[Seite 1↓]

Zusammenfassung

Die Primärinfektion oder Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) stellt bei immunsupprimierten Patienten nach wie vor ein grosses klinisches Problem dar. Doch nicht bei allen. Bei Patienten mit vergleichbarem Ausmaß an Immunsuppression kommt es bei einigen zu z.T. schweren klinischen Manifestationen oder gar zum Tod durch HCMV, während die Reaktivierung bei anderen asymptomatisch bleibt. In einer dritten Gruppe von Patienten werden überhaupt keine Reaktivierungen dokumentiert. T-Zellen spielen bei der Kontrolle der Infektion eine zentrale Rolle. Die Untersuchung der T-Zell-Antwort in einer Patientengruppe mit hohem Risiko für HCMV-Reaktivierung bzw. -Erkrankung bietet die Möglichkeit, die Ursachen für diese unterschiedlichen klinischen Verläufe zu analysieren. Ein besseres Verständnis der antiviralen T-Zell-Antwort und der damit verbundenen pathogenetischen Implikationen könnte Diagnostik, Prophylaxe und Therapie der HCMV-Infektion möglicherweise entscheidend verbessern. In dieser Arbeit wurden deshalb drei Ziele verfolgt: (1) Die Etablierung von Techniken, die die vollständige T-Zell-Epitop-Kartierung immundominanter Proteine und die Analyse der T-Zell-Reaktionen auf klonaler Ebene aus einem Minimum an Material ermöglichen sollten. (2) Die Anwendung dieser Techniken in einer Gruppe herz- und lungentransplantierter Patienten, um die T-Zell-Antwort gegen die beiden wahrscheinlich wichtigsten Ziele im HCMV, IE-1 und pp65, detailliert zu untersuchen und so mehr über die Gesetzmäßigkeiten dieser Antwort zu lernen. (3) Die Untersuchung auf mögliche Zusammenhänge zwischen den unterschiedlichen klinischen Verläufen im Hinblick auf HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung dieser Patienten und den be­obachteten interindividuellen Unterschieden in der Struktur der T-Zell-Antwort. Für die Epitop-Kartierung wurden Pentadecapeptide, die die gesamte Aminosäure-Sequenz von IE-1 bzw. pp65 umfassten und sich um jeweils 11 Aminosäurereste überlappten, in Pools von 25 bis 30 Peptiden in einer Weise zusammengefasst, dass jedes Peptid in einer einzigartigen Kombination von drei Pools enthalten war ("dreidimensionales Peptidpool-Design“). Dieses Design erlaubte ein Minimum an Ansätzen zur Epitop-Identifizierung - mit weniger als 17 ml Vollblut konnte eine komplette Kartierung erfolgen. Nach 6-stündiger Stimulation von mononukleären Zellen aus peripherem Blut ("peripheral blood mononuclear cells“, PBMC) der Patienten mit diesen Peptid-Pools wurden T-Zell-Reaktionen durch Färbung von intrazellulär zurückgehaltenem Interferon-γ (IFN-γ) sichtbar gemacht. Immunogene Peptide konnten dann anhand der jeweiligen Kombination von drei Pools, die zur Produktion von IFN-γ führten, eindeutig identifiziert werden. Ausserdem [Seite 2↓]wurde die Klonalität ausgewählter starker CD8+ T-Zell-Antworten auf einzelne IE-1- und pp65-Peptide untersucht. Dazu wurden die Peptid-spezifischen T-Zell-Populationen durch einen IFN-γ-Sekretions-Assay, magnetische Zellseparation (MACS) und durchflusszytometrische Feinsortierung aus PBMC isoliert und ihre Klonalität mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis klonal expandierter γ-T-Zell-Rezeptor-Rearrangements (TCR-γ-1/2-PCR) und anschliessender Fragmentanalyse fluoreszenzmarkierter PCR-Amplifikate (FFA) untersucht. Diese Methode erwies sich als sehr effektiv: schon geringe Zellzahlen (ca. 1 x 103 Zellen) waren für eine erfolgreiche PCR-Analyse ausreichend. Die so untersuchten CD8+ T-Zell-Reaktionen waren auf einen oder wenige T-Zell-Klone fokussiert. Die Struktur der analysierten T-Zell-Antworten war komplex: bei den Patienten bestanden grosse Unterschiede hinsichtlich des immundominanten Proteins, der Dominanz von CD4+ bzw. CD8+ T-Zell-Subpopulation, der antigenen Determinanten, der gemessenen Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen, sowie der Anzahl der identifizierten Epitope. Anschliessend wurden die HLA-Typen von Patienten und in vorangegangenen Projekten untersuchten gesunden Probanden, die auf gleiche Peptide reagierten, auf Übereinstimmungen untersucht. Ergänzend wurde für jedes identifizierte Peptid eine Bindungsmotiv-Analyse mit Hilfe von zwei online-Datenbanken zur Vorhersage von T-Zell-Epitopen durchgeführt ("SYFPEITHI“ und BioInformatics & Molecular Analysis Section des NIH, kurz "BIMAS“). Auf diese Weise konnten die jeweils wahrscheinlichsten präsentierenden HLA-Allele und die immunogenen Nonamere für den grössten Teil der immunogenen Peptide bestimmt werden. Für eine Reihe von Peptiden zeigte sich dabei, dass sie von verschiedenen HLA-Allelen präsentiert wurden. Zehn zuvor noch nicht beschriebene Epitope wurden ebenfalls identifiziert. Die Korrelation der experimentellen Daten mit den klinischen Verläufen der Patienten hinsichtlich HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung erbrachte jedoch noch keine Hinweise auf einen konkreten Zusammenhang, was wahrscheinlich durch die Komplexität der Antworten und die dafür zu geringe Patientenzahl bedingt war. Patienten mit starken T-Zell-Reaktionen gegen IE-1 schienen aber besser vor HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung geschützt zu sein. Zusammenfassend ermöglichen die in dieser Arbeit vorgestellten Methoden die Untersuchung des Langzeitverlaufes der CD4+ und CD8+ T-Zell-Antwort gegen immundominante Proteine auf Epitop-Ebene nach initialer Identifizierung der antigenen Determinanten. Die Klonalität dieser Reaktionen kann ebenfalls relativ einfach analysiert werden. Weil nur wenig Blut für diese Untersuchungen erforderlich ist, können sie auch bei Patienten mit einem hohen Risiko für HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung angewendet werden. Dadurch wurde die experimentelle Basis geschaffen, um durch eingehende Untersuchungen der komplexen HCMV-spezifischen T-Zell-[Seite 3↓]Anwort möglicherweise Hinweise für die Verbesserung von Diagnose, Prophylaxe und Therapie dieser Patienten zu erhalten.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
27.05.2004