Bedeutung der Alloantigen-unabhängigen Faktoren in der Frühphase nach tierexperimenteller NierentransplantationUwe Hoff161.171.1.18541#4151.1.29101.2111.2.1548#536121.2.21.2.31314151.2.41.3161.4171.5181.5.11.5.21920221223233.13.1.124253.1.23.1.3263.1.43.227283.2.1293.33.44304.14.2314.3324.4335355.15.1.1550#182365.1.2552#2355.2375.2.15.2.1.138567#41039567#2665.2.1.240567#26741567#41542567#2695.2.1.343548#53444567#3594546567#360475.2.1.448427#3935.2.25.2.2.149567#39950567#399515.2.2.252473#380535.2.2.354473#37955567#386565.2.2.457567#3975.3585.3.159567#2665.3.260227#2276616.16.1.16263646.1.265666.267686970716.37273746.4757677778 Literaturverzeichnis798081828384858687888990919293 Abkürzungsverzeichnis9495 Danksagung96 Lebenslauf97 Veröffentlichungen98 Eidesstattliche Erklärung99deInhaltsverzeichnisHilfeAus der Franz Volhard Klinik und dem Max Delbrück Zentrum für Molekulare Medizin
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
DissertationBedeutung der Alloantigen-unabhängigen Faktoren in der Frühphase nach tierexperimenteller NierentransplantationZur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin
von
Uwe Hoff aus Berlin Prof. Dr. med. Martin Paul Professor Dr. med. Duska Dragun Professor Dr. med. Karl F. Hilgers PD Dr. rer. nat. Dominik Müller Datum der Promotion: 18.04.2005 Zusammenfassung

Die Schädigung des Organs durch Ischämie-Reperfusion (IR) im Rahmen der kadaverischen Organtransplantation hat bedeutenden Anteil an der Pathogenese verzögert einsetzender Organfunktion und Auswirkungen auf das Langzeitüberleben des Transplantats. In der vorliegenden Studie sollte der Einfluss unspezifischer Schädigung durch IR verglichen mit spezifischen Alloantigen-abhängigen Mechanismen während der Frühphase nach der Transplantation sowie die Auswirkungen prolongierter Aufbewahrung auf Schädigung und Immunogenität des Organs ermittelt werden. Nach vorausgegangener vierstündiger kalter Ischämiezeit wurden Organe aus syngen (Lew/Lew) und allogen (F344/Lew) transplantierten Ratten an 8 aufeinander folgenden Zeitpunkten innerhalb der ersten 10 Tage zu funktionellen, immunhistochemischen und morphologischen Veränderungen untersucht. In weiteren Gruppen wurden syngen transplantierte Organe 24 Stunden nach der Transplantation untersucht, die zuvor ansteigenden kalten Ischämiezeiten zwischen 2 und 48 Stunden ausgesetzt wurden. Im zeitlichen Verlauf zeigten sich bis 7 Tage nach der Transplantation keine wesentlichen Unterschiede zu Nierenfunktion, Morphologie, Zellinfiltration und Expression von Adhesionsmolekülen zwischen allogenen und isogenen Gruppen. Die zunächst eintretende Verschlechterung der Nierenfunktion war begleitet von einem Einstrom neutrophiler und monozytärer Zellen und morphologischen Veränderungen im Sinne von akuter Tubulusnekrose (ATN). Unter zunehmender Infiltration von Monozyten/Makrophagen kam es funktionell und morphologisch zur Regeneration. Neutrophile traten vornehmlich über Interaktion von ICAM-1/LFA-1 und Monozyten/Makrophagen über VCAM-1/VLA-4 aus dem Gefäßsystem aus. Gabe von Cyclosporin A führte zu signifikanter Reduktion ED-1-positiver Makrophagen nach 10 Tagen, ohne jedoch den Anteil des aktivierten Makrophagensubtyps ED-2 zu beeinflussen. Ansteigende kalte Aufbewahrung des Organs führte zu größerer vaskulärer Schädigung, die sich durch abnehmende Intensität und lückenhaftere Verteilung von PECAM-1 auf dem Endothel äußerte. Die Zunahme der Intensität von Tissue Factor auf Endothel und infiltrierenden Leukozyten deutete neben gesteigerter Thrombogenese auf alternative Adhäsionsmechanismen hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass innerhalb der ersten 10 Tage nach der Transplantation wichtige Phasen der Gewebeschädigung und Regeneration ausgelöst durch die Schädigung nach IR und weitestgehend ohne Beteiligung Alloantigen-abhängiger Faktoren ablaufen. Eine bedeutende Rolle als Mediatoren während dieser Phasen kommt dabei den Monozyten/Makrophagen zu.

