisetzung proinflammatorischer Substanzen wie freien Radikalen, Interleukinen, IFN-γ, TNF-α und PAF. Die gesteigerte entzündliche Antwort führt über Hochregulation von Adhäsionsmolekülen auf aktiviertem Endothel zu verstärkter Leukozyteninfiltration. Außerdem kommt es zur vermehrten Expression alloantigener Oberflächenrezeptoren wie den MHC-Klasse-ΙΙ-Molekülen auf Parenchymzellen des Transplantats. Schließlich resultiert somit aus der zunächst gesteigerten unspezifischen Immunantwort des Empfängers auf die Schädigung vermutlich auch eine verstärkte spezifische Abstoßung des übertragenen Organs.

Wie stark Alloantigen-abhängige im Vergleich zu Alloantigen-unabhängigen [Seite 72↓]Mechanismen an den Vorgängen in der Frühphase nach der Transplantation beteiligt sind, ist bisher jedoch noch weitgehend ungeklärt. Weil Protokollbiopsien innerhalb der ersten Woche nach der Organübertragung nicht durchgeführt werden, um Empfänger und Organ nicht zu gefährden, können klinische Studien nur wenig zur Aufdeckung der Abläufe in diesem frühen Zeitraum beitragen. Deshalb wurde in dieser Studie ein etabliertes tierexperimentelles Modell zur chronischen Abstoßung nach Nierentransplantation gewählt (80). Dabei dienten Lewisratten als Empfänger von Organen aus Lewisratten (isogene Gruppen) bzw. Fischer-Ratten (allogene Gruppen). Dieses sogenannte „Low-Responder“-Modell erschien für die Untersuchung der Mechanismen des Ischämie-/Reperfusionsschadens, der Regeneration und der beginnenden Rejektion als geeigneter gegenüber der Kombination von „High-Responder“-Tierstämmen, bei denen starke Immunglobulinablagerungen im Rahmen früher vaskulärer Rejektion eine fulminante inflammatorische Antwort auslösen, so dass die Tiere innerhalb von zwei Wochen an urämischem Nierenversagen versterben (129).

Im zeitlichen Verlauf nach IR und Transplantation wie auch nach zunehmender kalter Aufbewahrungszeit der Organe hatten sich Monozyten/Makrophagen als vorherrschende Zellpopulation im Nierengewebe herausgestellt. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass Monozyten/Makrophagen sowohl an regenerativen Abläufen (94) als auch an der Schädigung im Rahmen akuter (112, 127) und chronischer Ereignisse (126, 130) nach Transplantation beteiligt sein können. Wie bereits angesprochen kommt in diesem Zusammenhang der Fähigkeit von Monozyten/Makrophagen je nach den vorherrschenden Bedingungen in der unmittelbaren Umgebung entweder weitere Gewebeschäden hervorzurufen oder reparative Mechanismen zu steuern – dem sogenannten „Macrophage Programming“ - besondere Bedeutung zu (111).

Verzögert einsetzende Organfunktion ist ein häufiges Phänomen nach ischämischer Schädigung im Rahmen der Transplantation und geht morphologisch meist mit dem Bild der akuten tubulären Nekrose (ATN) einher (78). Für die regenerativen Vorgänge nach ATN sind Makrophagen wegen ihrer Fähigkeit Wachstumsfaktoren wie transforming growth factor α und β (TGF-α, TGF-β), insulinlike growth factor 1 (IGF-1), EGF-like growth factor (EGF-like) fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF) und platelet activating factor (PAF) zu sezernieren von zentraler Bedeutung (94, 111). Dabei [Seite 73↓]bilden Monozyten mit Lymphozyten und Parenchymzellen eine Art Netzwerk mit hohem regenerativem Potential: EGF und TGF-α fördern die Regeneration von Epithelzellen (131), FGF fördert die Revaskularisierung (132), PDGF und PAF wirken chemotaktisch, und TGF-β hat zentrale Bedeutung beim Umbau der extrazellulären Matrix (133). Die Vielzahl der beteiligten Chemokine und Wachstumsfaktoren verdeutlicht die Komplexität der Leukozyteninteraktion während des Regenerationsprozesses. Die Geschwindigkeit der ablaufenden Heilungsprozesse führt in der Regel nicht zur vollständigen Restitution des Parenchymgewebes sondern zur Ausbildung fibrösen Narbengewebes, welches durch einen Überschuss an Strukturen der extrazellulären Matrix gekennzeichnet ist (134). Auch nach ischämischer Schädigung und Transplantation kam es innerhalb der ersten Woche parallel zum Einstrom von neutrophilen Granulozyten zunächst zur Funktionsverschlechterung mit anschließender Regeneration, während die Infiltration durch monozytäre Zellen weiter zunahm. Der ausbleibende Rückgang monozytärer Zellen im Nierenparenchym trotz Regeneration der Nierenfunktion deutet auf ein mögliches Missverhältnis zwischen reparativen und schädigenden Prozessen hin, was eventuell die Auslösung der spezifischen Abstoßungsreaktion in allogen transplantierten Tieren begünstigte.