 Entzündung Organtransplantation Ischämie-Reperfusion kalte Ischämiezeit Transplantatversagen Endothel Adhäsionsmoleküle Tissue Faktor Monozyten Makrophagen Abstract

Organ damage due to long cold preservation is associated with delayed graft function and has important effects on graft survival. Aim of this study was to determine the impact of ischemia-reperfusion (IR) injury compared to antigen-specific mechanisms and the effect of prolonged cold ischemia on intragraft injury and antigenicity during the early phase post transplantation. Rat renal grafts were four-hours cold-preserved, transplanted to syngeneic (Lew/Lew) or allogeneic recipients (F344/Lew) and harvested at 8 different time points after transplantation for further investigation of functional, immunhistochemical and histologic changes. In five additional syngen groups organs were cold preserved from 2 hours to 48 hours and harvested after 24 hours post transplantation. No significant differences in renal function, morphologic changes, cellular infiltration and expression of adhesion molecules occurred between syngeneic and allogeneic groups within the first 7 days. Initial functional impairment was accompanied by the influx of neutrophils and monocytes/macrophages together with morphologic changes reflecting acute tubular necrosis (ATN). Increasing infiltration of monocytes/macrophages paralleled functional and morphologic regeneration. Extravasation of neutrophils was mediated mainly by interaction of ICAM-1/LFA-1 and infiltration of monocytes/macrophages by VCAM-1/VLA-4. Treatment with the standard dose of Cyclosporin A (CsA) lead to a significant decrease of ED1-positive macrophage infiltration 10 days post NTx but the portion of ED2-positive macrophage subtype was not affected. Prolonged cold organ preservation lead to more severe vascular damage indicated by decreased color intensity and continuity of PECAM-1 staining on endothelial cells. Higher staining intensity for Tissue Factor (TF) on endothelium and infiltrating leukocytes implicated enhanced intragraft procoagulant capacity and alternative adhesion mechanisms. These results show that within the first 10 days post transplantation phases of tissue injury and repair after ischemia-reperfusion are largely independent of the immunologic background and monocytes/macrophages play an important role as mediators during these processes.

 Inflammation solid organ transplantation ischemia-reperfusion cold ischemia graft failure endothelium adhesion molecules tissue factor monocytes macrophages Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1 Ischämie-/Reperfusionsschaden und immunologische Antwort nach Nierentransplantation

      • 1.1.1 Pathophysiologie des Ischämie-/Reperfusionsschaden

      • 1.1.2 Folgereaktionen nach Ischämie-/Reperfusionsschaden in der experimentellen und klinischen allogenen Nierentransplantation

    • 1.2 Mechanismen der Leukozytenadhäsion nach Ischämie-/ Reperfusionsschaden

      • 1.2.1 Die Adhäsionskaskade

      • 1.2.2 Annäherung („Tethering“) und „Rollen“ („Rolling“)

      • 1.2.3  Aktivierung („Triggering“) und feste Bindung („Arrest“) der Leukozyten an das Endothel

      • 1.2.4 Transmigration der Leukozyten durch die Gefäßwand

    • 1.3 Bedeutung von Tissue Factor (TF) nach Ischämie-/ Reperfusion und Transplantation

    • 1.4 T-Zell-vermittelte spezifische Abstoßungsmechanismen

    • 1.5  Einflußfaktoren auf die chronische Abstoßungsreaktion

      • 1.5.1 Delayed Graft Function

      • 1.5.2 Chronische Allograft Nephropathie

  • 2  Hypothese

  • 3  Methoden

    • 3.1 Tiermodell

      • 3.1.1 Transplantationsmodell

      • 3.1.2 Gruppeneinteilung

      • 3.1.3  Bestimmung der Nierenfunktion

      • 3.1.4 Organentnahme

    • 3.2 Immunhistologie

      • 3.2.1 Semiquantitative Analyse der immunhistologischen Präparate

    • 3.3 Histologie

    • 3.4 Statistische Methoden

  • 4  Material

    • 4.1 Antikörper

    • 4.2 Puffer und Lösungen

    • 4.3  Chemikalien, Reagenzien

    • 4.4  Geräte und Instrumente

  • 5  Ergebnisse

    • 5.1 Organfunktion

      • 5.1.1 Nierenfunktionswerte im Serum bei konstanter kalter Ischämiezeit von 4 Stunden in isogen und allogen transplantierten Tieren (Teil A)

      • 5.1.2 Nierenfunktionswerte bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

    • 5.2  Immunhistochemie

      • 5.2.1 Immunhistochemische Ergebnisse bei konstanter kalter Ischämiezeit in isogen und allogen transplantierten Tieren (Teil A)

        • 5.2.1.1 Nachweis von Selektinen

        • 5.2.1.2  Nachweis der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und PECAM-1

        • 5.2.1.3 Nachweis von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sowie der Integrine VLA-4 und LFA-1

        • 5.2.1.4 Nachweis von ED-1- und ED-2-positiven Zellen in allogen transplantierten Tieren 10 Tage nach Transplantation ohne versus 1,5 mg/kg bzw.5 mg/kg immunsuppressiver Behandlung mit Cyclosporin-A (CsA)

      • 5.2.2 Immunhistochemische Ergebnisse bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

        • 5.2.2.1 Nachweis der Adhäsionsmoleküle PECAM-1 und VCAM-1

        • 5.2.2.2 Nachweis von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sowie der Integrine LFA-1 und VLA-4

        • 5.2.2.3  Nachweis von MHC-ΙΙ-positiven Zellen, dendritischen Zellen (OX-62) und ED-2-positiven Zellen

        • 5.2.2.4 Nachweis von Tissue Factor (TF)

    • 5.3 Pathohistologische Analyse

      • 5.3.1 Morphologische Veränderungen bei konstanter kalter Ischämiezeit in isogen und allogen transplantierten Tieren innerhalb der ersten 10 Tage nach Transplantation (Teil A)

      • 5.3.2 Morphologische Veränderungen bei ansteigender kalter Ischämiezeit und Organentnahme nach 24h (Teil B)

  • 6  Diskussion

    • 6.1 Bedeutung von Allogenität und Ischämie-/Reperfusionsschaden für die entzündlichen Vorgänge in der Frühphase nach der Transplantation

      • 6.1.1 Spezifische Mechanismen und Kinetik der Adhäsionskaskade nach IR und Transplantation

      • 6.1.2  Mögliche Einflüsse der vorherrschenden Entzündungszellen auf morphologische und funktionelle Veränderungen des Transplantats

    • 6.2 Auswirkungen der Dauer der kalten Ischämiezeit auf Gewebeschädigung, Immunogenität und Adhäsions-mechanismen

    • 6.3 Vaskuläre Schädigung im Kontext der „Response to injury“-Hypothese

    • 6.4 Perspektiven und mögliche therapeutische Konsequenzen

  • 7  Zusammenfassung

  • Literaturverzeichnis

  • Abkürzungsverzeichnis

  • Danksagung

  • Lebenslauf

  • Veröffentlichungen

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1 : Verwendete Antikörper

Bilder

  • Abb. 1: Pathophysiologische Vorgänge bei der Entstehung des mikrovaskulären Ischämie-/Reperfusionsschaden. Modifiziert übernommen aus Menger MD, Vollmar B, Glasz J et al.: Microcirculatory manifestations of hepatic ischemia/ reperfusion injury. Prog Appl Microc 1993, 19: 106. Karger, Basel. Switzerland.

  • Abb. 2: Wichtige Adhäsionsmoleküle und „Chemoattractants“ beim Ablauf der Adhäsionskaskade. Modifiziert übernommen aus Andrian UH, Mackay CR: T-Cell Function and Migration. N Engl J Med 2000; 343: 1020-34.

  • Abb. 3: Nierenfunktionsparameter von allogen und isogen transplantierten Tieren zum Zeitpunkt der Organentnahme. (A) Kreatinin-Konzentration im Serum. (B) Harnstoff-Konzentration im Serum. Zeichen: (■) allogen; (●) isogen. Beide Parameter sind in mg/dl als Mittelwert + SEM angegeben.

  • Abb. 4: Nierenfunktionsparameter isogen transplantierter Tiere 24 h post transplantationem, deren Organe kalten Ischämiezeiten zwischen 2 und 24h ausgesetzt waren. (A) Kreatinin-Konzentration im Serum. (B) Harnstoff-Konzentration im Serum. Beide Parameter sind in mg/dl angegeben als Mittelwert + SEM.

  • Abb. 5: Immunhistochimischer Nachweis für P-Selektin 2 Stunden nach Transplantation. Vaskuläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. Intraglomerläre Expression: (D) isogenes Transplantat; (E) allogenes Transplantat; (F) native Niere. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 6: Immunhistochemischer Nachweis für L-Selektin 6 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 7: Immunhistochemischer Nachweis für ICAM-1 24 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 200fache Vergrößerung.