Nach Verlängerung der kalten Aufbewahrungszeit der Organe zeigte sich neben zunehmender tubulärer Schädigung und massiv gesteigerter Monozyteninfiltration auch ein erheblicher Anstieg der vaskulären Schäden. Möglicherweise ist die Endothelschädigung in der Frühphase nach der Transplantation auch für die Progredienz der chronischen Abstoßung und des späteren Organversagens von Bedeutung. Denn neben fortschreitender interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophie ist vornehmlich die zunehmende Vaskulopathie arterieller Gefäße für das chronische Transplantatversagen verantwortlich (135). Intravasale Ultraschalluntersuchungen im Rahmen chronischer Rejektion bei transplantierten Herzen konnten zeigen, dass Umbauprozesse in perivaskulären Bereichen der Arterien zur Schrumpfung der Gefäße beitragen (136). Dabei umgeben Makrophagen und Lymphozyten die Arterien manschettenartig. Während nach akuter Schädigung die Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus diesen Zellen regenerativ wirkt, kommt es bei chronischer Einwirkung zur Vermehrung der extrazellulären Matrix. Daraus resultieren Vernarbungen der Adventitia, gefolgt von Lumeneinengung und Elastizitätsverlust (130, 137). Auch am Fortschreiten [Seite 74↓]der chronischen allogenen Nephropathie haben Gefäßveränderungen wichtigen Anteil (79, 138, 139). In transplantierten Nieren stehen allerdings die Verdickung und Fibrosierung der arteriellen Intima im Vordergrund (79, 138). Dabei ähneln die vaskulären Veränderungen physiologischen Alterungsprozessen in der Niere und atherosklerotischen Umbauprozessen (139, 140). Es ist aber erwiesen, dass auch in der Pathogenese der Atherosklerose Monozyten/Makrophagen eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen in der Gefäßwand spielen (141). Bei diesen Abläufen hat auch VCAM-1 für die Interaktion von Monozyten und Endothelzellen wesentliche Bedeutung (142). Die initialen vaskulären Schäden unmittelbar nach der Reperfusion in Folge ischämischer Schädigung sind dabei vielleicht von entscheidender für die später auftretenden entzündlichen Gefäßveränderungen im Rahmen der chronischen Abstoßung.

6.4 Perspektiven und mögliche therapeutische Konsequenzen

Die Schädigung durch lange kalte Aufbewahrung und anschließende Reperfusion des Organs hat in der kadaverischen Nierentransplantation bedeutenden Einfluss auf Organfunktion und immunologische Abstoßung in der akuten Phase nach der Transplantation (9, 77, 78, 115). Außerdem reduzieren lange Ischämiezeiten vor der Implantation signifikant das Langzeitüberleben des Transplantats (8, 114). Im Tiermodell führt ischämische Schädigung unabhängig von Alloantigen-abhängigen Mechanismen zu ähnlichen Veränderungen wie bei der chronischen Rejektion in allogenen Transplantaten (128). In neueren experimentellen Studien konnten synergistische Effekte von Alloantigen-abhängigen und –unabhängigen Faktoren bei der Progredienz der chronischen Schädigung transplantierter Nieren festgestellt werden (81).

Die Ergebnisse aus den Tierexperimenten dieser Studie haben gezeigt, dass bereits in der ersten Woche nach der Transplantation wichtige Phasen tubulärer und vaskulärer Schädigung gefolgt von regenerativen Prozessen ablaufen. Es konnte gezeigt werden, dass die entzündliche Antwort nach IR und Transplantation durch komplexe Interaktion von Leukozyten untereinander und mit Endothelzellen über eine Vielzahl unterschiedlicher Adhäsionsmechanismen erfolgt. Zahlreiche Ansätze zur Intervention auf der Ebene der Leukozytenadhäsion konnten bereits Erfolge in Bezug auf akute Schädigungen und chronisches Organversagen erzielen. Durch Blockade auf Ebene der [Seite 75↓]Selektine (23) und der Liganden ICAM-1/LFA-1 (24, 26, 29) konnten positive Effekte erzielt werden. Die zentrale Funktion des Endothels für die Regulation des Leukozytenaustritts ins Gewebe und die Langzeitbedeutung für die chronische Rejektion durch Blockade dieser Funktion mittels Antisense-Oligonukleotiden gegen ICAM-1 konnte in anderen Untersuchungen dieser Arbeitsgruppe ebenfalls gezeigt werden (143). Unterschiede bei der Adhäsion von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sowie mögliche Redundanz dieser Mechanismen könnten erklären, warum Anti-Adhäsionsstrategien mit Antikörpern gegen ICAM-1 in klinischen Studien keinen Benefit in Bezug auf akute Rejektionsereignisse und verzögert einsetzende Organfunktion brachten (30). Die vorherrschende Infiltration von Monozyten/Makrophagen nach zunehmenden kalten Ischämiezeiten stützt diese Theorie, weil diese Zellen wahrscheinlich hauptsächlich über VCAM-1/VLA-4 aus den Gefäßen austraten (55). Die Blockade der Interaktion von VCAM-1 und VLA-4 bietet folglich weitere therapeutische Möglichkeiten, insbesondere weil diese Liganden an mehreren Schritten der Adhäsionskaskade beteiligt sind (53). Hinzu kommt, dass unter dem Einfluss zunehmender Gefäßschädigung bei ansteigenden Ischämiezeiten über Tissue Factor vermutlich weitere Adhäsionswege für Monozyten beteiligt waren (64). Durch Verhinderung der Expression von TF mittels Antisense-Oligonukleotiden konnte im Tierexperiment bereits eine deutliche Reduktion der Schäden nach IR erreicht werden, wodurch weitere Interventionsmöglichkeiten aufgezeigt wurden (67). Da TF neben der Migration von Leukozyten vor allem auch an der Aktivierung der Blutgerinnung (63) beteiligt ist, bieten sich auch hier optimale Therapieoptionen für die kadaverische Transplantation.