  • Abb. 8: Immunhistochemischer Nachweis für VCAM-1 24 Stunden nach Transplantation. Vaskuläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. Intraglomeruläre Expression: (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 9: Immunhistochemischer Nachweis für PECAM-1 24 Stunden nach Transplantation. (A) isogenes Transplantat; (B) allogenes Transplantat; (C) native Niere. 200fache Vergrößerung.

  • Abb. 10: Zeitverlauf verschiedener Populationen von Abwehrzellen nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF in Gewebeschnitten allogener (■) und isogener (●) Organe. (A) neutrophile Granulozyten (HIS-48), (B) LFA-1-positive Zellen, (C) ED-1-positive Monozyten/Makrophagen, (D) VLA-4-positive Zellen. ٭P = 0,01.

  • Abb. 11: Immunhistochemischer Nachweis für neutrophile Granulozyten und LFA-1-positive Zellen in isogenen und allogenen Transplantaten 24 Stunden nach Transplantation. Perivaskuläre neutrophile Infiltrate: (A) isogen; (B) allogen. Intraglomeruläre neutrophile Infiltrate: (C) isogen; (D) allogen. Perivaskuläre LFA-1-positive Infiltrate: (E) isogen; (F) allogen. Intraglomeruläre LFA-1-positive Infiltrate: (G) isogen; (H) allogen. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 12: : Immunhistochemischer Nachweis für ED-1-positive Monozyten/Makrophagen und VLA-4-positive Zellen in isogenen und allogenen Transplantaten 24 Stunden nach Transplantation. Perivaskuläre ED-1-positive Infiltrate: (A) isogen; (B) allogen. Intraglomeruläre ED-1-positive Infiltrate: (C) isogen; (D) allogen. Perivaskuläre VLA-4-positive Infiltrate: (E) isogen; (F) allogen. Intraglomeruläre VLA-4-positive Infiltrate: (G) isogen; (H) allogen. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 13: Einfluß der Behandlung mit Cyclosporin A (CsA) in niedriger Dosis oder Standarddosis auf die Zahl ED-1- bzw. ED-2-positiver Monozyten/Makrophagen in Organen allogen transplantierter Tiere 7 und 10 Tage nach dem Eingriff. (■) ED-1-positive Zellen, (□) ED-2-positive Zellen. Alle Werte sind als Mittelwert + SEM dargestellt. ٭P = 0,001

  • Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis für PECAM-1 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach (A) 2h, (B) 6h, (C) 12h und (D) 24h vorausgegangener kalter Ischämiezeit. 200fache Vergrößerung.

  • Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis für VCAM-1 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach (A) 2h, und (B) 6h vorausgegangener kalter Ischämiezeit. 400fache Vergrößerung.

  • Abb. 16: Verschiedene Populationen von Abwehrzellen in Gruppen mit variablen kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF pro Gewebeschnitt. ٭ P = 0,01. (A) neutrophile Granulozyten, (B) LFA-1-positive Zellen, (C) ED-1-positive Monozyten/Makrophagen, (D) VLA-4-positive Zellen.

  • Abb. 17: Verschiedene Populationen von Abwehrzellen in Gruppen mit variablen kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM der Anzahl positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld (GF) aus 15 zufällig gewählten GF pro Gewebeschnitt. (A) MHC-ΙΙ-positive Zellen, (B) Dendritische Zellen (OX-62), (C) ED-2-positive Zellen.

  • Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis für MHC-ΙΙ-positive Zellen nach 12 h kalter Ischämiezeit 24 Stunden nach Transplantation im Vergleich zum nativen Organ. 200fache Vergrößerung.

  • Abb. 19: Immunhistochemischer Nachweis für Tissue Factor 24 Stunden nach Transplantation in isogenen Transplantaten nach vorausgegangener kalter Ischämiezeit von 2h (A) vaskuläre, (B) glomeruläre und 6h (C) vaskuläre und (D) glomeruläre Expression. 200fache Vergrößerung.

  • Abb. 20: Histologische Färbung des Nierenparenchyms mit Hämatoxylin/Eosin: Deutliche Zeichen Akuter Tubulärer Nekrose (ATN) in isogen (A) und allogen (B) transplantierten Tieren 24 Stunden nach der Transplantation. Akute Rejektion in allogen transplantierten Tieren ohne Immunsuppression 10 Tage nach der Transplantation (C).

  • Abb. 21: ATN-Score für Gruppen mit ansteigenden kalten Ischämiezeiten 24h nach der Transplantation. Alle Werte sind dargestellt als Mittelwert + SEM.