Der große Einfluss von Monozyten/Makrophagen an Vorgängen in der akuten Phase nach der Transplantation (112) und im Rahmen der chronischen Abstoßung (126, 127) bietet ebenfalls mögliche Ansätze zur Intervention. Im Tiermodell konnte durch Einsatz eines spezifischen Inhibitors von Makrophagen und Monozyten das Auftreten der funktionellen und morphologischen Veränderungen bei chronischer Rejektion verhindert werden (126). Die Ergebnisse zum zeitlichen Verlauf lassen allerdings vermuten, dass innerhalb der ersten Woche nach der Transplantation sowohl schädigende als auch wichtige regenerative Einflüsse von Monozyten/Makrophagen ausgingen. Von entscheidender Bedeutung bei diesen Prozessen ist vermutlich die Ausschüttung [Seite 76↓]zahlreicher unterschiedlicher Wachstumsfaktoren aus diesen Zellen (144). Im Tiermodell konnten für die Wachstumsfaktoren EGF (145), FGF (146), TGF-β1 (147) und HGF (148) positive Effekte auf die tubuläre Regeneration, Hämodynamik und Funktion in der akuten Phase nach IR nachgewiesen werden. Die Wirkungen der einzelnen Wachstumsfaktoren unterscheiden sich aber erheblich bei akuten Ereignissen von denen im Rahmen chronischer Prozesse. So spielt unter anderem TGF-β1 eine wichtige Rolle für die Progredienz der chronischen Abstoßung beim Umbau der extrazellulären Matrix (149). Der Einsatz von Wachstumsfaktoren in der Akutphase nach der Transplantation oder bei der Aufbewahrung des Organs bietet demnach möglicherweise weitere therapeutische Optionen.

Einen weiteren möglichen Angriffspunkt bietet vermutlich der „indirekte“ Weg der Alloantigen-Präsentation über APCs des Empfängers. Wie bereits beschrieben, wird dieser Form der Auslösung einer spezifischen Immunantwort wichtige Bedeutung beim Ablauf chronischer Abstoßungsvorgänge zugesprochen (70). Insbesondere Strategien, die zur Blockade kostimulatorischer Signale bei der T-Zell-Aktivierung durch APCs wie der Interaktion von CD28 mit B7 oder von CD40L mit CD40 führen, zeigten schon erste vielversprechende Erfolge in tierexperimentellen Studien (113,150, 151).

Die deutliche Zunahme vaskulärer und tubulärer Schäden nach längeren kalten Ischämiezeiten könnte eventuell auch durch alternative Aufbewahrungsmethoden wie die maschinelle Perfusion des Organs gemildert werden (152). Beim Vergleich der pulsatilen maschinellen Perfusion des Transplantats mit der Technik des „cold flush“ durch UW-Lösung und anschließender kalter Aufbewahrung konnten geringeres Auftreten verzögerter Organfunktion und höhere Ein- und Zwei-Jahres-Überlebensraten festgestellt werden (153).

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie geben einen tieferen Einblick in die entzündlichen Vorgänge nach IR und Transplantation während der akuten Phase. Aus den Erkenntnissen lassen sich neue Ansätze ableiten für weitere experimentelle Studien auf diesem Gebiet und für die Entwicklung von Therapien, die das Auftreten verzögerter Organfunktion und möglicherweise auch akuter sowie chronischer Rejektionsereignisse verringern können. Durch neue therapeutische Möglichkeiten könnte außerdem eine Dosisreduktion anderer nephrotoxischer Immunsuppressiva erreicht werden (154).


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17.05.2005